Name: פיתוח של Hydrogel Amelogenin-chitosan עבור במבחנה אמייל לצמיחה מחודשת עם ממשק צפוף (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-07-10T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 26 s
Description: למד פיתוח הידרוג'ל אמלוגנין-כיטוזן לשחזור אמייל שטחי. השיטה כוללת גידול in situ של גבישי אפטיט בתוך ההידרוג'ל ליצירת ממשק צפוף וחזק עם האמייל הטבעי.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

המחברים רוצים להודות לפרופ' סטיבן נאט ולמר יוז'נג ז'אנג על הסיוע בקרן יונים ממוקדת, ולמרכז למיקרוסקופיה אלקטרונית ומיקרואנליזה (CEMMA) באוניברסיטת דרום קליפורניה למיקרוסקופ אלקטרונים. המחקר נתמך על ידי מענקי NIH-NIDCR; DE-13414 ו-DE-020099 ל-J.M.O.

טוחנות האדם חולצו בעקבות ההליכים סטנדרטיים להפקה בבית הספר לרפואת השיניים אוסטרוב מאוניברסיטת הדרום קליפורניה וטפלו באישור דירקטוריון סקירה המוסדית. 1. הכנת השן חרוטה חומצת Slice <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בחר טוחנת שלישית אדם ללא כל עששת משוחזרת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להסיר את חלק השורש של השן הטוחנת, ולחתוך את הכתר של השן הטוחנת longitudinally לפרוסות 2 מ&quot;מ עובי בעזרת מסור יהלום במהירות נמוכה מקורר מים. Ultrasonically לנקות פרוסות אלה למשך 2 דקות, ולאחר מכן לשטוף אותם עם מים deionized 3 פעמים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי לדמות נגעים מכרסמים, לחרוט את פרוסות שן עם 30% חומצה זרחתית ל30 שניות ולאחר מכן לשטוף אותם מייד במים deionized. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Ultrasonically לנקות את הפרוסות חרוטות למשך 2 דקות, ולאחר מכן לשטוף אותם עם מים deionized 3 פעמים. </li></ol> 2. הכנת Hydrogel Amelogenin-chitosan <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תרופות לn של פתרון מניות chitosan <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ממיסים 1% (w / v) chitosan (משקל מולקולרי בינוני, 75-85% deacetylated) ב1% (v / v) פתרון חומצה אצטית ואחרי ערבוב על 80 מעלות CO / נ </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר קירור הפתרון לRT, לסנן את פתרון chitosan באמצעות מסנן 0.45 מיקרומטר. כוון את ערך ה-pH ל5.0 על ידי הוספת 1 פתרון M NaOH. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכנת סידן ופתרון מניות פוספט (M 0.1) <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשקול את סידן כלורי (CaCl 2) ולהכין פתרון 0.1 M, ואז לערבב בעזרת מערבולת עד הפתרון הוא ברור. כוון את ערך ה-pH ל11 על ידי הוספת 1 פתרון M NaOH. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשקול את פוספט dibasic נתרן (Na 2 HPO 4) ולהכין פתרון 0.1 M, ואז לערבב בעזרת מערבולת עד הפתרון הוא ברור. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ביטוי וטיהור amelogenin רקומביננטי 17-18 Amelogenin רקומביננטי באורך מלא החזיריים (rP172) משמש כאן יש 172 חומצות אמינו והוא אנלוגי של מלאאורך P173 חזירי ילידים, אבל חסר מתיונין N-המסוף כמו גם קבוצת פוספט בSer16 18. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 20 גרם של מרק Lysogeny אבקה אגר (LB) ל500 מיליליטר deionized מים, חיטוי הפתרון ב121 ° C (הגדרה נוזלית) עבור 20 דקות. בואו מגניב אגר ל~ 55 ° C, להוסיף אמפיצילין (100 מיקרוגרם / מיליליטר) לתוך פתרון אגר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מעביר את הפתרון אגר לצלחות פטרי, בואו כל צלחת מגניב עד שהוא מוצק, ואז להפוך כדי למנוע התעבות על אגר. צלחות חנות בשקיות פלסטיק ב 4 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Streak הצלחת אגר LB עם תאי רקומביננטי (E.coli-BC21) ממניות גליצרול (-80 מעלות צלזיוס). דגירה הצלחות O / N ב 37 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן 50 מיליליטר של תקשורת NZCYM וחיטוי התקשורת ב121 מעלות צלזיוס במשך 30 דקות. לאפשר התקשורת להתקרר, להוסיף 50 μl של 100 מיקרוגרם / מיליליטר אמפיצילין ל50 מיליליטר התקשורת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחסן מושבה אחת מהצלחת אגר LB לתוך תקשורת NZCYM 50ml בתוספת ampicillפנימה דגירה התאים O / N בחממה רועדת ב 37 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן 1 ליטר של מדיה NZCYM וחיטוי התקשורת ב121 מעלות צלזיוס במשך 30 דקות. הוסף 1 מיליליטר של 100 מ&quot;ג / מיליליטר אמפיצילין ל1,000 מיליליטר תקשורת. קח את צפיפות אופטית קריאה (OD) כריק באמצעות ספקטרופוטומטר UV-Vis. הערה: אל תמחק את זה אחרי הקריאה ראשונה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחסן 10 מיליליטר של תרבית התאים מהצעד 2.3.5 ל1,000 מיליליטר תקשורת מהצעד 2.3.6. קראו את הצפיפות האופטית ב595 ננומטר מייד לאחר חיסון. קח קריאת הצפיפות האופטית מעת לעת כדי לשמור על מסלול של הצמיחה. הערה: קראו את החסר בכל פעם שהובסו הוא נלקח. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לגרום לעם 700 μl של איזופרופיל β-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG, 1 מ &#39;), כאשר התפתחות החיידקים מגיעה לכ 0.75 ~ 0.8 OD ב 595 ננומטר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קציר התאים כאשר OD מגיע 1.1. יוצקים את תכולת הבקבוק לתוך 6 בקבוקי פלסטיק. לאזן ולשקול את הבקבוקים לפני השימוש בצנטריפוגות. צנטריפוגה עבור 20 דקות ב8,554 XG ב 4 ° C.שמור על התא גלולה ב-20 ° CO / נ </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קח את כדורי התא ולשלב אותם בצינור 50 מיליליטר. הוספת 3.5 מיליליטר של 4M guanidine HCl לליטר של תסיסה. פעמים Sonicate 2-3 על קרח, 30 שניות בכל פעם, עם מרווחי דקות 1. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לעשות דילולים 6x של נפח תא עם 0.5% חומצה פורמית ולתת לו לבחוש בחדר הקר במשך שעה 2. צנטריפוגה במשך 30 דקות, 8,554 XG ב 4 ° C. שמור את supernatant. הוסף 20% אמוניום סולפט רווי באמצעות פתרון המניות הרוויים ומערבבים בחדר הקר, O / נ </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צנטריפוגה במשך 30 דקות, 8,554 XG ב 4 ° C ולשמור את הכדור. לשקם את כדורים ב0.1% חומצת trifluoroacetic (TFA), עומס על עמודת C4 (מ&quot;מ 10 x 250, 5 מיקרומטר), וfractionate באמצעות שיפוע ליניארי של 0.1% אצטוניטריל = 60% = TFA ו-B בTFA, ב קצב זרימה של 1.5 מיליליטר · -1 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להקפיא את פתרון החלבון על קרח יבש וLyophilize מדגם O / נ הקפוא </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכנת amelogenin-chitosan (CS-אמל) hydrogאל (איור 1 א) <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 200 מיקרוגרם של rp172 לתוך צינור המכיל 960 μl של 1% פתרון chitosan, ואז לערבב בעזרת מערבולת עד הפתרון הוא ברור. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 25 μl של 0.1 פתרון M CaCl 2 ואחריו 15 μl של 0.1 M Na 2 פתרון HPO 4 לפתרון chitosan המכיל amelogenin, ואז לערבב בעזרת מערבולת במשך 5 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> התאם את ה-pH של תמיסת CS-אמל ל6.5 על ידי הוספת 1 פתרון M NaOH בזהירות. הידרוג&#39;ל CS-אמל יהווה כאשר ערך ה-pH מגיע 6.5. </li></ol></li></ol> 3. אמייל לצמיחה מחודשת בHydrogel Amelogenin-chitosan <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכנת פתרון רוק מלאכותי <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לפזר כמות מסוימת של מגנזיום כלוריד (MgCl 2, 0.2 מ&quot;מ), סידן כלורי (CaCl 2, 1 מ&quot;מ), אשלגן זרחה dihydrogen (KH 2 PO 4, 4 מ&quot;מ), אשלגן כלורי (KCl, 16 מ&quot;מ) ואמוניום כלוריד ( NH 4 Cl, 4.5 מ&quot;מ) ב20 HEPES מ&quot;מ(4 - (2-Hydroxyethyl) piperazine-1-אתאן-sulfonic חומצה) חיץ 12. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> התאם ל-pH 7.0 עם 1 M NaOH ולאחסן את פתרון הרוק המלאכותי ב 4 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לפני השימוש בפתרון, להוסיף פלואוריד הנתרן (NAF, 300 עמודים לדקה). </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> יישום של הידרוג&#39;ל CS-אמל <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תחול על 20 הידרוג&#39;ל CS-אמל μl לפרוסת השן חרוטה באמצעות מזרק (איור 1). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ייבש את פרוסת השן מכוסה הידרוג&#39;ל בייבוש על RT במשך שעה 2. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להעביר את פרוסת השן לכוס המכילה 30 מיליליטר של תמיסת רוק מלאכותית. מכסה את הכוס בנייר אלומיניום, ולאחר מכן לשמור את הכוס בתנור ב 37 מעלות צלזיוס למשך 7 ימים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את פרוסת השן ולייבש אותו בתא ייבוש ב RT. </li></ol></li></ol> 4. אפיון הממשק שבין שכבה גדלה לאחרונה ואמייל מיקרו של הממשק שבין שכבת האמייל וגדל לאחרונה היה observed ידי מיקרוסקופיית אלקטרונים (SEM) ומיקרוסקופיה גבוהה מהפכה העברת אלקטרונים (HR-TEM). מדגם TEM הוכן באמצעות אלומת יונים ממוקדת טכניקה (FIB), צעדים לאשר הנן כדלקמן. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> טען את הדגימה למכשיר FIB-SEM ולסיים את כל המערכים בהתאם להוראות ההפעלה. הערה: התאמת Z פיין יש לבצע לפחות 2 פעמים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להפקיד רובד פחמן (15 × 3 מיקרומטר) על המדגם כדי להגן על המבנה הבסיסי (איור 2 א). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מיל המדגם בזהירות בצדדים העליונים, תחתון וימניים של שכבת פחמן להכין חתיכת המדגם דקה, ולאחר מכן לחתוך את הצד התחתון של פיסה דקה הזה. הערה: בדוק את יישור אלומת היונים לפני כל שלב טחינה (איור 2). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ולד קצה Pt על פיסה דקה וחותך את צד השמאל כדי להפריד את החתיכה (איור 3 ג) לדוגמה. הערה: בדוק את יישור אלומת היונים לפני שלב הריתוך. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הרם את tהוא PT להטות עם המדגם לאט, ולעלות על מדגם שבשבת על גבי רשת TEM עילוי-out. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לנתק את הקצה מהמדגם, ודק מדגם עד העובי שלה הוא פחות מ 100 ננומטר (איור 3D). הסר את הדגימה מהמכשיר לבצע תצפית TEM. הערה: בדוק את יישור אלומת היונים לפני כל תהליך הרזיה. </li></ol> 5. הערכת נכסי עקידה והמכאנית של שכבה גדלה חדש <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכוח המחייב נבחנים על ידי טיפול קולי. שמור על פרוסת השן תוקנה בשואב קולי (42 kHz, 100 W) עבור 10 דקות, ולאחר מכן לבחון את הממשק שבין השכבה לתיקון ואמייל טבעי עם ניתוח SEM backscattered אלקטרונים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> למדוד את הקשיות ומודולוס אלסטיות ב20 נקודות בדיקה על כל משטח אמייל לתיקון (n = 3) על ידי ננו indenter עם טיפ ברקוביץ&#39;. </li></ol> 6. Immunofluorescence מכתים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שטוף את פרוסת השן עם buffe טריסמלוח r (TBS) ל15 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחסום עם 1% אלבומין בסרום שור (BSA) בTBS ל15 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את הנוזל ודגירת O המדגם / N עם 1 ° Ab (1:500 העוף Anti-Amelogenin) בדילול מלא בTBS (BSA 0.1%, 0.3% טריטון X-100). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף את המדגם עם TBS ל30 דקות דגירה O / N עם 2 ° Ab (1:100 FITC אנטי עוף) בדילול מלא בTBS. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף את המדגם עם TBS ל30 דקות ולהשאיר לייבוש למשך 30 דקות נוספות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שים לב על ידי מיקרוסקופ פלואורסצנטי. </li></ol>

<ol><li>Moradian-Oldak, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein-+mediated+enamel+mineralization%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Bioscience%22%5BJournal%5D)">Protein- mediated enamel mineralization.</a> Frontiers in Bioscience. 17, 1996-2023 (2012).</li>
<li>Palmer, L. C., Newcomb, C. J., Kaltz, S. R., Spoerke, E. D., Stupp, S. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biomimetic+Systems+for+Hydroxyapatite+Mineralization+Inspired+By+Bone+and+Enamel%5BTitle%5D)+AND+%22Chem.+Rev%22%5BJournal%5D)">Biomimetic Systems for Hydroxyapatite Mineralization Inspired By Bone and Enamel.</a> Chem. Rev. 108, 4754-4783 (2008).</li>
<li>Onuma, K., Yamagishi, K., Oyane, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nucleation+and+growth+of+hydroxyapatite+nanocrystals+for+nondestructive+repair+of+early+caries+lesions%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cryst.+Growth%22%5BJournal%5D)">Nucleation and growth of hydroxyapatite nanocrystals for nondestructive repair of early caries lesions.</a> J. Cryst. Growth. 282, 199-207 (2005).</li>
<li>Xie, R. Q., Feng, Z. D., Li, S. W., Xu, B. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((EDTA-Assisted+Self-Assembly+of+Fluoride-Substituted+Hydroxyapatite+Coating+on+Enamel+Substrate%5BTitle%5D)+AND+%22Cryst.+Growth+Des%22%5BJournal%5D)">EDTA-Assisted Self-Assembly of Fluoride-Substituted Hydroxyapatite Coating on Enamel Substrate.</a> Cryst. Growth Des. 11, 5206-5214 (2011).</li>
<li>Li, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bio-Inspired+Enamel+Repair+via+Glu-Directed+Assembly+of+Apatite+Nanoparticles%3A+an+Approach+to+Biomaterials+with+Optimal+Characteristics%5BTitle%5D)+AND+%22Advanced+Materials%22%5BJournal%5D)">Bio-Inspired Enamel Repair via Glu-Directed Assembly of Apatite Nanoparticles: an Approach to Biomaterials with Optimal Characteristics.</a> Advanced Materials. 23, (2011).</li>
<li>Yin, Y. J., Yun, S., Fang, J. S., Chen, H. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemical+regeneration+of+human+tooth+enamel+under+near-physiological+conditions%5BTitle%5D)+AND+%22Chem.+Commun%22%5BJournal%5D)">Chemical regeneration of human tooth enamel under near-physiological conditions.</a> Chem. Commun. , 5892-5894 (2009).</li>
<li>Fan, Y., Sun, Z., Moradian-Oldak, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Controlled+remineralization+of+enamel+in+the+presence+of+amelogenin+and+fluoride%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Controlled remineralization of enamel in the presence of amelogenin and fluoride.</a> Biomaterials. 30, 478-483 (2009).</li>
<li>Li, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Repair+of+enamel+by+using+hydroxyapatite+nanoparticles+as+the+building+blocks%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Mater.+Chem%22%5BJournal%5D)">Repair of enamel by using hydroxyapatite nanoparticles as the building blocks.</a> J. Mater. Chem. 18, 4079-4084 (2008).</li>
<li>Chen, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Acellular+synthesis+of+a+human+enamel-like+microstructure%5BTitle%5D)+AND+%22Advanced+Materials%22%5BJournal%5D)">Acellular synthesis of a human enamel-like microstructure.</a> Advanced Materials. 18, (2006).</li>
<li>Yamagishi, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+synthetic+enamel+for+rapid+tooth+repair%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">A synthetic enamel for rapid tooth repair.</a> Nature. 433, 819-819 (2005).</li>
<li>Bleek, K., Taubert, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((New+developments+in+polymer-controlled%2C+bioinspired+calcium+phosphate+mineralization+from+aqueous+solution%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Biomaterialia%22%5BJournal%5D)">New developments in polymer-controlled, bioinspired calcium phosphate mineralization from aqueous solution.</a> Acta Biomaterialia. 9, 6283-6321 (2013).</li>
<li>Fletcher, J., Walsh, D., Fowler, C. E., Mann, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electrospun+mats+of+PVP%2FACP+nanofibres+for+remineralization+of+enamel+tooth+surfaces%5BTitle%5D)+AND+%22Crystengcomm%22%5BJournal%5D)">Electrospun mats of PVP/ACP nanofibres for remineralization of enamel tooth surfaces.</a> Crystengcomm. 13, 3692-3697 (2011).</li>
<li>Fang, P. -A., Conway, J. F., Margolis, H. C., Simmer, J. P., Beniash, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hierarchical+self-assembly+of+amelogenin+and+the+regulation+of+biomineralization+at+the+nanoscale%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Hierarchical self-assembly of amelogenin and the regulation of biomineralization at the nanoscale.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108, 14097-14102 (2011).</li>
<li>Yang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((How+Amelogenin+Orchestrates+the+Organization+of+Hierarchical+Elongated+Microstructures+of+Apatite%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Physical+Chemistry+B%22%5BJournal%5D)">How Amelogenin Orchestrates the Organization of Hierarchical Elongated Microstructures of Apatite.</a> Journal of Physical Chemistry B. 114, 2293-2300 (2010).</li>
<li>Li, H., Fujiki, Y., Sada, K., Estroff, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gel+incorporation+inside+of+organic+single+crystals+grown+in+agarose+hydrogels%5BTitle%5D)+AND+%22Crystengcomm%22%5BJournal%5D)">Gel incorporation inside of organic single crystals grown in agarose hydrogels.</a> Crystengcomm. 13, 1060-1062 (2011).</li>
<li>Ruan, Q., Zhang, Y., Yang, X., Nutt, S., Moradian-Oldak, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+amelogenin-chitosan+matrix+promotes+assembly+of+an+enamel-like+layer+with+a+dense+interface%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Biomater%22%5BJournal%5D)">An amelogenin-chitosan matrix promotes assembly of an enamel-like layer with a dense interface.</a> Acta Biomater. 9, 7289-7297 (2013).</li>
<li>Hu, C. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cloning%2C+cDNA+sequence%2C+and+alternative+splicing+of+porcine+amelogenin+mRNAs%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Dental+Research%22%5BJournal%5D)">Cloning, cDNA sequence, and alternative splicing of porcine amelogenin mRNAs.</a> Journal of Dental Research. 75, 1735-1741 (1996).</li>
<li>Bromley, K. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Amelogenin+Processing+by+MMP-20+Prevents+Protein+Occlusion+Inside+Calcite+Crystals%5BTitle%5D)+AND+%22Cryst.+Growth+Des%22%5BJournal%5D)">Amelogenin Processing by MMP-20 Prevents Protein Occlusion Inside Calcite Crystals.</a> Cryst. Growth Des. 12, 4897-4905 (2012).</li>
<li>Fan, Y., Sun, Z., Abbott, C., Moradian-Oldak, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+enamel+inspired+nanocomposite+fabrication+through+amelogenin+supramolecular+assembly%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">A enamel inspired nanocomposite fabrication through amelogenin supramolecular assembly.</a> Biomaterials. 28, 3034-3042 (2007).</li>
<li>Wright, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+molecular+etiologies+and+associated+phenotypes+of+amelogenesis+imperfecta%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Med.+Gent.+A%22%5BJournal%5D)">The molecular etiologies and associated phenotypes of amelogenesis imperfecta.</a> Am. J. Med. Gent. A. 140 (23), 2547-2555 (2006).</li>
<li>Eimar, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+enamel+hardness+by+its+crystallographic+dimensions%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Biomaterialia%22%5BJournal%5D)">Regulation of enamel hardness by its crystallographic dimensions.</a> Acta Biomaterialia. 8, 3400-3410 (2012).</li>
<li>Ruan, Q., Siddiqah, N., Li, X., Nutt, S., Moradian-Oldak, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Amelogenin-chitosan+matrix+for+human+enamel+regrowth%3A+effects+of+viscosity+and+supersaturation+degree%5BTitle%5D)+AND+%22Connect+Tissue+Res%22%5BJournal%5D)">Amelogenin-chitosan matrix for human enamel regrowth: effects of viscosity and supersaturation degree.</a> Connect Tissue Res. , (2014).</li>
<li>Pouget, E. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Initial+Stages+of+Template-Controlled+CaCO3+Formation+Revealed+by+Cryo-TEM%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">The Initial Stages of Template-Controlled CaCO3 Formation Revealed by Cryo-TEM.</a> Science. 323, 1455-1458 (2009).</li>
<li>Gebauer, D., Volkel, A., Colfen, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stable+Prenucleation+Calcium+Carbonate+Clusters%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Stable Prenucleation Calcium Carbonate Clusters.</a> Science. 322, 1819-1822 (2008).</li>
</ol>

למחברים אין מה לחשוף.

בעוד שתכולת המינרלים של אמייל היא גבוהה מה שהופך את רקמת mineralized הקשה ביותר בגוף האדם, bioceramic זה הוא רגיש לתהליכי איבוד מינרלים, אשר לעתים קרובות להתרחש כעששת או שחיקת שיניים. מוטציות גנטיות יכולות גם היא לגרום לאמייל דק או רך שמוביל לסדרה של מחלות תורשתיות של מום אמייל נקרא Amelogenesis imperfecta 20. מוצרי טיפוח בריאות פה המכילים פלואוריד או CPP-ACP כבר על השוק במשך כמה שנים (כלומר, לכות, משחות שיניים ומי פה) כדי לקדם את מינרליזציה החוזרת של ...

אמייל שיניים הוא המשטח המינרלי הקשה של שיניים אנושיות. הוא מורכב מגבישי אפטיט דמויי מחט רבים, אשר ארוזים במנסרות מאורגנות ומקבילות כדי להבטיח את החוזק המכני הייחודי וההגנה הביולוגית שהאמייל מספק1-2. בניגוד לרקמות מינרליות אחרות, כגון עצם ודנטין, אמייל בוגר הוא א-תאי ואינו יכול להתחדש לאחר אובדן מינרלים משמעותי1-2, המתרחש לעתים קרובות כעששת או שחיקה. מוצרים זמינים מסחרית כגון לכות המכילים פלואוריד, משחות שיניים ושטיפות פה יעילים במינרליזציה מחדש של אמייל, אך לאף אחד מהם אין פוטנציאל לקדם היווצרות גבישי אפטיט מאורגנים. מבחינה קלינית, הטיפול הקונבנציונלי לתיקון אמייל כולל הליך מילוי בחומרים מלאכותיים כגון אמלגם, קרמיקה או שרף מרוכב 3. עם זאת, חומרים אלה בדרך כלל אינם מתממשקים היטב עם הרקמה הטבעית המקיפה את הנגע, מכיוון שהמבנים, המרכיבים והתכונות שלהם שונים מהאמייל הטבעי. כתוצאה מכך, עששת משנית מתפתחת לעתים קרובות שעות נוספות בממשק בין השן לחומרים זרים. לכן, צמיחה מחודשת באתרה של אמייל עם ממשק צפוף היא יעד אטרקטיבי לתחומי מדעי החומרים והסטומטולוגיה. דרך מבטיחה במיוחד להשיג מטרה זו היא סינתזה ביומימטית של חומר דמוי אמייל על פני האמייל. לאחרונה נעשו ניסיונות רבים במבחנה להכין חומרים דמויי אמייל באמצעות מערכות ביומימטיות המכילות ננו-אפטיטים או תוספים אורגניים שונים 4-12. עם זאת, פיתוח האסטרטגיה הביומימטית האופטימלית לקידום גבישי רמינרליזציה להשגת ממשק צפוף מושלם הוא עדיין אתגר. 
במהלך מינרליזציה של אמייל, הצמיחה וההתארכות המכוונת של גבישי אפטיט מווסתת על ידי מטריצה עשירה באמלוגנין 1,13-14. כדי לחקות את המטריצה האורגנית בפיתוח אמייל, כאן אנו מתארים פרוטוקול מפורט לייצור הידרוג'ל אמלוגנין-צ'יטוזן (CS-AMEL) לצמיחה מחודשת של אמייל באתרו על משטח אמייל חרוט בחומצה המשמש כמודל לנגעים שחיקתיים. כ"אמצעי הגידול הרב-תכליתי ביותר" עבור גבישים 15, למטריצות הידרוג'ל יש יתרון על פני מערכת תמיסות מכיוון שמבחינה קלינית קל יותר לטפל בהן. יתר על כן, CS-AMEL הוא תואם ביולוגית, מתכלה ובעל תכונות אנטי-מיקרוביאליות והדבקה ייחודיות המשתוות לטובה עם מערכות ביומימטיות אחרות ליישומים דנטליים 16. חשוב לציין, המינרליזציה באתרה של גבישי אפטיט על פני האמייל מספקת ממשק צפוף בין השכבה המתוקנת לאמייל הטבעי, מה שעשוי לשפר את עמידות השחזורים ולמנוע היווצרות עששת חדשה בשולי השיקום.

<table><tbody><tr><td>טוחנת שלישית אנושית&nbsp;</td><td>בית הספר לרפואת שיניים ע"ש אוסטרו באוניברסיטת דרום קליפורניה&nbsp;</td><td>N/A</td><td>הטוחנות האנושיות חולצו בהתאם להליכים הסטנדרטיים למיצוי בבית הספר לרפואת שיניים אוסטרו של אוניברסיטת דרום קליפורניה וטופלו באישור מועצת הביקורת המוסדית.</td></tr><tr>ביטוי וטיהור <td>רקומביננטי של פוצין אמלוגנין</td><td>&nbsp; במעבדה</td><td>N/A</td><td>rP172, באורך מלא&nbsp;</td></tr><tr><td>צ'יטוזן&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>448877</td><td>משקל מולקולרי בינוני, 75-85%</td></tr><tr><td>חומצה זרחתית נטולת אצטילציה&nbsp;</td><td>VWR</td><td>AA033266</td><td></td></tr><tr><td>חומצה אצטית קרחונית</td><td>VWR</td><td>A036289</td><td></td></tr><tr><td>נתרן הידרוקסיד</td><td>VWR</td><td>BDH9292</td><td></td></tr><tr><td>סידן כלורי&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>223506</td><td></td></tr><tr><td>נתרן פוספט דו-בסיסי</td><td>נטול</td> מים <td>VWR BDH0316</td><td></td></tr><tr><td>BL21-CodonPlus (DE3)-RP&nbsp;</td><td>אג'ילנט טכנולוגיות בע"מ</td><td></td><td></td>230255</tr><tr><td>אמוניום גופרתי</td><td>VWR</td><td>BDH8001</td><td></td></tr><tr><td>חומצה טריפלואורואצטית</td><td>VWR</td><td>AAAL06374</td><td></td></tr><tr><td>אצטוניטריל</td><td>VWR</td><td>BDH1103</td><td></td></tr><tr><td>מגנזיום כלוריד&nbsp;</td><td>VWR</td><td>BDH0244</td><td></td></tr><tr><td>אשלגן דימימן פוספט&nbsp;</td><td>VWR</td><td>BDH9268</td><td></td></tr><tr><td>אשלגן כלורי&nbsp;</td><td>VWR</td><td>BDH0258</td><td></td></tr><tr><td>אמוניום כלוריד&nbsp;</td><td>VWR</td><td>AAAA15000</td><td></td></tr><tr><td>HEPES (4-(2-הידרוקסיאתיל)פיפרזין-1-חומצה אתאן-סולפונית)</td><td></td> <td>VWR AAA14777</td><td></td></tr><tr><td>נתרן פלואוריד&nbsp;</td><td>VWR</td><td>AA11561</td><td></td></tr><tr><td>Tris-buffered מלח</td><td>Bio-Rad</td><td>170-6435</td><td>10&times; </td></tr><tr><td>אלבומין סרום בקר</td> TBS <td>EMD Millipore&nbsp;</td><td>12659</td><td>CalBioChem, אלבומין, סרום בקר, Fraction V, Low Heavy Metals&nbsp;</td></tr><tr><td>טריטון X-100</td><td>EMD Millipore&nbsp;</td><td>TX1568-1</td><td></td></tr><tr><td>עוף אנטי-אמלוגנין</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td>מתנה מפרופ' מלקולם סניד, אוניברסיטת דרום קליפורניה</td></tr><tr><td>בקר אנטי-עוף IgY-FITC</td><td>סנטה קרוז ביוטכנולוגיה</td><td>Sc-2700</td><td></td></tr><tr><td>מערכת כרומטוגרפיה נוזלית בעלת ביצועים גבוהים</td><td>Agilent Technologies Inc.</td><td>וריאן פרוסטאר 210</td><td></td></tr><tr><td>C4 טור</td><td>פנומנקס&nbsp;</td><td>יופיטר 5&mu;</td> מיקרוסקופ אלקטרונים סורק 300A<td></td></tr><tr><td>&nbsp;</td><td>ג'אול&nbsp;</td><td>JSM-7001</td><td></td></tr><tr><td>FIB-SEM&nbsp;</td><td>ג'אול&nbsp;</td><td>JIB-4500</td><td></td></tr><tr><td>מיקרוסקופ אלקטרונים שידור&nbsp;</td><td>JEOL</td><td>JEM-2100F</td><td></td></tr><tr><td>מסור יהלום דיגיטלי במהירות נמוכה</td><td>MTI Corporation</td><td>SYJ-150</td><td></td></tr><tr><td>מיקרוסקופיה פלואורסצנטית</td><td>Leica</td><td>DMI3000 B</td><td></td></tr><tr><td>מנקה אולטרסאונד&nbsp;</td><td>ברנסון&nbsp;</td><td>2510</td><td>42 קילו-הרץ, 100 וואט</td></tr><tr><td>ננו-מקלט&nbsp;</td><td>אג'ילנט טכנולוגיות בע"מ</td><td>MTS XP</td><td></td></tr></tbody></table>

פיתוח של hydrogel amelogenin-chitosan עבור<em&gt; במבחנה</em&gt; אמייל לצמיחה מחודשת עם ממשק צפוף

Development of Amelogenin-chitosan Hydrogel for In Vitro Enamel Regrowth with a Dense Interface

שחזור אמייל ביומימטי הוא נושא משמעותי במדעי החומרים ורפואת השיניים כגישה חדשה לטיפול בעששת או שחיקה. אמלוגנין הוכח כחלבון קריטי לשליטה בצמיחה המאורגנת של גבישי אפטיט. במאמר זה, אנו מציגים פרוטוקול מפורט לשחזור אמייל שטחי באמצעות הידרוג'ל אמלוגנין-צ'יטוזן חדשני. בהשוואה לטיפולים קונבנציונליים אחרים, כגון פלואוריד מקומי ומי פה, לשיטה זו יש לא רק פוטנציאל למנוע התפתחות עששת אלא גם מקדמת שיקום אמייל משמעותי ועמיד. המיקרו-מבנה המאורגן דמוי האמייל המווסת על ידי מכלולי אמלוגנין יכול לשפר משמעותית את התכונות המכניות של אמייל חרוט, בעוד שממשק שיקום האמייל הצפוף שנוצר על ידי צמיחה מחודשת באתרו של גבישי אפטיט יכול לשפר את היעילות והעמידות של השחזורים. יתר על כן, הידרוג'ל צ'יטוזן קל לשימוש ויכול לדכא זיהום חיידקי, שהוא גורם הסיכון העיקרי להופעת עששת. לכן, הידרוג'ל אמלוגנין-צ'יטוזן תואם ביולוגית ומתכלה זה מראה הבטחה כחומר ביולוגי למניעה, שיקום וטיפול באמייל פגום.

היעילות של הפרוטוקול המתואר כאן מודגמת על ידי מיקרוסקופיית אלקטרונים (SEM), עקיפה נבחרה אזור אלקטרון (סעד) ועקיף X-ray (XRD) מנתח. לאחר תיקון על ידי הידרוג&#39;ל amelogenin-chitosan (CS-אמל) למשך 7 ימים, כמו שכבת אמייל בעובי של 15 מיקרומטר הוקמה על פני השטח האמייל חרוטים. השכבה החדשה שגדלה הייתה עשויים מערכי הורה מאוד של גבישים בקוטר של ~ 50 ננומטר, הולכת וגדלה באופן מועדף לאורך c-הציר, בניצב לפני השטח (חיצים באיור 3 א). ראוי לציין כי גבישי מחט כמו אלה היו מאורגני...

במאמר זה, אנו מתארים פרוטוקול עבור בודה הידרוג&#39;ל amelogenin-chitosan לשיקום אמייל שטחי. מאורגן בצמיחה באתרו של גבישי אפטיט בהידרוג&#39;ל יצר ממשק אמייל-שיקום צפוף, אשר ישפר את היעילות ועמידות של שחזורים.

פיתוח של Hydrogel Amelogenin-chitosan עבור<em&gt; במבחנה</em&gt; אמייל לצמיחה מחודשת עם ממשק צפוף

Biomimetic enamel reconstruction is a significant topic in material science and dentistry as a novel approach for the treatment of dental caries or ...

המטרה הכללית של הליך זה היא לפתח פרוטוקול לייצור הידרוג'ל של AMLO וכיטוזן לשחזור שטחי של זגוגית השן. הדבר מבוצע תחילה על ידי הכנת פרוסות שן שנחרטו. בשלב השני, מוכן הידרוג'ל טרי של AMLO וכיטוזן.בשלב הבא, מיושמים ה-AMLO וההידרוג'ל של הקיטן על פני השטח של פרוסת השן. לבסוף, זמינה צמיחה מחדש של זגוגית השן בעזרת ה-AMLO וההידרוג'ל של הקיטוזן ברוק מלאכותי. בסופו של דבר, ניתן להשתמש בטיפול אולטרסאונד ובסריקת ננו-החדרה (nano indenture) כדי להעריך את החוזק המכני של השכבה שנוצרה ואת ההיצמדות שלה לזגוגית הטבעית.ההשלכות של טכניקה זו משתקפות בפיתוח טכנולוגיה אשר כאשר היא מיושמת על זגג שן פגוע, הן במבוגרים והן בילדים, עוצרת נגעים מוקדמים של עששת, משקמת זגג ששחוק עקב עששת, משמרת את מבנה השן ומונעת את התקדמות ריקבון השן. את הפרוצדורה תדגים ד"ר צ'יטר (Dr. Chittar), עמיתת פוסט-דוקטורט מהמעבדה שלי. התחילו בבחירת שן בינה אנושית ללא סתימות או עששת משוקמת.השתמש במסור יהלום במהירות נמוכה עם קירור במים כדי לחתוך את הכתר לאורכו לפרוסות בעובי של שני מילימטרים, ולאחר מכן הסר את חלק השורש של השן הטוחנת באופן אולטרסוני. נקה את הפרוסות במשך שתי דקות ולאחר מכן שטוף אותן במים מיונזים שלוש פעמים כדי לדמות נגעי שחיקה. בצע תסביב (etching) לשתי הפרוסות באמצעות 30% phosphoric acid למשך 30 שניות.לאחר מכן, שטפו אותן מיד ב

development-amelogenin-chitosan-hydrogel-for-vitro-enamel-regrowth

Research

JoVE Journal

Bioengineering

הנדסה ביולוגית

המכשול העיקרי בתא טיפולים שוטפים גזע הוא לקבוע את השיטה היעילה ביותר, כדי לספק תאים אלה לרקמות המארחות. כאן אנו מתארים שיטה chitosan מבוסס משלוח יעיל ופשוט של הגישה, תוך מתן אפשרות השומן שמקורם בתאי גזע כדי לשמור על multipotency שלהם.

בניית Hydrogel קולגן עבור משלוח של התא טעון גזע Chitosan microspheres

פיגום הנדסת רקמות בזריקות מורכב פולי (N-isopropylacrylamide) סולפט -graft-כונדרואיטין (PNIPAAm-ז-CS) microparticles אלגינט המכילים הוכן. כוחו הדבק, נפיחות נכסים ב biocompatibility במבחנה מנותח במחקר זה. טכניקות האפיון שפותחו כאן עשויות לחול על מערכות thermogelling אחרות.

סינתזה של Thermogelling midi (N-isopropylacrylamide) מרוכבים -graft-כונדרואיטין סולפט עם אלגינט microparticles עבור הנדסת רקמות

כאן נתאר להכנת נתיישב hydrogels להזרקה מבוסס משקם באמצעות הכימיה אימין דינמי. שיטות להתאמת חוזק מכני של הידרוג ויישומה בתרבות תא 3D מוצגים.

הכנת Hydrogels להזרקה מבוסס משקם ויישומה בתרבות תא תלת-ממד

הבנת שינויים ואפשרות האפשר אמייל דורש לימוד פעילות ameloblast. כאן, אנו מתארים שיטה אמינה ועקבית לנתח מיקרו-איברים אמייל המכיל הפרשת ועל התבגרות-שלב ameloblasts העשויות לשמש עוד יותר כמותיים ואיכותיים בצרות.

ניתוח מיקרו של איבר אמייל השן החותכת הלסת של חולדות נחשף חשיפה לרעלים סביבתיים

כאן, אנו מציגים פרוטוקולים של culturing ברצועה חניכיים האדם (PDL) תא spheroids על ידי סרטים chitosan. תרבות של הספרואידים תלת ממדיים (3D) הסלולר מספק אלטרנטיבה של מערכת התרבות הקונבנציונלית פוליסטירן מרקמת רקמה (TCPS).

היווצרות של חניכיים האדם ברצועה הספרואידים תא על סרטים Chitosan

פרוטוקול זה מציג שיטה לתרבית ולצמיחה תלת-ממדית של תאים דמויי אמלובלסט במיקרו-כבידה כדי לשמור על צורתם המוארכת והמקוטבת, כמו גם על ביטוי חלבונים ספציפיים לאמייל. כמו כן מתוארים תנאי תרבית לתרבית של מבנים הנדסיים פריודונטליים ואיברי ריאה במיקרו-כבידה.

ריבוי תאים ואיברים דנטליים ונשימתיים במיקרו-כבידה

אנו מציגים פרוטוקול לפיתוח תרביות אורגנואידים אפיתליאליות החל מהשן האנושית. האורגנואידים ניתנים להרחבה חזקה ומשקמים מחדש את תאי הגזע האפיתליאליים של השן, כולל יכולת התמיינות האמלובלסט שלהם. המודל האורגנואידי הייחודי מספק כלי מבטיח לחקר הביולוגיה הדנטלית האנושית (תאי גזע) עם פרספקטיבות לגישות התחדשות שיניים.

ביסוס אורגנואידים מהשן האנושית ככלי רב עוצמה לקראת מחקר מכניסטי וטיפול רגנרטיבי

הפרוטוקול הנוכחי מתאר שיטה שאינה מבוססת על תחליב לייצור מיקרוגלים של צ'יטוזן-גניפין. ניתן לשלוט במדויק בגודלם של המיקרוג'לים האלה, והם יכולים להציג נפיחות תלוית pH, לפרק in vivo ולהיות עמוסים במולקולות טיפוליות שמשחררות לאורך זמן באופן מתמשך, מה שהופך אותם לרלוונטיים מאוד ליישומים של הנדסת רקמות.

ייצור של מיקרוג'לים צ'יטוזן-גניפינים מבוקרי גודל ונטולי תחליב ליישומים של הנדסת רקמות

לטיפול בעצם באמצעות אוסיפיקציה אנדוכונדרלית על ידי השתלת רקמת סחוס מלאכותית המיוצרת מתאי גזע מזנכימליים יש פוטנציאל לעקוף את החסרונות של טיפולים קונבנציונליים. הידרוג'ל חומצה היאלורונית יעיל בהגדלת שתלי סחוס ממוינים באופן אחיד, כמו גם ביצירת עצם משולבת עם כלי דם בין שתלים מאוחים in vivo.

היווצרות עצם משולבת באמצעות אוסיפיקציה אנדוכונדרלית in vivo באמצעות תאי גזע מזנכימליים

מחקר זה מציג מודל שולחני שנועד להעריך את התאימות של חומרי חבישת פצעים למערכות טיפול בפצעים בלחץ שלילי על ידי הערכת לחץ ואיסוף נוזלים במשך 72 שעות בהגדרות לחץ רציפות ולסירוגין.

פיתוח מודל ספסל להערכת התאימות של חומרי חבישת פצעים למערכות טיפול בפצעים בלחץ שלילי

כאן אנו מציגים פרוטוקול משולב ליצירת נגעים אוסטאוכונדרליים מבוקרים בברכי כבשים, כדי להקים מודל ניסיוני המתאים למחקרים של התחדשות רקמות עצם וסחוס. הפרוטוקול מתאר שיטה ליצירת פגם אוסטאוכונדרלי בעובי מלא בקונדיל הירך, תוך שימוש בטכניקות שמפחיתות את ההשפעות על רווחת בעלי החיים ואת השונות בתוצאות.

הקמה והערכה של מודל כבשים של פגם אוסטאוכונדרלי בעובי מלא

למד פיתוח הידרוג'ל אמלוגנין-כיטוזן לשחזור אמייל שטחי. השיטה כוללת גידול in situ של גבישי אפטיט בתוך ההידרוג'ל ליצירת ממשק צפוף וחזק עם האמייל הטבעי.

פיתוח של Hydrogel Amelogenin-chitosan עבור

גלה סרטונים נוספים