Name: Electrospun סיבי פיגומים של פולי (גליצרול-dodecanedioate) להנדסה עצבית רקמות מתאי גזע עובריים בעכבר (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-06-18T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 3 s
Description: למד לייצר סיבי PGD באלקטרוספינינג לתמיכה בגידול ותמיון תאי גזע עובריים של עכבר לתאי עצב. שיטה זו מציגה פוטנציאל ליישומים בהנדסת רקמות וברפואה רגנרטיבית.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

עבודה זו נערכה באמצעות המתקנים של ביו רפואית הפקולטה להנדסה באוניברסיטה הבינלאומית בפלורידה.

1. התקנת Electrospinning אספן <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חותכים את רדיד האלומיניום לתוך חתיכה מלבנית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מקפלים את החתיכה מלבנית לרצועה מלבנית, ולצרף אותו בניצב ללוחית מתכת שטוחה עם קלטת (איור 1). הערה: גודלו של שטיח הסיבים תלוי באורך וברוחב הרצועה. כך, ניתן להתאים את ממדי הרצועה לפי צורך. </li></ol> 2. פולימרית פתרון הכנה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מערבבים גליצרול וחומצת dodecanedioic (DDA) ב1:1 טוחנת בכוס ב-C ° 120 ל100 שעה להשיג פולימר PGD. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ממיסים פולי (אתילן אוקסיד) (PEO) וג&#39;לטין באתנול 65% עם יחס משקל של 1.5:3:95.5 בצינור 15 מיליליטר, להדק את הכובע ולחמם את התערובת בתנור ב 60 מעלות צלזיוס במשך שעה 1 עם ערבוב עד שזה הופך פתרון הומוגני (פתרון בסל). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לelectrospinning, לערבב פולימר PGD והפתרון הבסיסי ב04:06 יחס משקל. שים לב: יש ריכוז PGD דוהשפעה גרם בקוטר סיבים. 30% -50% PGD אחוזים מקובל לייצר סיבים ארוכים יותר מ -5 ס&quot;מ עם קוטר סיבים מוגבר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוספת ריבופלאבין 0.1% לפתרון פולימריים ומערבבים היטב. </li></ol> 3. Electrospinning <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להאכיל את פתרון פולימרים לתוך מזרק סטנדרטי 5 מיליליטר עם 18 G הקהה מחט פלדה אל חלד. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכנס את המזרק לתוך משאבת מזרק. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צרף את ההובלה מקורקעת של מקור כוח במתח גבוה ללוחית המתכת ולהוביל מטען החשמלי החיובי למחט. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> התאם את המרחק בין המחט ורצועת רדיד האלומיניום ל15 סנטימטר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מקם את משאבת המזרק בזווית של כ -15 ° ביחס לאופק כדי למנוע הצטברות של הסיבים בחלק הקדמי של הרצועה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפעל את משאבת המזרק ולהתאים את קצב הזרימה של המשאבה ל0.6 מיליליטר / שעה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפעל את מקור החשמל במתח הגבוה ולהגדיר את מתח ההפעלה ל14.6 KV. </li></ol> 4.עיבוד סיבים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר האיסוף יושלם, לחשוף את מחצלת סיבים לאור UV במשך 60 דקות לקישור צולב. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העבר את מחצלת הסיבים מרצועת רדיד האלומיניום לצלחת פטרי 100 מ&quot;מ, ותחשוף אותה לאור UV לעוד 20 דקות לעיקור. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בארון בטיחות ביולוגי, לחתוך את מחצלת סיבים לחתיכות עגולות באותו הגודל עם להב כירורגים ומניחים את החתיכות לתוך צלחת 24 גם. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לטיפול מראש זריעת תאים, לטבול את דגימות סיבים ב 1 מיליליטר של בופר פוספט (PBS) ולדגור על 37 מעלות צלזיוס למשך לילה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ביום שלאחר מכן, לשאוב PBS בזהירות, להוסיף 1 מיליליטר של מדיום התמיינות (DMEM/F12, N2, וFGF2) (ראה מתכון בטבלת חומרים) זה טוב ולדגור על 37 מעלות צלזיוס במשך 3 שעות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בינוני בידול לשאוב בזהירות, להוסיף 0.2 מיליליטר של matrigel לכל דגימת סיבים ולדגור על 37 מעלות צלזיוס במשך 30 דקות. שים לב: גם Laminin יכול לשמש לציפוי סיבים. הוספת 0.2 מיליליטר של 20 laminin מיקרוגרם / מיליליטרלסיבים ו דגירה בטמפרטורת חדר למשך 3 שעות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מוציא בזהירות matrigel העודף מכל טוב. לשטוף עם 2 מיליליטר של מדיום בידול פעם אחת. שים לב: דגימות הסיבים מוכנות לתרבית תאים. </li></ol> 5. נייד זריעה בסיבים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 1 מיליליטר של Accutase לצלחת תרבית תאי MES ודגירה של 10 דקות ב 37 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר 10 דקות, תאי MES מנותקים ממנת התרבות. הוסף 4 מיליליטר של מדיום בידול לצלחת. לאסוף את תאי MES צף לתוך צינור 15 מיליליטר ותאי פיפטה מעלה ומטה כדי לשבור מושבות (כ 15x). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צנטריפוגה ב XG 400 למשך 5 דקות ותאים מחדש להשעות ב4 מיליליטר של מדיום בידול. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ספירת התאים באמצעות hemocytometer. העבר 200 μl של ההשעיה התא לתוך צינור 15 מ&quot;ל ולדלל אותו 10x עם מדיום בידול. העבר 15 μl של ההשעיה התא המדולל לתא על hemocytometer עם כיסוי להחליק במקום. רוזןהתאים בכיכר מרכז 1 מ&quot;מ וארבעת ריבועי פינת hemocytometer מתחת למיקרוסקופ. הערה: נייד לכל מיליליטר = הספירה לכל מ&quot;ר בממוצע x גורם לדילול x 10 4 </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מקום כ 5 x 10 4 תאי MES על כל טוב. לאט לאט שחרר את ההשעיה התא על אמצע דגימות סיבים, במקום מחליק לצד השני של הבאר, כדי למנוע מפתרון הניקוז מחוץ למזרן הסיבים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 1 מיליליטר של מדיום בידול היטב כל אחד, ולשמור את הצלחת באינקובטור ב 37 ° C ו 5% CO 2 כדי לאפשר מצורף תאים, גדילה והתמיינות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשאוב את המדיום הישן מכל טוב ולהחליף עם 1 מיליליטר של מדיום בידול טרי בכל יום אחר. </li></ol> 6. כדאיויות תא <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשאוב את המדיום הישן מכל טוב. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מערבבים 1/10 ה נפח של מגיב הקרינה Resazurin עם מדיום התרבות ולהוסיף 1 מיליליטר היטב כל אחד. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Incubאכלתי ב37 ° C ו 5% CO 2 למשך 4 שעות, מוגן מפני אור ישיר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר 4 שעות, להעביר 100 μl 3x של המגיב מכל טוב לצלחת 96 היטב, ולאחר מכן הדגימות מוכנות להימדד על ספקטרופוטומטר הקרינה באמצעות הגדרות מסננים 560EX nm/590EM. </li></ol> 7. Real Time PCR <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר 14 ימים של תרבות, להוסיף למאגר תמוגה לדגימות ולבודד RNA המוחלט מהתאים בדגימות הסיבים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש 4 μl של רנ&quot;א הכל לסנתז cDNA ב20 קשקשי תגובת μl ידי שעתוק לאחור. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מכין את תערובת PCR תגובה בכל צינור אופטי: 10 μl מיקס מאסטר (2x), 0.2 צבע μl, 8 המים Nuclease ללא μl, cDNA μl 1, ופריימר μl 1 (צבעי יסוד המשמשים במחקר זה מופיעים בטבלה 1). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להגדיר את תכנית ה-PCR: א. דקות 95 C ° 2:20, מחזור ב 1. דקות 95 ° C 3 שניות → 60 ° C 1, 40 מחזור ג. 95 ° C שניות 15, ד המחזור 1. 60 C ° 1דקות, דואר מחזור 1. 95 ° C שניות 15, מחזור 1. בחר את שיטת C T השוואתית כדי לקבוע את רמות ביטוי הגנים יחסית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר PCR הוא סיים, לנתח את התוצאות בזמן אמת PCR עם תוכנת StepOne ולייצא את התוצאות ל-Excel. </li></ol>

<ol><li>Migneco, F., Huang, Y. -C., Birla, R. K., Hollister, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Poly+%28glycerol-dodecanoate%29%2C+a+biodegradable+polyester+for+medical+devices+and+tissue+engineering+scaffolds%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Poly (glycerol-dodecanoate), a biodegradable polyester for medical devices and tissue engineering scaffolds.</a> Biomaterials. 30, 6479-6484 (2009).</li>
<li>Reneker, D. H., Yarin, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electrospinning+jets+and+polymer+nanofibers%5BTitle%5D)+AND+%22Polymer%22%5BJournal%5D)">Electrospinning jets and polymer nanofibers.</a> Polymer. 49, 2387-2425 (2008).</li>
<li>Wang, Y., Ameer, G. A., Sheppard, B. J., Langer, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+tough+biodegradable+elastomer%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+biotechnology%22%5BJournal%5D)">A tough biodegradable elastomer.</a> Nature biotechnology. 20, 602-606 (2002).</li>
<li>Panunzi, S., De Gaetano, A., Mingrone, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Approximate+linear+confidence+and+curvature+of+a+kinetic+model+of+dodecanedioic+acid+in+humans%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Physiology-Endocrinology+And+Metabolism%22%5BJournal%5D)">Approximate linear confidence and curvature of a kinetic model of dodecanedioic acid in humans.</a> American Journal of Physiology-Endocrinology And Metabolism. 289, (2005).</li>
<li>Park, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Apparatus+for+preparing+electrospun+nanofibers%3A+designing+an+electrospinning+process+for+nanofiber+fabrication%5BTitle%5D)+AND+%22Polymer+Internationa+l%22%5BJournal%5D)">Apparatus for preparing electrospun nanofibers: designing an electrospinning process for nanofiber fabrication.</a> Polymer Internationa l. 56, 1361-1366 (2007).</li>
<li>Barnes, C. P., Sell, S. A., Boland, E. D., Simpson, D. G., Bowlin, G. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nanofiber+technology%3A+designing+the+next+generation+of+tissue+engineering+scaffolds%5BTitle%5D)+AND+%22Advanced+drug+delivery+reviews%22%5BJournal%5D)">Nanofiber technology: designing the next generation of tissue engineering scaffolds.</a> Advanced drug delivery reviews. 59, 1413-1433 (2007).</li>
<li>Li, W. -J., Mauck, R. L., Tuan, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electrospun+nanofibrous+scaffolds%3A+production%2C+characterization%2C+and+applications+for+tissue+engineering+and+drug+delivery%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biomedical+Nanotechnology%22%5BJournal%5D)">Electrospun nanofibrous scaffolds: production, characterization, and applications for tissue engineering and drug delivery.</a> Journal of Biomedical Nanotechnology. 1, 259-275 (2005).</li>
<li>Pham, Q. P., Sharma, U., Mikos, A. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electrospinning+of+polymeric+nanofibers+for+tissue+engineering+applications%3A+a+review%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+engineering%22%5BJournal%5D)">Electrospinning of polymeric nanofibers for tissue engineering applications: a review.</a> Tissue engineering. 12, 1197-1211 (2006).</li>
<li>Lim, S. H., Mao, H. -Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electrospun+scaffolds+for+stem+cell+engineering%5BTitle%5D)+AND+%22Advanced+drug+delivery+reviews%22%5BJournal%5D)">Electrospun scaffolds for stem cell engineering.</a> Advanced drug delivery reviews. 61, 1084-1096 (2009).</li>
<li>Lowery, J. L., Datta, N., Rutledge, G. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+fiber+diameter%2C+pore+size+and+seeding+method+on+growth+of+human+dermal+fibroblasts+in+electrospun+poly+%28epsilon-caprolactone%29+fibrous+mats%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Effect of fiber diameter, pore size and seeding method on growth of human dermal fibroblasts in electrospun poly (epsilon-caprolactone) fibrous mats.</a> Biomaterials. 31, 491-504 (2010).</li>
<li>Tillman, B. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+in+vivo+stability+of+electrospun+polycaprolactone-collagen+scaffolds+in+vascular+reconstruction%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">The in vivo stability of electrospun polycaprolactone-collagen scaffolds in vascular reconstruction.</a> Biomaterials. 30, 583-588 (2009).</li>
<li>Ju, Y. M., Choi, J. S., Atala, A., Yoo, J. J., Lee, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bilayered+scaffold+for+engineering+cellularized+blood+vessels%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Bilayered scaffold for engineering cellularized blood vessels.</a> Biomaterials. 31, 4313-4321 (2010).</li>
<li>McCullen, S. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+situ+collagen+polymerization+of+layered+cell-seeded+electrospun+scaffolds+for+bone+tissue+engineering+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+Engineering+Part+C%3A+Methods%22%5BJournal%5D)">In situ collagen polymerization of layered cell-seeded electrospun scaffolds for bone tissue engineering applications.</a> Tissue Engineering Part C: Methods. 16, 1095-1105 (2010).</li>
</ol>

אין ניגודי האינטרסים הכריזו.

המגבלות של אספנים פשוטים או המורכבות של מסתובב אספנים שכיום משמשים לelectrospinning להגדיל את המגבלה של קבלת האורך הרצוי וגודל של שטיח סיבים עבור יישומים מסוימים. בנוסף, העברת סיבים מאספן הקרקע למנת התרבות או מצעים אחרים היא אתגר 5. בדו&quot;ח זה, אספן חדש תוכנן, עשוי בפשטות על ידי הצמדת רצועת רדיד אלומיניום לאספן מקורקע, היה יכול לקבל את מחצלות בגודל סיבים גדולות ל10 סנטימטר על 20 סנטימטר בכל פעם. איורים 1 ו -2 ממחישים את ההגדרה סכמטית...

Electrospinning הוא אחת מהשיטות העיבוד היעילות לייצר פיגומי גודל סיבי מיקרו לננומטר. העיקרון הבסיסי של electrospinning כרוך קונוס טיילור של פתרון שמתקיים בפתח של מחט על ידי הפעלת מתח גבוה בין קצה המחט ואספן מקורקע. כאשר הדחייה אלקטרוסטטית בפתרון מתגברת מתח הפנים, סילון נוזל טעון הוא נפלט אל מחוץ לקצה המחט, עובר דרך האוויר עם אידוי ממס, ולבסוף הופקד על האספן מקורקע. משאבת המזרק מספקת זרימה רציפה של פתרון המתעוררים מspinneret ועותקים ובכך מרובים של סיבי electrospun יכולים להיות מפוברק בתוך תקופה קצרה של זמן. במהלך עוזב spinneret להגיע לאספן, הסילון הטעון יעבור מתיחה ומצליף על פי מספר הפרמטרים הכוללים את מתח הצמיגות ופני שטח של הפתרון פולימריים, electrostatiכוח ג בפתרון, ואת האינטראקציה של השדה החשמלי החיצוני, וכו &#39;2. בתהליך electrospinning, אספן משמש כמצע מוליך שבו יכולים להיות מופקדים סיבי מיקרו לננומטר. במחקר זה, סוג חדש של אספן סיבים נועד להשיג מחצלות סיבים עם הגודל הרצוי (רוחב x אורך). באופן מסורתי, רדיד אלומיניום משמש כאספן אבל קשה להעביר את הסיבים מהמשטח השטוח למצע אחר. הקושי של קצירת מחצלת סיבים ללא פגע מאספן מסורתי היה בעיקר בשל העובדה שסיבי electrospun לצרף מאוד על פני השטח של האספן. לכן, אנחנו שונה האספן על ידי קיפול פיסת נייר אלומיניום לרצועה מלבנית והצמדתו בניצב ללוחית מתכת שטוחה. סיבי electrospun נמתחים על פני השטח שבין הקצה של הרצועה ולוחית המתכת, שניתן להעביר בקלות לsubstrat אחרתדואר. ריבית בפולימרי אלסטומרי תרמית crosslinked הוא גדל במהירות בגלל עבודתם החלוצית של קבוצתו של רוברט לנגר, שהציג את פולי (sebacate גליצרול) (PGS), פוליאסטר שהוא מקביל לגומי מגופר, ב2002 3. דומה לPGS, יש לנו פיתחנו בהצלחה פולי (גליצרול-dodecanoate) (PGD) על ידי עיבוי תרמית של גליצרול וחומצת dodecanedioic והפגינו קניין זיכרון צורה הייחודי שלה 1. שלא כמו פולי נוקשה חומרים סינטטיים (בוטיראט הידרוקסיל) או פולי (L-lactide) (moduli של יאנג של 250 מגפ&quot;ס ו660 מגפ&quot;ס, בהתאמה), PGD מפגין רכוש אלסטומרי כמו גומי, עם מודול יאנג של 1.08 מגפ&quot;ס כאשר הטמפרטורה היא מעל 37 ° C, שהוא משחק קרוב לעצבים באתר ההיקפיים (0.45 MPA). בנוסף, PGD הוא מתכלה וזמן הפירוק ניתן מכויל על ידי שינוי היחס של גליצרול וחומצת dodecanedioic. חומצת Dodecanedioic היא תת עשר פחמןעמדה עם שתי קבוצות קרבוקסיליות מסוף, HOOC (CH 2) 10 COOH. חומצות dicarboxylic אפילו ממוספרות כמו חומצת sebacic וחומצת dodecanedioic יכולות להיות מפורקות לאצטיל-CoA והזן את חומצת tricarboxylic (TCA) מחזור / (חומצת לימון). מוצר חילוף החומרים של חומצות dicarboxylic, succinyl-CoA, הוא מבשר וביניים של מחזור 4 TCA gluconeogenetic. לפיכך, חלק מהמחקרים הראו כי הם יכולים להיות מנוצלים כמצע אלטרנטיבי דלק לתזונת Enteral וparenteral, במיוחד במצבים פתולוגיים. בנוסף, PGD מפגין זיכרון צורה ייחודית משום שטמפרטורת מעבר זכוכית שלה היא 31 במעלות צלזיוס, ובכך הוא מציג תכונות מכאניות שונות בטמפרטורת חדר ובטמפרטורת גוף. לסיכום, PGD הוא מתכלה, ביולוגית, המציג תכונות אלסטיות ייחודיות עם תכונות מכאניות דומות לרקמות עצבים; ולכן, זה חומר מתאים ליישומי הנדסת רקמת עצב. בפרוטוקול זה, electrospunסיבים ארוכים המשתרעים על שטח מרבץ גדול היו מפוברק באמצעות האספן החדש תוכנן מPGD. פיגומי הסיבים יכולים לתמוך בצמיחה בתאי גזע pluripotent עכבר ובידול.

<table><tbody><tr><td>גליצרול</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>G7757</td><td></td></tr><tr><td>חומצה דודקנדיואית</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>D1009</td><td></td></tr><tr><td>ג'לטין</td><td>סיגמא-אולדריץ</td>' <td>D1890</td><td></td></tr><tr><td>פולי (תחמוצת אתילן) (PEO)</td> <td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>182028</td><td></td></tr><tr><td>ריבופלבין</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>132350250</td><td>0.10%</td></tr> <tr><td>תאי גזע עובריים</td> <td>של עכברGlobalStem</td><td>GSC-5002</td><td></td></tr><tr><td>Matrigel</td><td>Becton Dickinson</td><td>356234</td><td></td></tr><tr><td>DMEM/F12</td><td>Thermo Scientific</td><td>SH30272.02</td><td></td></tr><tr><td>N2 תוסף</td><td>Invitrogen</td><td>17502048</td><td>1%</td></tr> <tr><td>FGF2</td><td>Stemgent</td><td>03-0002</td><td>10 ננוגרם/מ"ל</td></tr><tr><td>Accutase</td><td>Invitrogen</td><td>A11105-01</td><td></td></tr><tr><td>פוספט חוצץ מלח (PBS)</td><td>Invitrogen</td><td>10010-031</td><td></td></tr><tr><td>צבע פלואורסצנטי Resazurin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>62758-13-8</td><td></td></tr><tr><td>SV מערכת בידוד RNA כוללת</td><td>Promega</td><td>Z3100</td><td></td></tr><tr><td>GoScript מערכת שעתוק הפוך</td><td>Promega</td><td>A5000</td><td></td></tr><tr><td>GoTaq qPCR Master Mix</td><td>Promega</td><td>A6001</td><td></td></tr><tr><td>משאבת מזרק&nbsp;</td><td>פישר סיינטיפיק</td><td>14-831-200</td><td></td></tr><tr><td>מקור מתח גבוה&nbsp;</td><td>ספלמן מתח גבוה אלקטרוניקה תאגיד</td><td></td><td>SL30</td></tr><tr><td>אור UV</td><td>פיליפס</td><td>308643</td><td>15W/G15T8</td></tr><tr><td>סינרגיה HT Multi-Mode Microplate Reader</td><td>BioTek</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Perkin Elmer GeneAmp PCR System 9600</td><td>Perkin Elmer</td><td>8488</td><td></td></tr><tr><td>StepOne בזמן אמת PCR מערכת</td><td>יישומי ביו-סיסטמס</td><td>4376357</td><td></td></tr></tbody></table>

electrospun סיבי פיגומים של פולי (גליצרול-dodecanedioate) להנדסה עצבית רקמות מתאי גזע עובריים בעכבר

Electrospun Fibrous Scaffolds of Poly(glycerol-dodecanedioate) for Engineering Neural Tissues From Mouse Embryonic Stem Cells

עבור יישומי הנדסת רקמות, הכנת פיגומים מתכלים ביולוגית היא המשימה הרצויה אך המאתגרת ביותר. בין שיטות ייצור השונות, electrospinning הוא אחד האטרקטיבי ביותר, בשל הפשטות והרבגוניות שלו. בנוסף, nanofibers electrospun לחקות את הגודל של מטריצה ​​תאית הטבעית הבטחת תמיכה נוספת להישרדות תא וצמיחה. מחקר זה הראה את הכדאיות של הייצור של סיבים ארוכים המשתרעים על הפקדת שטח גדול יותר לפולימר מתכלה ביולוגית חדשני בשם פולי (גליצרול-dodecanoate) (PGD) 1 באמצעות אספן חדש תוכנן עבור electrospinning. PGD ​​מפגין תכונות אלסטיות ייחודיות עם תכונות מכאניות דומות לרקמות עצבים, ולכן הוא מתאים ליישומי הנדסת רקמות עצביים. הסינתזה והגדרת ייצור להכנת חומרי פיגומים סיביים הייתה פשוט, לשעתקו מאוד, ולא יקרים. בbiocompatibilityבדיקות, תאים שמקורם בתאי גזע עובריים של עכברים יכולים לדבוק ולגדול על סיבי PGD electrospun. לסיכום, פרוטוקול זה סיפק שיטת ייצור תכליתית להכנת סיבי electrospun PGD כדי לתמוך בצמיחה של תאי שושלת תאי גזע העובריים של עכברים נגזרו עצביים.

המרכיבים העיקריים של electrospinning מוצגים באיור 1. מחצלת גודל סיבים גדולה הייתה בדרך כלל שהושגה באמצעות הרצועה המצורפת בניצב רדיד האלומיניום ולוחית מתכת שטוחה. איור 2 מציג את עיצוב האספן ומחצלת electrospinning סיבים. הרוחב והאורך יכולים להיות מותאם ליישומים שונים. אורכו של הסיב עשוי פולימר עם PGD ותערובת פתרון בסיסי הוא עד 10 סנטימטר. המורפולוגיה של סיבי electrospun מוצגת באיור 3. בקטרים ​​של סיבים עשויים מ40% ריכוז PGD הם בטווח...

סינתזה וייצור של סיבי electrospun ארוכים המשתרעים על שטח גדול יותר הפקדה באמצעות אספן חדש תוכנן מפולימר מתכלה רומן בשם פולי (גליצרול-dodecanoate) (PGD) דווחה. הסיבים היו מסוגלים לתמוך בצמיחה של תאים שמקורם בתאי גזע pluripotent עכבר.

Electrospun סיבי פיגומים של פולי (גליצרול-dodecanedioate) להנדסה עצבית רקמות מתאי גזע עובריים בעכבר

For tissue engineering applications, the preparation of biodegradable and biocompatible scaffolds is the most desirable but challenging task. &#160;Among ...

הליך זה, מייצר אלקטרוס סיבים ארוכים מסובבים מפולימר מתכלה חדש בשם פולי גליצרול Dote Cano eight. ראשית הגדר את הקולט המעוצב החדש והכין את התמיסה הפולימרית לספינינג אלקטרו, באמצעות מזרק ומשאבה, העביר את התמיסה לקולט. לאחר מכן העבירו את מחצלת הסיבים המתקבלת לצלחת תרבות לצורך קישור צולב.לאחר מכן זרע תאי גזע עובריים של עכבר על הסיבים החתוכים. בסופו של דבר, התוצאות יכולות להוכיח שתאי גזע עובריים של עכבר יכולים לשרוד ולהתמיין לתאים עצביים על פיגומי הסיבים. בסרטון של היום, הראינו לכם כיצד להכין את החומר הביולוגי מייצור תאי הסינכרון, ולבסוף להשתמש בסיבים האלקטרו-טוואן האלה לתרבית תאים.במיוחד כאשר אנו משלבים עם התא שמקורו בתאי פולי וכתם. ייתכן שיהיה להם יישום חשוב מאוד בעתיד להעברת התאים וליצירת רקמה מתפקדת. רקמות מראות היום שהיא תדגים לך הליך נורא.היא הדבר הכי טוב במעבדה שלי. חותכים נייר אלומיניום לחתיכה מלבנית. מקפלים את החלק המלבני לרצועה מלבנית ומחברים אותו בניצב לצלחת מתכת שטוחה בעזרת סרט.אורך הרצועה תלוי בגודל מחצלת הסיבים הדרושה לתמיסה הפולימרית. ערבב גליצרול ועשה חומצה דיאית דקאן ביחס מולארי אחד לאחד ב-120 מעלות צלזיוס למשך 100 שעות. כדי להשיג פולי גליצרול, האם פולימר דקנואי ממיס תחמוצת פוליאתילן וג'לטין ב-65% אתנול עם יחס משקל של 1.5 עד שלושה עד 95.5 בצינור של 15 מיליליטר.מהדקים את המכסה ומחממים את התערובת בתנור בחום של 60 מעלות צלזיוס למשך שעה, תוך ערבוב כל 15 דקות עד שתמיסת הבסיס הומוגנית. לספינינג אלקטרו, מערבבים את פולימר ה-PGD ואת תמיסת הבסיס. ביחס משקל של ארבע עד שש, הוסיפו לתערובת 0.1% ריבופלבין וערבבו היטב.הזינו את התמיסה הפולימרית למזרק סטנדרטי של חמישה מיליליטר עם מחט נירוסטה קהה בגודל 18. לאחר מכן הכנס את המזרק למשאבת מזרק. חבר את הכבל המוארק של כרך גבוהtagמקור מתח ללוחית המתכת ואת הכבל הטעון חיובית למחט.כמו כן, התאם את המרחק בין המחט לרדיד האלומיניום. רצועה ל -15 סנטימטרים. כעת הנח את משאבת המזרק בזווית של כ-15 מעלות עם האופקי כדי למנוע הצטברות של הסיבים בקדמת הרצועה.הפעל את משאבת המזרק והתאם את קצב הזרימה של המשאבה ל-0.6 מיליליטר לשעה. הפעל את כרך גבוהtagמקור החשמל והגדר את מתח ההפעלה ל-14.6 קילו-וולט. לאחר השלמת האיסוף, חשוף את שטיח הסיבים לאור UV למשך 60 דקות של קישור צולב.העבירו את מחצלת הסיבים מרצועת נייר האלומיניום לצלחת פטרי של 100 מילימטר. חותכים את מחצלת הסיבים לחתיכות עגולות באותו גודל בעזרת הלהב הכירורגי ומניחים את החלקים לצלחת של 24 בארות. לאחר מכן חשוף את הצלחת לאור UV לעיקור נוסף של 20 דקות לתאים לפני הטיפול.טבלו דגימות סיבים במיליליטר אחד של מי מלח עם פוספט ודגרו על 37 מעלות צלזיוס למשך הלילה למחרת. שאפו את ה-PBS בזהירות. הוסף מיליליטר אחד של מדיום התמיינות לכל באר ודגירה בחום של 37 מעלות צלזיוס למשך שלוש שעות.לאחר שאיבת מדיום ההתמיינות מוסיפים בזהירות 0.2 מיליליטר ג'ל מאטרי לכל דגימת סיבים ודוגרים בחום של 37 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות. הסר בזהירות את עודפי ג'ל המטרי מכל אחד מהם. יש לשטוף היטב פעם אחת עם שני מיליליטר של מדיום בידול.הוסף מיליליטר אחד של טאס לצלחת תרבית תאי גזע עובריים של עכבר לאחר 10 דקות, 37 מעלות צלזיוס. כאשר תאי ה-MES מנותקים, הוסף ארבעה מיליליטר של מדיום התמיינות. אסוף את תאי ה-MES הצפים לצנטריפוגה של צינור 15 מיליליטר ב-400 Gs למשך חמש דקות.השעו מחדש את התאים הגלולים בארבעה מיליליטר של התמיינות. בינוני. העבירו 200 מיקרוליטר של מתלה התאים לצינור של 15 מיליליטר והוסיפו 10 נפחי בידול. בינוני. העבר 15 מיקרוליטר של תרחיף התאים המדולל לתא על ציטומטר ההמו.עם החלקת כיסוי במקום, ספרו את התאים בריבוע המרכזי של מילימטר אחד ואת ארבעת ריבועי הפינה של ציטומטר ההמו. עכשיו יורדים חמש פעמים 10 לרביעי. תאי ES של עכבר לאט לאט באמצע דגימות הסיבים.הוסף מיליליטר אחד של מדיום התמיינות לכל באר ותרבית ב-37 מעלות צלזיוס ו-5% פחמן דו חמצני לחיבור תאים. צמיחה ובידול. מלאו את המיליליטר האחד של מדיום הבידול כל יומיים.כדי למדוד את כדאיות התא, שאפו את המדיום הישן מכל באר והוסיפו מיליליטר אחד של אחד ל-10 דילול אברה ומגיב פלואורסצנטי בתרבית. דגירה בינונית בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס ו-5% פחמן דו חמצני למשך ארבע שעות מוגנת מפני אור ישיר. לאחר מכן העבירו דגימות משולשות של 100 מיקרוליטר מכל באר לצלחת של 96 בארות ומדדו תמונות מיקרוסקופ אלקטרונים סורקות פלואורסצנטיות שימשו להערכת המורפולוגיה של סיבים מסובבים אלקטרוניים.הקוטר של סיבים אלה העשויים מריכוז PGD של 40% נמצא בטווח המיקרומטר כאן. תאי גזע עובריים של עכברים מובחנים תורבבו במשך שלושה ימים על הסיבים ומיקרוסקופיה קונפוקלית שימשה להדמיה של חלבון פלואורסצנטי ירוק מבוטא. המספר המוגבר של תאים פלואורסצנטיים ירוקים ביום השישי מצביע על כך שפיגומי הסיבים יכולים לתמוך הן בהידבקות התאים והן בהתפשטות התאים.מדידות Zu ופלואורסצנטיות הראו כי ציפוי עם מטריג'ל ולמינין הביא לכדאיות תאים שווה ערך ושגשוג גבוה יחסית. עוצמת השטף וסמני התאים העצביים כומתו על ידי PCR בזמן אמת ביום הראשון. רוב תאי ה-MES שגודלו על סיבים ביטאו את סמני הפלוריפוטנטיות.OCT ארבע ננו ו-SOX שתיים. תת-קבוצה מינורית ביטאה את סמני תאי הגזע העצביים PAC 6 ו-neston. לאחר שבועיים בתרבית, הייתה עלייה ברמות הביטוי של כמה סמני תאים עצביים, כגון מפה 2 ו-DCX, כמו גם סמן אוליגודנדרוציטים אוליגו 1 וסמן אסטרוציטים.GFAP פעם אחת התמקצע. טכניקה זו יכולה להיעשות תוך שעתיים-שלוש אם היא מבוצעת כראוי.

electrospun-fibrous-scaffolds-poly-glycerol-dodecanedioate-for

Research

JoVE Journal

Bioengineering

הנדסה ביולוגית

תהליך electrospinning פולימרים של הנדסת רקמות והתרבות תא מופנית במאמר זה. באופן ספציפי, electrospinning של macromers photoreactive עם יכולות עיבוד נוסף של photopatterning ורב פולימר electrospinning מתואר.

Electrospinning פיגומים פולימר סיבי עבור הנדסת רקמות ותרבות Cell

מזדהות סיבים electrospun ישיר על גדילה של נוירונים במבחנה הם מרכיב הפוטנציאל של פיגומים התחדשות עצבים. אנו מתארים את הליך הכנת מצעים electrospun סיבים ותרבות חופשית בסרום של חושי העיקרי עכברוש E15 (DRG) ו הנוירונים המנוע. ויזואליזציה של נוירונים ידי immunocytochemistry כלולה גם.

תרבות מוטור ראשיים עצב סנסורי בתקשורת מוגדר על electrospun פולי-L-lactide nanofiber פיגומים

זה מפרט עבודה והכנת 3D הפיברין פיגומים culturing ומבדל בתאי גזע plutipotent. פיגומים אלה ניתן להשתמש כדי לסנן את ההשפעות של חומרים ביולוגיים שונים על התנהגות בתאי גזע גם שונה כדי לכלול מערכות אספקת סמים.

הכנת 3D הפיברין פיגומים יישומים סלולריים גזע תרבות

כאן אנו מתארים את השימוש של הרכבה עצמית 3 ממדי הפיגום לתרבות תאים אנושיים אבי עצביים. אנו מציגים פרוטוקול לשחרר את התאים מן הפיגומים כדי להיות מנותח למשל לאחר מכן על ידי cytometry הזרימה. פרוטוקול זה עשוי להתאים סוגי תאים אחרים לבצע מחקרים מפורטים באופן מכניסטי.

טיפוח האדם ובתאים עצבית ב Hydrogel עצמית להרכבת 3 מימדי פפטיד

פיגומים Electrospun יכול להיות מעובד הייצור עבור יישומים הנדסת רקמות. כאן אנו מתארים שיטות ספינינג פיגומים מורכבים (על ידי ספינינג רצופים), להכנת פיגומים עבים יותר (על ידי שכבות רב באמצעות אדי חום או חישול), להשגת עקרות (ייצור מזוהם או פירסום הייצור עיקור) ו להשגת תכונות ביומכניים המתאימים.

Postproduction עיבוד Fibres Electrospun עבור הנדסת רקמות

פרוטוקול זה משלב אלקטרו-ספינינג ומיקרוספירות כדי לפתח פיגומים מהונדסי רקמות להכוונת נוירונים. גורם הגדילה העצבי היה עטוף בתוך מיקרוספירות PLGA והוכנס לפיגומים סיביים של חומצה היאלורונית (HA).  הפעילות הביולוגית של החלבון נבדקה על ידי זריעת הפיגומים עם גרעיני שורש הגב של אפרוח ראשוני ותרבית במשך 4-6 ימים.

גורם הגדילה Electrospinning שחרור מיקרוסכמות לתוך סיביים פיגומים

כאן, אנו מציגים פרוטוקול לפברק פיגומי nanofiber electrospun עם ארגון מדורג של סיבים ולחקור את היישומים שלהם בויסות מורפולוגיה תא / אורינטציה. הדרגתיים בכל קשורים לתכונות פיסיקליות וכימיות של פיגומי nanofiber מציע מגוון רחב של יישומים בתחום ביו-רפואיים.

Electrospun nanofiber פיגומים עם דרגות בארגון סיבים

תובנה לגבי הפעולות המורכבות של המוח דורשת כלי מחקר מתקדמים. כאן אנו מדגימים מודל תלת מימדי חדש מבוסס משי-קולגן של רקמה עצבית הדומה לארכיטקטורה דמוית מוח. המודל יכול לשמש לחקר הרכבת רשת עצבית, הנחיה אקסונלית, אינטראקציות תא-תא ופעילות חשמלית.

דגם של רקמות עצביות מקוטב מבוסס משי-קולגן מהונדס 3D

במסמך זה, אנו מציגים עבור התרבות תלת-ממד של עכברוש פרוטוקול תאי המוח-derived עכשיו, דונלד, לרבות האסטרוציטים, מיקרוגלייה oligodendrocytes להפוך. נדגים התרבות התא הראשי, סינתזה הידרוג חומצה היאלורונית methacrylated (חמה), HAMAphoto-הפילמור ותא כימוס, דוגמת עיבוד עבור הדמיה מיקרוסקופית אלקטרונים קונאפוקלית של סריקה.

שיפור תרבויות הידרוג 3D של תאי גליה העיקרי עבור במבחנה דוגמנות של Neuroinflammation

פרוטוקול זה מתאר פבריקציה נוספת של מערכת התרבות התא כדי לאפשר זריעה של תאי גזע על גרדום פולימר מוליך ועבור במבחנה גירוי חשמלי העוקבים ויוו השרשה של לגרדום נזרע תאי הגזע באמצעות...

מוליכות חשמלית לגרדום לווסת ולהעביר תאי גזע

למד לייצר סיבי PGD באלקטרוספינינג לתמיכה בגידול ותמיון תאי גזע עובריים של עכבר לתאי עצב. שיטה זו מציגה פוטנציאל ליישומים בהנדסת רקמות וברפואה רגנרטיבית.

Electrospun סיבי פיגומים של פולי (גליצרול-dodecanedioate) להנדסה עצבית רקמות מתאי גזע עובריים בעכבר

גלה סרטונים נוספים