Name: שימוש של Flexneri Shigella כדי לחקור אינטראקציות Autophagy-נוגדנים (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-09-09T18:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 52 s
Description: חקור את האינטראקציות בין אוטופאגיה לציטוסקלטון במהלך זיהום Shigella flexneri בתאי HeLa ובזברה פיש. שיטות אלו מאפשרות לעקוב אחר יצירת כלובי ספטין המגבילים תנועת חיידקים ומכוונים אותם לפירוק אוטופאגי.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

עבודה במעבדה SM נתמכת על ידי בקריירה מחקר פיתוח [WT097411MA] מלגת Wellcome Trust.

<ol><li>Ashida, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Shigella+are+versatile+mucosal+pathogens+that+circumvent+the+host+innate+immune+system%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Immunol%22%5BJournal%5D)">Shigella are versatile mucosal pathogens that circumvent the host innate immune system.</a> Curr Opin Immunol. 23, 448-455 (2011).</li>
<li>Phalipon, A., Sansonetti, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Shigella%27s+ways+of+manipulating+the+host+intestinal+innate+and+adaptive+immune+system%3A+a+tool+box+for+survival%5BTitle%5D)+AND+%22Immunol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Shigella's ways of manipulating the host intestinal innate and adaptive immune system: a tool box for survival.</a> Immunol Cell Biol. 85, 119-129 (2007).</li>
<li>Welch, M. D., Way, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Arp2%2F3-mediated+actin-based+motility%3A+A+tail+of+pathogen+abuse%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Host+Microbe%22%5BJournal%5D)">Arp2/3-mediated actin-based motility: A tail of pathogen abuse.</a> Cell Host Microbe. 14, 242-255 (2013).</li>
<li>Haglund, C. M., Welch, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pathogens+and+polymers%3A+microbe-host+interactions+illuminate+the+cytoskeleton%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Pathogens and polymers: microbe-host interactions illuminate the cytoskeleton.</a> J Cell Biol. 195, 7-17 (2011).</li>
<li>Mostowy, S., Cossart, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Septins%3A+the+fourth+component+of+the+cytoskeleton%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Septins: the fourth component of the cytoskeleton.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. 13, 183-194 (2012).</li>
<li>Saarikangas, J., Barral, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+emerging+functions+of+septins+in+metazoans%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+Rep%22%5BJournal%5D)">The emerging functions of septins in metazoans.</a> EMBO Rep. 12, 1118-1126 (2011).</li>
<li>Mostowy, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Entrapment+of+intracytosolic+bacteria+by+septin+cage-like+structures%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Host+Microbe%22%5BJournal%5D)">Entrapment of intracytosolic bacteria by septin cage-like structures.</a> Cell Host Microbe. 8, 433-444 (2010).</li>
<li>Mostowy, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((p62+and+NDP52+proteins+target+intracytosolic+Shigella+and+Listeria+to+different+autophagy+pathways%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">p62 and NDP52 proteins target intracytosolic Shigella and Listeria to different autophagy pathways.</a> J Biol Chem. 286, 26987-26995 (2011).</li>
<li>Mostowy, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Septins+regulate+bacterial+entry+into+host+cells%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Septins regulate bacterial entry into host cells.</a> PLoS One. 4 (15), (2009).</li>
<li>Mostowy, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Septin+11+restricts+InlB-mediated+invasion+by+Listeria%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Septin 11 restricts InlB-mediated invasion by Listeria.</a> J Biol Chem. 284, 11613-11621 (2009).</li>
<li>Phan, Q. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+endothelial+cell+Septin+7+in+the+endocytosis+of+Candida+albicans%5BTitle%5D)+AND+%22mBio%22%5BJournal%5D)">Role of endothelial cell Septin 7 in the endocytosis of Candida albicans.</a> mBio. 4 (e00542-13), (2013).</li>
<li>Mostowy, S., Cossart, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Septins+as+key+regulators+of+actin+based+processes+in+bacterial+infection%5BTitle%5D)+AND+%22Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Septins as key regulators of actin based processes in bacterial infection.</a> Biol Chem. 392, 831-835 (2011).</li>
<li>Levine, B., Mizushima, N., Virgin, H. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Autophagy+in+immunity+and+inflammation%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Autophagy in immunity and inflammation.</a> Nature. 469, 323-335 (2011).</li>
<li>Randow, F., MacMicking, J. D., James, L. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cellular+self-defense%3A+how+cell-autonomous+immunity+protects+against+pathogens%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Cellular self-defense: how cell-autonomous immunity protects against pathogens.</a> Science. 340, 701-706 (2013).</li>
<li>Mostowy, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Autophagy+and+bacterial+clearance%3A+a+not+so+clear+picture%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Autophagy and bacterial clearance: a not so clear picture.</a> Cell Microbiol. 2 (12063), (2012).</li>
<li>Mostowy, S., Cossart, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bacterial+autophagy%3A+restriction+or+promotion+of+bacterial+replication%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Bacterial autophagy: restriction or promotion of bacterial replication.</a> Trends Cell Biol. 22, 283-291 (2012).</li>
<li>Kanther, M., Rawls, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Host-microbe+interactions+in+the+developing+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Immunol%22%5BJournal%5D)">Host-microbe interactions in the developing zebrafish.</a> Curr Opin Immunol. 22, 10-19 (2010).</li>
<li>Renshaw, S. A., Trede, N. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+model+450+million+years+in+the+making%3A+zebrafish+and+vertebrate+immunity%5BTitle%5D)+AND+%22Dis+Model+Mech%22%5BJournal%5D)">A model 450 million years in the making: zebrafish and vertebrate immunity.</a> Dis Model Mech. 5, 38-47 (2012).</li>
<li>Mostowy, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+zebrafish+as+a+new+model+for+the+in+vivo+study+of+Shigella+flexneri+interaction+with+phagocytes+and+bacterial+autophagy%5BTitle%5D)+AND+%22Plos+Path%22%5BJournal%5D)">The zebrafish as a new model for the in vivo study of Shigella flexneri interaction with phagocytes and bacterial autophagy.</a> Plos Path. 9, e1003588(2013).</li>
<li>Fischer, A. H., Jacobson, K. A., Rose, J., Zeller, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fixation+and+permeabilization+of+cells+and+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harb+Protoc%22%5BJournal%5D)">Fixation and permeabilization of cells and tissues.</a> Cold Spring Harb Protoc. , (2008).</li>
<li>Klionsky, D. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Guidelines+for+the+use+and+interpretation+of+assays+for+monitoring+autophagy%5BTitle%5D)+AND+%22Autophagy%22%5BJournal%5D)">Guidelines for the use and interpretation of assays for monitoring autophagy.</a> Autophagy. 8, 445-544 (2012).</li>
<li>Mizushima, N., Yoshimori, T., Levine, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Methods+in+mammalian+autophagy+research%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Methods in mammalian autophagy research.</a> Cell. 140, 313-326 (2010).</li>
<li>Westerfield, M. A guide for the laboratory use of zebrafish (Danio rerio). <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aWesterfield%2C+M+%22The+Zebrafish+Book%22">The Zebrafish Book</a>. , 4-5.2, (2000).</li>
<li>Benard, E. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Infection+of+zebrafish+embryos+with+intracellular+bacterial+pathogens%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Infection of zebrafish embryos with intracellular bacterial pathogens.</a> J Vis Exp. 61 (e3781), (2012).</li>
<li>He, C., Bartholomew, C. R., Zhou, W., Klionsky, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assaying+autophagic+activity+in+transgenic+GFP-Lc3+and+GFP-Gabarap+zebrafish+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Autophagy%22%5BJournal%5D)">Assaying autophagic activity in transgenic GFP-Lc3 and GFP-Gabarap zebrafish embryos.</a> Autophagy. 5 (4), 520-526 (2009).</li>
<li>Mizushima, N., Komatsu, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Autophagy%3A+renovation+of+cells+and+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Autophagy: renovation of cells and tissues.</a> Cell. 147, 728-741 (2011).</li>
<li>Komatsu, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Homeostatic+levels+of+p62+control+cytoplasmic+inclusion+body+formation+in+autophagy-deficient+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Homeostatic levels of p62 control cytoplasmic inclusion body formation in autophagy-deficient mice.</a> Cell. 131, 1149-1163 (2007).</li>
<li>Nowicki, B., Coyne, K. E., Lublin, D. M., Nowicki, S., Hart, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Short+consensus+repeat-3+domain+of+recombinant+decay-accelerating+factor+is+recognized+by+Escherichia+coli+recombinant+Dr+adhesin+in+a+model+of+a+cell-cell+interaction%5BTitle%5D)+AND+%22J+Exp+Med%22%5BJournal%5D)">Short consensus repeat-3 domain of recombinant decay-accelerating factor is recognized by Escherichia coli recombinant Dr adhesin in a model of a cell-cell interaction.</a> J Exp Med. 178, 2115-2121 (1993).</li>
<li>Hall, C., Flores, M., Storm, T., Crosier, K., Crosier, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+zebrafish+lysozyme+C+promoter+drives+myeloid-specific+expression+in+transgenic+fish%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">The zebrafish lysozyme C promoter drives myeloid-specific expression in transgenic fish.</a> BMC Developmental Biology. 7 (42), (2007).</li>
<li>Renshaw, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+transgenic+zebrafish+model+of+neutrophilic+inflammation%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">A transgenic zebrafish model of neutrophilic inflammation.</a> Blood. 108, 3976-3978 (2006).</li>
<li>Ellett, F., Pase, L., Hayman, J. W., Andrianopoulos, A., Lieschke, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((mpeg1+promoter+transgenes+direct+macrophage-lineage+expression+in+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">mpeg1 promoter transgenes direct macrophage-lineage expression in zebrafish.</a> Blood. 117, 2010-2010 (2011).</li>
<li>Bill, B. R., Petzold, A. M., Clark, K. J., Schimmenti, L. A., Ekker, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+primer+for+morpholino+use+in+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Zebrafish%22%5BJournal%5D)">A primer for morpholino use in zebrafish.</a> Zebrafish. 6 (9), (2009).</li>
<li>He, C., Klionsky, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analyzing+autophagy+in+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Autophagy%22%5BJournal%5D)">Analyzing autophagy in zebrafish.</a> Autophagy. 6, 642-644 (2010).</li>
<li>Howe, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+zebrafish+reference+genome+sequence+and+its+relationship+to+the+human+genome%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">The zebrafish reference genome sequence and its relationship to the human genome.</a> Nature. 25 (496 (7446)), 498-503 (2013).</li>
<li>Levraud, J. P., Colucci-Guyon, E., Redd, M. J., Lutfalla, G., Herbomel, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+analysis+of+zebrafish+innate+immunity%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">In vivo analysis of zebrafish innate immunity.</a> Methods Mol Biol. 415, 337-363 (2008).</li>
</ol>

החוקרים מצהירים כי אין להם אינטרסים כלכליים מתחרים.

כאשר ניטור autophagy ושלד התא במבחנה תוך שימוש בתאים בתרבית רקמה, יכולים להיות מיושמים בפרוטוקולים מפורטים בסעיפי 1 ו -2 למגוון רחב של סוגי תרבית רקמת תא. יתר על כן, כדי לעקוב autophagy (למשל, ATG8 / LC3 + ve autophagosomes) ושלד תא (לדוגמא., זנבות אקטין, כלובי septin) דינמיקה בזמן אמת במהלך זיהום Shigella באמצעות הדמיה חיה, תאים בתרבית רקמה ניתן transfected זמני באמצעות GFP-, מבני RFP- או CFP מתויג כמו בעבר תיארו 7,8. כדי להגדיל את אחוז התאים הנגועים בShigella (כלומר, בדרך כלל רצוי לניתוח בזמן אמת בהתחשב בכך שShigella יכול לפלוש 5-30% מתאי הלה ב100:. 1 משרד הפנים), להוסיף ישירות 400 μl של Shigella (OD 600 = 0.3 -0.6) לתאים ב2 מ&quot;ל MEM (רעב לסרום) ולחכות לפחות 1.5 לאחר זיהום שעה לכניסת חיידקים מספיק, לברוח מphagosome, שכפול, auהכרת tophagy והקמה כלובי septin. לחלופין, ניתן להשתמש במתח Shigella M90T אפאי, המבטא את adhesin AfaE ויש לי את יכולות פלישה הרבה יותר גבוהות בתאי האפיתל בהשוואה לזן M90T 28. ראוי לציין, מתח M90T אפאי טרם נבדק in vivo באמצעות דג הזברה. צלחות של מושבות Shigella יכולות להיות כל הזמן על 4 מעלות צלזיוס למשך 2-3 ימים ומשמשות לכמה ניסויים. עם זאת, לאורך זמן, מושבות של Shigella שאיבדו את הפלסמיד הארסיות גם יכול לספוג אדום קונגו ונראה שיש לי שמר פלסמיד ארסיותם. מסיבה זו אנו ממליצים להשתמש במניות חיידקים טריות במידת האפשר. כאשר ניטור הביולוגיה של התא של זיהום in vivo, פרוטוקולים מתוארים בסעיפי 3 ו דג הזברה שורת 4 שימוש wildtype AB. כדי לפקח על אינטראקציות -leukocyte Shigella, ניתן להשתמש בקווים דג הזברה מהונדסים, למשל, MPX: GFP או, liz: DsRed לחזותייםize נויטרופילים 19,29,30 או MPEG1: mCherry לדמיין מקרופאגים 19,31. כדי להמחיש autophagy in vivo, הקו המהונדס דג הזברה GFP-Lc3 19,24 יכול לשמש כמפורט בסעיף 3.8. להפריע autophagy in vivo, מינון oligonucleotide morpholino היעיל יש להעריך באופן ניסיוני המבוסס על יעילותה לעכב שחבור תמליל או תרגום חלבון. מומלץ לבצע ניסוי טיטרציה וכדי לאשר את הדלדול על ידי RT-PCR (לoligonucleotide morpholino אחוי) או על ידי SDS-PAGE (לoligonucleotide morpholino translational) 32. בידוד RNA מעוברים או זחלי דג הזברה יכול להתבצע באמצעות מיצוי thiocyanate-פנול, כלורופורם guanidinium. כדי לחלץ חלבון מזחלי דג הזברה (8 עד 15 זחלים / צינור), מכאני homogenize באמצעות העלי ב200 מאגר תמוגה μl (1 מ &#39;טריס, 5 M NaCl, 0.5 M EDTA, 0.01% condensat אתילן אוקסיד octylphenolדואר, ומעכבי פרוטאז). צנטריפוגה צינורות ב19,000 XG ב 4 מעלות צלזיוס למשך 15 דקות ולהעביר את supernatant לצינור חדש. הוסף חוצץ Laemmli ולחמם את המדגם על 95 מעלות צלזיוס למשך 15 דקות. ניתן לאחסן lysates ב -80 מעלות צלזיוס עד צורך, ויכול להיות מוערך על ידי מערבי סופג כאמור בסעיף 2.3. דג הזברה הוא מודל מצוין לin vivo יישום תרופה. ניתוח באמצעות oligonucleotides morpholino יכול להיות כהשלמה עם סמים הוקמו כדי לתפעל autophagy (למשל, rapamycin וbafilomycin). זחלים נגוע ו / או נגועים יכולים להיות מטופלים עם rapamycin (1.5 מיקרומטר) או bafilomycin (80 ננומטר) בדילול מלא בE2 ושטף autophagic יכול להיות מוערך על ידי מערבי סופג כפי שמתואר ב25,33. התוצאה של המניפולציה autophagy על התוצאה של הזיהום וההישרדות של הזחלים הנגועים ניתן להעריך כאמור בסעיף 3.5. בנוסף ללימוד תא מארחגורמים, במבחנה ובפרוטוקולי vivo יכולים להיות מיושמים על מנת להעריך גורמי חיידקים הנדרשים להכרה autophagy, באמצעות זני מוטציה חיידקים שמוכרים באופן דיפרנציאלי על ידי autophagy, למשל., Shigella ΔicsA (חלבון Shigella ICSA מגייס N-WASP ולאחר מכן Arp2 / 3 לזנב אקטין והיווצרות כלוב septin; בהעדרו לא יכול להיות זנבות אקטין, ללא כלובים septin) וShigellaΔicsB (Shigella ימנע את תגובת autophagic באמצעות חלבון חיידקי מפעיל IcsB, המונע את הגיוס של מכונות autophagy לICSA; בהיעדרו לא יכול להיות יותר כלובי septin, יותר autophagy) 7,8. Shigella הוא לא הפתוגן טבעי של דג הזברה וגדל בצורה אופטימלית על 37 C °. עם זאת, עבודה הראתה כי גורמים ארסי הנדרשים לפלישת Shigella, לברוח מvacuole phagocytic ושכפול בCYtosol יכול לבוא לידי ביטוי והם פונקציונליים בזחלי דג הזברה ב28 ° C 19. 28 ° C הוא הטמפרטורה הנפוצה ביותר לגידול דג הזברה וטמפרטורה סטנדרטית על מנת להבטיח התפתחות דג הזברה נורמלית 23. באופן מפתיע, האירועים המרכזיים פתוגניים שיובילו לshigellosis בבני אדם (כלומר, מוות של תאי מקרופאג, פלישה וכפל בתוך תאי אפיתל, התפשטות תא אל התא, ההרס דלקתי של האפיתל המארח) הם בתמונות בנאמנות במודל דג הזברה של זיהום Shigella 19. גני autophagy ושלד תא בכל מקום באים לידי ביטוי ויש מגוון רחב של פונקציות ביולוגיות. מחקרי עכבר הראו נוקאאוט זה של autophagy החיוני 26 או septin גנים 5 הם קטלניים עובריים, וסביר להניח שחלק מהגנים הללו יהיה גם חיוני להתפתחות דג הזברה (אם כי בעיה זו עשויה להיות מופחתת על ידי העובדה שיש לי דג הזברה מרובהגני paralogous 33). אם כן, קיימות מספר חלופות כדי להתגבר על בעיה זו, כולל (i) השימוש בחומרים כימי תרופתיים לווסת autophagy ושלד התא, (ii) ניתן טיטרציה למטה morpholinos, (iii) בנוקאאוט של גנים יכול להיות מיועד לרק תא מסוים סוגים, ו / או (iv) גני המעורבים בהכרת autophagic שאינם חיוניים להתפתחות של בעלי חיים (לדוגמא., p62) עשוי להיות ממוקד. בעוד דג הזברה היא מערכת מודל אידיאלית לחקור autophagy ושלד התא במהלך זיהום Shigella, כלים מולקולריים כרגע חסרים. השדה צריך ליצור כלים חדשים וביטוי ספציפי תא כונן של חלבוני עניין. להפיל ביטוי של גני autophagy / שלד תא, רצפי morpholino חדשים נדרשים, ושיטות חדשניות להנדסת הגנום (למשל, Talen, CRISPR / Cas9) יכול לשמש גם. בינתיים, מספר כלים שנוצרו בעבר למחקרים בבני אדם או בעכברייתכן באותה מידה לעבוד עבור דג הזברה. החיידקים תאיים ס flexneri התפתח כאורגניזם מודל יוצא דופן כדי לטפל בבעיות מרכזיות בביולוגיה, לרבות היכולת של חיידקים כדי להיות מוכרת על ידי 1,2 המערכת החיסונית. התא המארח מעסיק septins להגביל את תנועתיות של ס &#39; flexneri ולמקד אותם לautophagy, מרכיב קריטי של חסינות אוטונומית תא 7,8. מקרים אלה מצביעים על מסגרת מולקולרית חדשה ללמוד autophagy ויכולתה כדי לבזות חיידקי cytosolic. נושא עיקרי הוא עכשיו לפענח באופן מלא את האירועים מולקולריים ותאיים הבסיסיים, וכדי לאמת את האירועים הללו ניתחו במבחנה במהלך זיהום חיידקי in vivo תוך שימוש במודלים של בעלי חיים רלוונטיים. לשם כך, דג הזברה כבר נקבע כמארח חדש בעל ערך לניתוח של ס &#39; זיהום flexneri 19. יחסי גומלין בין חיידקים ותאי מארח ניתן הדמיה ברזולוציה גבוהה, ומודל דג הזברה צריך להוכיח שימושי להבנת הביולוגיה של התא של זיהום Shigella in vivo. זחלי דג הזברה יכולים לשמש כדי לחקור את תפקידו של autophagy חיידקים בהגנת מארחת, והעבודה הוכיחה כי שההפרעות של autophagy יכולות להשפיע לרעה על הישרדות מארח בתגובה לזיהום Shigella 19. התצפיות שנוצרו ממחקר של Shigella, septin כליאה וautophagy במבחנה תוך שימוש בתאים בתרבית הרקמה וin vivo באמצעות זחלי דג הזברה עשויה לספק התקדמות יסודית בהבנת הגנת מארחת. הם גם יכולים להציע את הפיתוח של אסטרטגיות חדשות שנועדו להילחם במחלות זיהומיות. מטרה קריטית של דו&quot;ח זה היא הגיוני של האירועים המולקולריים ותאיים ניתחו במבחנה (כלומר, autophagy, זנבות אקטין, septin כליאה) במהלך זיהום חיידקי in vivo בהקשר של אף אוזן גרוןהאורגניזם זעם, תוך שימוש בזחלי דג הזברה. אם לא מכיר את ביולוגיה וטיפול דג הזברה, אחד עשוי להתייחס בפרוטוקולי עומק לגידול דג הזברה נכון 23 ובניתוח vivo של זיהום דג הזברה 19,35.

flexneri Shigella, חיידק enteropathogenic פולשנית גראם שלילי, יכול לברוח מphagosomes לcytosol, ופלמר cytoskeleton אקטין המארח להתחמק תגובות חיסוניות cytosolic ולקדם תנועת התוך ובין תאית 1,2. למרות ההבנה של תנועתיות מבוססות אקטין במבחנה 3,4, המנגנונים המגבילים את הפצת חיידקי in vivo לא הוגדרו באופן מלא. הדבר זה הוא קריטי להבנה של חסינות מולדת והגנת מארחת מלאה יותר. Septins, משפחה שמורה ביותר של חלבונים בין metazoans, היא אדנוזין guanosine (GTP) -binding חלבונים שיותכו מתחמי הטרו oligomeric וליצור חוטים פולריים שמקשרים עם ממברנות תאים ו5,6 שלד התא. מחקר שנערך לאחרונה גילה כי תאי מארח נגועים יכולים למנוע תנועתיות המבוססת אקטין Shigella על ידי חיידקי מידור הממוקדים לautoph&quot;כלובי septin &#39;AGY בתוך, חושפים את המנגנון התאי הראשון שמנטרל תנועתיות המבוססת אקטין 7,8. שדה פתוח לרווחה של חקירה נמצא כיום ב&#39;ביולוגיה septin וזיהום &quot;. הרכבה Septin, הנגרמת על ידי מגוון רחב של גורמי מחלה (למשל, חיידקים ליסטריה 7,9,10, Mycobacterium marinum 7,8, קנדידה אלביקנס 11), עשויה להתגלות כנושא מרכזי בהגנת מארחת 5,12. Autophagy, תהליך פירוק תאיים שמור ביותר, נתפס כמרכיב מרכזי של חסינות תאים אוטונומיים בגלל יכולתה לספק חיידקי cytosolic ל13,14 הליזוזום. עם זאת, התפקיד של autophagy חיידקי in vivo כדי להגביל או לקדם שכפול חיידקים נשאר גרוע הבין 15,16. דג הזברה (Danio rerio) התפתחה כמודל חוליות לחקר הזיהומים כי זה אופטי נגישבשלבי הזחל כאשר מערכת החיסון המולדת היא כבר פונקציונלית 17,18. מחקר שנערך לאחרונה אפיין את הרגישות של זחלי דג הזברה לס flexneri, הפרדיגמה לautophagy חיידקי 15, והשתמשה במודל זיהום -zebrafish Shigella ללמוד המניפולציה של autophagy לטיפול אנטיבקטריאלי in vivo 19. דוח זה מספק כלים ומבחנים ללמוד ס חדשים אינטראקציות flexneri עם autophagy ושלד התא. בשלב ראשון, פרוטוקולים כדי לפקח על אינטראקציות autophagy-שלד התא מתוארים באמצעות זיהום Shigella של שורת תאי אפיתל האנושית הלה. כדי להעריך את התפקיד של אינטראקציות autophagy-שלד תא בתהליך זיהום Shigella במבחנה, שיטות לתמרן autophagy ורכיבי שלד תא (באמצעות siRNA או חומרים כימיים תרופתיים) מסופקים. עבודה חדשה הראתה כי על ידי השימוש בo זיהום Shigellaזחלי דג הזברה f, ניתן ליישם מבחני דומים ללמוד הביולוגיה של התא של זיהום בגוף חי. פרוטוקולים להכין ולהדביק זחלי דג הזברה הם מפורטים, ולהעריך את תגובת המארח לזיהום Shigella in vivo, פרוטוקולים כדי לקבוע הישרדות מארח וניטל חיידקים של זחלים נגועים מסופקות. שיטות לניטור הגיוס של סמני septin וautophagy לShigella (באמצעות זחלי דג הזברה קבועים או חיים) ושיטות על מנת לבחון את תפקידם של תהליכים אלה in vivo [באמצעות oligonucleotides morpholino (הזריק ב1-4 עובר שלב תא) או חומרים כימיים תרופתיים ( הוספתי ישירות למים באמבטית דג הזברה)] הם דנו גם. תכנית זו של העבודה צפויה לספק תובנות לתוך המנגנונים הנדרשים לשליטה בזיהום על ידי תגובות מארחות cytosolic.

<table><tbody><tr><td>בפילומיצין A1</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>B1793&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>בלביסטטין</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>B0560</td><td></td></tr><tr><td>מיקרו-נימי זכוכית בורוסיליקט&nbsp;</td><td>מכשיר הרווארד</td><td>30038</td><td></td></tr><tr><td>מניפולטור ידני גס&nbsp;</td><td>Narishige</td><td>M-152</td><td></td></tr><tr><td>Cytochalasin D</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C6762</td><td></td></tr><tr><td>4',6-diamidino-2-phenylindole (DAPI)</td> <td>בדיקות מולקולריות</td><td>D1306</td><td></td></tr><tr><td>Dumont #5 פינצטה עדינה</td><td>כלי מדע עדינים</td><td>11254-20</td><td></td></tr><tr><td>Forchlorfeneuron&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>32974</td><td></td></tr><tr><td>נוגדן IgG (H+L) נגד עכבר עיזים</td><td>בדיקות מולקולריות</td><td>N/A&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>נוגדן נמלה-ארנב עיזים IgG (H+L)</td><td>בדיקות מולקולריות</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>JetPEI מגיב טרנספקציה</td><td>Polyplus transfection</td><td>101-01N</td><td></td></tr><tr><td>Latrunculin B</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L5288</td><td></td></tr><tr><td>LC3 נוגדן</td><td>Novus Biologicals</td><td>NB100-2220</td><td></td></tr><tr><td>אגרוז נמס נמוך</td><td>Promega</td><td>V2111</td><td></td></tr><tr><td>MatTek צלחת תחתית זכוכית</td><td>תאגיד MatTek</td><td>P35G-1.0-14</td><td></td></tr><tr><td>MEM בתוספת L-alanyl-L-glutamine&nbsp;</td><td></td> תמיסת חומצות אמינו לא חיוניות <td>GIBCO</td> 41090028 <td></td></tr><tr><td>MEM</td><td>GIBCO</td><td>11140-035</td><td></td></tr><tr><td>מיקרו-מזרק&nbsp;</td>מכשיר חולץ <td>מיקרופיפטה Narishige</td><td>IM-300</td><td></td></tr>&<tr><td>nbsp;</td><td>סאטר אינסטרומנט ושות', נובאטו,</td> <td>P-87&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>שמן מינרלי</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P35G-1.0-14</td><td></td></tr><tr><td>מונוקלונלי אנטי טובולין, נוגדן אצטילטי&nbsp;</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>T6793</td><td></td></tr><tr><td>נוקודאזול</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>M1404</td><td></td></tr><tr><td>N-פנילתיאוריאה&nbsp;</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>P7629</td><td></td></tr><tr><td>פרפורמלדהיד</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>158127</td><td></td></tr><tr><td>פלואידין&nbsp;</td><td>בדיקות מולקולריות</td><td>A12379</td><td></td></tr><tr><td>תמיסה אדומה פנול</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P0290</td><td></td></tr><tr><td>קוקטייל מעכב פרוטאז</td><td>Roche</td><td>4693116001</td><td></td></tr><tr><td>p62/SQSTM1 נוגדן</td><td>Cliniscience</td><td>PM045</td><td></td></tr><tr><td>רפמיצין</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>R8781</td><td></td></tr><tr><td>נתרן פירובט</td><td>GIBCO</td><td>11360039</td><td></td></tr><tr><td>מגיב טרנספקציה</td><td>Life Technologies</td><td>12252-011</td><td></td></tr><tr><td>Vectashield סט קשיח מדיום הרכבה המכיל DAPI&nbsp;</td><td>מעבדות וקטור</td><td>H-1500&nbsp;</td><td></td></tr></tbody></table>

שימוש של<em&gt; flexneri shigella</em&gt; כדי לחקור אינטראקציות autophagy-נוגדנים

Use of Shigella flexneri to Study Autophagy-Cytoskeleton Interactions

flexneri Shigella הוא הפתוגן תאיים שיכול לברוח מphagosomes להגיע cytosol, ופלמר המארח יקטין שלד תא כדי לקדם את תנועתיות וההפצה שלה. עבודה חדשה הראתה כי חלבונים מעורבים בתנועתיות המבוסס על אקטין גם צמודים לautophagy, תהליך פירוק תאיים חיוני לחסינות אוטונומית תא. באופן מפתיע, תאי מארח עלולים למנוע תנועתיות המבוסס על תקטין של ס &#39; flexneri ידי מידור חיידקים &quot;כלובי septin &#39;בתוך ולמקד אותם לautophagy. תצפיות אלו מצביעות על כך שהבנה של septins מלאה יותר, משפחה של חלבוני קושרי GTP סיביים, תספק תובנות חדשות על התהליך של autophagy. דו&quot;ח זה מתאר פרוטוקולים כדי לפקח על אינטראקציות autophagy-שלד תא הנגרמות על ידי ס &#39; flexneri במבחנה תוך שימוש בתאים בתרבית רקמה וin vivo באמצעות זחלי דג הזברה. פרוטוקולים אלה מאפשרים חקירה של mechanis תאיתms ששולט הפצת חיידקים ברמת האורגניזם המולקולרית, תאית, וכל.

עם הזיהום של תאים בתרבית רקמה במבחנה, ס &#39; flexneri יכול לברוח מphagosome ולפלוש cytosol. בcytosol, תאי מארח יכולים למנוע את תנועתיות המבוסס על אקטין של Shigella ידי מידור חיידקים בתוך כלובי septin (איור 1 א). חיידקים וממולכד על ידי כלובי septin יכולים גם להיות מתויגים על ידי p62 סמני autophagy (איור 1) וLC3 (איור 1 ג). תצפיות אלו מדגישות מנגנון חדשני של הגנת מארחת המגביל את ההפצה של גורמי מחלה פולשנית, וגם לחשוף את הקישורים חדשים בין autophagy ושלד התא. באופן מפתיע, הדלדול של סמני autophagy מפחית באופן משמעותי כליאת septin של חיידקים (איור 2 א), והעבודה הראתה גם כי הדלדול של כליאת septin מפחית גיוס של סמני autophagy 8 באופן משמעותי. כך, לפחות במקרה של Shigella, septin הרכבה כלוב וformatio autophagosomeניתן לצפות n כתהליכים תלויים זה בזה. דרישות סלולריות אחרות למידור של Shigella ידי כלובי septin כוללות פילמור אקטין ופעילות actomyosin (איור 2). אין מודל טבעי עכבר של shigellosis, וחקירה של הפתוגנזה Shigella, ביולוגיה septin וautophagy חיידקי in vivo יכול להפיק תועלת ממודל חדש של בעלי חיים של זיהום, זחלי דג הזברה 19. אפשר להדביק זחלי דג הזברה על ידי הזרקת חיידקים באתרים אנטומיים שונים כגון זריקות זנב תוך ורידי לניסויי הישרדות, וזריקות שריר זנב למיקרוסקופיה in vivo (איור 3 א). בהתאם למינון, ס &#39; flexneri מוזרק בזחלי דג הזברה יכולה גם להיות מסומנת בתוך לאחר זיהום 48 שעות, או עלול לגרום לזיהום מתקדם וסופו של דבר קטלני (3B מספרים - 3D). fa ארסיות Shigellactors באים לידי ביטוי ב28 ° C, טמפרטורת הצמיחה האופטימלית של דג הזברה, וזיהום דג הזברה על ידי Shigella תלוי אך ורק על מערכת ההפרשה מהסוג III שלה (T3SS) 19, הקובע ארסיות חיונית במחלות של בני אדם. יחד צילום, תצפיות אלה מצביעים על כך שזחל דג הזברה מייצג מארח חדש בעל ערך לניתוח vivo של זיהום Shigella. הנגישות האופטית של זחלי דג הזברה מאפשרת הדמיה של כליאת septin in vivo (איור 4 א), הישג ​​שמעולם לא לפני הושג תוך שימוש במודלי מארח יונקים. כדי להשלים את ההוכחה לכך שכלובי septin ללכוד את החיידקים ממוקדים לautophagy in vivo, אחד יכול להדביק את זחלי דג הזברה מהונדסים להביע GFP-Lc3 ולבחון גיוס סמן autophagy לShigella (איור 4). לניתוח ultrastrucutral של autophagosomes Shigella in vivo, אלמיקרוסקופיה ectron יכולה לשמש כדי להראות את תפיסת cytosolic של חיידקים על ידי וקואולות קרום כפולה 19 בבירור. Autophagy נתפס כמרכיב מרכזי של חסינות תאים אוטונומיים ומנגנון הגנה חיוני מפני חיידקי intracytosolic 14-16. לאפיין פונקצית autophagy in vivo, ניתן להשתמש בם זחלי דג הזברה שטופל morpholino p62. בניגוד למכונות autophagy הליבה [לדוגמא., 36 חלבוני autophagy קשורים (ATGs) 26], p62 הוא לא חיוני להתפתחות של בעלי החוליות 27 וזחלים וכך דג הזברה יכול להתפתח בצורה תקינה לפני ההדבקה. באופן מפתיע, זחלים מדולדלים p62 מחוסן עם ס &#39; תוצאת flexneri בסיכון מוגבר לתמותה באופן משמעותי וניטל חיידקים מוגבר 19. בהסכם עם עבודה במבחנה מראה שהרכבת כלוב septin הוא תלות הדדית עם היווצרות autophagosome 7,8, גיוס septin לShigella מצטמצם באופן ברור בזחלים מדולדלים p62 ( <strאונג&gt; 4C איור). נתונים אלה מראים כי הישרדות דג הזברה תלויה בautophagy בתיווך p62 לשלוט זיהום חיידקים תוך תאיים. <img alt="איור 1" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51601/51601fig1highres.jpg" width="500" /> איור 1 כלוב septin במבחנה. () תאי הלה היו נגועים בס flexneri למשך 4 דקות שעות 40, קבוע, שכותרתו עם נוגדנים לSEPT9 וphalloidin, וצלם על ידי microcopy confocal. סרגל קנה מידה, 1 מיקרומטר תאי הלה (B). נדבקו עם ס &#39; flexneri למשך 4 דקות שעות 40, קבוע, שכותרתו עם נוגדנים לp62 וSEPT2, וצלם על ידי מיקרוסקופ אור הניאון. סרגל קנה מידה, 1 תאים (C) הלה מיקרומטר. היו transfected עם GFP-ATG8 / LC3, נגוע בס flexneri למשך 4 דקות שעות 40, קבוע, שכותרתו עם נוגדנים לSEPT2, וצלמתי על ידי מיל אור הניאוןcroscopy. סרגל קנה מידה, 1 מיקרומטר. נתונים אלה שונים מMostowy et 7 אל. <img alt="איור 2" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51601/51601fig2highres.jpg" width="500" /> .2 דרישות איור נייד להיווצרות כלוב -septin Shigella. () טופלו תאי הלה עם שליטה (CTRL), p62, ATG5, ATG6 או ATG7 siRNA. lysates כל התא של תאים שטופלו-siRNA היה immunoblotted לGAPDH, p62, ATG5, ATG6, או ATG7 להראות את היעילות של דלדול siRNA (למעלה). תאים שטופל siRNA היו נגועים בס flexneri למשך 4 דקות שעות 40, קבוע, ומתויג למיקרוסקופיה כמותית. גרפים (תחתון) מייצגים את ממוצע% ± SEM של Shigella בתוך כלובי SEPT2 מn ≥3 ניסויים לטיפול. (B) תאי הלה היו נגועים בס flexneri, שטופל בDMSO, cytochalasin D (CytD), B latrunculin (LatB), nocodazole (Noco), או blebbistatin (בועה) ולאחר 4 שעות 40 דקות היו קבועות ומתויגות למיקרוסקופיה כמותית. גרפים מייצגים את ממוצע% ± SEM של Shigella בתוך כלובי SEPT2 משני ניסויים בלתי תלויים לטיפול. נתונים אלה שונים מMostowy et 7 אל. <img alt="איור 3" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51601/51601fig3highres.jpg" width="500" /> איור 3 מודל דג הזברה של זיהום Shigella. תמונות () כדי להמחיש את הכיוון של זחל דג הזברה תחת סטראו. (לוח שמאלי) זחלי 72 הודעה hr הפריה דג הזברה הוצבו רוחבי בצלחת ההזרקה עם צד הגב שלהם מול מחט הזריקה. זיהום (פנל התיכון) בזרם דם בוצע על ידי injecting החיידקים (פתרון אדום) בוריד הזנב, אחורי לפתיחה ואברי המין. זיהום (פנל מימין) בשריר הזנב בוצע על ידי הזרקת החיידקים (פתרון אדום) מעל somite. (B) עקומות הישרדות של זחלים שלאחר הפריה 72 שעה מוזרק במינונים שונים של ס &#39; flexneri וטופחו על 28 מעלות צלזיוס במשך לאחר זיהום 48 שעות. הבידוד היעיל סווג כנמוך (&lt;10 3 CFU, חוגים פתוחים), בינוני (~ 4 x 10 3 CFU, משולשים פתוחים) או (~ 10 4 CFU, ריבועים פתוחים) הגבוה. אומר% ± SEM (פסים אופקיים) מn ≥3 ניסויים בכיתה הבידוד. (C) ספירת חיידקים חיים בhomogenates מזחלים בודדים בזמנים שונים לאחר הזיהום שנמדד על ידי ציפוי על ק&quot;ג הערה, רק זחלים ששרדו את הזיהום כלולים בניתוח ספירה. הממוצע ± SEM (פסים אופקיים) מוצג גם. (ד) הפצה של GFP- Shigella שנקבע על ידיהדמיה בשידור חי באמצעות סטראו ניאון בזמנים שונים לאחר הזיהום באמצעות מדיום, או הבידוד נמוך, במינון גבוה (זנב זריקות תוך ורידי). כיסוי של תמונת שידור (אפורה) וקרינת GFP (ירוק) (ב) -. (ד &#39;) נתונים אלה שונים מMostowy et al 19. <img alt="איור 4" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51601/51601fig4highres.jpg" width="500" /> איור 4 הביולוגיה של התא של זיהום Shigella in vivo. זחלי דג הזברה () היו נגוע בשריר הזנב עם GFP- Shigella (מינון נמוך) ל24 שעות, קבוע, שכותרתו עם נוגדנים נגד SEPT7 (אדום) ולGFP (ירוק ), וצלם על ידי מיקרוסקופ confocal. סרגל קנה מידה, 5 מיקרומטר. זחלי דג הזברה (B) GFP-Lc3 היו נגועים בmCherry- Shigella (מינון בינוני) ל4 שעות, קבוע, שכותרתו עם נוגדנים נגד mCherry (אדום) ולGFP (ירוק), וצלם על ידי מיקרוסקופ confocal. . סרגל קנה מידה, 1.5 מיקרומטר (C) זחלי דג הזברה שטופלו באו שליטה (CTRL; תמונה משמאל) או p62 (תמונה מימין) morpholinos היה נגוע בGFP- Shigella ל4 שעה (מינון בינוני), קבוע, שכותרתו עם נוגדנים נגד SEPT7 ( אדום) ולGFP (ירוק), וצלם על ידי מיקרוסקופ confocal. חיצים להדגיש כמה דוגמאות של Shigella וממולכד בכלובי septin (CTRL) או לא (p62 מדולדל) לאחר זיהום 4 שעות. סרגל קנה מידה, 5 מיקרומטר. נתונים אלה שונים מMostowy et al 19.

כדי לנטרל את הפצת הפתוגן, תאי מארח לארגן מחדש את שלד התא שלהם למדר חיידקים ולגרום autophagy. זיהום Shigella שימוש של תאי רקמת תרבות, מארח וגורמי הפתוגן שבבסיס תהליך זה זוהה ואופיין. תוך שימוש במודלי דג הזברה של זיהום Shigella, התפקיד של מולקולות ומנגנונים גילו נחקרים in vivo.

שימוש של<em&gt; Flexneri Shigella</em&gt; כדי לחקור אינטראקציות Autophagy-נוגדנים

Shigella flexneri is an intracellular pathogen that can escape from phagosomes to reach the cytosol, and polymerize the host actin cytoskeleton to promote ...

המטרה הכללית של נוהל זה היא לחקור מנגנוים תוך-תאיים השולטים בהפצה בקטריאלית במהלך זיהום in vitro ו-in vivo, באמצעות שימוש בתאי תרבית רקמה ובזחלי דג זברה. השיטה ה-in vitro מתחילה בהכנה של *Chlamydia trachomatis*, פתוגן בקטריאלי גרם-שלילי ואנטרו-אינוואזיבי. לאחר מכן מדמים זיהום, ומשתמשים ב-siRNA או ברכיבים פרמקולוגיים כדי לתמרן את מנגנון האוטופגיה ושלד התא של המארח במהלך הזיהום. כדי לחקור אינטראקציות בין האוטופגיה לשלד התא הנגרמות על ידי *Chlamydia* ב-in vivo, מדמים זיהום בעוברים של דג זברה שלושה ימים לאחר ההפריה בכל אחת מהשיטות.השלב הסופי הוא סימון הרקמות באמצעות סמני אוטופגיה וסמני שלד התא. בסופו של דבר, התוצאות יספקו תובנות לגבי המנגנונים הנדרשים לבקרת הזיהום על ידי תגובות מאביח של המארח. היתרון בשימוש בג'ל לחקר אוטופגיה של חיידקים לעומת חיידקים אחרים כגון listeria, הוא שאוטופגיה המכוונת לג'ל יכולה להילכד גם בתוך כלובים ראשוניים.שיטה זו עשויה לסייע במתן מענה לשאלות מפתח בתחום האוטופגיה, כגון מהו תפקידו של השלד התאי באוטופגיה ומהו תפקידה של האוטופגיה בהגבלה או בקידום של חיידקים תוך-תאיים? המשמעויות של טכניקה זו עשויות להתרחב לתהליכי אוטופגיה אחרים, כגון אוטופגיה של וירוסים או מיטוכונדריה, ויכולות להיות להן גם השלכות טיפוליות עבור מחלות אנושיות בעלות מרכיב של ספטין או אוטופגיה. אלו הן הדגמות בדגי זהברה.הדבקה ב-shige היא קריטית, כיוון שהשלבים הכוללים הזרקת חיידקים לדגיות זברה קשים ללמידה, מכיוון שהכנת המחט והזרקה נכונה דורשות זמן ודיוק גבוה. מיקרוסקופיה של הדבקת דגיות זברה דורשת ניסיון. עבור פרוטוקול זה, השתמש בזן הברש (wild type) של cha Flexner M nine DT מתוך מאגר גליצרול קפוא, קוור את החיידקים על צלחות Tryptic Soy עם Congo Red, והדגר אותם ב-37 °C למשך לילה.כמו כן, זרעו תאי hella בצלחות שיש-בארים במצע MEM עם 10% fetal calf serum ביום למחרת. בחרו מושבה בודדת וגדלו אותה במצע TCS למשך לילה עם ניעור בטמפרטורה של 37 °C ביום הבא. הכינו תרביות משנה על ידי ביצוע דילול של 1:80 ב-TCS רענן.כאשר הצפיפות האופטית של תרביות המשנה ב-600 nanometers היא בין 0.3 ל-0.6, אספו את החיידקים על ידי סבב צנטריפוגה במהירות של 1000 G למשך חמש דקות. לאחר מכן, השביחו את משקע החיידקים ב-MEM עד להגעה לאותה צפיפות אופטית.שלום, יש להדביק את התאים בריבוי הדבקה (MOI) של 100 ל-1 באופן ישיר. הוסיפו את ה-chag המדולל ב-MEM לתאי ה-hella הפרוסים, והביאו את נפח ה-MEM הכולל לשני מיליליטרים (2 mL) לבאר. לאחר מכן, כדי למקסם את היצמדות החיידקים לתאי המארח, סובבו את הפלטות בצנטריפוגה ב-700 G למשך 10 דקות ובטמפרטורת החדר, והדגירו את הפלטות למשך 30 דקות כדי לאפשר לחיידקים להדביק את התאים לאחר תקופת ההדבקה.שטפו בעדינות את התאים פעמיים. השתמשו ב-MEM טרי כדי להסיר עוד יותר חיידקים חוץ-תאיים, ודגרו את התאים במצע מלא המכיל Gentamycin למשך שעה אחת עד ארבע שעות, בהתבסס על תצפיות אמפיריות. לאחר מכן, קבעו וסמנו את התאים המודבקים.דמיינו אותם באמצעות מיקרוסקופיה פלואורסצנטית-אפי או מיקרוסקופיית קונפוקלית עם עדשה של 63 x או 100 x כדי להבחין בכלובים של cha septin המסומנים ב-DAPI, אשר ניתן לראות כמבנים דמויי טבעת בעלת קוטר של כ-0.6 מיקרונים המקיפים חיידקים ציטוזוליים המנמירים actin. ניתן לזהות את החיידקים שבתוך כלובים של septin גם באמצעות סמני אוטופגיה כגון P 62 ו-lc three a TG eight. מבחינה מושגית, ההיבט המאתגר ביותר בפרוצדורה זו הוא הזיהוי של אוטופגוזומים חיידקיים וכלובים של sing in vivo ו-in vitro, דבר הדורש מיקרוסקופיה וניתוח קפדניים.יתרה מכך, יש לוודא כי מנותחים מספר נEvents מתאים על פני מספר שכמיות ביולוגיות ולהבטיח מובהקות סטטיסטית לאחר הדבקת תאי hella ב-chila. ראשית, יש להמתין לפחות שעתיים וחצי כדי לאפשר לחיידקים להגיע לציטוזול. לאחר מכן, ניתן להוסיף טיפול תרופתי כדי לטפל בשלד התא.הוסיפו בין 1 ל-5 µL של תמיסת מלאי של תרופה מדוללת לכל 2 mL של מצע עם תאים כביקורת שלילית. טפלו בסדרת תאים אחת ב-DMSO בתוך MEM, ולאחר מכן דגרו את התאים למשך 30 דקות כדי להשפיע על הזרימה האוטופגית (autophagic flux) של התאים. השתמשו ב-20 nM rapamycin או ב-160 nM bafimycin.לאחר מכן, דגרו את התאים למשך ארבע עד 12 שעות לאחר הטיפול. קבעו וסמנו את התאים כפי שמתואר בפרוטוקול הכתוב. טכניקה זו מדמה זיהום ג'ל ואינטראקציות של אוטופגיה עם השלד התאי in vivo כדי להתחיל את התרבית המשנית ולאסוף ג'ל כפי שתואר בעבר, שטפו את החיידקים עם one XPBS וסובבו אותם בצנטריפוגה ב-1000 G למשך 10 דקות.לאחר מכן, השעו שוב את החיידקים ב-80 µL של 0.1% Phenol red ב-PBS. שמרו תמיסה זו על קרח. היא צריכה להכיל כ-2000 חיידקים לכל nanoliter. 72 שעות לפני ההזרקה המתוכננת, אספו עוברים מדגי zebrafish ששחררו ביצים כדי להסיר מזהמים חוץ-תאיים.שטפו את העובריים במצע E two עם 0.003% bleach למשך 10 דקות. לאחר 10 דקות, העבירו למצע E two ושטפו את העובריים חמש פעמים ב-E two. לאחר מכן, מלאו צלחות של 10 סנטימטר ב-50 מיליליטר של E two ועד 50 עובריים.גדלו סה"כ כ-100 עוברים בטמפרטורה של 28 מעלות צלזיוס, 24 שעות לאחר ההפריה. טפלו בעוברים המתפתחים ב-0.003% pheno threa בתוך מדיום E2 כדי למנוע היווצרות מעטפת, המפריעה למיקרוסקופיה. התחילו בהרדמה של הזחלים בני 72 שעות באמצעות אמבט trica בריכוז 200 microgram per milliliter במדיום E2.לאחר מכן, בעזרת מיקרו-מניפולטור ופינצטה עדינה, שברו את קצה מחט המיקרו-הזרקה ובדקו את השבירה תחת מיקרוסקופ. כעת טענו את המחט: ראשית, העבירו טיפה של תרבית חיידקים אל כיסוי זכוכית (cover slip) על משטח המיקרוסקופ. שנית, הפעילו את המיקרו-מזרק ואת בלוני הגז.שלישית, הנח את קצה המחט לתוך הטיפה. ורביעית, מלא את המחט כדי להעריך את הישרדות דגי הזברה במהלך זיהום ב-cha. בצע הזרקה תוך-ורידית עדינה בעזרת מכחול דק.מקמו את הזחליים המורדמים הילטראלית על פלטת ההזרקה, כאשר הצד הגבי שלהם פונה אל המחט. כעת יש למקם את קצה המחט קרוב לפתח הגניטלי-שניאלי, כאשר הוא מכוון אל וריד ה-coddle. לאחר מכן, דקרו את העור והזריקו בולוס של 1-5 nanoliter של חיידקים.הזרקה מוצלחת לווריד הזנב (codal vein) מזוהה על ידי ויזואליזציה של פנול אדום המתרחב לאורך הווריד. מבחינה טכנית, ההזרקה לווריד הזנב היא ההיבט הקשה ביותר בפרוצדורה זו, ואנו דורשים תרגול על זחלי zebrafish. מיקרוסקופיה קונפוקלית יכולה להיות מאתגרת גם כן, כיוון שהזחלים דורשים קיבוע נכון.לאחר ההזרקות, העבירו כל זחל נגוע באופן פרטני לבאר של פלטת 24 בארות המכילה מילליטר אחד של מצע E2. דגרו את הפלטה בטמפרטורה של 28 °C ועקבו אחר העוברים מדי יום, כדי להמחיש את הגיוס של septin ומסמני autophagy.הזריק את ה-Ella לאתרים מקומיים כגון שריר הזנב. הכן את הזחלים להזרקה כפי שהודגם בסעיף הקודם. הנח את דגי הזברה במצב צדי ומקם את המחט מעל השריר.לאחר מכן מחדירים למרווח שבין שני סומיטים כ-one nanoliter של Ella. הזרקה מוצלחת לשרירי הזנב תתבטא בכך שהסומייט המוזרק ייצבע באדום. כתוצאה משימוש בבופר phenol red, הכינו agarose 0.1% בעל נקודת התכה נמוכה במדיום E2 בטמפרטורה של 37 °C.הוסיפו טיפות של agarro באופן פרטני לכלי עם תחתית זכוכית. העבירו את הזחלים המוזרקים עם נפח מינימלי של תמיסה אל טיפות ה-agarro. כווני אותם שם כרצונכם והמתינו עד שה-agarro יתגבש.לאחר מכן, כסו את כל הצלחית ב-LMA ולאחר מכן ב-E two עם trica. לאחר מכן, קחו Zacks מדי שתי דקות למשך מספר שעות. בתרביתי תאי רקמה מזוהמים, shaila בורחת מהפגוזום אל הציטוזול, שם שלד התא של המארח יכול להסתדר מחדש ולביית את החיידקים בתוך מבנים דמויי כלוב של septin.חיידקים הלכודים בכלובים של ספטין מזוהים על ידי סממני אוטופגיה כגון P 62 ו-lc three. דג הזברה מהווה מאחס חדש בעל ערך למחקר in vivo של זיהום CHA. בהתאם למינון הזיהומי, דגי זברה יכולים לסלק מינון נמוך תוך 48 שעות לאחר הזיהום, או במקרה של מינון גבוה, להיסף מהזיהום.השקיפות האופטית של דגי זברה (zebra fish) מאפשרת ויזואליזציה in vivo של כלובי ספטין (septin cages), הישג שלא בוצע במודלים אחרים של חולייתנים, כדי להשלים את הראיות לכך שכלובי ספטין לוכדים חיידקים המיועדים לאוטופגיה. דגי זברה טרנסגניים GFP lc three הוחדרו כדי לצפות בגיוס של אוטופגוזומים lc three חיוביים ל-cha תוך-תאי in vivo בזמן אמת. כדי לאפיין את האוטופגיה, זחליים שטופלו ב-P 62 morpho הוחדרו עם chala. זחליים שטופלו ב-control Morpho הראו מבני כלוב ספטין תקינים.עם זאת, בזבובים שעובדו עם morpho של P 62, גיוס הספטין ל-chala היה מופחת, מה שמעיד על כך ש-P 62 הוא מרכיב חיוני למנגנון האוטופגיה. ברגע שהזיהום נשלט, ניתן לבצע PHI בזבובים תוך שעה עד שעתיים כאשר הפעולה מבוצעת כראוי בעקבות פרוצדורה זו. ניתן להשתמש בשיטות אחרות, כגון עריכה גנומית באמצעות מערכת CRISPR/Cas9, כדי לתמרן את הגנום של דג הזברה. בנוסף, ניתן להנדס דג זברה עם קו פלואורסצנטי ממוקד חדש כדי לעקוב בזמן אמת אחרי הדינמיקה של שלד התא באוטופגיה במהלך זיהום ג'ל באמצעות דימיון חי לאחר גילויו.כלוב ה-Septin של Chaga שימש למחקר של אינטראקציות בין השלד התאי לאוטופגיה, והספיק את הדרך לחוקרים בביולוגיה של זיהומים ותאיים להאיר תפקידים חדשים של השלד התאי באוטופגיה. אין לשכוח שעבודה עם Ella עלולה להיות מסוכנת ביותר, ויש לנקוט תמיד באמצעי זהירות, כגון עבודה בסביבת מעבדה ברמה 2 (level two), בעת ביצוע הליך זה.

use-of-shigella-flexneri-to-study-autophagy-cytoskeleton-interactions

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

אימונולוגיה וזיהומים

גישה חזקים כדי לפקח על משלוח של האברונים את לומן חומצי של vacuole את השמרים במשך השפלה ומיחזור מתואר. השיטה מסתמכת על תיוג הספציפי של האברונים היעד עם פלואורסצנטי כפול פליטת מקודדים גנטית pH-biosensor, ויזואליזציה של תאים בודדים באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי.

Assay מיקרוסקופ פלואורסצנטי עבור Mitophagy ניטור השמרים Saccharomyces cerevisiae

Autophagy היא תהליך בכל מקום שמאפשר לתאים לבזות ולמחזר חלבונים ואת האברונים. אנו מיישמים מיקרוסקופ פלואורסצנטי המתקדם כדי להמחיש ולכמת קטנים, אבל שינויים מהותיים, פיסיים הקשורים לאינדוקציה של autophagy, כולל הקמת וההפצה של autophagosomes וlysosomes, ומיזוגם בautolysosomes.

ניתוח כמותי של Autophagy באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי 3D מתקדם

אנו מתארים שיטה למעקב אחר קרע endomembrane שהושרו על ידי החיידקים תוך...

מידות תא יחיד של קרע vacuolar נגרמים על ידי פתוגנים תאיים

מיקרוסקופיה זמן לשגות של סמני autophagy כותרתו fluorescently מאפשרת ניטור של תגובת autophagy הדינמית עם רזולוציה גבוהה זמנית. שימוש autophagy ספציפית וסמני אברון בשילוב של 3 צבעים שונים, אנו יכולים לעקוב אחר תרומתו של חלבון להיווצרות autophagosome בהקשר מרחב ובזמן חזק.

לחיות תא הדמיה של אירועי autophagy מוקדמים: Omegasomes ומעבר

הנה, cytometry זרימת multispectral הדמיה עם תכונה אנליטית שמשווה תמונות פירוט בהיר של 3 סמנים autophagy ו quantifies שיתוף שלהם לוקליזציה, יחד עם ספירת LC3 ספוט, שימש למדוד autophagy באופן אובייקטיבי, כמותי, סטטיסטית וחסכונית.

הערכת השטף autofagic ידי מדידת LC3, p62, ו LAMP1 Co-localization באמצעות multispectral הדמיה cytometry

מוצגים כאן שתי שיטות מחקר של אינטראקציה עם נוגדן מבוססי חלבון: immunofluorescence ו- immunoprecipitation. טכניקות אלה מתאימים ללמוד הפיזי אינטראקציות בין חלבונים עבור גילוי הרומן מרכיבי הסלולר איתות המסלולים, הבנה חלבון דינמיקה.<br...

חקר אינטראקציות חלבון במחקר Autophagy

כאן, אנו מציגים פרוטוקולים להמחיש תגובות סידן (Ca2 +) שהפיק הלה תאים נגועים על ידי שיגלה. על ידי אופטימיזציה של הפרמטרים של זיהום חיידקי, הדמיה עם Ca2 + רגשים פלורסנט, מאופיינים טיפוסיות גלובאליים ומקומיים Ca2 + אותות הנגרמת על ידי חיידקים על פני מגוון רחב של קינטיקה זיהום.

הדמיה Ca2 + תגובות במהלך זיהום שיגלה תאי אפיתל

פרוטוקול להדמיית המיקרוטובולות הדינמיות ב-vivo באמצעות חלבון מחייב קצה עם תווית פלואורסצנטית הוצג. תיארנו את השיטות לתיוג, תמונה וניתוח המיקרוטובולות הדינמיות בתאי העצב של מיקרוטובול לרוחב אחורי (PLM) של C. elegans.

In vivo הערכה של מיקרוטובולה דינמיקה והתמצאות ב Caenorhabditis elegans נוירונים

כאן, אנו מציגים פרוטוקול למיקרוסקופ אור-אלקטרונים מתאמי אופטימלי על חתך המבוסס על תיוג אנדוגני פלואורסצנטי ככלי לחקר לוקליזציה של חלבונים נדירים ביחס לאולטרה-מבנה תאי. כוחה של גישה זו מודגם על ידי לוקליזציה אולטרה-מבנית של LC3 אנדוגני בתאים מורעבים ללא טיפול Bafilomycin.

לוקליזציה אולטרה-מבנית של LC3 אנדוגני על ידי מיקרוסקופ אור-אלקטרונים קורלטיבי בחתך

הפרוטוקול הנוכחי מתאר בדיקות זיהום כדי לחקור היצמדות לשיגלה , פלישה ושכפול תוך תאי באמצעות קווי תאי אפיתל במבחנה .

ניתוח זיהום תאי אפיתל עם שיגלה

פרוטוקול זה מתאר מנגנון לשימוש במיקרוסקופ אור ואלקטרונים בקורלציה כדי להמחיש את האינטראקציה של מיטוכונדריה וליזוזומים המסומנים ב-mEosEM ו-APEX2, בהתאמה.

מיקרוסקופ אור ואלקטרונים בקורלציה דו-צבעונית להדמיית אינטראקציות בין מיטוכונדריה לליזוזומים

חקור את האינטראקציות בין אוטופאגיה לציטוסקלטון במהלך זיהום Shigella flexneri בתאי HeLa ובזברה פיש. שיטות אלו מאפשרות לעקוב אחר יצירת כלובי ספטין המגבילים תנועת חיידקים ומכוונים אותם לפירוק אוטופאגי.

שימוש של

גלה סרטונים נוספים