שיטות כדי לאפיין ספונטניות ומושרות רתיעת תנועה במודל של מחלת פרקינסון מושרה Rotenone של דרוזופילה

המטרה הכוללת של הניסוי הבא היא לקבוע תנועה ספונטנית המושרה על ידי בהלה וארוכת טווח במודל מחלת פרקינסון המושרה על ידי רוטנון של דרוזופילה, זה מושג על ידי גידול דרוזופילה על מזון בתוספת רוטנון כדי לגרום לפנוטיפ. כשלב שני, זבובים נתונים לבדיקת תגובת הבהלה ומנגנון בקבוקון כפול ובדיקת תנועה ספונטנית לטווח ארוך. במוניטור פעילות דרוזופילה, התוצאות מראות כי חשיפה לרוטנון גורמת לפגמים בתנועה בדרוזופילה בהתבסס על כימות של תנועה ספונטנית בהלה וארוכת טווח.

שיטות אלו יכולות לעזור לענות על שאלות מפתח בתחום הדרוזופילה, מודלים של הפרעות ניווניות ותנועה, כגון פגמים בתנועה המושרה על ידי בהלה ותנועה ספונטנית לטווח ארוך. כדי להתחיל, הוסף 1.5 גרם מדיום דרוזופילה מיידי. בבקבוקון זבוב רגיל מהווים את המדיום עם חמישה מיליליטר מים נטולי יונים המכילים את מינון הרוטנון המתאים.

לאחר מכן, שמונה עד 12 זבובים זכרים בני יום עד שלושה ימים משתמשים בפחמן דו חמצני ומעבירים אותם לבקבוקונים המכילים את התרופה. תוספת מזון מאפשרת לזבובים להתאושש מהרגעה למשך 20 דקות כשהבקבוקון במצב אופקי. לאחר מכן הניחו את הבקבוקון זקוף באינקובטור כהה בהיר של 12 שעות בטמפרטורה של 25 מעלות צלזיוס למשך שארית הניסוי.

לאחר מכן, הפוך בקבוקון זבוב רגיל על גבי בקבוקון אחר ואטום את התפר עם סרט ליצירת מנגנון בקבוקון כפול. לאחר מכן חלקו את הבקבוקון הכפול לשלושה חלקים שווים של 6.33 סנטימטרים על ידי סימון עיגולים סביב הבקבוקונים בטוש קבוע. לאחר שלושה ימים של חשיפה לסמים, מעבירים זבובים למנגנון הבקבוקון הכפול.

החלפת הקלטת מעל התפר מאפשרת לזבובים להתאקלם בסביבה החדשה למשך 15 דקות. לאחר מכן הניחו את הבקבוקונים על רקע לבן והגדירו את המצלמה הדיגיטלית. ודא שהמנגנון כולו נראה במסגרת תמונה אחת ושמכשיר הבקבוקון הכפול והטיימר נראים וכל הזבובים בפוקוס.

סמן את מיקום המצלמה והבקבוקון כדי לשמור על מסגרות עקביות בין הניסויים, הצג בבירור את מספר הניסוי והטיפול התרופתי בתצוגת המצלמה. לאחר מכן, הקש בחוזקה על מנגנון הבקבוקון הכפול על השיש שלוש פעמים וודא שכל הזבובים נופלים לתחתית הבקבוקון והפעל את הטיימר מיד. צלם תמונה של המכשיר כל חמש שניות למשך דקה אחת.

לאחר מכן אפשר לזבובים להתאושש ללא הפרעה למשך דקה אחת. חזור על הבדיקה פעמיים נוספות עם זמני התאוששות של דקה אחת בין כל ניסוי. סקור את התמונות ורשום את מספר הזבובים בכל קטע לאורך זמן כדי לבצע את החישובים להרכיב מחדש שלושה גרם של אוף מיידי, מדיום עם 15 מיליליטר מים נטולי יונים ומינון רוטנון מתאים.

לאחר חמש דקות, הנח בזהירות את הצינורות אנכית לבקבוקונים שקופים והעמיס את המזון המוצק בגובה סנטימטר אחד על ידי סיבוב הצינור. לאחר מכן, דחף בעדינות את מכסה הפלסטיק בקצה הצינור, הימנע מיצירת בועות אוויר הרגעה. זכר בן יום אחד עף עם פחמן דו חמצני ומכניס בזהירות זבוב אחד לכל צינור בעזרת מברשת.

ואז חבר את קצה הצינור עם צמר גפן קטן. אפשר לזבובים להתאושש מפחמן דו חמצני כשהצינורות במצב אופקי למשך 15 דקות וודא שכל הזבובים חיים ופעילים. הכנס את הצינורות למוניטור פעילות הדרוזופילה או DAM, ובדוק שכל הצינורות נמצאים באותו מיקום ביחס ל-DAM.

הנח את ה-DAM באינקובטור כהה בהיר של 12 שעות ב-25 מעלות צלזיוס. לאחר מכן, חבר את ה-DAM למערכת איסוף הנתונים. לאחר מכן פתח את תוכנת DAM תחת העדפות.

בחר איסוף נתוני התחלה באורך סל של 10 דקות, ואפשר לתוכנית לאסוף נתונים במשך שבעה ימים. לאחר מכן, פתח את תוכנית סריקת קבצי DAM וגש לנתוני הצג על ידי לחיצה על בחר נתוני קלט. לאחר מכן בחר את טווח הצג המתאים והגדר את אורך הסל למרווחי זמן של 10 דקות.

הבא בסוג קובץ הפלט, בחר קובצי ערוצים והשאר את כל האפשרויות האחרות בברירת המחדל שלהן. לאחר מכן לחץ על סרוק נתונים ושמור את הקבצים בתיקיה ייעודית. לבסוף, ייבא נתונים לתוכנת ניתוח נתונים צירקדית כדי לקבל ספירות לדקה.

לאחר שלושה ימים של חשיפה למינונים שונים של זבובי קנטון שנחשפו למינונים מוגברים הראו מחסור בתגובת הבהלה. אחוז נמוך יותר של זבובים היו בחלק העליון ואחוז גבוה יותר בחלק התחתון של המכשיר לאחר 30 שניות המעידים על ליקוי בתגובת הסאראל, מגמה דומה נצפתה עבור זבובים בבדיקת התנועה הספונטנית. ספירות לדקה נמדדו במוניטור פעילות הדרוזופילה או DAM.

ביום הרביעי לאחר החשיפה, זבובים שנחשפו ל-250 מיקרו-מולאר ו-500 מיקרו-מולר של רוטנון מציגים ירידה משמעותית בספירה לדקה. ניתן להתאים את הבדיקות הללו בנוחות כדי לאפיין פגמים בתנועה במודלים אחרים של מחלות בוושט ויעילות של חומרים טיפוליים.