העברת פרוטון והחלבון Dynamics קונפורמציה בחלבונים רגישים לאור בזמן נפתר-Step-לסרוק פורייה-להפוך ספקטרוסקופית אינפרא אדום

המטרה הכוללת של פרוצדורה זו היא לבחון את הדינמיקה של הפרוטונציה ושינויים קונפורמציונליים של שני חלבוני ממברנה רגישים לאור באמצעות ספקטרוסקופיית FTIR בשיטת STEP scan עם רזולוציה של זמן. דבר זה מושג תחילה על ידי יצירת סרט חלבון מהוהן שספיגת האינפרא-אדום שלו תיבחן בתצורת reflection attenuated total עבור bacteriorhodopsin, או בתצורת transmission עבור channelrhodopsin-2. השלב השני הוא עירור הדגימה באמצעות הבזק לייזר בננו-שנייה באורך גל מתאים כדי להתחיל תגובה פוטו-ציקלית בחלבון, תוך זיהוי שינויים תלויי-זמן בעוצמת אור האינפרא-אדום המקיים אינטראקציה עם הדגימה.

בשלב הבא, התהליך שתואר לעיל חוזר על עצמו במיקומים בדידים של המראה הניידת של an interferometer, השולט בהפרש המסלול האופטי בין שתי קרניים מפוצלות, עד להקלטה של interferogram מלא ברזולוציית זמן. השלב הסופי הוא המרת ה-interferogram ברזולוציית הזמן לספקטרום בליעה הפרשי IR ברזולוציית זמן, באמצעות התמרת פורייה וחוק למברט-באר. לבסוף, נבחנת ההתפתחות בזמן של הפסים, במיוחד באלו של ה-MI ובאזורי הקשר הכפול של CO בקבוצות קרבוקסיליות, כדי להסיק את הדינמיקה של שינויים קונפורמציונליים ושינויי פרוטונציה בחלבון.

היתרון המרכזי של טכניקה זו על פני רוב השיטות הניסיוניות הקיימות הוא יכולתה לפתור שינויים חולפים של פרוטונציה בחלבונים. יתרה מכך, היא עושה זאת בטווחי זמן של מיקרו-שניות ומלי-שניות, טווח הזמן הרלוונטי ביותר לבחינת תפקודיות חלבונים. שיטה זו יכולה לסייע במתן מענה לשאלות מפתח בתחומי הביופיזיקה המולקולרית ומדעי החלבונים, כגון אילו שאריות עוברות פרוטונציה ומתי הן עושות זאת במהלך המנגנון התפקודי של חלבון, או מתי מתרחשים שינויים משמעותיים בחלבונים.

הדגמת הפרוצדורה תבוצע על ידי Victor Ria, עמית מחקר מהמעבדה שלי. ראשית, התקינו את אביזר ה-attenuated total reflectance או ה-ATR בתא הדגימות של ספקטרומטר ה-FTIR. מדדו ספקטרום אנרגיה בטווח רחב ברזולוציה של 4 inverse centimeters של פני השטח הנקיים של אלמנט ההחזר הפנימי באמצעות ספקטרוסקופיית FTIR מסוג rapid scan קונבנציונלית. כסו את פני השטח של ה-ATR ב-20 µL של הבאפר בעל החוזק היוני הגבוה שבו ייעשה שימוש מאוחר יותר לrehydration של הדגימה.

לאחר מכן, מדדו את בליעת ה-IR של הבאפר. בשלב הבא, הסירו את הבאפר ושטפו את הפני השטח במים ללא מגע. הסירו את שאריות הנוזל באמצעות זרימת אוויר חזקה, ופזרו כ-3 µL של תמיסת חלבון בריכוז 6 mg/mL של חיידקי Rodin בממברנה סגולה על גבי הפני השטח.

ייבשו את תרחיף החלבון תחת זרם עדין של אוויר יבש עד להשגת שכבה דקה (film). לאחר מכן, מדדו את ספקטרום הבליעה של השכבה היבשה. לאחר מכן, הוסיפו בעדינות 20 עד 40 µL של בופר בעל חוזק יוני גבוה כדי להחזיר את הלחות לשכבה היבשה.

כסו את מחזיק ה-A TR במכסה כדי למנוע אידוי של מים ומדידה של ספקטרום בליעה. העריכו את אחוז הדגימה שנותרה סמוך לפני השטח לאחר רהידרציה של הסרט על ידי חיסור ספקטרום הבליעה של הבאפר. בשלב זה, הוסיפו 10 µL של channel opsin two מומס ב-dec alside בתוך באפר בעל חוזק יוני נמוך למרכז של חלון בריום פלוריד בקוטר 20 mm.

מרחו את התמיסה בעזרת טיפ של מיקרופיפט לקוטר של שישה עד שמונה מילימטרים, תוך שימוש בזרימה עדינה של אוויר יבש ליצירת סרט הומוגני חם שקוטרו תואם בקירוב לגודל קרן ה-IR במפתח הגדול ביותר. לאחר מכן, השתמשו בטבעת סיליקון (O-ring) שטוחה בעובי של מילימטר אחד. הידרטו את הסרט על ידי הוספה של 3 µL עד 5 µL של תערובת גליצרול ומים, המחולקת לשלוש עד חמש טיפות סביב הסרט היבש, וסגרו אותו בצורה הדוקה עם חלון שני.

הכנס את חלונות הבריום פלוריד מסוג סנדוויץ' למחזיק. לאחר מכן, מקם את המחזיק בתא הדגימה. מדוד ספקטרום בליעה.

יש לוודא כי הבליעה המקסימלית באזור ה-amide one היא בטווח של 0.6 עד 1.0 עבור מערך ה-A TR. השתמש בסיב אופטי הממוקם על מכסה ה-A TR כדי לצמד את הלייזר לדגימה. כוונן את צפיפות האנרגיה של הלייזר בדגימה לשני עד שלושה millijoules per square centimeter per pulse.

באמצעות מד הספק או ניסויי תמסורת, השתמשו במראות כדי להוביל את הלייזר לדגימה ובמידת הצורך, בעדשות כדי למקד או להסיט את קרן הלייזר לקוטר הגבוה מעט מגודל דגימת הסרט. סנכרנו את פולס הלייזר עם הקלטת הנתונים באמצעות ה-Q switch. השתמשו בפולס Sync out TTL של האלקטרוניקה של לייזר ה-neodymium dope atrium aluminum garnet כדי להפעיל את הממיר מאנלוגי לדיגיטלי של הספקטרומטר.

הגדירו את קצב העירור של הלייזר לביצוע מדידות סריקה בשלבים (step scan) ברזולוציית זמן בטווח ספקטרלי של 1800 עד 850 cm⁻¹. מקמו מסנן אופטי למעבר נמוך (lowpass) בנתיב האופטי, שיהיה אט מעל 1,950 cm⁻¹ ובעל העברה טובה מתחת ל-1800 cm⁻¹.

לאחר מכן, שנו את מצב הגלאי מצימוד AC לצימוד DC. בשלב זה, אפסו את רמת ה-DC של ה-INTERFEROGRAM על ידי הפעלת מתח הסטה (bias) לגלאי. כווני מחדש את ההגבר האלקטרוני כדי לנצל טוב יותר את הטווח הדינמי של הממיר מאנלוגי לדיגיטלי.

לאחר מכן, הפעל את תפריט ה-step scan של ספקטרומטר ה-FTIR. הגדר את רוחב הפס הספקטרלי של מדידת ה-step scan לשמינית ממספר הגל של לייזר ההליום-ניאון. הגדר את הרזולוציה הספקטרלית והרזולוציית הפאזה ל-8 cm⁻¹ ו-64 cm⁻¹ בהתאמה.

בחר פונקציית appe. לאחר מכן, הגדר את מצב רכישת ה-INTERFEROGRAM ל-single side forward. הגדר את קצב הדגימה של הממיר מאנלוגי לדיגיטלי לערך הגבוה ביותר הזמין בספקטרומטר.

הגדירו את הטריגר (trigger) של הניסוי כחיצוני. לאחר מכן, הגדירו את מספר נקודות הנתונים במרווחים לינאריים שיש להקליט, כולל 100 נקודות לפני הטריגר (pre-trigger). לאחר מכן, הגדירו את מספר החזרות (co-additions) או את מספר הממוצעים של התגובה הפוטוכימית עבור כל מיקום של המראה והתחילו את הניסוי.

לבסוף, חזור על הניסוי 10 פעמים עבור חיידקים, redsin, ו-35 פעמים על שלושה דגימות סרטים שונות עבור channel redsin two, כדי להגיע לכ-200 הוספות משותפות לכל מיקום מראה. פסי מאפיין מרעידות amite של קשרי פפטיד ניתנים להבחנה בספקטרום הבליעה של קצף יבש של חיידקים redsin. בעת שימוש בבפפרים בעלי חוזק יוני נמוך, הסרט מתרחב יתר על המידה, דבר המפחית את כמות החלבון הנבדקת על ידי השדה האוונסנטי (evanescent field). התלות המדויקת בין נפיחות הסרט לבין החוזק היוני של הבאפר תלויה, בין גורמים אחרים, באופי הליפידים.

נפיחות הקוממיות לאחר הידרציה דורשת זמן כדי להגיע לייצוב עבור חיידקי dosin. בממברנה סגולה, התהליך הוא מונו-אקספוננציאלי עם קבוע זמן של 12 דקות. תרשים תלת-ממדי מניסוי FDIR טיפוסי של סריקת מדרגות בעת רגעית על חיידקים.

כאן מוצג Redsin. ניתן לחלץ ספקטרומים בנקודות זמן ספציפיות. לדוגמה, כאשר מצבים ביניים במחזור הפוטו-כימי של ה-redsin בחיידקים צפויים להגיע לאוכלוסייה הגבוהה ביותר שלהם.

בבקטריה rod Dossin, עקומות זמן של שינויי בולענות ב-1,762 סמ⁻¹ מעידות על דינמיקת הפרוטונציה והדה-פרוטונציה של aspartate 85, וב-1,741 סמ⁻¹ על שינויים בקשרי מימן ועל דינמיקת הדה-פרוטונציה והרה-פרוטונציה של חומצה אספרטית 96. עקומות הזמן ב-1,670 ו-1,555 סמ⁻¹.

דווח על שינויים בתנודות של MI אחת ושתיים, ששתיהן רגישות לקונפורמציה של שלד הפפטיד. בעקבות שיטה זו, ניתן לבצע טכניקות אחרות כגון נוירוגנזה מכוונת לאתר או ספקטרוסקופיה של אנזימי הרשתית, על מנת לשייך פס תנודתי לשאריות ספציפיות בחלבון לאחר פיתוחו. טכניקה זו סללה את הדרך לחוקרים בתחום הביופיזיקה המולקולרית לחקור את המנגנון התפקודי של חלבונים רבים ושונים המונעים על ידי אור.