Name: טראומה מוחית חריפה בעכברים אחריו שני פוטונים הדמיה אורכית (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-04-06T14:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 14 s
Description: למדו שיטה להפעלת טראומה מוחית חריפה בעכברים באמצעות דקירה סטריאוטקטית עם מחט סרינג', וצפו בהתנהגות תאי המוח בזמן אמת באמצעות הדמיה אורכית של שני פוטונים.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

אנו אסירי תודה לד&quot;ר פרנק קירכהוף למתן GFAP-EGFP וזני עכבר CX3CR1-EGFP. העבודה נתמכה על ידי מענקים ממרכז ניידות הבינלאומית של פינלנד, טקס, בית הספר פיני בוגר מדעי המוח (FGSN) והאקדמיה של פינלנד.

<ol><li>Lighthall, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Controlled+cortical+impact%3A+A+new+experimental+brain+injury+model%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurotrauma%22%5BJournal%5D)">Controlled cortical impact: A new experimental brain injury model.</a> J. Neurotrauma. 5 (1), 1-15 (1988).</li>
<li>Lindgren, S., Rinder, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Experimental+studies+in+head+injury%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysik%22%5BJournal%5D)">Experimental studies in head injury.</a> Biophysik. 2 (5), 320-329 (1965).</li>
<li>Shreiber, D. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Experimental+investigation+of+cerebral+contusion%3A+histopathological+and+immunohistochemical+evaluation+of+dynamic+cortical+deformation%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neuropathol.+Exp.+Neurol%22%5BJournal%5D)">Experimental investigation of cerebral contusion: histopathological and immunohistochemical evaluation of dynamic cortical deformation.</a> J. Neuropathol. Exp. Neurol. 58 (2), 153-164 (1999).</li>
<li>Feeney, D. M., Boyeson, M. G., Linn, R. T., Murray, H. M., Dail, W. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Responses+to+cortical+injury%3A+I.+Methodology+and+local+effects+of+contusions+in+the+rat%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Res%22%5BJournal%5D)">Responses to cortical injury: I. Methodology and local effects of contusions in the rat.</a> Brain Res. 211 (1), 67-77 (1981).</li>
<li>Bardehle, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Live+imaging+of+astrocyte+responses+to+acute+injury+reveals+selective+juxtavascular+proliferation%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Live imaging of astrocyte responses to acute injury reveals selective juxtavascular proliferation.</a> Nat. Neurosci. 16 (5), 580-586 (2013).</li>
<li>Sword, J., Masuda, T., Croom, D., Kirov, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evolution+of+neuronal+and+astroglial+disruption+in+the+peri-contusional+cortex+of+mice+revealed+by+in+vivo+two-photon+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Brain%22%5BJournal%5D)">Evolution of neuronal and astroglial disruption in the peri-contusional cortex of mice revealed by in vivo two-photon imaging.</a> Brain. 136 (5), 1446-1461 (2013).</li>
<li>Feng, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+neuronal+subsets+in+transgenic+mice+expressing+multiple+spectral+variants+of+GFP%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Imaging neuronal subsets in transgenic mice expressing multiple spectral variants of GFP.</a> Neuron. 28, 41-51 (2000).</li>
<li>Nolte, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((GFAP+promoter-controlled+EGFP-expressing+transgenic+mice%3A+a+tool+to+visualize+astrocytes+and+astrogliosis+in+living+brain+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22Glia%22%5BJournal%5D)">GFAP promoter-controlled EGFP-expressing transgenic mice: a tool to visualize astrocytes and astrogliosis in living brain tissue.</a> Glia. 33 (1), 72-86 (2001).</li>
<li>Jung, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+fractalkine+receptor+CX%283%29CR1+function+by+targeted+deletion+and+green+fluorescent+protein+reporter+gene+insertion%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Cell.+Biol%22%5BJournal%5D)">Analysis of fractalkine receptor CX(3)CR1 function by targeted deletion and green fluorescent protein reporter gene insertion.</a> Mol. Cell. Biol. 20 (11), 4106-4114 (2000).</li>
<li>Nimmerjahn, A., Kirchhoff, F., Kerr, J. N. D., Helmchen, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sulforhodamine+101+as+a+specific+marker+of+astroglia+in+the+neocortex+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Methods%22%5BJournal%5D)">Sulforhodamine 101 as a specific marker of astroglia in the neocortex in vivo.</a> Nat. Methods. 1 (1), 31-37 (2004).</li>
<li>Carré, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Technical+aspects+of+an+impact+acceleration+traumatic+brain+injury+rat+model+with+potential+suitability+for+both+microdialysis+and+PtiO2+monitoring%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci.+Methods%22%5BJournal%5D)">Technical aspects of an impact acceleration traumatic brain injury rat model with potential suitability for both microdialysis and PtiO2 monitoring.</a> J. Neurosci. Methods. 140, 23-28 (2004).</li>
<li>Holtmaat, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-term%2C+high-resolution+imaging+in+the+mouse+neocortex+through+a+chronic+cranial+window%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Protoc%22%5BJournal%5D)">Long-term, high-resolution imaging in the mouse neocortex through a chronic cranial window.</a> Nat. Protoc. 4 (8), 1128-1144 (2009).</li>
<li>Yang, G., Pan, F., Parkhurst, C. N., Grutzendler, J., Gan, W. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Thinned-skull+cranial+window+technique+for+long-term+imaging+of+the+cortex+in+live+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Protoc%22%5BJournal%5D)">Thinned-skull cranial window technique for long-term imaging of the cortex in live mice.</a> Nat. Protoc. 5, 201-208 (2010).</li>
<li>Cianchetti, F. A., Kim, D. H., Dimiduk, S., Nishimura, N., Schaffer, C. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stimulus-evoked+calcium+transients+in+somatosensory+cortex+are+temporarily+inhibited+by+a+nearby+microhemorrhage%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+one%22%5BJournal%5D)">Stimulus-evoked calcium transients in somatosensory cortex are temporarily inhibited by a nearby microhemorrhage.</a> PloS one. 8 (5), (2013).</li>
<li>Shih, A. Y., Mateo, C., Drew, P. J., Tsai, P. S., Kleinfeld, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+polished+and+reinforced+thinned-skull+window+for+long-term+imaging+of+the+mouse+brain%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">A polished and reinforced thinned-skull window for long-term imaging of the mouse brain.</a> J. Vis. Exp. 61, (2012).</li>
</ol>

יש המחברים אין לחשוף.

טראומה מוחית היא אירוע פתאומי, בלתי צפוי. כאן, אנו מתארים את מודל החיה שמתרבה ספקטרום של שינויים פתולוגיים שנצפו בחולים אנושיים לאחר פגיעה מוחית כגון ניוון מוחיים, חיסול של דנדריטים, בצקת במוח, צלקת גליה, דימומים בקליפת המוח בשילוב עם דימום תת עכבישי מוקד וחדירות מוגברות של מחסום דם מוח. ללמוד פתוגנזה ראשית ומשנית, כמו גם התאוששות לאחר טראומה, מודל פציעה זה היה בשילוב עם אורכי בהדמית vivo של עצבי עדינים ומבני גליה. קווי עכבר מהונדסים שימשו המבטאים חלבוני ניאון בתאי עצב (T...

פגיעה מוחית חריפה היא בעיה משמעותית בבריאות הציבור עם שכיחות גבוהה של פגיעה בתאונות דרכים, נפילות או תקיפות, ושכיחות גבוהה של מוגבלות כרוניות שלאחר מכן. גישות טיפוליות לטיפול בפגיעה מוחית יישארו סימפטומטי לחלוטין, ובכך להגביל את האפקטיביות של טיפול prehospital, כירורגית וקריטי. זה הופך את ההשפעה החברתית והכלכלית של פגיעה מוחית חמורה במיוחד. עבור מגוון רחב של סיבות, רוב הניסויים הקליניים לא הצליח להוכיח שיפור בהתאוששות לאחר פגיעה מוחית תוך שימוש בגישות טיפוליות חדשניות. מודלים של בעלי החיים הם קריטיים לפיתוח אסטרטגיות טיפוליות חדשות לקראת שלב שבו יעילות תרופה ניתן לחזות בחולים עם ניזק מוחי. נכון לעכשיו, כמה מודלים של בעלי חיים מבוססים היטב של חבלת הראש קיימים, כוללים השפעה מבוקרת קליפת המוח 1, פגיעת הקשה נוזל 2, עיוות בקליפת המוח דינמית 3, ירידה במשקל4, ופציעת תמונה 5. מספר המודלים הניסיוניים שנוצלו כדי ללמוד היבטים מורפולוגיים, מולקולריים והתנהגותיות מסוימים של פתולוגיה הקשורים חבלת הראש. עם זאת, אין מודל חיה אחת הוא מוצלח כולו באימות אסטרטגיות טיפוליות חדשות. פיתוח של מודלים של בעלי חיים אמינים, לשחזור ובשליטה של ​​פגיעה מוחית יש צורך להעריך את התהליכים פתולוגיים המורכבים. שילוב החדשני של הטכנולוגיות החדישות ביותר מיקרוסקופי ההדמיה וכתבי ניאון גנטי מקודדים מציע הזדמנות חסרת תקדים לחקור את כל השלבים של פגיעה מוחית, הכוללים פגיעה העיקרית, הפצה של הפגיעה העיקרית, פגיעה משנית, והתחדשות. בפרט, in vivo שני הפוטונים במיקרוסקופ הוא טכנולוגיה אופטית קוי ייחודית המאפשרת הדמיה של מבנים תאיים ואפילו subcellular בשכבות בקליפת המוח עמוקה של מוח מכרסם בזמן אמת. מספר סוגים של תאים וorgaניתן הדמיה Nelles בו זמנית על ידי שילוב סמני ניאון שונים. שימוש בכלי רב עוצמה זה, אנו יכולים לחזות שינויים מורפולוגיים ופונקציונליים דינמיים בחיים מוח בתנאי פוסט טראומתיים. היתרונות של במיקרוסקופ שני פוטונים vivo בלימוד פגיעה מוחית הודגמו לאחרונה על ידי קירוב ועמיתיו 6. שימוש במודל חבלה קל המוקדים בקליפת המוח, מחברים אלה הראו כי פציעה הדנדריטים חריפה בקליפת pericontusional היא מגודרת על ידי הירידה בזרימת הדם המקומית. יתר על כן, הם הראו כי קליפת המוח נפגעת מטבולית סביב אתר חבלת ניזוק עוד יותר על ידי שלילת קוטביות מתפשטת. נזק המשני זה משפיע על מעגלים סינפטיים, מה שהופך את ההשלכות של פגיעה מוחית טראומטית חמורות יותר. כאן, אנו מציעים את השיטה של ​​זין stereotaxic עם מחט מזרק, אשר יכול להיות בשילוב עם יישום תרופה אקטואלי בו זמנית, כמודל מתקדם למוח המקומיפציעה וככלי ללמוד השלכות pathophysiological של טראומה חריפה במוח של היונקים in vivo.

<table><tbody><tr><td>פינצטה מטומטמת 2A-sa, 115 מ"מ</td><td>XYtronic</td><td>XY-2A-SA</td><td></td></tr><tr><td>30 G &frac12; במחט</td><td>BD</td><td>REF 304000</td><td></td></tr><tr><td>גוזם בעלי חיים, מכונת גילוח</td><td>Aesculap</td><td>Isis GT420</td><td></td></tr><tr><td>מיקרוסקופ משקפת</td><td>Zeiss</td><td>Stemi 2000</td><td></td></tr><tr><td>בקר טמפרטורה ביולוגי עם כרית חימום נירוסטה</td><td>Supertech</td><td>TMP-5b</td><td></td></tr><tr><td>להב מיקרוכירורגי קהה</td><td>BD</td><td>REF 374769</td><td></td></tr><tr><td>צינור בורוסיליקט עם נימה</td><td>מכשירי סאטר</td><td>BF120-69-10</td><td>לייצור פיפטות זכוכית</td></tr><tr><td>קרפרופן</td><td>פייזר</td><td>רימאדיל וטרינר</td><td></td></tr><tr><td>כלורהקסידין דיגלוקונאט</td><td>סיגמא</td><td>C9394</td><td></td></tr><tr><td>צמנט שיניים</td><td>DrguDent, Dentsply</td><td>REF 640 200 271</td><td></td></tr><tr><td>Dexamethasone</td><td>FaunaPharma</td><td>Rapidexon vet</td><td></td></tr><tr><td>מקדחות חד פעמיות</td><td>Meisinger</td><td>HP 310 104 001 001 008</td><td></td></tr><tr><td>Dulbeco' s PBS 10x</td><td>Sigma</td><td>D1408</td><td></td></tr><tr><td>Dumont #5 מלקחיים, 110 מ"מ</td><td>FST</td><td>91150-20</td><td></td></tr><tr><td>חולץ מיקרואלקטרודות אילינג</td><td>אילינג</td><td>50-2013</td><td>חולץ אנכי לייצור פיפטות זכוכית</td></tr><tr><td>משחת עיניים</td><td>נוברטיס</td><td>ויסקוטירס</td><td></td></tr><tr><td>בקרת מקדחה קדמית</td><td>Foredom</td><td>FM3545</td><td></td></tr><tr><td>ידית</td> <td>מיקרו-מנוע ForedomForedom</td><td>MH-145</td><td></td></tr><tr><td>פלטפורמת הרדמת גז לעכברים</td><td>Stoelting</td><td>50264</td><td>מורכב על מכשיר סטריאוטקסי</td></tr><tr><td>Hemostasis קולגן ספוג</td><td>Avitene, Ultrafoam BARD</td><td>Ref 1050050</td><td></td></tr><tr><td>Imaris</td><td>Bitplane</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Ketamine</td><td>Intervet</td><td>Ketaminol vet</td><td></td></tr><tr><td>Mai Tai DeepSee</td><td>לייזר ספקטרה-פיזיקה</td><td></td><td></td></tr><tr><td>מחזיק מתכת</td><td>מלקחיים Neurotar</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Microdressing, 105 מ"מ</td><td>Aesculap</td><td>BD302R</td><td></td></tr><tr><td>Microfil</td><td>WPI</td><td>MF34G-5</td><td>נימים למילוי מזרק מיקרו</td></tr><tr><td>שמן מינרלי</td><td>Sigma</td><td>M8410</td><td></td></tr><tr><td>מיקרוסקופ סריקת לייזר מולטיפוטון</td><td>Olympus</td><td>FV1000MPE</td><td></td></tr><tr><td>מזרק NanoFil 10 &mu; l</td><td>WPI</td><td>NANOFIL</td><td>מזרק המילטון</td></tr><tr><td>ספוגיות לא ארוגים 5 x 5</td><td>Molnlycke Health Care</td><td></td><td>טמפונים כירורגיים</td></tr><tr><td>דבק פוליאקרילי</td><td>Henkel</td><td>Loctite 401</td><td></td></tr><tr><td>כיסוי זכוכית עגול&nbsp;</td>מדעי <td></td><td></td><td>מיקרוסקופיה אלקטרונית</td></tr><tr><td>1.5 עובי&nbsp;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>מכשיר סטריאוטקסי לבעלי חיים קטנים</td><td>David Kopf Instruments</td><td>900</td><td></td></tr><tr><td>מתאם עכבר וחולדה ילודים</td><td>Stoelting</td><td>51625</td><td>מורכב על מכשיר סטריאוטקסי.</td></tr><tr><td>מספריים לקשתית הסטודנטים, ישר 11.5 ס"מ</td><td>FST</td><td>91460-11</td><td></td></tr><tr><td>Sulforhodamine 101</td><td>בדיקות מולקולריות</td><td>S-359</td><td></td></tr><tr><td>UMP3 משאבת מיקרו-מזרק ובקר משאבת מיקרו-מזרק מיקרו 4</td><td>WPI</td><td>UMP3-1</td><td>מיקרו-מזרק ובקר</td></tr><tr><td>Xylazine</td><td>Bayer Health Care</td><td>Rompun vet</td><td></td></tr></tbody></table>

טראומה מוחית חריפה בעכברים אחריו שני פוטונים הדמיה אורכית

Acute Brain Trauma in Mice Followed By Longitudinal Two-photon Imaging

למרות טראומה מוחית חריפה לעתים קרובות תוצאות מנזק בראש בתאונות שונות ומשפיעה על חלק ניכר מהאוכלוסייה, אין טיפול יעיל לזה עדיין. מגבלות של מודלים של בעלי חיים המשמשים כיום לעכב הבנה של מנגנון פתולוגיה. מיקרוסקופיה multiphoton מאפשרת לימוד תאים ורקמות במוח של בעלי חיים ללא פגע אורכים בתנאים פיסיולוגיים ופתולוגיים. כאן, אנו מתארים שני מודלים של פגיעה מוחית חריפה למדו באמצעות הדמיה שני פוטונים של תאים במוח התנהגות בתנאי פוסט טראומתיים. אזור במוח שנבחר הוא נפגע עם מחט חדה כדי לייצר טראומה של רוחב ועומק שבשליטת parenchyma המוח. השיטה שלנו משתמשת בזין stereotaxic עם מחט מזרק, אשר יכול להיות בשילוב עם יישום תרופה בו זמנית. אנו מציעים כי בשיטה זו יכולה לשמש ככלי מתקדם ללמוד מנגנונים תאיים של השלכות pathophysiological של טראומה חריפה במוח של יונקים <em&gt; In vivo. בסרטון הזה, אנו משלבים פגיעה מוחית חריפה עם שתי הכנות: דילול חלון וגולגולת גולגולת. כמו כן נדונונו ביתרונות ומגבלות של שני ההכנות להדמית multisession של התחדשות המוח לאחר טראומה.

יש לנו אופטימיזציה שני הליכי פעולה: 1) חלון כרוני גולגולת ו2) דלילה גולגולת, להדמיה מוחית פוסט טראומטית בעכברים מהונדסים. בתצוגה סכמטית של ההכנות הניסיוניות מוצגת באיור 1. זין טראומטי על ידי מחט פלדה של OD 0.3 מ&quot;מ (30 G) מוחל (איור 1 א) גם נקדח. חלון הכנת גולגולת מוצלחת מאפשרת הדמיה בעומקים עד 650 מיקרומטר מתחת לפני השטח pial (איור 1), ואילו דילול גולגולת נוטה להטיל מגבלה של כ 300 מיקרומטר (איור 1 ג), כפי שמו...

טראומה מוחית חריפה היא פגיעה חמורה שאין לה טיפול הולם עד כה. מיקרוסקופיה multiphoton מאפשרת לימוד אורכי התהליך של התפתחות טראומה המוחית חריפה וחיטוט אסטרטגיות טיפוליות במכרסמים. שני דגמים של טראומה מוחית חריפה למדה אצל בשני פוטונים הדמיה vivo של המוח הם הפגינו בפרוטוקול זה.

Although acute brain trauma often results from head damage in different accidents and affects a substantial fraction of the population, there is no ...

שלום, אני Michel iv, חוקר פוסט-דוקטורט במרכז למדעי העצבים באוניברסיטת הלסינקי. שלום, אני Hel Stein, סטודנט לתארים מתקדמים באוניברסיטת הלסינקי. בסרטון זה, נתאר שיטה להפעלת טראומה חריפה מקומית במוח של עכבר לצורך דימות פוטוני עוקב של התנהגות תאי המוח ומצבים פוסט-טראומטיים.פגיעה מוחית חריפה היא פתולוגיה חמורה המשפיעה על חלק ניכר מהאוכלוסייה במדינות מפותחות. מיקרוסקופיה רב-פוטונית מאפשרת לחקור תאים בהקשר רקמתי במוח של מכרסם חי תחת תנאים פיזיולוגיים ופתולוגיים. כאן אנו מתארים שיטה להשראת פגיעה מוחית חריפה המבוצעת כדקירה סטריאוטקטית באמצעות מחט של מזרק, ולאחריה דימוי דו-פוטוני של התנהגות תאי המוח והתנאים הפוסט-טראומטיים.שיטה של גרימה סטריאוטקטית לפגיעה מוקדית במוח היא כלי לחקר ההשלכות הפתופיזיולוגיות של טראומה חריפה. במוח של יונקים, ניתן להתמקד באזור ספציפי במוח ולגרום לו פגיעה באמצעות מחט חדה כדי להוציא לפועל טראומה ברוחב ובעומק הרצויים בתוך פה-רנכימה של המוח. בסרטון זה, נשתמש בפגיעה חריפה במוח בשילוב עם הליכים של יצירת חלון גולגולתי או דילול הגולגולת, ולאחר מכן נבצע הדמיית שני פוטונים של נוירונים וגליות במוח לאחר הטראומה.כל הניסויים המוצגים כאן בוצעו בהתאם לתקנות אוניברסיטת הלסינקי לניסויי בעלי חיים; העכבר הורדם באמצעות הזרקה תוך-פריטונית של ketamine ו-zine. נסרה פיסת עור כדי לחשוף את הגולגולת, ולאחר מכן קובע בעזרת מוטות אוזניים על שולחן חימום המחובר למניפולטור הסטראאוטקטי. מזרק עם מחט פלדה בקוטר 0.3 millimeter מקובע על מערכת המיקרו-הזרקה.הסדרה להזרקה מיקרוסקופית מאפשרת לנו להחיל דקירה טראומטית לאזור מוגדר במוח; באמצעות מיקרוסקופ בינוקולרי, אנו מאתרים את נקודת ה-breg על הגולגולת. אנו מזהים את אזור העניין באמצעות קואורדינטות סטריאוטקטיות. אנו קודחים את הגולגולת בעדינות ובזהירות בנקודה המסומנת באמצעות מקדחה כירורגית במהירות גבוהה.אנו מחדירים את המחט אל תוך הבאר שנקדחה ומטביעים אותה לזמן קצר לתוך המוח לעומק של 0.5 עד שני מילימטרים, החל מגובה קרקעית הבאר. יתרון בולט של שיטה זו הוא היכולת להזריק DI או תרופות לאותה באר קטנה, ובכך להחדיר תמיסות בדיוק לאתר הפגיעה. למסירת תמיסות לקורטקס, אנו משתמשים במזרק מיקרו עם בקר אלקטרוני ובמזרק של 10 µL המחובר למניפולטור סטראוטקטי.כאשר קצה הפ pipette מזכוכית נוגע במשטח המוח, נטמיע אותו פנימה ב-0.5 עד מילימטר אחד נוסף. לאחר מכן, נשתמש בבקר המזרק המיקרוסקופי (micro injector controller) כדי להזריק 0.5 עד שני microliters של תמיסת D או תרופה לתוך המוח בקצב של חמישה nanoliters לשנייה. לאחר מכן, נקדח בעדינות את העצם מסביב לאתר הפגיעה ונסיר את החלק העגול של הגולגולת.פני השטח של המוח נשטפים עם בופר קורטקס וזכוכית כיסוי עגולה ודקה מונחת מעל פתח הגולגולת. זכוכית הכיסוי נחתמת עם דבק פוליאקרילאמיד ומחזיק פלדה מודבק מעל זכוכית הכיסוי. כדי להבטיח היצמדות חזקה של חלון הגולגולת לגולגולת, מניחים מלט דנטלי מסביב למחזיק.העכבר המורדם מותקן על מיקרוסקופ הפוטונים הכפולים, ותאים מדויקים באתר הפגיעה בתוך המוח החי. תמונה זו צולמה שלוש שעות לאחר הפגיעה במוח. אתר הפגיעה מוצג במוחו של עכבר טרנסגני המבטא GFP תחת הפרומוטור GFAP באסטרוציטים.בנוסף לאסטרוציטים המבטאים GFP בצבע ירוק, תאי אסטרוציטים רבים נצבעים באדום על ידי הזרקת sulfur rumine 1 0 1. הסיבים הלבנים מייצגים את אות יצירת ההרמונייה השנייה (second harmonic generation), הממחיש ככל הנראה את מבני הסיבים במטריקס החוץ-תאי. יצירת ההרמונייה השנייה מתגלה ככלי בעל ערך לתיחום אתר הפגיעה.האות נפלט על ידי מבנים שאינם סימטריים מרכזית, כגון סיבי חלבון, ואינו דורש כל צביעה חיצונית. אות יצירת ההרמוניה השנייה הוא העז ביותר על פני השטח של המוח ואינו מפעפע לעומק פהומה של המוח (brain parenchyma). בתמונה זו, ניתן לראות הצטברות של מיקרוגליה מופעלת באתר הפגיעה.התאי המיקרוגליאליים מוצגים בירוק והיצירה ההרמונית השנייה באפור. בקרבת אתר הפגיעה, מיקרוגליה מופעלת מציגה מורפולוגיה אופיינית עם מעט שלוחות מסתעפות בזמן הכנת פני הגולגולת. השתמש בקואורדינטות סטריאוטקטיות כדי לאתר את אזור המוח שיוצג בתמונה וסמנו בעט.הימנע מבחירת אזורי עניין הממוקמים ישירות מעל ה-cranial sutures, כיוון שהגולגולת פחות יציבה באזורים אלה וכיוון שכלי דם גדולים הנמצאים מתחתיהם בעטיפת המוח (meninges) יפגעו באיכות הדימות. מקם את מחזיק הגולגולת המצופה בדבק מעל אזור העניין בגולגולת החיה תוך הפעלת לחץ מינימלי. לאחר מכן, מרח צמנט דנטלי מסביב למחזיק והמת כחמש דקות עד שמחזיק הגולגולת יהיה מודבק היטב לגולגולת.שטפו את פתח מחזיק הגולגולת מספר פעמים עם PBS כדי להסיר את שאריות הדבק שלא פולימרו. תחת מיקרוסקופ בינוקולרי, דקקו שטח מעגלי של גולגולת, בדרך כלל בקוטר של 0.5 עד 1.5 מילימטרים, מעל האזור הרלוונטי. גולגולת העכבר מורכבת משתי שכבות דקות של עצם דחוסה ושכבה עבה של עצם ספוגית שנמצאת ביניהן.העצם הספוגית מכילה חלליים זעירים המסודרים במעגלים קונצנטריים ותעלות דמויות צינוריות (canaliculi) רבות המכילות כלי דם; בעת הדילול, הסר את השכבה החיצונית של העצם הדחוסה ואת רוב העצם הספוגית. באמצעות מקדח מיקרו במהירות גבוהה, השתמש באוויר דחוס במהלך הקידוח כדי להסיט את שאריות העצם. בצע את הקידוח לסירוגין כדי למנוע התחממות יתר של העצם כתוצאה מחיכוך.קררו את החלק המשעמם בנוזל, שנשמר בטמפרטורת החדר, ומרחו מדי פעם את בופר הקורטקס באזור הדילול כדי לעקוב אחר החום. במהלך תהליך הדילול עשוי להתרחש דימום קל מכלי הדם העוברים דרך העצם הספוגית. דימום זה ייסתיים בדרך כלל באופן ספונטני תוך מספר דקות.השתמשו בדימות יצירת הרמוניה שנייה (second harmonic generation imaging) כדי לוודא שרוב רקמת העצם הספוגית הוסרה. בשלב זה, עובי הגולגולת עדיין לא צריך להיות פחות מ-50 micrometers. טבלו את הגולגולת בטיפה של בופר קליפה (cortex buffer) והמשיכו בהליך דילול הגולגולת באמצעות להב מיקרו-כירורגי או מקדח גימור מיקרוסקופי כדי להשיג דגימה דקה וחלקה מאוד, בעובי של כ-20 micrometers ובקוטר של כ-700 micrometers. במהלך השלב הסופי של תהליך הדילול, בחנו את הדגימה שוב ושוב באמצעות דימות יצירת הרמוניה שנייה.ניתן לדמיין את האזור הנבחר לפני ואחרי גרימת הפגיעה. יש לדמיין מספר אזורים שונים של האזור הדק כדי לשלוט בארטפקטים אפשריים שנגרמו מהניתוח בעקבות גרימת הפגיעה. מקמו את המחט מעל האזור הדק.וודאו שאין כלי דם גדולים מתחת לאתר. החדירו את המחט אל תוך המוח בעומק של 0.5 עד שני מילימטרים כלפי מטה, בהתאם לקואורדינטות של נקודת הדקירה. הוציאו את המחט ועצרו דימומים המופיעים לאחר הפגיעה המוחית החריפה.בעזרת טמפון המסטטי, המתן עד להיווצרות קרישי דם ועד להפסקת הדופק באתר הפגיעה. ניתן להזריק לפתח הפגיעה תמיסות המכילות, למשל, sulfur Rumine 1 0 1 או צבעים אחרים, באופן דומה לזה שהודגם לעיל בהכנת חלון הגולגולת. בניגוד לחלון הגולגולת בהכנה של דילול הגולגולת, ניתן לגשת לאתר הפגיעה שוב ושוב לצורך הולכת תרופות וצבעים.שמירה על סטריליות בכל הפעולות מסייעת לשמור על שקיפות האזור שדוקק על ידי מניעת דלקת. כאן ניתן לראות את אתר הפגיעה שצולם לאחר דיקוק הגולגולת. בתמונה בצד שמאל, ניתן לראות את צד הפגיעה מוקף בדנדריטים של נוירונים קורטיקליים המסומנים ב-YFP, 20 דקות לאחר הטראומה.התמונה מימין מייצגת את אותו אזור במוח של אותה חיה חמישה ימים לאחר הטראומה. בתמונה זו ניתן לראות דוגמה נוספת של מיקרוסקופיית פוטונים כפולים של המוח. לאחר דילול הגולגולת, ניתן לראות את העצם באמצעות אות של יצירת הרמונית שנייה המופיע באפור.בפאנל השמאלי, המיקרוגליה מוצגת בירוק. בהסדרה ניסויית זו, ניתן לצפות במיקרוגליה מתחת לעצם סביב אתר הפגיעה, כפי שמוצג בפאנל הימני. במחקר הנוכחי, השתמשנו הן בחלון גולגולתי כרוני והן בהכנות של דילול עצם הגולגולת כדי לחקור את התנהגות התאים בתנאים פוסט-טראומטיים בתוך המוח החי.לשתי השיטות יש יתרונות ומגבלות מסוימים. החלון הגולגולתי הכרוני מספק רזולוציה טובה יותר, חדירה עמוקה יותר לרקמת המוח ונוחות של מספר מפגשי דימות. מאידך, הליך דילול הגולגולת נוטה פחות לגרום לדלקת באתר הדימות ומאפשר יישומים חוזרים של תרופות וצבעים.

acute-brain-trauma-in-mice-followed-by-longitudinal-two-photon-imaging

Research

JoVE Journal

Medicine

רפואה

בחומר וידאו משלים זה, אנו מראים פרוטוקול עבור...

הדמיה כרונית של עכבר-Visual Cortex שימוש ההכנה סחוט הגולגולת

סרטון זה מדגים העברה של פגיעה מוחית טראומטית (TBI) בעכברים. לאחר חשיפת הגולגולת, אתר TBI מסומן. לאחר מכן העכבר ממוקם מתחת להתקן TBI. הפגיעה מועברת על ידי הרמת מוט המתכת ומאפשרת לו ליפול בחופשיות על המשפיע, שנמצא במגע עם הגולגולת.

העברת פגיעה מוחית טראומטית במוח עכבר

מקור: Maruoka, H., et. al. {{}}הדמיה סימולטנית של דינמיקת מיקרוגליה ופעילות עצבית בעכברים ערים. J. Vis. exp. (2022) סרטון זה מציג הליך מיקרוסקופיה דו-פוטוני להדמיית פעילות עצבית ודינמיקה של מיקרוגליה בעכבר ער במהלך גירוי חזותי, תוך הדגשת מעברי סידן ואינטראקציות תאיות.

הדמיה סימולטנית של דינמיקת מיקרוגליה ופעילות עצבית בעכבר ער

הספורטאים סופגים כמה מאות פציעות מוחיות טראומטיות קלות (mTBI) / זעזוע מוח מדי שנה; עם זאת, את התוצאות של אלה על המוח הוא הבין היטב. לכן, מודל החיות של mTBI יחיד וחוזר על עצמו באופן עקבי משכפל סימפטומים קליניים רלוונטיים מספק את האמצעים לקדם את המחקר של mTBI ו זעזוע מוח.

דגם עכבר של פגיעה בודדת וחזרה קלה של פגיעה מוחית טראומטית

שיטה זו מתארת הכנה כרונית המאפשרת גישה אופטית להיפוקמפוס של עכברים חיים. הכנה זו יכולה לשמש לביצוע הדמיה אופטית לאורך של הפלסטיות הקונסטרוקטיבית העצבית ופעילות-מעורר פלסטיות הסלולר במשך תקופה של מספר שבועות.

אורך שני-פוטון הדמיה של CA1 היפוקמאל בעכברים חיים

פרוטוקול זה מתאר טכניקת השרשה כרונית חלון הגולגולת שניתן להשתמש בהם עבור הדמיה האורך של מבנים נוירווליו-כלי דם, אינטראקציות, ותפקוד בתנאים בריאים ונגועים. היא משמשת כחלופה משלימה לגישת הדימות הtranscranial, שבזמן הרצוי לעתים קרובות, יש כמה מגבלות קריטיות.

מיפוי המוח מדויק לבצע חוזרות ונשנות של הדמיה Vivo של נוירודינמיקה החיסונית בעכברים

מאמר זה מתאר שיטה לתצפית כרונית in vivo של תאי מיקרוגליה במנוחה בהיפוקמפוס עכבר CA1 באמצעות ניתוח מבוקר מדויק ומיקרוסקופ שני פוטונים.

ב Vivo הדמיה כרונית של שני פוטונים של תאי מיקרוגליה בהיפוקמפוס העכבר

הפרוטוקול מתאר פגיעה מוחית טראומטית קלה במודל עכבר. בפרט, פרוטוקול שלב אחר שלב לגרימת פגיעת ראש סגורה קלה בקו האמצע ואפיון מודל בעלי החיים מוסבר במלואו.

מודל ראש סגור מבוקר אלקטרומגנטי של פגיעה מוחית טראומטית קלה בעכברים

מחקר זה מדגים העברה של פגיעה מוחית טראומטית חוזרת ונשנית לעכברים והשתלה סימולטנית של חלון גולגולתי לצורך הדמיה תוך-חיונית עוקבת של EGFP המתבטא בנוירונים באמצעות מיקרוסקופ של שני פוטונים.

הדמיה תוך חיונית של ביטוי חלבון פלואורסצנטי בעכברים עם פגיעה מוחית טראומטית בגולגולת סגורה וחלון גולגולת באמצעות מיקרוסקופ דו-פוטוני

Pseudofracture, מודל Murine לשחזור הטראומה שרירים ושלד סטרילי, מאפשרת הערכה של המנוח פוסט טראומטית התגובות טווח החיסונית. מאמר זה מתאר את נוהלי ביצוע של צעד אחר צעד את המודל, כולל פוטנציאל שילובים מודל ניסיוני כדי לאפשר לימוד של טראומה מרובים.

Pseudofracture: טראומה חריפה היקפיים דגם רקמות

למדו שיטה להפעלת טראומה מוחית חריפה בעכברים באמצעות דקירה סטריאוטקטית עם מחט סרינג', וצפו בהתנהגות תאי המוח בזמן אמת באמצעות הדמיה אורכית של שני פוטונים.

טראומה מוחית חריפה בעכברים אחריו שני פוטונים הדמיה אורכית

גלה סרטונים נוספים