Electrospun סיבי פיגומים של פולי (גליצרול-dodecanedioate) להנדסה עצבית רקמות מתאי גזע עובריים בעכבר

הליך זה, מייצר אלקטרוס סיבים ארוכים מסובבים מפולימר מתכלה חדש בשם פולי גליצרול Dote Cano eight. ראשית הגדר את הקולט המעוצב החדש והכין את התמיסה הפולימרית לספינינג אלקטרו, באמצעות מזרק ומשאבה, העביר את התמיסה לקולט. לאחר מכן העבירו את מחצלת הסיבים המתקבלת לצלחת תרבות לצורך קישור צולב.

לאחר מכן זרע תאי גזע עובריים של עכבר על הסיבים החתוכים. בסופו של דבר, התוצאות יכולות להוכיח שתאי גזע עובריים של עכבר יכולים לשרוד ולהתמיין לתאים עצביים על פיגומי הסיבים. בסרטון של היום, הראינו לכם כיצד להכין את החומר הביולוגי מייצור תאי הסינכרון, ולבסוף להשתמש בסיבים האלקטרו-טוואן האלה לתרבית תאים.

במיוחד כאשר אנו משלבים עם התא שמקורו בתאי פולי וכתם. ייתכן שיהיה להם יישום חשוב מאוד בעתיד להעברת התאים וליצירת רקמה מתפקדת. רקמות מראות היום שהיא תדגים לך הליך נורא.

היא הדבר הכי טוב במעבדה שלי. חותכים נייר אלומיניום לחתיכה מלבנית. מקפלים את החלק המלבני לרצועה מלבנית ומחברים אותו בניצב לצלחת מתכת שטוחה בעזרת סרט.

אורך הרצועה תלוי בגודל מחצלת הסיבים הדרושה לתמיסה הפולימרית. ערבב גליצרול ועשה חומצה דיאית דקאן ביחס מולארי אחד לאחד ב-120 מעלות צלזיוס למשך 100 שעות. כדי להשיג פולי גליצרול, האם פולימר דקנואי ממיס תחמוצת פוליאתילן וג'לטין ב-65% אתנול עם יחס משקל של 1.5 עד שלושה עד 95.5 בצינור של 15 מיליליטר.

מהדקים את המכסה ומחממים את התערובת בתנור בחום של 60 מעלות צלזיוס למשך שעה, תוך ערבוב כל 15 דקות עד שתמיסת הבסיס הומוגנית. לספינינג אלקטרו, מערבבים את פולימר ה-PGD ואת תמיסת הבסיס. ביחס משקל של ארבע עד שש, הוסיפו לתערובת 0.1% ריבופלבין וערבבו היטב.

הזינו את התמיסה הפולימרית למזרק סטנדרטי של חמישה מיליליטר עם מחט נירוסטה קהה בגודל 18. לאחר מכן הכנס את המזרק למשאבת מזרק. חבר את הכבל המוארק של כרך גבוהtagמקור מתח ללוחית המתכת ואת הכבל הטעון חיובית למחט.

כמו כן, התאם את המרחק בין המחט לרדיד האלומיניום. רצועה ל -15 סנטימטרים. כעת הנח את משאבת המזרק בזווית של כ-15 מעלות עם האופקי כדי למנוע הצטברות של הסיבים בקדמת הרצועה.

הפעל את משאבת המזרק והתאם את קצב הזרימה של המשאבה ל-0.6 מיליליטר לשעה. הפעל את כרך גבוהtagמקור החשמל והגדר את מתח ההפעלה ל-14.6 קילו-וולט. לאחר השלמת האיסוף, חשוף את שטיח הסיבים לאור UV למשך 60 דקות של קישור צולב.

העבירו את מחצלת הסיבים מרצועת נייר האלומיניום לצלחת פטרי של 100 מילימטר. חותכים את מחצלת הסיבים לחתיכות עגולות באותו גודל בעזרת הלהב הכירורגי ומניחים את החלקים לצלחת של 24 בארות. לאחר מכן חשוף את הצלחת לאור UV לעיקור נוסף של 20 דקות לתאים לפני הטיפול.

טבלו דגימות סיבים במיליליטר אחד של מי מלח עם פוספט ודגרו על 37 מעלות צלזיוס למשך הלילה למחרת. שאפו את ה-PBS בזהירות. הוסף מיליליטר אחד של מדיום התמיינות לכל באר ודגירה בחום של 37 מעלות צלזיוס למשך שלוש שעות.

לאחר שאיבת מדיום ההתמיינות מוסיפים בזהירות 0.2 מיליליטר ג'ל מאטרי לכל דגימת סיבים ודוגרים בחום של 37 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות. הסר בזהירות את עודפי ג'ל המטרי מכל אחד מהם. יש לשטוף היטב פעם אחת עם שני מיליליטר של מדיום בידול.

הוסף מיליליטר אחד של טאס לצלחת תרבית תאי גזע עובריים של עכבר לאחר 10 דקות, 37 מעלות צלזיוס. כאשר תאי ה-MES מנותקים, הוסף ארבעה מיליליטר של מדיום התמיינות. אסוף את תאי ה-MES הצפים לצנטריפוגה של צינור 15 מיליליטר ב-400 Gs למשך חמש דקות.

השעו מחדש את התאים הגלולים בארבעה מיליליטר של התמיינות. בינוני. העבירו 200 מיקרוליטר של מתלה התאים לצינור של 15 מיליליטר והוסיפו 10 נפחי בידול. בינוני. העבר 15 מיקרוליטר של תרחיף התאים המדולל לתא על ציטומטר ההמו.

עם החלקת כיסוי במקום, ספרו את התאים בריבוע המרכזי של מילימטר אחד ואת ארבעת ריבועי הפינה של ציטומטר ההמו. עכשיו יורדים חמש פעמים 10 לרביעי. תאי ES של עכבר לאט לאט באמצע דגימות הסיבים.

הוסף מיליליטר אחד של מדיום התמיינות לכל באר ותרבית ב-37 מעלות צלזיוס ו-5% פחמן דו חמצני לחיבור תאים. צמיחה ובידול. מלאו את המיליליטר האחד של מדיום הבידול כל יומיים.

כדי למדוד את כדאיות התא, שאפו את המדיום הישן מכל באר והוסיפו מיליליטר אחד של אחד ל-10 דילול אברה ומגיב פלואורסצנטי בתרבית. דגירה בינונית בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס ו-5% פחמן דו חמצני למשך ארבע שעות מוגנת מפני אור ישיר. לאחר מכן העבירו דגימות משולשות של 100 מיקרוליטר מכל באר לצלחת של 96 בארות ומדדו תמונות מיקרוסקופ אלקטרונים סורקות פלואורסצנטיות שימשו להערכת המורפולוגיה של סיבים מסובבים אלקטרוניים.

הקוטר של סיבים אלה העשויים מריכוז PGD של 40% נמצא בטווח המיקרומטר כאן. תאי גזע עובריים של עכברים מובחנים תורבבו במשך שלושה ימים על הסיבים ומיקרוסקופיה קונפוקלית שימשה להדמיה של חלבון פלואורסצנטי ירוק מבוטא. המספר המוגבר של תאים פלואורסצנטיים ירוקים ביום השישי מצביע על כך שפיגומי הסיבים יכולים לתמוך הן בהידבקות התאים והן בהתפשטות התאים.

מדידות Zu ופלואורסצנטיות הראו כי ציפוי עם מטריג'ל ולמינין הביא לכדאיות תאים שווה ערך ושגשוג גבוה יחסית. עוצמת השטף וסמני התאים העצביים כומתו על ידי PCR בזמן אמת ביום הראשון. רוב תאי ה-MES שגודלו על סיבים ביטאו את סמני הפלוריפוטנטיות.

OCT ארבע ננו ו-SOX שתיים. תת-קבוצה מינורית ביטאה את סמני תאי הגזע העצביים PAC 6 ו-neston. לאחר שבועיים בתרבית, הייתה עלייה ברמות הביטוי של כמה סמני תאים עצביים, כגון מפה 2 ו-DCX, כמו גם סמן אוליגודנדרוציטים אוליגו 1 וסמן אסטרוציטים.

GFAP פעם אחת התמקצע. טכניקה זו יכולה להיעשות תוך שעתיים-שלוש אם היא מבוצעת כראוי.