שיטות כדי לאפיין ספונטניות ומושרות רתיעת תנועה במודל של מחלת פרקינסון מושרה Rotenone של
17 באוגוסט 2014
מחלת פרקינסון היא הפרעה ניוונית של מערכת עצבים, הנובעת מהניוון של נוירונים דופאמין במערכת העצבים המרכזית, גורמים לליקויי תנועה. מודלים Rotenone מחלת פרקינסון בדרוזופילה. מאמר זה מתאר שני מבחני המאפיינים את ליקויי תנועה הן ספונטניים ולהבהיל מושרים נגרמים על ידי rotenone.
המטרה הכללית של הניסוי הבא היא לקבוע את התנועה הספונטנית ארוכת הטווח ואת התנועה המושרית על ידי תגובת בהלה במודל של מחלת פרקינסון ב-drosophila המושרה על ידי rotenone; דבר זה מושג באמצעות גידול של drosophila על מזון המועשר ב-rotenone כדי להשרות את הפנוטיפ. כשלב שני, הזבובים נחשפים לבדיקת תגובת בהלה, למערך של מבחנות כפולות ולבדיקת תנועה ספונטנית ארוכת טווח. בניטור פעילות של drosophila, התוצאות מראות כי חשיפה ל-rotenone גורמת לפגמים בתנועה ב-drosophila, בהתבסס על כימות של תגובת הבהלה והתנועה הספונטנית ארוכת הטווח.
שיטות אלו יכולות לסייע במתן תשובות לשאלות מפתח בתחום ה-drosophila, ובמיוחד במודלים של הפרעות ניו روندגנרטיביות והפרעות בתנועה, כגון פגמים בתנועה המושרה על ידי בהלה, ותנועה ספונטנית לטווח ארוך. לתחילת הפעולה, הוסיפו 1.5 grams של מצע drosophila מיידי. בתוך מבחנה סטנדרטית לזבובים (fly vial), הכינו את המצע עם 5 milliliters של מים דה-יוניים המכילים את מינון ה-rotenone המתאים.
בשלב הבא, הרדימו שמונה עד 12 זבובים זכרים בני יום עד שלושה ימים באמצעות פחמן דו-חמצני והעבירו אותם למבחנות המכילות את התרופה. מזון מועשר יאפשר לזבובים להתאושש מההרדמה במשך 20 דקות כאשר המבחנה במצב אופקי. לאחר מכן, הניחו את המבחנה במצב אנכי באינקובטור עם מחזור אור-חושך של 12 שעות בטמפרטורה של 25 °C למשך יתרת הניסוי.
בשלב הבא, הפוך מבחנה סטנדרטית לזבובים מעל מבחנה אחרת ואטום את החיבור באמצעות סרט דביק כדי ליצור מערך של מבחנה כפולה. לאחר מכן, חלק את המבחנה הכפולה לשלושה מקטעים שווים של 6.33 centimeters על ידי סימון עיגולים מסביב למבחנות באמצעות טוש פרמננטי. לאחר שלושה ימים של חשיפה לתרופה, העבר את הזבובים אל מערך המבחנה הכפולה.
לאחר החלפת הסרט מעל התפר, יש לאפשר לזבובים להתרגל לסביבה החדשה למשך 15 דקות. לאחר מכן, הניחו את המבחנות על רקע לבן והגדירו את המצלמה הדיגיטלית. ודאו כי כל המערך נראה בתוך פריים אחד, וכי מערך המבחנות הכפול והטיימר נראים בבירור וכל הזבובים נמצאים במיקוד.
סמנו את מיקום המצלמה ואת מיקום המבחנה כדי לשמור על מסגרות עקביות בין החזרות, והציגו בבירור את מספר ההרצה ואת הטיפול התרופתי בשדה הראייה של המצלמה. לאחר מכן, הקישו בחוזקה את מכשיר המבחנות הכפולות נגד משטח העבודה שלוש פעמים, וודאו שכל הזבובים נפלו לתחתית המבחנה והפעילו את הטיימר באופן מיידי. צלמו את המכשיר מדי חמש שניות למשך דקה אחת.
לאחר מכן, אפשרו לזבובים להתאושש ללא הפרעה במשך דקה אחת. חזרו על הבדיקה פעמיים נוספות, עם זמני התאוששות של דקה אחת בין ניסוי לניסוי. סקרו את התמונות ורשמו את מספר הזבובים בכל מקטע לאורך זמן כדי לבצע את החישובים; הכינו מחדש שלוש גרם של instant oph, מצע עם 15 milliliters של מים דה-יוניזציה והמינון המתאים של rotenone.
לאחר חמש דקות, מקמו בזהירות את המבחנות באופן אנכי בתוך בקבוקונים שקופים, והעלו את המצע המוצק לגובה של own centimeter על ידי סיבוב המבחנה. לאחר מכן, דחפו בעדינות את פקק הפלסטיק בקצה המבחנה, תוך הימנעות מיצירת בועות אוויר. הרדימו זבובים זכרים בני יום אחד באמצעות carbon dioxide והכניסו בזהירות זבוב אחד לכל מבחנה בעזרת מברשת צבע.
לאחר מכן, חסמו את קצה המבחנה בעזרת גדור צמר קטן. המתינו 15 דקות כשהמבחנות במצב אופקי כדי לאפשר לזבובים להתאושש מחשיפה לפחמן דו-חמצני, וודאו כי כל הזבובים בחיים ופעילים. הכניסו את המבחנות למערכת ניטור פעילות דרוזופילה, או DAM, ובדקו שכל המבחנות נמצאות באותו מיקום ביחס למערכת ה-DAM.
הנח את ה-DAM באינקובטור עם מחזור אור-חושך של 12 שעות בטמפרטורה של 25 degrees Celsius. לאחר מכן, חבר את ה-DAM למערכת איסוף הנתונים. לאחר מכן, פתח את תוכנת ה-DAM תחת ההגדרות (preferences).
בחר באורך סל (bin length) של 10 דקות להתחלת איסוף הנתונים, ואפשר לתוכנה לאסוף נתונים במשך שבעה ימים. לאחר מכן, פתח את תוכנית סריקת קובצי ה-DAM וגש לנתוני הניטור על ידי לחיצה על "select input data". לאחר מכן בחר את טווח הניטור המתאים והגדר את אורך הסל למרווחים של 10 דקות.
בשלב הבא, תחת סוג קובץ הפלט (output file type), בחרו בקובצי ערוצים (channel files) והשאירו את שאר האפשרויות על הגדרות ברירת המחדל. לאחר מכן לחצו על סריקת נתונים (scan data) ושמרו את הקבצים בתיקייה ייעודית. לבסוף, ייבאו את הנתונים לתוכנה לניתוח נתוני מקצב צירקדי כדי לקבל את מספר הספירות לדקה.
לאחר שלושה ימי חשיפה למינונים שונים, זבובים מסוג Canton-S (wild type) שנחשפו למינונים מוגברים הראו ליקוי בתגובת ההבהלה. אחוז נמוך יותר של זבובים שהה בחלק העליון ואחוז גבוה יותר בחלק התחתון של המכשור לאחר 30 שניות, דבר המעיד על ליקוי בתגובת ההבהלה; מגמה דומה נצפתה בזבובים במבחן התנועה הספונטנית. מספר התנועות לדקה נמדד באמצעות מד פעילות דרוזופילה (Drosophila Activity Monitor) או DAM.
ביום הרביעי לאחר החשיפה, זבובים שנחשפו ל-250 micromolar ו-500 micromolar של rotenone מראים הפחתה משמעותית במספר הפעימות לדקה. ניתן להתאים את הבדיקות הללו בנוחות לאפיון פגמים בניידות במודלים אחרים של מחלות בוושט ולהערכת היעילות של סוכנים טיפוליים.
צפו בתמליל המלא וקבלו גישה לאלפי סרטונים מדעיים
סקירה כללית
מחקר זה בוחן ליקויי תנועה במודל של זבוב הפירות (Drosophila) למחלת פרקינסון שהושרה על ידי rotenone. המחקר מתמקד הן בתנועה ספונטנית והן בתנועה המושרה על ידי גירוי (startle-induced), ומספק תובנות לגבי הפרעות נוירודגנרטיביות.
מרכיבי מפתח של המחקר
תחום מדעי
- מדעי המוח
- ניתוח התנהגותי
- הפרעות נוירודגנרטיביות
רקע
- מחלת פרקינסון מאופיינת בניוון של נוירונים דופמינרגיים.
- Drosophila משמשת כאורגניזם מודל לחקר פגמים בתנועה.
- Rotenone משמש להשראת תסמינים דמויי פרקינסון בזבובים אלו.
- הבנת התנועה יכולה לספק תובנות לגבי מנגנוני הניוון העצבי.
מטרת המחקר
- להערכת תנועה (locomotion) המושראת על ידי תגובת הדhארה ב-Drosophila.
- להערכת תנועה ספונטנית ארוכת טווח במודל המושרה על ידי rotenone.
- לבחינת ההשפעה של rotenone על התנהגות תנועתית.
שיטות שנעשה בהן שימוש
- זבובים מסוג Drosophila גודלו על מזון מועשר ב-rotenone.
- הזבובים עברו בדיקת תגובה להבהלה (startle response assay).
- מכשיר של מבחנות כפולות שימש להערכת תנועתיות (locomotion).
- תנועתיות ספונטנית לטווח ארוך נמדדה באמצעות מד פעילות ל-Drosophila.
תוצאות עיקריות
- חשיפה ל-rotenone הובילה לליקויי תנועה משמעותיים.
- כימות הנתונים חשף פגיעה בתנועה המושרה על ידי תגובת בהלה.
- גם התנועה הספונטנית לטווח ארוך הושפעה מהחשיפה ל-rotenone.
- ממצאים אלו תורמים להבנת הפרעות בתנועה במודלים של מחלות נוירודגנרטיביות.
מסקנות
- המחקר מספק מסגרת להערכת תנועה במודלים של *Drosophila* למחלת הפרקינסון.
- התוצאות מדגישות את התועלת בשימוש ברוטנון (rotenone) במחקר של הפרעות נוירודגנרטיביות.
- מחקרים עתידיים יכולים להסתמך על שיטות אלו כדי לבחון שאלות נוירוביולוגיות נוספות.
שאלות נפוצות
רלוונטיות תעשייתית למנהלים
מחקר זה מספק גישה ניתנת להרחבה ובעלת תפוקה גבוהה לכימות פגמים מוטוריים במודל של Drosophila למחלת פרקינסון, המאפשרת תיקוף יעדים בשלבים מוקדמים והפחתת סיכונים מנגנונית עבור טיפולים נוירודגנרטיביים. על ידי לכידה של פנוטיפים של תנועה ספונטנית ותנועה מושרית מהפתעה, הבדיקות תומכות בביטחון ניבוי לגבי מודולציה של מסלולים ומסעות סריקה פנוטיפיים. המתודולוגיה מציעה רציפות תרגומית משלב הגילוי ועד להערכה פרה-קלינית, ובכך מסייעת לתעדוף מותאם-סיכון של תרכובות המשפיעות על שלמות נוירונים דופמינרגיים ותפקוד מיטוכונדריאלי.
יישומים אסטרטגיים במו"פ של ביו-פארמה
גילוי מוקדם ותיקוף מטרה
- ערך מדעי: מאפשר בדיקה של היפותזות טיפוליות הקשורות להישרדות נוירונים דופמינרגיים ולעיכוב של קומפלקס I מיטוכונדריאלי.
- ערך תפעולי: מספק מדדים כמותיים הניתנים לשחזור לצורך הבהרת מסלולים ביולוגיים והפחתת סיכונים ביולוגיים של מטרות מיטוכונדריאליות.
- ערך ניבויי: תומך במיון תיקי תרופות על ידי הבחנה בין תרכובות המצילות את התפקוד הלוקומוטורי לבין תרכובות שאין להן השפעה על גירעונות המושרים על ידי rotenone.
סריקה ופיתוח בדיקה (Assay)
- ערך מדעי: מספק מערכות ביולוגיות עוברות תיקוף להערכה של תרכובות בשלבים הבאים במסכים המתמקדים בניווניות עצבים.
- ערך תפעולי: מבטיח סטנדרטיזציה של הבדיקה ותאימות לסריקה בסנכרון גבוה באמצעות מכשיר מבחנות כפול ומכשיר למעקב אחר פעילות של Drosophila.
- יכולת הרחבה: מאפשר שימוש חוזר בפלטפורמה על פני מינונים שונים של rotenone ורקעים גנטיים שונים, לצורך פנוטיפ של תנועה עקבי.
מחקר תרגומי ופרה-קליני
- ערך מדעי: שומר על רלוונטיות למחלה על ידי מידול עקה חמצונית וירידה במוטוריקה המושרים על ידי rotenone, במקביל להתקדמות מחלת הפרקינסון בבני אדם.
- ערך תפעולי: מאפשר מעקב אורכי של התנועה הספונטנית לאורך שבעה ימים להערכת השפעות כרוניות של התרכובת.
- ערך ניבוי: תומך בהחלטות קידום מותאמות סיכון על ידי קישור תגובות הדהמה חריפות ופעילות לטווח ארוך למנגנונים ניווניים של מערכת העצבים.
שילוב תהליכי עבודה וצינור עיבוד
השיטה משתלבת בתהליכי עבודה של שלבים מוקדמים בגילוי (discovery) על ידי קביעת קווי בסיס של תנועה לפני סריקת תרכובות, ונמשכת לשלב אופטימיזציה של תרכיבים מובילים (lead optimization) לצורך אישור מנגנון הפעולה.
- ביולוגיה של הגילוי: תומכת בבדיקת השערות הנוגעות לתפקוד לקוי של מיטוכונדריה ומסלולי עקה חמצונית בניו روندגנרציה.
- סריקה: מספקת תוצרי התניידות כמותיים מבוססי-תאים (bins), המתאימים לניתוח תמונות אוטומטי ולאפיוני תגובה למספר.
- אנליטיקה: מייצרת נתוני ספירה לדקה והתפלגות מיקום המאפשרים השוואה סטטיסטית של השפעות הטיפול לאורך זמן.
- מחקר תרגומי: מקשרת בין פגמים בתגובת בהלה אקוטית ואובדן פעילות ספונטנית כרונית לבין דעיסה מוטורית הדרגתית הנראית במודלים פרה-קליניים.
- שימוש חוזר ארגוני: מבססת פלטפורמה לטיפוס פנוטיפי של התניידות הניתנת לשימוש חוזר וניתנת להתאמה למודלים אחרים של מחלות ב-Drosophila ולבדיקת יעילות טיפולית.
השפעה תפעולית וארגונית
- ערך מדעי: מגביר את הביטחון החזוי בתיקוף המטרה על ידי הפחתת העמימות המכניסטית בפנוטיפים של תנועתיות.
- ערך תפעולי: משפר את השחזור והסטנדרטיזציה בין מעבדות באמצעות פרוטוקולי הקשה מוגדרים, מרווחי התאוששות ופרמטרי דימוי.
- ערך אסטרטגי: משפר החלטות המשך (go/no-go) על ידי אספקת סמנים ביולוגיים כמותיים ומוקדמים של שלמות נוירונלית ותפקוד מיטוכונדריאלי.
- השפעה על הפורטפוליו: מאפשר תיעדוף מבוסס סיכון של תרכובות המשנות את ההידרדרות התנועתית המושרית על ידי rotenone, ובכך מפחית את הסיכון לכישלון בשלב מאוחר.
שיקולי יישום
- דורש מומחיות בטיפול ב-Drosophila, הרדמה והקמה של מערך לבדיקה התנהגותית.
- תלוי בתשתית הדמיה (מצלמה דיגיטלית, תאורה) ובמערכות ניטור פעילות של Drosophila לצורך איסוף נתונים.
- מחייב סטנדרטיזציה בין צוותים בסימון המבחנות, בעוצמת הנקישה ובזמני ההתאוששות כדי להבטיח עקביות בין הבדיקות.
- כולל שיקולי התאמה בעת הרחבת הבדיקות לרקעים גנטיים או לתנאים סביבתיים שונים.
- מוגבל על ידי הצורך בבדיקה ידנית של תמונות בבדיקות בהלה, אלא אם יוטמע מעקב אוטומטי.
שאלות נפוצות בנושאי ביו-פרמה
Chapters in this video
0:05
Title
1:12
Startle-induced Locomotion Assay and Setup
3:11
Startle-induced Locomotion Experimentation and Data Analysis
4:04
Spontaneous Locomotion Assay Setup
5:19
Spontaneous Locomotion Data Collection and Analysis
6:36
Results: Rotenone-induced Response Deficiency
7:35
Conclusion
