פיתוח של Hydrogel Amelogenin-chitosan עבור

המטרה הכללית של הליך זה היא לפתח פרוטוקול לייצור הידרוג'ל של AMLO וכיטוזן לשחזור שטחי של זגוגית השן. הדבר מבוצע תחילה על ידי הכנת פרוסות שן שנחרטו. בשלב השני, מוכן הידרוג'ל טרי של AMLO וכיטוזן.

בשלב הבא, מיושמים ה-AMLO וההידרוג'ל של הקיטן על פני השטח של פרוסת השן. לבסוף, זמינה צמיחה מחדש של זגוגית השן בעזרת ה-AMLO וההידרוג'ל של הקיטוזן ברוק מלאכותי. בסופו של דבר, ניתן להשתמש בטיפול אולטרסאונד ובסריקת ננו-החדרה (nano indenture) כדי להעריך את החוזק המכני של השכבה שנוצרה ואת ההיצמדות שלה לזגוגית הטבעית.

ההשלכות של טכניקה זו משתקפות בפיתוח טכנולוגיה אשר כאשר היא מיושמת על זגג שן פגוע, הן במבוגרים והן בילדים, עוצרת נגעים מוקדמים של עששת, משקמת זגג ששחוק עקב עששת, משמרת את מבנה השן ומונעת את התקדמות ריקבון השן. את הפרוצדורה תדגים ד"ר צ'יטר (Dr. Chittar), עמיתת פוסט-דוקטורט מהמעבדה שלי. התחילו בבחירת שן בינה אנושית ללא סתימות או עששת משוקמת.

השתמש במסור יהלום במהירות נמוכה עם קירור במים כדי לחתוך את הכתר לאורכו לפרוסות בעובי של שני מילימטרים, ולאחר מכן הסר את חלק השורש של השן הטוחנת באופן אולטרסוני. נקה את הפרוסות במשך שתי דקות ולאחר מכן שטוף אותן במים מיונזים שלוש פעמים כדי לדמות נגעי שחיקה. בצע תסביב (etching) לשתי הפרוסות באמצעות 30% phosphoric acid למשך 30 שניות.

לאחר מכן, שטפו אותן מיד במים מיונזים. לאחר מכן, נקו את הפרוסות שנחרטו באמצעות אולטרסאונד למשך שתי דקות נוספות ושטפו אותן במים מיונזים.

שלוש פעמים נוספות. להכנת תמיסת המלאי של Kazan. ראשית המיסו 1% weight per volume של Kazan בתמיסת חומצה אצטית בריכוז 1% volume per volume, ולאחר מכן ערבבו בטמפרטורה של 80 °C למשך הלילה.

לאחר קירור התמיסה לטמפרטורת החדר, סננו את ה-esan דרך מסנן של 0.45 micrometer, ולאחר מכן הוסיפו sodium hydroxide בריכוז one molar כדי לכוון את ה-pH ל-5.0. להכנת תמיסת המלאי של סידן ופוספט, שקלו calcium chloride והכינו תמיסה בריכוז 0.1 molar. לאחר מכן, ערבבו את התמיסה במערבל vortex עד להפיכתה לשקופה וכוונו את ערך ה-pH ל-11 באמצעות sodium hydroxide בריכוז one molar.

לאחר מכן, שקלו את ה-diba sodium phosphate. ערבבו תמיסה בריכוז 0.1 molar ובצעו vortex עד שהתמיסה תהיה צלולה. להכנת ה-AMLO Genin kaizan hydrogel, הוסיפו 960 µL של תמיסת 1%esan שהוכנה טרי למבחנה המכילה 200 µg של recombinant porcine AMLO genin.

לאחר מכן, ערבלו את התמיסה ב-vortex עד להשגת שקיפות. כעת, הוסיפו 25 µL של תמיסת calcium chloride בריכוז 0.1 M, ולאחריה 15 µL של תמיסת sodium phosphate diba בריכוז 0.1 M, לתמיסת ה-AMLO המכילה ozan. ערבלו את התמיסה ב-vortex למשך חמש דקות.

לאחר מכן, יש להוסיף בזהירות נתרן הידרוקסיד בריכוז one molar כדי לכוונן את ה-pH של תמיסת ה-AMLO וה-ozan ל-6.5. הידרוג'ל של AMLO ו-ozan ייווצר כאשר ערך ה-pH יגיע ל-6.5 כדי להמריץ צמיחה מחדש של אמייל ב-AMLO ו-az, הידרוג'ל. ראשית, כוונן את ה-pH של תמיסת הרוק המלאכותית ל-7.0 באמצעות נתרן הידרוקסיד בריכוז one molar, ואחסן את התמיסה בטמפרטורה של 4 °C. לאחר מכן, השתמש במזרק כדי למרוח כ-20 µL של הידרוג'ל AMLO ו-chizen על קצה פרוסת השן, והנח אותה במייבש בטמפרטורת החדר.

לאחר שעתיים, הוסיפו 300 PPM של נתרן פלוריד לתמיסת הרוק, ולאחר מכן העבירו את פרוסת השן לכלי כימי המכיל 30 milliliters מהתמיסה. כסו את הכלי בנייר אלומיניום והניחו אותו בתנור בטמפרטורה של 37 °C. לבסוף, הוציאו את פרוסת השן לאחר שלושה עד שבעה ימים והניחו אותה במייבש (desiccator) בטמפרטורת החדר עד לייבוש; לאחר תיקון באמצעות AMLO ו-chizen hydrogel למשך שבעה ימים, נוצרת שכבה דמוית אמייל בעובי של 15 micrometers על פני השטח של האמייל שנחורר.

השכבה שגדלה זה עתה מורכבת ממערכים מסודרים מאוד של גבישים בעלי קוטר של כ-50 nanometers הגדלים באופן מועדף לאורך ציר ה-sea בניצב לפני השטח. שימו לב כי גבישים דמויי-מחטים אלה מאורגנים באגודות הדומות ליחידות הבסיסיות של זגוגית שן טבעית. תמונת עקיפת אלקטרונים מאזור נבחר (SAED) של השכבה המשוקמת מראה תבנית בצורת קשת, החושפת יישור היררכי של הגבישים שגדלו זה עתה.

ניתוח עקיפת קרני רנטגן לאורך כיוון 0 0 2 מאשר כי השכבה שגדלה זה עתה מורכבת מאפטיט, המיושר לאורך ציר C הקריסטלוגרפי בהתאם לתצפיות במיקרוסקופיית אלקטרונים סורקת ובעקיפת אלקטרונים מאזור נבחר. בתמונה זו מוצגת המיקרו-מבנה של הממשק בין השכבה שגדלה זה עתה לבין זגוגית השן הטבעית. שימו לב כי הגבישים שגדלו זה עתה לא גדלו באותו כיוון של גבישי זגוגית השן המקוריים, וכי צמיחת אפטיט בתיווך חלבונים גורמת לאוריינטציה ניצבית של הגבישים שגדלו זה עתה ביחס לגבישי זגוגית השן הטבעית. אין מרווח נראה לעין בממשק שבין השכבה שגדלה זה עתה לבין מצע זגוגית השן.

בסולם הננו, הזגג והגבישים שגדלו מחדש התמזגו יחד ליצירת ממשק רציף. לאחר 10 דקות של טיפול באולטרסאונד, השכבה שגדלה מחדש בתוך הידרוג'ל ה-AMLO Genin chito עדיין קשורה היטב למשטח הזגג, והמבנה המאורגן נשמר עבור הדגימה שטופלה בהידרוג'ל tizen ללא am mologen. עם זאת, נצפה מרווח גדול בין הזגג לשכבה המשוקמת, המאפשר להבחין בבירור בין השכבה שגדלה מחדש לבין הזגג הטבעי.

בניסוי זה, ה-AMLO genin בשכבה שגדלה מחדש סומן באופן אימונו-פלואורסצנטי, ונוכחותו של ה-AMLO genin אוששה באמצעות הפלואורסצנציה הירוקה בתוך השכבה שגדלה מחדש. כפי שמוצג בגרף, לאחר תסריט חומצי (acid etching), הקשיחות והמודולוס של פני השטח של האמייל יורדים בכמעט 98% ו-88% בהתאמה. קבוצת הביקורת שטופלה בהידרוג'ל אוזון ללא AMLO genin הראתה שיפור מוגבל בלבד הן בקשיחות והן במודולוס.

לעומת זאת, לאחר מינרליזציה בתוך ההידרוג'ל של AMLO ו-ozan, נצפית עלייה של כמעט פי ארבעה במודולוס ופי תשע בקשיות לאחר פיתוחו. ב-VI ובהערכה נוספת במודלים, ניתן להרחיב פרוטוקול זה כדי לתכנן טכנולוגיה לטיפול בפגמים באמייל, כגון עששת בשלב מוקדם ושחיקה של האמייל.