העברת פרוטון והחלבון Dynamics קונפורמציה בחלבונים רגישים לאור בזמן נפתר-Step-לסרוק פורייה-להפוך ספקטרוסקופית אינפרא אדום

המטרה הכוללת של הליך זה היא לחקור את הדינמיקה של פרוטונציה ושינויי אישור של שני חלבוני ממברנה רגישים לצילום באמצעות אוסקופיה ספקטרוסקופיה FTIR של סריקת STEP שנפתרה בזמן. זה מושג על ידי יצירת תחילה סרט חלבון מיובש שספיגת האינפרא אדום שלו תיבדק בתצורת השתקפות כוללת מוחלשת עבור חיידקים אופסין, או בתצורת שידור עבור ערוץ רודן 2. השלב השני הוא לעורר את הדגימה עם הבזק לייזר ננו-שניות באורך גל מתאים כדי ליזום תגובה פוטו-מחזורית בחלבון המזהה שינויים שנפתרו בזמן בעוצמת האור האינפרא אדום המקיים אינטראקציה עם הדגימה.

לאחר מכן, התהליך הנ"ל חוזר על עצמו במיקומים דיסקרטיים של המראה הניידת של אינטרפרומטר השולט בהפרש הנתיב האופטי בין שתי אלומות מפוצלות עד לרישום אינטרפרוגרמה שנפתרה בזמן מלא. השלב האחרון הוא להפוך את האינטרפרוגרמה שנפתרה בזמן לספקטרום ספיגת הפרש IR שנפתר בזמן באמצעות התמרת פורייה וחוק הבירה למברט. בסופו של דבר, נבדקת התפתחות הזמן של איסורים, במיוחד ב-MI ובאזורים הקרבוקסיליים של הקשר הכפול CO כדי לקבל דינמיקה של שינויים אישוריים ופרוטונציה בחלבון.

היתרון העיקרי של הטכניקה של שיטות ניסיוניות קיימות ביותר הוא שהיא פותרת שינויים חולפים בפרוטונים בחלבונים. יתר על כן, הוא עושה זאת בסולמות הזמן של מיקרו ואלפית השנייה, טווח הזמן הרלוונטי ביותר לבדיקת פונקציונליות החלבון. שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלות מפתח בתחום הביופיזיקה המולקולרית ומדעי החלבונים, כגון אילו שאריות הפרוטונאט ומתי הן מתרחשות במהלך המנגנון התפקודי של חלבון או מתי מתרחשים שינויים גדולים בחלבונים.

הדגמת ההליך תיעשה על ידי עמית מחקר ויקטור ריה מהמעבדה שלי תושבת ראשונה, ההחזר הכולל המוחלש או אביזר TR לתא הדגימה של ספקטרומטר FTIR. מדוד ספקטרום אנרגיה רחב טווח בארבעה סנטימטרים הפוכים. רזולוציה של משטח אלמנט ההשתקפות הפנימי הנקי על ידי ספקטרוסקופיה FTIR בסריקה מהירה קונבנציונלית מכסה את פני השטח של ה-A TR ב-20 מיקרוליטר של מאגר החוזק היוני הגבוה ששימש מאוחר יותר לייבוש הדגימה.

לאחר מכן מדוד את ספיגת ה-IR של המאגר. לאחר מכן, הסר את המאגר ושטוף את המשטח במים מבלי לגעת בו. הסר את שאריות הנוזל על ידי זרימת אוויר אינטנסיבית המתפשטת כשלושה מיקרוליטרים של תמיסת חלבון של שישה מיליגרם למיליליטר של חיידקים רודן בקרום סגול על גבי פני השטח.

יבש את תרחיף החלבון תחת זרם עדין של אוויר יבש עד לקבלת סרט. לאחר מכן מדוד את ספקטרום הספיגה של הסרט היבש. לאחר מכן הוסיפו בעדינות 20 עד 40 מיקרוליטר של המאגר בעל החוזק היוני הגבוה כדי להחזיר לחות לסרט היבש.

מכסים את מחזיק A TR במכסה כדי למנוע מידת אידוי מים וספקטרום סופג. הערך את אחוז הדגימה שנותרה ליד פני השטח לאחר התייבשות הסרט על ידי הפחתת ספקטרום הספיגה של המאגר. בשלב זה, הוסף 10 מיקרוליטר של אופסין תעלה שניים מומסים בדצמבר, במאגר בעל חוזק יוני נמוך במרכז חלון בריום פלואוריד בקוטר 20 מילימטר.

מורחים את התמיסה בעזרת קצה המיקרו פיפטה לקוטר של שישה עד שמונה מילימטרים, באמצעות זרימה עדינה של אוויר יבש, סרט הומוגני חם שקוטרו תואם בערך את גודל קרן ה-IR בצמצם הגדול ביותר. לאחר מכן, השתמש בטבעת O סיליקון שטוחה בעובי מילימטר אחד. הרטיבו את הסרט על ידי הוספת שלושה עד חמישה מיקרוליטרים של תערובת של גליצרול ומים המופצים בשלוש עד חמש טיפות סביב הסרט היבש וסגרו אותו היטב עם חלון שני.

הכנס את החלונות הסנדוויץ' בריום פלואוריד למחזיק. לאחר מכן הנח את המחזיק בתא הדגימה. מדוד ספקטרום ספיגה.

ודא שהספיגה המקסימלית באזור אמיד אחד היא בטווח של 0.6 עד 1.0 עבור הגדרת A TR. השתמש בסיב אופטי המונח על גבי מכסה A TR כדי לחבר את הלייזר לדגימה. התאם את צפיפות האנרגיה של הלייזר בדגימה לשניים עד שלושה מילי-ג'אול לסנטימטר רבוע לכל פולס.

באמצעות מד כוח או ניסויי השידור, השתמש במראות כדי להביא את הלייזר לדגימה ובמידת הצורך, בעדשות כדי לאסוף או להסיט את קרן הלייזר לקוטר מעט מעל גודל סרט הדגימה. סנכרן את דופק הלייזר עם הקלטת הנתונים באמצעות מתג Q. סנכרן את דופק ה-TTL של האלקטרוניקה של לייזר נופך אלומיניום אטריום ניאודימיום כדי להפעיל את הספקטרומטר ממיר אנלוגי לדיגיטלי.

הגדר את קצב העירור של הלייזר כדי לבצע את הזמן שנפתר. מדידות סריקת שלבים בטווח הספקטרלי של 1800 עד 850 סנטימטר הפוך. הנח מסנן אופטי נמוך בנתיב האופטי האטום מעל 1,950 סנטימטרים הפוכים, ועם שידור טוב מתחת ל-1800 סנטימטרים הפוכים.

לאחר מכן שנה את הגלאי ממצב צימוד AC ל-DC. בנקודה זו, הביאו את רמת ה-DC של האינטרפרוגרמה לאפס על ידי הפעלת הטיית זרם על הגלאי. כוונן מחדש את הרווח האלקטרוני כדי לנצל טוב יותר את הטווח הדינמי של הממיר האנלוגי לדיגיטלי.

לאחר מכן, התחל את תפריט סריקת השלבים של ספקטרומטר FTIR. הגדר את רוחב הפס הספקטרלי של היעד למדידת סריקת הצעד לשמינית ממספר גל לייזר ניאון הליום. הגדר את הרזולוציה הספקטרלית והפאזה לשמונה סנטימטרים הפוכים ו-64 סנטימטרים הפוכים בהתאמה.

בחר פונקציית אפליקציה. לאחר מכן הגדר את מצב רכישת האינטרפרוגרמה לצד אחד קדימה. הגדר את קצב הדגימה של הממיר האנלוגי לדיגיטלי לגבוה ביותר הזמין בספקטרומטר.

הגדר את הטריגר לניסוי חיצוני. לאחר מכן הגדר את מספר נקודות הנתונים במרווחים ליניאריים שיש לרשום, כולל 100 נקודות טריגר pret. לאחר מכן, הגדר את מספר המהדורות המשותפות או את מספר הממוצעים של תגובת הצילום לכל מיקום מראה והתחל את הניסוי.

לבסוף, חזור על הניסוי 10 פעמים עבור חיידקים, רדסין, ו-35 פעמים על שלושה סרטי דגימה שונים עבור ערוץ אדום שניים כדי לקבל כ-200 תוספות משותפות לכל מיקום מראה איסורים אופייניים מקשר פפטיד רעידות אמיט ניתנות להבחנה בספקטרום ספיגת הקצף היבש של החיידקים. בעת שימוש במאגרים בעלי חוזק יוני נמוך, הסרט מתרחב יתר על המידה ומפחית את כמות החלבון שנבדק על ידי השדה החולף. התלות המדויקת בין נפיחות הסרט לחוזק יוני המאגר תהיה תלויה בין שאר הגורמים באופי השומנים.

נפיחות בסרט לאחר הידרציה דורשת זמן כדי להגיע לייצוב לחיידקים של מינוסין. בקרום סגול, התהליך הוא מונו אקספוננציאלי עם קבוע זמן של 12 דקות. תרשים תלת מימד מסריקת צעדים טיפוסית שנפתרה בזמן, ניסוי FDIR על חיידקים.

רדסין מוצג כאן. ניתן לחלץ ספקטרום בזמנים ספציפיים. לדוגמה, כאשר מצבי ביניים במחזור הצילום של החיידקים צפויים להגיע לאוכלוסייה הגבוהה ביותר שלהם.

במוט החיידקים דוסין עקבות זמן מחזור צילום של שינויי ספיגה ב -1, 762 סנטימטרים הפוכים. דיווחים על דינמיקת הדפרוטונציה של אספארטט 85 וב -1,741 סנטימטרים הפוכים על שינויים בקשר מימן והדינמיקה של אומת הדפרוטונציה של חומצה אספרטית.96. הזמן מתחקה אחר 1,670 ו-1,555 סנטימטרים הפוכים.

דווח על שינויים בתנודות MI 1 ו-2, ששתיהן רגישות לאישור עמוד השדרה של הפפטיד. בעקבות שיטה זו, ניתן לבצע טכניקות אחרות כגון נוירוגנזה מכוונת אתר או ספקטרוסקופיה של אנזים רשתית על מנת להקצות פס רטט לשאריות ספציפיות בחלבון לאחר התפתחותו. טכניקה זו סללה את הדרך לחוקרים בתחום הביופיזיקה המולקולרית לחקור את המנגנון התפקודי של שפע של חלבונים מונעי אור שונים.