Name: השימוש במערכי יעד פלורסנט להערכה של תגובות תא T בvivo (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-06-19T15:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 9 s
Description: למד ליצור מערכי יעד פלורסנטים להערכת תגובות תאי T בחולדות באמצעות ציטומטריית זרימה רב-פרמטרית. השיטה מאפשרת ניתוח של מעל 250 פרמטרים בו-זמנית בתאי מטרה מתויגים בצבעי CFSE ו-CTV.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

עבודה זו נתמכה על ידי פרויקט מענקים # 1010395 (CP BQ ו) ו# 525,431 (CR), ותכנית # גרנט 455,395 (CP) מהמועצה למחקר הבריאות והרפואה הלאומית של אוסטרליה, מרכז אוסטרלי לצהבת והאיידס וירולוגיה EOI 2012 מענק (CR וRJJ) ומענק מטעם קרן גורדון וגרטל רועת הדובים (BQ ו CR). ברצוננו להודות Harpreet Vohra ומיכאל Devoy לתחזוקה שלהם המעולה של המעבדה JCSMR FACS, המתקן האוסטרלי לחקר סרטן קרן Biomolecular המשאבים, JCSMR, ANU, לסינתזת פפטיד, וד&quot;ר דוד בויל, מעבדות CSIRO לבריאות בעלי חיים, ילונג, אוסטרליה למתן מניות חיסון הורה ה-HIV.

<ol><li>Quah, B. J., Wijesundara, D. K., Ranasinghe, C., Parish, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescent+target+array+killing+assay%3A+A+multiplex+cytotoxic+T-cell+assay+to+measure+detailed+T-cell+antigen+specificity+and+avidity+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Cytometry+A%22%5BJournal%5D)">Fluorescent target array killing assay: A multiplex cytotoxic T-cell assay to measure detailed T-cell antigen specificity and avidity in vivo.</a> Cytometry A. 81, 679-690 (2012).</li>
<li>Quah, B. J., Wijesundara, D. K., Ranasinghe, C., Parish, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescent+target+array+T+helper+assay%3A+a+multiplex+flow+cytometry+assay+to+measure+antigen-specific+CD4%2B+T+cell-mediated+B+cell+help+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol+Methods%22%5BJournal%5D)">Fluorescent target array T helper assay: a multiplex flow cytometry assay to measure antigen-specific CD4+ T cell-mediated B cell help in vivo.</a> J Immunol Methods. 387, 181-190 (2013).</li>
<li>Quah, B. J., Parish, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((New+and+improved+methods+for+measuring+lymphocyte+proliferation+in+vitro+and+in+vivo+using+CFSE-like+fluorescent+dyes%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol+Methods%22%5BJournal%5D)">New and improved methods for measuring lymphocyte proliferation in vitro and in vivo using CFSE-like fluorescent dyes.</a> J Immunol Methods. 379, 1-14 (2012).</li>
<li>Mata, M., Paterson, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Th1+T+cell+responses+to+HIV-1+Gag+protein+delivered+by+a+Listeria+monocytogenes+vaccine+are+similar+to+those+induced+by+endogenous+listerial+antigens%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">Th1 T cell responses to HIV-1 Gag protein delivered by a Listeria monocytogenes vaccine are similar to those induced by endogenous listerial antigens.</a> J Immunol. 163, 1449-1456 (1999).</li>
<li>Earl, P. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Design+and+evaluation+of+multi-gene%2C+multi-clade+HIV-1+MVA+vaccines%5BTitle%5D)+AND+%22Vaccine%22%5BJournal%5D)">Design and evaluation of multi-gene, multi-clade HIV-1 MVA vaccines.</a> Vaccine. 27, 5885-5895 (2009).</li>
<li>Wild, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preclinical+evaluation+of+the+immunogenicity+of+C-type+HIV-1-based+DNA+and+NYVAC+vaccines+in+the+Balb%2FC+mouse+model%5BTitle%5D)+AND+%22Viral+Immunol%22%5BJournal%5D)">Preclinical evaluation of the immunogenicity of C-type HIV-1-based DNA and NYVAC vaccines in the Balb/C mouse model.</a> Viral Immunol. 22, 309-319 (2009).</li>
<li>Takeshita, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+analysis+of+the+same+HIV+peptide+functionally+binding+to+both+a+class+I+and+a+class+II+MHC+molecule%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">Molecular analysis of the same HIV peptide functionally binding to both a class I and a class II MHC molecule.</a> J Immunol. 154, 1973-1986 (1995).</li>
<li>Krutzik, P. O., Nolan, G. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescent+cell+barcoding+in+flow+cytometry+allows+high-throughput+drug+screening+and+signaling+profiling%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Fluorescent cell barcoding in flow cytometry allows high-throughput drug screening and signaling profiling.</a> Nature Methods. 3, 361-368 (2006).</li>
<li>Gilbert, D. F., Wilson, J. C., Nink, V., Lynch, J. W., Osborne, G. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiplexed+labeling+of+viable+cells+for+high-throughput+analysis+of+glycine+receptor+function+using+flow+cytometry%5BTitle%5D)+AND+%22Cytometry+A%22%5BJournal%5D)">Multiplexed labeling of viable cells for high-throughput analysis of glycine receptor function using flow cytometry.</a> Cytometry A. 75, 440-449 (2009).</li>
<li>Quah, B. J., Parish, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+use+of+carboxyfluorescein+diacetate+succinimidyl+ester+%28CFSE%29+to+monitor+lymphocyte+proliferation%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">The use of carboxyfluorescein diacetate succinimidyl ester (CFSE) to monitor lymphocyte proliferation.</a> J Vis Exp. , (2010).</li>
<li>Quah, B. J., Warren, H. S., Parish, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Monitoring+lymphocyte+proliferation+in+vitro+and+in+vivo+with+the+intracellular+fluorescent+dye+carboxyfluorescein+diacetate+succinimidyl+ester%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Monitoring lymphocyte proliferation in vitro and in vivo with the intracellular fluorescent dye carboxyfluorescein diacetate succinimidyl ester.</a> Nat Protoc. 2, 2049-2056 (2007).</li>
<li>Durward, M., Harms, J., Splitter, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antigen+specific+killing+assay+using+CFSE+labeled+target+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Antigen specific killing assay using CFSE labeled target cells.</a> J Vis Exp. , (2010).</li>
<li>Hermans, I. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+VITAL+assay%3A+a+versatile+fluorometric+technique+for+assessing+CTL-+and+NKT-mediated+cytotoxicity+against+multiple+targets+in+vitro+and+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol+Methods%22%5BJournal%5D)">The VITAL assay: a versatile fluorometric technique for assessing CTL- and NKT-mediated cytotoxicity against multiple targets in vitro and in vivo.</a> J Immunol Methods. 285, 25-40 (2004).</li>
<li>Busch, D. H., Pamer, E. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((T+cell+affinity+maturation+by+selective+expansion+during+infection%5BTitle%5D)+AND+%22J+Exp+Med%22%5BJournal%5D)">T cell affinity maturation by selective expansion during infection.</a> J Exp Med. 189, 701-710 (1999).</li>
<li>Savage, P. A., Boniface, J. J., Davis, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+kinetic+basis+for+T+cell+receptor+repertoire+selection+during+an+immune+response%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">A kinetic basis for T cell receptor repertoire selection during an immune response.</a> Immunity. 10, 485-492 (1999).</li>
<li>Wang, X. L., Altman, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Caveats+in+the+design+of+MHC+class+I+tetramer%2Fantigen-specific+T+lymphocytes+dissociation+assays%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol+Methods%22%5BJournal%5D)">Caveats in the design of MHC class I tetramer/antigen-specific T lymphocytes dissociation assays.</a> J Immunol Methods. 280, 25-35 (2003).</li>
<li>von Essen, M. R., Kongsbak, M., Geisler, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanisms+behind+functional+avidity+maturation+in+T+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Dev+Immunol%22%5BJournal%5D)">Mechanisms behind functional avidity maturation in T cells.</a> Clin Dev Immunol. , (2012).</li>
<li>Prussin, C., Metcalfe, D. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detection+of+intracytoplasmic+cytokine+using+flow+cytometry+and+directly+conjugated+anti-cytokine+antibodies%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol+Methods%22%5BJournal%5D)">Detection of intracytoplasmic cytokine using flow cytometry and directly conjugated anti-cytokine antibodies.</a> J Immunol Methods. 188, 117-128 (1995).</li>
<li>Foster, B., Prussin, C., Liu, F., Whitmire, J. K., Whitton, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detection+of+intracellular+cytokines+by+flow+cytometry%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Protoc+Immunol%22%5BJournal%5D)">Detection of intracellular cytokines by flow cytometry.</a> Curr Protoc Immunol. , (2007).</li>
<li>Czerkinsky, C. C., Nilsson, L. A., Nygren, H., Ouchterlony, O., Tarkowski, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+solid-phase+enzyme-linked+immunospot+%28ELISPOT%29+assay+for+enumeration+of+specific+antibody-secreting+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol+Methods%22%5BJournal%5D)">A solid-phase enzyme-linked immunospot (ELISPOT) assay for enumeration of specific antibody-secreting cells.</a> J Immunol Methods. 65, 109-121 (1983).</li>
<li>Klinman, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ELISPOT+assay+to+detect+cytokine-secreting+murine+and+human+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Protoc+Immunol%22%5BJournal%5D)">ELISPOT assay to detect cytokine-secreting murine and human cells.</a> Curr Protoc Immunol. , (2008).</li>
<li>Yerly, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Increased+cytotoxic+T-lymphocyte+epitope+variant+cross-recognition+and+functional+avidity+are+associated+with+hepatitis+C+virus+clearance%5BTitle%5D)+AND+%22J+Virol%22%5BJournal%5D)">Increased cytotoxic T-lymphocyte epitope variant cross-recognition and functional avidity are associated with hepatitis C virus clearance.</a> J Virol. 82, 3147-3153 (2008).</li>
</ol>

החוקרים מצהירים כי אין להם אינטרסים כלכליים מתחרים.

היתרון של מבחני מבוססי FTA הוא שהם מאפשרים אפליה מ&gt; 250 אוכלוסיות תאי יעד קיימא ומתפקד באופן מלא מבעלי חי מארח אחד על ידי cytometry זרימה. זה מספק רמת המורכבות לin vivo מבחני מבוססים cytometry זרימה שלא היו אפשרי בעבר. זה מודגש בניסויים בבעלי החיים 2 הראו לעיל, שבו תגובות ל7 אפיטופים נגיפיים מובחנים בשעה 6 בריכוזים יכולים להיות במעקב במשכפל של 6 בו זמנית בחיה אחת המאפשרת פרמטרים כגון AUC ו50 EC שייקבעו לתגובות תא T in vivo . <p class="jove_conte...

תאי T לשחק תפקיד מרכזי בתגובה החיסונית אדפטיבית ולעתים קרובות יעד למניפולציה באימונותרפיה. תאי T מסוג CD4 + מפעיל להגיב לאנטיגן הזר על ידי הפרשת ציטוקינים המסדירים היבטים רבים של חסינות והוא יכול גם לעזור באופן ישיר תאי B לייצר נוגדנים. תאי CD8 + T ציטוטוקסיים (הרג) יכולים גם להגיב לאנטיגן הזר על ידי הפרשת ציטוקינים כמו גם משחק תפקיד מרכזי באופן ישיר הרג תאי מבטאי אנטיגן זר. האינטראקציה הבסיסית שיוזמת פונקציות מפעיל תא T אלה כרוך באינטראקציה של קולטן תא T (TCR) עם פפטידים זרים המוצגים על מולקולות MHC על פני השטח של תאים. תאים מסוג CD4 + T מכירים חלבונים המוצגים על מולקולות MHC ברמה השניה בתאי המציגים אנטיגנים ותאי CD8 + T מכירים חלבונים המוצגים על מולקולות MHC ברמה שאני שמוצגים בדרך כלל בתאי חיידק נגוע. על מנתכדי להעריך את תפקיד תאי T לשחק בתגובה חיסונית, זה חיוני כי פונקציות מפעיל שלהם נמדדות על ידי טכניקות אמינות ורגישות. שיטות נפוצות להערכת תגובת תא T כוללות; MHC class-I/II/peptide תגובתיות tetramer; ייצור ציטוקינים על ידי ELISPOT ומכתים ציטוקינים תאיים; והורג את הקיבולת על ידי 51 מבחני Cr-שחרורו. מבחני אלה, לעומת זאת, מבוצעים בדרך כלל ex vivo עם גירוי במבחנה, או לספק תובנה מוגבלת לתפקוד תא T. באופן אידיאלי, כאשר מודדים תגובות תא T זה יהיה מועיל להעריך אותם באתרו, in vivo כפי שהם מתרחשים, ללא מניפולציה של תאי T כדי למנוע שינויים בפרמטרים תפקודיים שעלולים להתרחש באמצעות גירוי במבחנה. חלק הנפוץ ביותר במבחני תא T vivo פונקציונליים מבוססים על מדידת הרג CTL בתיווך של תאי היעד פעמו עם פפטידים אני מחייב כיתת MHC, המנויים בvivoבאמצעות זיהוי שלהם באמצעות תיוג ניאון עם צבעים חיוניים כגון CFSE. בעוד סוגים אלה של מבחני יכולים לפקח על הרג CTL בתיווך של מטרות כשהם קורים in vivo, יש להם יכולת מוגבלת יחסית להעריך הריגתם של מטרות מרובות הצגת ריכוזים שונים וסוגים שונים של אפיטופים פפטיד, אשר נדרש כדי לאפשר לפרמטרים איכותיים כגון בעבר להיטות כפונקציונלית וריאנט epitope תגובתיות צולבת להיות מוערכת. מבחני אלה גם אינם מספקים שום מידע על תגובות תא בתיווך מסוג CD4 + T. כדי להתגבר על רב מהמגבלות עם שיטות הנוכחיות שימשו להערכת תגובות תא T, שפתחנו לאחרונה זמנית assay המבוסס על מערכי ניאון יעד (FTAs), המאפשר הניטור של תגובות תא T נגד&gt; 250 תאי המטרה בו זמנית בחיה אחת על ידי cytometry זרימת 1, 2. FTAs מורכב של לימפוציטים שכותרתו עם sevריכוזי eral ושילובים של צבעים חיוניים כמו CFSE, CTV ועלות לכל יום ומאפשרים&gt; 250 צבירי תאים של הקרינה ייחודית להיות שנוצרו. מכיוון שהתאים אלה נשארים קיימא ומתפקד באופן מלא, הם יכולים להיות מוזרקים לבעלי חיים כדי לאפשר ניטור של האינטראקציה שלהם עם תאי T מפעיל in vivo 3. לדוגמא, יכולים להיות פעמו צבירי תאי FTA עם פפטידים אני מחייב ברמה MHC כדי לאפשר הערכה של הרג CTL בתיווך אנטיגן הספציפי של תאי יעד 1. בנוסף, יכולים להיות גם פעמו צבירי תאי FTA עם פפטידים MHC ברמה השנייה מחייבים, המאפשרים הערכה של תא T מסייע אנטיגן ספציפי לפעילות (T H) על ידי הערכת הפעלה (על ידי הערכה של סמני הפעלה כגון CD69, CD44 ו / או CD62L) של תאי B בתוך FTA נושאים פפטיד מאותו המקור 2. מאז ניתן לאתר יותר מ -250 מטרות בו זמנית, ניתן למדוד תגובות CTL וT H נגד צבירי תאים רבים יעד פעמו עם nפפטידים umerous בריכוזים שונים וההכללה של משכפל רבים. Assay FTA לכן מספק רמה חסרת תקדים של הערכת תגובת מפעיל תא T in vivo. כאן אנו מתארים בפירוט את הבנייה של FTA ולהראות עד כמה הם יכולים להיות מיושמים להערכת תגובות תא T in vivo. הנוהל מתאר את בניית FTA המורכב מ252 צבירי תאים ניתן להבחין באמצעות השימוש בשלושה צבעים חיוניים, מורכבים 6 חזרות של 42 צבירי תאים פעמו עם MHC ברמה שאני ופפטידים השני מחייבים. התיוג של 42 צבירי תאים מתרחש ב10 חרוטי מיליליטר עם תחתית צינורות וזה עוזר להוציא אלה במעמד צינור כמתואר בטבלה 1. שיטה זו יכולה להיות מותאמת למספרים קטנים יותר של אשכולות להבחין כפי שנדרשה על ידי הפחתת הכמות של תיוג של כל צבע שבוצע 1. אנו מדגישים את התועלת של assay על ידי מראה איך זה יכול למדוד responses שנוצר על ידי חיסון אבעבועות וירוס רקומביננטי נגד אפיטופים מרובים במדגם קטן של עכברים. זה מראה כיצד assay FTA יכול לשמש כדי למדוד את התגובות מצטברות ולהיטות פונקציונלית דרך, בהתאמה, את השימוש בשטח תחת עקומת הערכות (AUC) ומדידת ריכוז הפפטיד יעיל נדרש ליצור תגובות מחצית מקסימליים (50 EC).

<table><tbody><tr><td>RPMI</td><td>Sigma</td><td>R8758</td><td></td></tr><tr><td>סרום עגל עוברי</td><td>Serana</td><td>FCS-500</td><td></td></tr><tr><td>CTV</td><td>Invitrogen</td><td>C34557</td><td></td></tr><tr><td>CFDA, SE</td><td>Invitrogen</td><td>C1157</td><td></td></tr><tr><td>CPD</td><td>eBioscience</td><td>65-0840-90</td><td></td></tr><tr><td>anti-B220 PerCp-Cy5.5</td><td>eBioscience</td><td>110730</td><td></td></tr><tr><td>anti-CD69 סגול מבריק 605</td><td>Biolegend</td><td>104529</td><td></td></tr><tr><td>PKH-26</td><td>Sigma</td><td>PKH26GL-1KT</td><td></td></tr><tr><td>Vortex</td><td>Scientific Industries Inc</td><td></td><td></td></tr><tr><td>צנטריפוגה</td> ציטומטר זרימה <td>אפנדורף</td><td></td><td></td></tr><tr><td>(Fortessa או שווה ערך עם מקור לייזר כחול, אדום וסגול)</td><td>BD Bioscience</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

השימוש במערכי יעד פלורסנט להערכה של תגובות תא t<em&gt; בvivo</em

The Use of Fluorescent Target Arrays for Assessment of T Cell Responses In vivo

היכולת לעקוב אחר תגובות תא T in vivo היא חשובה לפיתוח ההבנה של התגובה החיסונית שלנו ואת העיצוב של immunotherapies. כאן אנו מתארים את השימוש בטכנולוגית מערך יעד ניאון (FTA), אשר מנצלת צבעים חיוניים כגון succinimidyl אסתר carboxyfluorescein (CFSE), צבעי לייזר סגול להתרגש (ויולט CellTrace: CTV) וצבעי לייזר אדום להתרגש (Cell הפצת הנשק דיי eFluor 670: CPD ) לcombinatorially ימפוציטים עכבר תווית ל&gt; 250 צבירי תאי ניאון להבחין. צבירי תאים בתוך FTAs אלה ניתן פעמו עם histocompatibility המרכזי (MHC) פפטידים מחייבים ברמה שאני וMHC ברמה השני ובכך לפעול כתאי מטרה לCD8 + ותאים מסוג CD4 + T, בהתאמה. תאי FTA אלה להישאר קיימא ומתפקד באופן מלא, ולכן יכולים להינתן לעכברים כדי לאפשר הערכה של הרג בתיווך תא CD8 + T תאי יעד FTA והל-מדיטציה של תאי CD4 +עמ &#39;של תאי יעד תא FTA B בזמן אמת in vivo על ידי cytometry זרימה. מאז ניתן להעריך&gt; 250 תאי מטרה בפעם אחת, הטכניקה מאפשרת הניטור של תגובות תא T נגד כמה אפיטופים אנטיגן בכמה ריכוזים ובחזרות מרובות. ככזה, הטכניקה יכולה למדוד את תגובות תא T בשני (למשל גודל המצטבר של התגובה) כמותיים ו( להיטות למשל. פונקציונלית ותגובתיות epitope צולב של התגובה) איכותית ברמה. בזאת, אנו מתארים כיצד FTAs ​​אלה בנויים ולתת דוגמא של איך הם יכולים להיות מיושמים על מנת להעריך את תגובות תא T הנגרמות על ידי נגיף אבעבועות חיסון רקומביננטי.

כדוגמא לשימוש של assay FTA, עכבר BALB / ג היה חוסן בנגיף רקומביננטי vaccinia (VV) להביע HIV-אני אפיטופים (VV-HIV) ותגובות לאפיטופים HIV-CTL, Gag, mut איסור הפרסום, Env ופול, VV CTL אפיטופים F2L וmut F2L, וepitope HIV-T H התא, Gag ה (כפי שמתואר ב2) הוערכו באמצעות assay FTA 252 פרמטר (איור 1). גרסאות Epitope של Gag (mut איסור פרסום) וF2L (mut F2L) אינן באות לידי ביטוי בוקטור VV-HIV ולכן תגובות נגד אפיטופים אלה הן שיקוף של תגובות תא T תגובתי צלב...

היכולת לעקוב אחר תגובות תא T בפירוט in vivo היא חשובה לפיתוח ההבנה של התגובה החיסונית שלנו. כאן אנו מתארים את השימוש במערכי ניאון יעד (FTAs) בin vivo assay תא T שמעריך&gt; 250 פרמטרים בו זמנית על ידי cytometry זרימה.

השימוש במערכי יעד פלורסנט להערכה של תגובות תא T<em&gt; בvivo</em

The ability to monitor T cell responses in vivo is important for the development of our understanding of the immune response and the design of ...

המטרה הכללית של פרוצדורה זו היא ליצור מערך של עד 252 תאי מטרה פלואורסצנטיים המסומנים באופן מובחן עבור בדיקות חיסוניות באמצעות ציטומטריית זרימה רב-פרמטרית. דבר זה מושג תחילה על ידי סימון לימפוציטים של מטרה בשילובים ובעוצמות ייחודיים של צבעים חיוניים כגון CFSE ו-CTV. השלב הבא הוא חשיפת כל אוכלוסייה מובחנת של לימפוציטי מטרה לאפיטופים של פפטידים המועמדים להיקשר ל-MHC Class one ו-MHC class two.לאחר מכן התאים נשטפים באופן נרחב כדי לשמור על ספציפיות האפיטופים, ולאחר מכן התאים מאוגדים ומוזרקים לבעל חיים. השלבים הסופיים הם קציר של תאי מערך התיוג הפלואורסצנטי מרקמות ספציפיות, סימונם ובחינת תגובות ספציפיות לפפטידי MHC. בסופו של דבר, תוצאות ציטומטריית זרימה יכולה להראות תגובות CTL על ידי מדידת מוות של תאי מטרה, והן יכולה להראות תגובות T helper חיוביות ל-CD4 על ידי מדידת עלייה בביטוי של סממני אקטיבציה בתאי מטרה מסוג B. היתרון המרכזי של טכניקה זו על פני בדיקות CTL קונבנציונליות in vivo הוא שהיא מאפשרת מדידה סימולטנית של למעלה מ-250 תאי מטרה בבעל חיים אחד; את הפרוצדורה יעגיל בן קוייר (Ben Quire), עמית מחקר במעבדתי.הפרוצדורה דורשת לימפוציטים שנאספו מהטחול המבודד ו/או מקשרי לימפה של עכברים, אשר סוננו ותוחזקו בריסוס בריכוז של עד 200 מיליון תאים למיליליטר ב-11.5 מיליליטר של RPMI המכיל 5% fetal calf serum. הכנת ה-FDA מתחילה בסימון. 42 מבחנות פלסטיק בעלות תחתית קונית בנפח של 10 מיליליטר, ממוספרות מ-1 עד 42; כל התאים יעברו פולס עם שבעה אפיתופים פפטידיים שונים בשש ריכוזים שונים, בחזרה שש פעמים, כדי ליצור 252 מקבצי תאים נבדלים.כעת, השביה מחדש את הלימפוציטים באופן יסודי על ידי הפיכת המבחנה מספר פעמים. לאחר מכן, הוסף 1.9 milliliters של תרחיף תאים למבחנות של 10 milliliters המסומנות ב-37 עד 42, תוך הקפדה לא להרטיב את החלק העליון של המבחנות.כעת פתח את המכסה של מבחנה 38 והנח אותה במצב אופקי מעל מבחנה 38. הוסף 83 µL של PBS. לאחר מכן הוסף 17 µL של מלאי ה-CTV המתאים כפי שמוצג בטבלה שתיים של הפרוטוקול הכתוב.לאחר טעינת המבחנה, ערבבו אותה באמצעות וורטקס. חזרו על פעולה זו עם מבחנות 39 עד 42, תוך הבטחה שכל מבחנה תקבל מלאי CTV שונה כפי שרשום בטבלה 2.כעת יש לדגור את התאים למשך חמש דקות לפחות בטמפרטורת החדר. לאחר מכן, הוסיפו חמישה מיליליטר של RPMI המכיל 5%FCS לכל מבחנה. השביו את התאים ביסודיות באמצעות וורטקס לכל מבחנה. העבירו מיליליטר אחד של התליה לשש מבחנות אחרות בהתאם לתבנית הטעינה המוצעת המפורטת בפרוטוקול הטקסט; במהלך כל העברה, חשוב להקפיד לא להרטיב את החלק העליון של המבחנה הנטענת. כדי לסמן את התאים ב-CFSE, הסירו את פקקי המבחנות 31 עד 36 המכילות מיליליטר אחד של תאים והניחו את המבחנות באופן אופקי לצד כל אחת מהמבחנות.ראשית, יש להוסיף 103 µL של PBS, על ידי הזרקה לדופן העליונה היבשה. לאחר מכן, יש להוסיף שבעה µL של מלאי CFSE המתאים בהתאם לטבלה 3 של הפרוטוקול הכתוב, ולערבב מיד את המבחנה באמצעות וורטקס. חזור על פעולה זו עם המבחנות כפי שהן מקובצות בטבלה 3.יש לוודא שכל מבחנה מקבלת מלאי שונה של CFSE. דגרו את כל המבחנות למשך חמש דקות לפחות בטמפרטורת החדר. לאחר המתנה של חמש דקות, שטפו את התאים כדי להשלים את הסימון.דללו כל תרחיף עם תשעה מיליליטרים של RPMI בטמפרטורת החדר עם 5%FCS. שקיעו את התאים ב-300 GS למשך 10 דקות בטמפרטורת החדר והסירו את העלייה באמצעות שאיבה בעזרת פיפטת העברה. הכנת פפטידים נקשרי MHC Class one ו-MHC class two מוצגת בפרוטוקול הטקסט. סעיף זה מדגים כיצד לבצע סימון פולס (pulse label) של התאים באמצעות פפטידים אלו.ראשית, השביה מחדש את משקע התאים במדיום שנותר, לדוגמה, על ידי העברת המבחנות לאורך סבכה. לאחר מכן, הבא את הנפח הכולל של תרחיף התאים ל-250 µL ב-PMI שלנו המכיל 5% FCS. עבור כל משקע תאים יידרשו כ-200 µL של מדיום.בשלב הבא, הוסיפו 250 microliters של מלאי פפטידים שהוכן מראש, כמפורט בטבלה חמש, למבחנות המיועדות. פעלו לפי התבנית המוצגת בטבלה אחת והקפידו לכלול מבחנת ביקורת של PBS בלבד לצורך חישוב תגובות תאי T. קריטי שכל אפיתופ פפטידי וכל ריכוז פפטידי יוקצו למבחנה אחת, וכי הדבר יתועד בבירור בהתבסס על הפלואורסצנציה הצפויה של התאים במבחנה זו.מאחר שהחתימה הפלואורסצנטית של צביר זה תגדיר פפטיד זה, ערבב כל תרחיף תאים באמצעות וורטקס ולאחר מכן דגור את התאים בטמפרטורה של 37 °C למשך שעה אחת. לאחר הדגירה, בצע שטיפה של התאים. ראשית, הוסף 5 mL של RPMI קר מהקרח עם 5% FCS לכל תרחיף תאים והשב את התאים למצב של תרחיף על ידי היפוך המבחנות.לאחר מכן, הניחו בזהירות תחת כל תרחיף תאים שלושה מיליליטר של משקע FCS קר מאוד, שהתאים בו עברו ספינטרציה למשך 10 דקות ב-300 G ובטמפרטורה של ארבע מעלות צלזיוס. השתמשו בהאצה ובבלימה איטיות כדי להבטיח שהממשק של התמיסות יישמר בכל מבחנה. שאבו בזהירות את ה-RPMI ולאחר מכן שאבו את ה-FCS, תוך השארת משקע התאים השטוף ללא הפרעה.לאחר בידוד המשקעים, שטפו את התאים שוב. השביו את משקעי התאים שנשטפו פעמיים ב-10 milliliters של RPMI קר מאוד עם 5%FCS וחזרו על הסבוב במצנטריפוגה; לאחר הסבוב, שפכו את העל-נוזלים. לאחר מכן, רכזו את כל האוכלוסיות יחד לשפופרת חדשה של 10 milliliters עם שישה milliliters של RPMI קר מאוד המכיל 5%FCS, שקיעו את התאים המרוכזים באמצעות סבוב במצנטריפוגה ושאבו את העל-נוזל בעזרת פיפטה להעברה בשלב זה של הפרוצדורה כולה.ניתן להפיק שש חזרות בתוך בדיקה (intra assay replicates) על ידי סימון תאי דופק הפפטיד בשש ריכוזים שונים של CPD. ראשית, הוסף 11.4 milliliters של RPMI בטמפרטורת החדר המכיל 5% FCS למשקע התאים המאוחד והחזר לתליה באופן יסודי באמצעות פיפוט. שנית, הוסף 1.9 milliliters של תליית תאים לשש מבחנות חדשות של 10 milliliters המסומנות ב-A עד F, תוך הקפדה לא להרטיב את החלק העליון של המבחנה.כדי להתחיל בסימון התאים באמצעות מבחנה B ללא פקק של CPD, הניחו את המבחנה באופן אופקי לאורך הקיר היבש. ראשית, הוסיפו 92 µL של PBS ולאחריו נפח של תמיסת מקור CPD בהתאם לטבלה 4. לאחר מכן, ערבבו את התערובת במערבל וורטקס (vortex). חזרו על שלב זה עם מבחנות C עד F, תוך וידוא שכל מבחנה מקבלת תמיסת מקור CPD שונה, כפי שמופיע בטבלה 4.לאחר ערבוב כל המבחנות, יש להדגיר אותן למשך חמש דקות בטמפרטורת החדר. לאחר מכן יש לשטוף את התאים פעמיים: ראשית, יש להשעות אותם מחדש ב-10 milliliters של מצע בטמפרטורת החדר; שנית, יש לסובב אותם במ centriuge להשקעה; ושלישית, יש לשאוב את העלייה (supernatants) באמצעות פיפט טרנספר.לאחר מכן חזרו על התהליך. כעת רכזו את כל התאים מהמבחנות A עד F למבחנה אחת ב-8 mL של מצע קרור קפוא.אספו את התאים על ידי סבוב במצנטריפוגה והמשיכו בהזרקת התאים לבעלי חיים ובניתוח פלוו-ציטומטריה (flow cytometry) לאחר מכן. פרטים מופיעים בפרוטוקול הטקסט. עכבר BC חוסן עם נגיף וקסיניה רקומביננטי המבטא אפיטופים של HIV V1, והתגובות לאפיטופים שונים הוערכו באמצעות בדיקת FTA בעלת 252 פרמטרים.שני וריאנטים של אפיטופים, gag mute ו-FTL mute, לא בוטאו בווקטור, ועכברים נאיביים הוזרקו גם הם עם ה-FTA. ה-TA הובחן מתאי העכבר המארח באמצעות סימון P KH 26, ותאי FTAB הובחנו באמצעות צביעה בנוגדן B two 20 בשיטת ציטומטריה של זרימה. כל אחד מששת החזרות התוך-בעיליות סונן (gated) על בסיס פלואורסצנציית CPD; מטרות FTA המבטאות ריכוזים שונים של אפיטופים סוננו על בסיס פלואורסצנציית CFSE ו-CTV.שיעור ההריגה הספציפית של כל שכפול הוערך על ידי השוואת מוות של תאי צבירי FTA בבעלי חיים שעברו תגביר (primed) ביחס לצבירי FTA תואמים בבעלי חיים נאיביים. פעילות של תאי T מסייעים הוערכה על ידי השוואת ביטוי יתר של CD 69 בתאי B של צבירי FTA בבעלי חיים שעברו תגביר ביחס לצבירי תאי B של FTA תואמים בבעלי חיים נאיביים. מניתוח זה עולה כי זיהום ב-V-V-H-I-V יצר את תגובות ה-CTL החזקות ביותר נגד האפיטופ האימונו-דומיננטי VV F two L, כאשר 100% מתאי המטרה של FDA שקיבלו דחף (pulsed) של 0.001 micromolar או יותר מהאפיטופ הוסרו מהטחול.בנוסף לתגובות CTL, בדיקת ה-FTA מדדה גם תגובות של תאי T מסייעים על ידי הערכת הפעלת תאי FTAB, המבטאים את האפיטופ הקושר מסוג class two של H-I-V-M-H-C HIV gag th. הדבר הראה כי התרחשה הפעלת תאי B ספציפיים לאנטיגן בבעלי חיים שעברו priming, מה שמעיד על יצירת תאי T מסייעים אפקטורים ספציפיים ל-HIV gag. לאחר צפייה בסרטון זה, תהיה לכם הבנה טובה לגבי האופן שבו ניתן ליצור מערך מטרות פלואורסצנטי של למעלה מ-250 תאי מטרה.

the-use-fluorescent-target-arrays-for-assessment-t-cell-responses

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

אימונולוגיה וזיהומים

המידור של חלבונים גם בתוך קרום פלזמה או אל מקומות תאיים הוא אחד מנגנון רגולטורי כי יכול מאוד להשפיע על התוצאות איתות, ולכן, כדי להבין איתות חשוב ללמוד את התנהגות במרחב ובזמן של חלבונים המעורבים. המתואר כאן מערכת מבוססת מיקרוסקופיה TIRF ללמוד התמרה האות בתאי T, אבל הוא החלים רחב.

טכניקה מיקרוסקופית TIRF הדמיה בזמן אמת סימולטני של TCR וחלבונים הקשורים אליו לשידור אותות

סרטון זה מדגים את ההקרנה של תרכובות אימונומודולטוריות באמצעות בדיקה מבוססת פלורסנט. לימפוציטים T שמקורם בעכבר מהונדס עם קלטות ביטוי חלבון פלואורסצנטי ירוק מטופלים בתרכובות אלה. אותות ה-GFP המשופרים והמופחתים מאפשרים לזהות את ההשפעות הממריצות והמעכבות של התרכובות, בהתאמה.

בדיקה מבוססת פלואורסצנטיות המשתמשת בלימפוציטים מהונדסים לבדיקת תרכובות אימונומודולטוריות

אנו מתארים assay תא בודד תפוקה גבוהה למדוד cytotoxicity של תאי T כאשר דגר עם תאי המטרה סרטניים. שיטה זו מעסיקה, מערך אלסטומרי צפוף של תת nanoliter בארות (~ 100.000 / מערך בארות) מרחבית להגביל את תאי T ותאי מטרה ביחסים מוגדרים ומצמידה למיקרוסקופ פלואורסצנטי כדי לפקח נטייה-היעד פעיל ואפופטוזיס שלאחר מכן.

Assay כמותית תפוקה גבוהה מתא בודד Cytotoxicity לתאי T

אנו מתארים הדמיה של בעלי חיים שלמים וטכניקות מבוססות ציטומטריית זרימה לניטור התרחבות של תאי CD8+ T ספציפיים לאנטיגן בתגובה לחיסון עם ננו-חלקיקים במודל חיסון עכברי.

טכניקות הדמיה כל-החיה והזרימה Cytometric לתגובות ניתוח של אנטיגן ספציפי CD8 + T תא לאחר Nanoparticle חיסון

כתב יד זה מתאר כיצד לבצע (מולקולה בודדת) Förster Resonance Energy Transfer (FRET) - מבחנים מבוססי Förster למדידת דינמיקת הקישור בין קולטן אנטיגן של תאי T (TCR) ומולקולות MHC עמוסות פפטידים אנטיגניות כפי שהן מתרחשות בתוך הסינפסה האימונולוגית של תא T במגע עם שכבת שומנים דו-שכבתית נתמכת מישורית פונקציונלית.

מדידת TCR-pMHC כריכה<em&gt; באתר</em&gt; באמצעות assay מיקרוסקופית המבוסס על סריג

המנגנונים ששולטים תנועתיות ביניים של תאי T מסוג CD4 מפעיל באתרים של דלקת הם יחסית לא ידועים. אנו מציגים גישה לא פולשנית לדמיין ולטפל בתאים במבחנה -primed CD4 T בדרמיס האוזן הדלקתית, המאפשר חקר את ההתנהגות הדינמית של תאים אלה באתרו.

הדמית תא CD4 T גירת ביניים בדרמיס המוסת

אנו מציגים במחקר הנוכחי הוא assay קרינה מבוססת רומן באמצעות לימפוציטים נגזר עכבר מהונדס. Assay זה מתאים להקרנה תפוקה גבוהה (HTS) של מולקולות קטנות ניחן קיבולת אחד עיכוב או קידום ההפעלה הלימפוציטים.

Assay לימפוציטים הקרינה מבוסס מתאים להקרנה תפוקה גבוהה של מולקולות קטנות

פרוטוקול זה מתאר שיטה התמונה תושב גידולים הסתננות CD8 בתאי T עם נוגדנים fluorescently בשילוב בתוך אמבריולוגיה הגידול פרוסות תוויות. טכניקה זו מאפשרת ניתוחים בזמן אמת של נדידת תאים CD8 T באמצעות מיקרוסקופיה קונפוקלית.

לשעבר Vivo הדמיה של לימפוציטים מסוג T CD8 תושב באמבריולוגיה הגידול פרוסות משתמש מיקרוסקופיה קונפוקלית

פרוטוקול זה מתאר שיטה מבוססת הדמיה כדי להפעיל באמצעות photoactivatable פפטיד MHC, המאפשר שליטה מדויקת ייתכן של הפעלת תא T לימפוציטים מסוג T.

יכולות בקרה של תא T הפעלה באמצעות אגוניסט Photoactivatable

פרוטוקול זה מתאר את המתודולוגיה למעקב לא פולשני אחר תאי T שהונדסו גנטית כדי לבטא קולטני אנטיגן כימריים ב- vivo עם פלטפורמה זמינה קלינית.

הדמיה דינמית של תאי T קולטן אנטיגן כימרי עם [18F]טטרפלואורובורט טומוגרפיה של פליטת פוזיטרונים/טומוגרפיה ממוחשבת

למד ליצור מערכי יעד פלורסנטים להערכת תגובות תאי T בחולדות באמצעות ציטומטריית זרימה רב-פרמטרית. השיטה מאפשרת ניתוח של מעל 250 פרמטרים בו-זמנית בתאי מטרה מתויגים בצבעי CFSE ו-CTV.

השימוש במערכי יעד פלורסנט להערכה של תגובות תא T

גלה סרטונים נוספים