Name: ניתוח תפוקה גבוהה של קולטני ריח יונקים: מדידה של קולטן הפעלה באמצעות בלוציפראז פעילות (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-06-02T14:15:00.000+00:00
Duration: 12 min 2 s
Description: למדו שיטה לניתוח תפוקה גבוהה של קולטני ריח יונקים באמצעות מדידת לומינסנציה של לוציפראז בתאי H3A. השיטה מאפשרת זיהוי מהיר של ליגנדים וקידום הבנת קידוד ריחות במערכת העצבים.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

עבודה זו נתמכה על ידי R01 DC013339, R03 DC011373, ורות ל &#39;Kirschstein השירות הלאומי לחקר פרס T32 DC000014. חלק מהעבודה בוצע באמצעות Monell chemosensory קולטן איתות הליבה, אשר נתמכה בחלקו על ידי מימון מDC011735 P30-NIH NIDCD Core גרנט. המחברים מודים ג Sezille לעזרה באיסוף הנתונים.

1. תרבות של תאי Hana3A <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן תקשורת M10 ידי להשלים בינוני מינימום הכרחי (MEM) עם 10% (v / v) FBS. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תחזוקת תרבות <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שמור על תאים בתקשורת M10. הערה: וקטורי הביטוי לRTP1L, RTP2, REEP1, ו-G αolf להקנות עמידות puromycin לתאי Hana3A, אבל השמירה על התאים עם אנטיביוטיקה זה לא משפיע באופן משמעותי תוצאות assay. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תת ביחס של 1:08 ב10 מנות סנטימטר כל 2-3 ימים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לדגור על 37 ° C עם 5% CO 2. </li></ol></li></ol> 2. תאי ציפוי עבור transfection <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תקשורת לשאוב מ100% מחוברות 10 צלחת סנטימטר של תאי Hana3A. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שטוף תאים על ידי הוספת 10 מיליליטר PBS, מתערבל הצלחת, וaspirating PBS. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 3 מיליליטר של 0.05% טריפסין / EDTA ולחכות לתאים לנתק (כ 1 דק &#39;). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להשבית טריפסין על ידי הוספת 5 מיליליטר M10 ולשבור את גושי תא על ידי triturating בערך 10x &amp;# 160; עם טפטפת 10 מיליליטר. פיפטה בזהירות כדי למנוע החדרת בועות אוויר לתקשורת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לכל צלחת 96 היטב, העברת 1 מיליליטר של תאים לתוך צינור חרוטי 15 מיליליטר, צנטריפוגה ב XG 200 למשך 5 דקות, ולשאוב supernatant מבלי להפריע לתא גלולה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Resuspend התאים 6 מיליליטר M10 לכל 1 מיליליטר של תאים שהועברו בשלב 2.5. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פיפטה 50 μl של תאים היטב בכל צלחת 96 היטב דגירה הלילה בשעה 37 ° C עם 5% CO 2. </li></ol> 3. Transfection של קולטני ריח <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכנת פלסמיד דנ&quot;א <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן את ה-DNA פלסמיד באמצעות פרוטוקול ללא רעלן פנימי. הערה: ערכות הכנה השתמש בפלסמיד דנ&quot;א מיועד &quot;, רעלן פנימי ללא תשלום,&quot; או להוסיף שלב חילוץ פנול, כלורופורם לפרוטוקול הכנת פלסמיד דנ&quot;א. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לדלל DNA לריכוז של 100 ng / μl בTE חיץ. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שימו לב לתאים מצופים (שלב 2.7) כדי להבטיח confluency נכון של approximately 30-50% לכל טוב ולחזור לחממה. הערה: בעוד confluency זה לא אופטימלי למגיב transfection השומנים בדם, confluency של 30-50% בשלב זה הוא אופטימלי למדידת פעילות לוציפראז 24 שעות לאחר transfection. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכנת Transfection Mix <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פיפטה RTP1S-PCI, M3-R-PCI, PCRE לוק, וpSV40-RL פלסמידים לתוך מדיום MEM כל הכרכים מפורטים בטבלה המס &#39;1 כדי להפוך את תמהיל פלסמיד (כרכים שצוין הם לכל צלחת 96 היטב). <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:356px;;text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr height="22"><td colspan="3" height="22" style="height:22px;width:356px;"> תערובת פלסמיד </td></tr><tr height="21"><td height="21" style="height:21px;"></td><td> בכל טוב </td><td> לכל צלחת 96 היטב </td></tr><tr height="21"><td height="21" style="height:21px;"> MEM </td><td> - </td><td> 500 μl </td></tr><trגובה = &quot;21&quot;&gt; <td height="21" style="height:21px;"> RTP1S-PCI </td><td> 5 ng </td><td> 480 ng </td></tr><tr height="21"><td height="21" style="height:21px;"> M3-R-PCI </td><td> 2.5 ng </td><td> 240 ng </td></tr><tr height="21"><td height="21" style="height:21px;"> PCRE לוק </td><td> 10 ng </td><td> 960 ng </td></tr><tr height="22"><td height="22" style="height:22px;"> pSV40-RL </td><td> 5 ng </td><td> 480 ng </td></tr></tbody></table> טבלת 1. רכיבי פלסמיד תערובת. היטב ולכל כרכי 96 גם צלחת של RTP1S-PCI, M3-R-PCI, PCRE לוק, וpSV40-RL, וממ. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לכל צלחת 96 היטב, לדלל 18 מגיב transfection שומנים μl ב450 בינוני MEM μl. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פיפטה פלסמיד תערובת (משלב 3.3.1), קולטני ריח מתויג rhodopsin בפלסמיד PCI (Rho-OR-PCI), ותמהיל שומנים transfection (משלב 3.3.2) כדי להפוך מפורט מורכבים ב <sטרונג&gt; טבלה 2. מערבבים את הפתרון על ידי טחינה דקה ו דגירה בטמפרטורת חדר למשך 15 דקות. עצור את התגובה על ידי הוספת M10 לפי טבלה 2 הערה:. התגובה הזו היא זמן רגיש ולא צריך להיות מותר להמשיך ליותר מ 30 דקות. חישוב +10% גם הוא חשוב כדי להבטיח נפח מספיק לשלבים הבאים. <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr height="21"><td colspan="3" height="21" style="height:21px;width:472px;"> מורכב </td></tr><tr height="21"><td height="21" style="height:21px;"></td><td> בכל טוב </td><td> לכל טוב +10% </td></tr><tr height="21"><td height="21" style="height:21px;"> תערובת פלסמיד </td><td> 4.2 μl </td><td> 4.58 μl </td></tr><tr height="21"><td height="21" style="height:21px;"> Rho-OR-PCI </td><td> 0.05 ng </td><td> 0.06 ng </td></tr><trגובה = &quot;21&quot;&gt; <td height="21" style="height:21px;"> תערובת transfection שומנים בדם </td><td> 4.2 μl </td><td> 4.58 μl </td></tr><tr height="22"><td height="22" style="height:22px;"> M10 </td><td> 41.7 μl </td><td> 45.83 μl </td></tr></tbody></table> טבלה 2. רכיבים מורכבים. היטב ולכל כרכים + 10% גם של תערובת פלסמיד (טבלת 1), פלסמיד חוש הריח קולט (Rho-OR-PCI), ותערובת transfection שומנים בדם. M10 מתווסף כדי להרוות את התגובה הבאה דגירה 15 דקות בטמפרטורת חדר. </li></ol></li></ol><ol start="4" style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הקש את התקשורת על צלחות התא. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פיפטה 50 μl של מורכב זה לזה היטב דגירה הלילה בשעה 37 ° C עם 5% CO 2. </li></ol> 4. ריח גירוי <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שים לב לתאים transfected כדי להבטיח confluency נכון של 50-80% לכל טוב ולחזור לחממה. הערה: אם תאים הם פחות מ 50קריאות% ומחוברות, גחלילית לוציפראז ולוציפראז Renilla עלולות להיות נמוכות מדי למדידת הפעלת קולט. תשקול לבטל את הצלחת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן 1 פתרונות מניות M של כל ריח בDMSO. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן את פתרונות גירוי ריח במדיום CD293. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> על ניסויי הקרנה, לדלל פתרון מניות של ריח ל100 מיקרומטר. כמו כן להכין שליטה ללא ריח (CD293 בלבד) על מנת לשלוט לאו הפעלה ברקע. הערה: לניסויי הקרנה, כל זוג או / ריח הוא נבדק רק פעם אחת בכל ניסוי. בגלל כמה דיפוזיה ריח פני בארות אפשרית, מומלץ לעורר עם odorant אחד לכל צלחת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לניסויי תגובת מינון, להכין שבעה דילולים סדרתי של פי 10 של פתרון מניות ריח בשלושה עותקים החל משעת 1 מ&quot;מ לכל קולטן. כמו כן להכין את אותו ריח דילולים בשלושה עותקים לתאי transfected וקטור ריקים כדי לשלוט על הפעלת רקע ריח. הערה: לניסויי תגובת מינון, כל אחד oטיפול ריכוז dor צריך להתנהל בשלושה עותקים. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הקש את התקשורת על צלחות התא. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 25 μl פיפטה של ​​פתרון גירוי ריח לכל היטב דגירה במשך 4 שעות. </li></ol> 5. מדידה או לפעילות באמצעות בלוציפראז Assay <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Resuspend מצע גחלילית לוציפראז להוראות היצרן וחנות ב -80 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להפשיר 1 מיליליטר של מצע גחלילית בלוציפראז לכל צלחת 96 היטב. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן את תגובת גחלילית לוציפראז טרי מרווה ומגיב לוציפראז Renilla מצע (5 לוציפראז μl מרווה / מצע לוציפראז Renilla לכל 1 מיליליטר של חיץ). הערה: כ 1 מיליליטר של מגיב הוא זקוק לכל צלחת 96 היטב. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן את קורא microplate זורח. פתח את תוכנת microplate קורא. בתוך סמל המערכת: <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תחת &quot;טרום החימום&quot; Tab, סמן את התיבה למצב &quot;ON&quot; ולהגדיר את הטמפרטורה של המכונה ל25 °; ג </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תחת הלשונית &quot;Dispenser&quot;, ראש כל מתקן עם 1,000 μl של 70% אתנול ואחרי 1,000 μl של מים מזוקקים. הערה: השתמש aliquots נפרדים של אלכוהול ומים לכל מתקן. אתנול משמש לחיטוי מכשירי, ומים מסיר אתנול שיורית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ראש כל מתקן עם 1,500 μl של אוויר (להסיר מכשירי מנוזל). הערה: תחול עם אוויר מבטיחה כי מצעי לוציפראז אינם מדוללים במים שיורית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מתקן ראש 1 עם 1,080 μl של מצע גחלילית לוציפראז (משלב 5.2). מתקן ראש 2 עם מצע Renilla לוציפראז (משלב 5.3). הערה: היזהר שלא לחצות לזהם-מצעי לוציפראז. תחול עם מצעי לוציפראז ממלא את השטח המת במכשירים מגיב. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הגדר את הפרוטוקול הבא לקרוא גחלילית שתי והארת לוציפראז Renilla. בתוך התוכנה הקשורים לקורא microplate, בלתידער תפריט &quot;קובץ&quot;, לחץ על &quot;משימה החדשה&quot;. סמן &quot;פרוטוקולים&quot; ולחץ על &quot;צור חדש&quot;. בחלון הבא, העיגול שליד &quot;תקן פרוטוקול&quot; צריך להיות נבחרים. לחץ על &quot;אישור&quot;. לחץ לחיצה כפולה על &quot;נוהל&quot; בצד שמאל של המסך. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לוותר 10 μl של מצע גחלילית בלוציפראז לכל הבארות באמצעות מתקן 1. תחת תפריט &quot;פעולות&quot;, לחץ על &quot;לוותר&quot;. בחלון &quot;לוותר על שלב&quot;, קבע: &quot;Dispenser&quot; 1, &quot;לקרקע&quot; לאף אחד &quot;, כרך לוותר&quot; ל10 μl ו&quot; שיעור &quot;ל225 μl / sec. לחץ על &quot;אישור&quot;. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לנער את הצלחת ל30 שניות. תחת תפריט &quot;פעולות&quot;, לחץ על &quot;Shake&quot;. בחלון &quot;Shake שלב&quot;, להגדיר &quot;עוצמה&quot; לבינוני ו&quot; משך &quot;ל00:30 MM: SS. לחץ על &quot;אישור&quot;. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קראו את הארה של כל הבארות ל0.5 שניות לכל טוב. תחת תפריט &quot;פעולות&quot;, לחץ על &quot;קראו&quot;;. בחלון &quot;קראו שלב&quot;, קבע: &quot;איתור שיטה&quot; להארה &quot;, קראו סוג&quot; לנקודתי קצה &quot;, אינטגרציה בזמן&quot; ל00:00:50 MM: SS: ss, &quot;סטי מסנן&quot; 1, &quot;פליטה&quot; לחור, &quot;מיקום אופטיקה&quot; למעלה, &quot;רווח&quot; ל135, ו&quot; קראו גובה &quot;ל1.00 מ&quot;מ. לחץ על &quot;אישור&quot;. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לוותר 10 μl של מצע לוציפראז Renilla לכל הבארות באמצעות מתקן 2. הגדר את התנאים כמו בשלב 5.6.1, למעט קבוצה &quot;Dispenser&quot; 2. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Shake צלחת ל30 שניות. הגדר את התנאים כמו בשלב 5.6.2. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קראו הארה של כל הבארות ל0.5 שניות לכל טוב. הגדר את התנאים כמו בשלב 5.6.3. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את המכסה מצלחת 96 היטב ומניח את הצלחת בקורא microplate. הפעל את התכנית להקים בשלב 5.5 לקרוא הארה צלחת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> נקה את המשאבות מנפק מגיב. מאייקון המערכת תחת לשונית &quot;Dispenser&quot;: <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> טהר 1,000 μl של fמצע לוציפראז irefly ממתקן גחלילית בלוציפראז לתוך צינור התאוששות. הערה: לוציפראז Firefly ניתן לאחסן ב -80 ° C ושימוש חוזר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ראש כל מתקן עם 1,000 μl של מים מזוקקים, ואחריו 1,000 μl של 70% אתנול, ולבסוף 1,500 μl של אוויר (להסיר מכשירי מנוזל). הערה: מים מסיר מצעי לוציפראז מהמשאבות מגיב, מחטא אתנול, ואוויר מתייבש כל אתנול שיורית. </li></ol></li></ol> 6. ניתוח נתונים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> יצוא נתונים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בתוכנת microplate קורא, לחץ לחיצה כפולה על &quot;הבונים דווח / יצוא&quot; בצד השמאל של המסך. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחץ על הכפתור &quot;חדש היצוא לאקסל&quot; ולחץ על &quot;אישור&quot;. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> סמן Export1 ולחץ על &quot;ערוך&quot;. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> על פי &quot;נוהל&quot; &quot;תוכן&quot; לבדוק &quot;תיאור מערכת&quot;, &quot;תיאור פלייט&quot;, וגם &quot;מטריקס הפריסה פלייט&quot;. כולל &quot;נתונים גולמיים&quot;nd &quot;מחושב נתונים&quot;. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תחת &quot;עבודה&quot;, סמן &quot;Autoexecute על השלמת ההליך&quot;. תחת יצוא מצב, לבדוק &quot;כל הצלחות באותה חוברת העבודה&quot; ו &quot;כגיליון עבודה חדש&quot;. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תחת &quot;קובץ&quot; בוחר את שם קובץ בפורמט ומיקום קובץ, ולחץ על &quot;אישור&quot;. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> סגור את החלון &quot;דווח / יצוא הבונים&quot;. </li></ol></li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי להשיג ערכי לוציפראז מנורמלים, לחלק את קריאת גחלילית לוציפראז הארה לכל טוב (שלב 5.6.3) על ידי קריאת Renilla הארה לכל טוב (שלב 5.6.6). </li></ol>

<ol><li>Wetzel, C. H., Oles, M., Wellerdieck, C., Kuczkowiak, M., Gisselmann, G., Hatt, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Specificity+and+sensitivity+of+a+human+olfactory+receptor+functionally+expressed+in+human+embryonic+kidney+293+cells+and+Xenopus+Laevis+oocytes%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+neuroscience+the+official+journal+of+the+Society+for+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Specificity and sensitivity of a human olfactory receptor functionally expressed in human embryonic kidney 293 cells and Xenopus Laevis oocytes.</a> The Journal of neuroscience the official journal of the Society for Neuroscience. 19 (17), 7426-7433 (1999).</li>
<li>Spehr, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+a+testicular+odorant+receptor+mediating+human+sperm+chemotaxis%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Identification of a testicular odorant receptor mediating human sperm chemotaxis.</a> Science. 299 (5615), 2054-2058 (2003).</li>
<li>Sanz, G., Schlegel, C., Pernollet, J. -C., Briand, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+odorant+specificity+of+two+human+olfactory+receptors+from+different+phylogenetic+classes+and+evidence+for+antagonism%5BTitle%5D)+AND+%22Chemical+senses%22%5BJournal%5D)">Comparison of odorant specificity of two human olfactory receptors from different phylogenetic classes and evidence for antagonism.</a> Chemical senses. 30 (1), 69-80 (2005).</li>
<li>Matarazzo, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+characterization+of+two+human+olfactory+receptors+expressed+in+the+baculovirus+Sf9+insect+cell+system%5BTitle%5D)+AND+%22Chemical+senses%22%5BJournal%5D)">Functional characterization of two human olfactory receptors expressed in the baculovirus Sf9 insect cell system.</a> Chemical senses. 30 (3), 195-207 (2005).</li>
<li>Jacquier, V., Pick, H., Vogel, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+an+extended+receptive+ligand+repertoire+of+the+human+olfactory+receptor+OR17-40+comprising+structurally+related+compounds%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+neurochemistry%22%5BJournal%5D)">Characterization of an extended receptive ligand repertoire of the human olfactory receptor OR17-40 comprising structurally related compounds.</a> Journal of neurochemistry. 97 (2), 537-544 (2006).</li>
<li>Neuhaus, E. M., Mashukova, A., Zhang, W., Barbour, J., Hatt, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+specific+heat+shock+protein+enhances+the+expression+of+mammalian+olfactory+receptor+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Chemical+senses%22%5BJournal%5D)">A specific heat shock protein enhances the expression of mammalian olfactory receptor proteins.</a> Chemical senses. 31 (5), 445-452 (2006).</li>
<li>Shirokova, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+specific+ligands+for+orphan+olfactory+receptors.+G+protein-dependent+agonism+and+antagonism+of+odorants%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+biological+chemistry%22%5BJournal%5D)">Identification of specific ligands for orphan olfactory receptors. G protein-dependent agonism and antagonism of odorants.</a> The Journal of biological chemistry. 280 (12), 11807-11815 (2005).</li>
<li>Keller, A., Zhuang, H., Chi, Q., Vosshall, L. B., Matsunami, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+variation+in+a+human+odorant+receptor+alters+odour+perception%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Genetic variation in a human odorant receptor alters odour perception.</a> Nature. 449 (7161), 468-472 (2007).</li>
<li>Menashe, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+elucidation+of+human+hyperosmia+to+isovaleric+acid%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+biology%22%5BJournal%5D)">Genetic elucidation of human hyperosmia to isovaleric acid.</a> PLoS biology. 5 (11), (2007).</li>
<li>Saito, H., Chi, Q., Zhuang, H., Matsunami, H., Mainland, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Odor+coding+by+a+Mammalian+receptor+repertoire%5BTitle%5D)+AND+%22Science+signaling%22%5BJournal%5D)">Odor coding by a Mammalian receptor repertoire.</a> Science signaling. 2 (60), (2009).</li>
<li>Jaeger, S. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Mendelian+Trait+for+Olfactory+Sensitivity+Affects+Odor+Experience+and+Food+Selection%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Biology%22%5BJournal%5D)">A Mendelian Trait for Olfactory Sensitivity Affects Odor Experience and Food Selection.</a> Current Biology. 23, 1-5 (2013).</li>
<li>DeMaria, S., Ngai, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+cell+biology+of+smell%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+cell+biology%22%5BJournal%5D)">The cell biology of smell.</a> The Journal of cell biology. 191 (3), 443-452 (2010).</li>
<li>Zhang, X., Firestein, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+olfactory+receptor+gene+superfamily+of+the+mouse%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+nauroscience%22%5BJournal%5D)">The olfactory receptor gene superfamily of the mouse.</a> Nature nauroscience. 5 (2), 124-1233 (2002).</li>
<li>Glusman, G., Yanai, I., Rubin, I., Lancet, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+complete+human+olfactory+subgenome%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+research%22%5BJournal%5D)">The complete human olfactory subgenome.</a> Genome research. 11 (5), 685-702 (2001).</li>
<li>Olender, T., Lancet, D., Nebert, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Update+on+the+olfactory+receptor+%28OR%29+gene+superfamily%5BTitle%5D)+AND+%22Human+Genomics%22%5BJournal%5D)">Update on the olfactory receptor (OR) gene superfamily.</a> Human Genomics. 3 (1), 87(2008).</li>
<li>Mombaerts, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genes+and+ligands+for+odorant%2C+vomeronasal+and+taste+receptors%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+reviews.+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Genes and ligands for odorant, vomeronasal and taste receptors.</a> Nature reviews. Neuroscience. 5 (4), 263-278 (2004).</li>
<li>Malnic, B., Hirono, J., Sato, T., Buck, L. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Combinatorial+receptor+codes+for+odors%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Combinatorial receptor codes for odors.</a> Cell. 96 (5), 713-723 (1999).</li>
<li>Araneda, R. C., Kini, aD., Firestein, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+molecular+receptive+range+of+an+odorant+receptor%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">The molecular receptive range of an odorant receptor.</a> Nature. 3 (12), 1248-1255 (2000).</li>
<li>Saito, H., Kubota, M., Roberts, R. W., Chi, Q., Matsunami, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RTP+family+members+induce+functional+expression+of+mammalian+odorant+receptors%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">RTP family members induce functional expression of mammalian odorant receptors.</a> Cell. 119 (5), 679-691 (2004).</li>
<li>Katada, S., Hirokawa, T., Oka, Y., Suwa, M., Touhara, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+basis+for+a+broad+but+selective+ligand+spectrum+of+a+mouse+olfactory+receptor%3A+mapping+the+odorant-binding+site%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+neuroscience+the+official+journal+of+the+Society+for+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Structural basis for a broad but selective ligand spectrum of a mouse olfactory receptor: mapping the odorant-binding site.</a> The Journal of neuroscience the official journal of the Society for Neuroscience. 25 (7), 1806-1815 (2005).</li>
<li>Lu, M., Echeverri, F., Moyer, B. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endoplasmic+Reticulum+Retention%2C+Degradation%2C+and+Aggregation+of+Olfactory+G-Protein+Coupled+Receptors%5BTitle%5D)+AND+%22Traffic%22%5BJournal%5D)">Endoplasmic Reticulum Retention, Degradation, and Aggregation of Olfactory G-Protein Coupled Receptors.</a> Traffic. 4 (6), 416-433 (2003).</li>
<li>McClintock, T. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+expression+of+olfactory-adrenergic+receptor+chimeras+and+intracellular+retention+of+heterologously+expressed+olfactory+receptors%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+research.+Molecular+brain+research%22%5BJournal%5D)">Functional expression of olfactory-adrenergic receptor chimeras and intracellular retention of heterologously expressed olfactory receptors.</a> Brain research. Molecular brain research. 48 (2), 270-278 (1997).</li>
<li>Zhao, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+Expression+of+a+Mammalian+Odorant+Receptor%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Functional Expression of a Mammalian Odorant Receptor.</a> Science. 279 (5348), 237-242 (1998).</li>
<li>Kajiya, K., Inaki, K., Tanaka, M., Haga, T., Kataoka, H., Touhara, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+bases+of+odor+discrimination%3A+Reconstitution+of+olfactory+receptors+that+recognize+overlapping+sets+of+odorants%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+neuroscience+the+official+journal+of+the+Society+for+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Molecular bases of odor discrimination: Reconstitution of olfactory receptors that recognize overlapping sets of odorants.</a> The Journal of neuroscience the official journal of the Society for Neuroscience. 21 (16), 6018-6025 (2001).</li>
<li>Krautwurst, D., Yau, K., Reed, R. R., Hughes, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+Ligands+for+Olfactory+Receptors%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Identification of Ligands for Olfactory Receptors.</a> Cell. 95, 917-926 (1998).</li>
<li>Li, Y. R., Matsunami, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Activation+state+of+the+M3+muscarinic+acetylcholine+receptor+modulates+mammalian+odorant+receptor+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Science+signaling%22%5BJournal%5D)">Activation state of the M3 muscarinic acetylcholine receptor modulates mammalian odorant receptor signaling.</a> Science signaling. 4 (155), (2011).</li>
<li>Zhuang, H., Matsunami, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluating+cell-surface+expression+and+measuring+activation+of+mammalian+odorant+receptors+in+heterologous+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Evaluating cell-surface expression and measuring activation of mammalian odorant receptors in heterologous cells.</a> Nature. 3 (9), 1402-1413 (2008).</li>
<li>Haddad, R., Khan, R., Takahashi, Y. K., Mori, K., Harel, D., Sobel, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+metric+for+odorant+comparison%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+methods%22%5BJournal%5D)">A metric for odorant comparison.</a> Nature methods. 5 (5), 425-429 (2008).</li>
<li>Veithen, A., Wilkin, F., Philippeau, M., Van Osselaer, C., Chatelain, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Olfactory+Receptors%3A+From+basic+science+to+applications+in+flavors+and+fragrances%5BTitle%5D)+AND+%22Perfumer+and+Flavorist%22%5BJournal%5D)">Olfactory Receptors: From basic science to applications in flavors and fragrances.</a> Perfumer and Flavorist. 35 (1), 38-40 (2010).</li>
<li>Bozza, T., Feinstein, P., Zheng, C., Mombaerts, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Odorant+receptor+expression+defines+functional+units+in+the+mouse+olfactory+system%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+neuroscience+the+official+journal+of+the+Society+for+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Odorant receptor expression defines functional units in the mouse olfactory system.</a> The Journal of neuroscience the official journal of the Society for Neuroscience. 22 (8), 3033-3043 (2002).</li>
<li>Oka, Y., Katada, S., Omura, M., Suwa, M., Yoshihara, Y., Touhara, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Odorant+receptor+map+in+the+mouse+olfactory+bulb%3A+in+vivo+sensitivity+and+specificity+of+receptor-defined+glomeruli%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Odorant receptor map in the mouse olfactory bulb: in vivo sensitivity and specificity of receptor-defined glomeruli.</a> Neuron. 52 (5), 857-869 (2006).</li>
<li>Zhao, H., Ivic, L., Otaki, J. M., Hashimoto, M., Mikoshiba, K., Firestein, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+expression+of+a+mammalian+odorant+receptor%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Functional expression of a mammalian odorant receptor.</a> Science. 279 (5348), 237-242 (1998).</li>
<li>Touhara, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+identification+and+reconstitution+of+an+odorant+receptor+in+single+olfactory+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Functional identification and reconstitution of an odorant receptor in single olfactory neurons.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 96 (7), 4040-4045 (1999).</li>
<li>Zhuang, H., Matsunami, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synergism+of+accessory+factors+in+functional+expression+of+mammalian+odorant+receptors%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+biological+chemistry%22%5BJournal%5D)">Synergism of accessory factors in functional expression of mammalian odorant receptors.</a> The Journal of biological chemistry. 282 (20), 15284-15293 (2007).</li>
<li>McRae, J. F., Mainland, J. D., Jaeger, S. R., Adipietro, K. A., Matsunami, H., Newcomb, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+variation+in+the+odorant+receptor+OR2J3+is+associated+with+the+ability+to+detect+the+%26%2334%3Bgrassy%26%2334%3B+smelling+odor%2C+cis-3-hexen-1-ol%5BTitle%5D)+AND+%22Chemical+senses%22%5BJournal%5D)">Genetic variation in the odorant receptor OR2J3 is associated with the ability to detect the &#34;grassy&#34; smelling odor, cis-3-hexen-1-ol.</a> Chemical senses. 37 (7), 585-593 (2012).</li>
<li>Adipietro, K. A., Mainland, J. D., Matsunami, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+evolution+of+mammalian+odorant+receptors%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+genetics%22%5BJournal%5D)">Functional evolution of mammalian odorant receptors.</a> PLoS genetics. 8 (7), (2012).</li>
<li>Zhuang, H., Chien, M. -S., Matsunami, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamic+functional+evolution+of+an+odorant+receptor+for+sex-steroid-derived+odors+in+primates%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Dynamic functional evolution of an odorant receptor for sex-steroid-derived odors in primates.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (50), 21247-21251 (2009).</li>
<li>Oka, Y., Nakamura, A., Watanabe, H., Touhara, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+odorant+derivative+as+an+antagonist+for+an+olfactory+receptor%5BTitle%5D)+AND+%22Chemical+senses%22%5BJournal%5D)">An odorant derivative as an antagonist for an olfactory receptor.</a> Chemical senses. 29 (9), 815-822 (2004).</li>
<li>Oka, Y., Omura, M., Kataoka, H., Touhara, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Olfactory+receptor+antagonism+between+odorants%5BTitle%5D)+AND+%22The+EMBO+journal%22%5BJournal%5D)">Olfactory receptor antagonism between odorants.</a> The EMBO journal. 23 (1), 120-126 (2004).</li>
<li>Fawcett, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+introduction+to+ROC+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Pattern+Recognition+Letters%22%5BJournal%5D)">An introduction to ROC analysis.</a> Pattern Recognition Letters. 27 (8), 861-874 (2006).</li>
<li>Baghaei, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Olfactory+Receptors%5BTitle%5D)+AND+%22Olfactory+Recept.+Methods+Protoc%22%5BJournal%5D)">Olfactory Receptors.</a> Olfactory Recept. Methods Protoc. 1003, 229-238 (2013).</li>
<li>Dey, S., Zhan, S., Matsunami, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assaying+surface+expression+of+chemosensory+receptors+in+heterologous+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+visualized+experiments+JoVE%22%5BJournal%5D)">Assaying surface expression of chemosensory receptors in heterologous cells.</a> Journal of visualized experiments JoVE. (48), (2011).</li>
</ol>

יש המחברים אין לחשוף.

זהות odorant מקודדת על ידי דפוסי הפעלה קולטני ריח, אבל דפוסי הפעלת קולטן, כולל שהקולטנים מופעלים ובאיזו מידה, ידועים פחות מ -6% מקולטניים ריח האנושי 1-11. מאמצים לאפיין קולטני ריח היו מוגבלים על ידי השיטות עתירות העבודה או תחולתם רק קבוצת משנה של 17,23,24,33,34 משפחה קולטני ריח. מערכת ביטוי Heterologous Hana3A תומכת בביטוי חזק של רוב קולטני ריח שנבדק, והוא יכול לשמש בשילוב עם מערכת כתב בלוציפראז cAMP מגיב כדי לפקח על הפעלה קולטני ריח 19,26,27. ביצו...

מערכת חוש הריח של היונקים יש את היכולת להגיב למספר עצום של גירויים ריחניים, המאפשרים זיהוי ואפליה של אלפי ניחוחי. קולטני ריח (אס) הם החיישנים המולקולריים שהביעו עצב סנסורי חוש הריח באפיתל ההרחה 12. הכרת ריח יונקים מתרחשת באמצעות הפעלת ההפרש של חדרי ניתוח על ידי ניחוחי, ו-OR משפחת הגן היא נרחבת, עם בערך 1,000 עכברי ו400 קולטנים אנושיים 12-16. הניתוחים תפקודיים קודמים של חדרי ניתוח בתאי עצב של חוש ריח ובתאי Heterologous הראו כי ניחוחי שונה מוכרים על ידי ייחודי, אבל חופף הרכבים של חדרי ניתוח 10,17-20. התאמת ligands לחדרי ניתוח היא קריטית להבנת הקוד וחיוני לבניית מודלים מעשי של חוש ריח חוש הריח. בשל קשיים להביע חדרי ניתוח במערכות Heterologous, כמו גם מספר רב של שניהם ניחוחי וחדרי ניתוח, הנתונים אלה נעדרו במידה רבה מfield; אכן, פחות מ -6% מחדרי ניתוח באדם יש ליגנד פורסם 1-11. פרוטוקול זה מתאר את השימוש של assay לוציפראז לאפיין odorant / או אינטראקציות. assay זה מאפשר אפיון התפוקה גבוהה של או.אר. אס, משימה שהיא חיוני להבנת odorant / או אינטראקציות כמו גם בפיתוח מודל של קידוד ריח. מחקרי תפוקה גבוהה של חדרי ניתוח בפני שלושה אתגרים מרכזיים. ראשית, או.אר. האס באו לידי ביטוי בתאי Heterologous נשמרו בחדר המיון ומושפל לאחר מכן בהפרוטאזום 21,22, מניעת חדרי הניתוח מאינטראקציה עם ניחוחי במערכת assay 23-25. בעיה זו טופלה על ידי הגילוי של חלבוני אבזר המאפשרים ביטוי על פני קרום התא יציב של מגוון רחב של חדרי הניתוח 19,26,27. קולטן חלבוני טרנספורטר-1 ו -2 (RTP1 ו2) לקדם או ביטוי על פני קרום תא והפעלה בתגובה לגירוי odorant 19. המבוסס על עבודה זו, תאי HEK293T היושונה כדי להביע את היציבות RTP1 ארוך (RTP1L) וRTP2, חלבון שיפור ביטוי הקולטן 1, וαolf G, וכתוצאה משורת תאי Hana3A 19,27. בנוסף, קולטן מסוג 3 מוסקריניים אצטילכולין (M3-R) אינטראקציה עם חדרי ניתוח על פני התא ומשפר הפעלה בתגובה לניחוחי 26. Co-transfection של OR עם RTP1S וM3-R לתוצאות תאי Hana3A בביטוי חזק, עקבי ופונקציונלי של מגוון רחב של חדרי ניתוח על פני תא 27. שנית, יונקים או רפרטוארים הם גדולים למדי. בבני אדם, למשל, רפרטואר OR הוא סדר גודל רב יותר מאשר רפרטואר קולט התעורר אצלם, ו -2 סדרי גודל רב יותר מאשר רפרטואר קולט החזותי. למרות שיבוט בודד או הוא פרוטוקול פשוט יחסית, נדרש מאמץ מעלה מול משמעותי כדי ליצור ספרייה מקיפה. שלישית, למרות שאנו יודעים כי בראייה, אורך גל מתורגם לצבע ובתדירות אודישן מיתרגם המגרש, והארגון של ריחות הוא הבין היטב, מה שהקשה על חוקרים ללשרבב ממדגם מייצג של ניחוחי. למרות שחלק מהתקדמות שנעשתה ב10,28 חזית זו, המפה של נוף חוש הריח נשארת שלמה. הקרנת עשרות אלפי מולקולות נגד מאות חדרים הניתוח היא משימה מרתיעה; מסכי תפוקה גבוהה בתחום זה דורשים קמפיינים שהוגדרו בזהירות. האתגרים הנותרים העיקריים הם אלה של לוגיסטיקה ועלות ולא בעיות הטמונות לטכניקה. למרות הקרנת Heterologous לא הייתה בשימוש נרחב כדי לזהות ligands ידי קבוצות אקדמיות, חברה פרטית שהשתמשה באותה הטכניקה כדי לזהות ligands ל100 חדרי ניתוח אנושיים 29. למרבה הצער, הנתונים האלה יישארו קניינית. יש assay לוציפראז התפוקה גבוהה המתוארים כאן מספר יתרונות על פני שיטות חלופיות המשמשות להערכה או הפעלה. למרות responses של עצב סנסורי חוש הריח האם נמדד באמצעות אלקטרופיזיולוגיה והדמיה סידן, יש טכניקות אלה מתקשים מתגרים מזה בו או גורם לתגובה של נוירון בשל החפיפה במאפייני תגובה לנוירונים חוש הריח. למרות דפיקות-בסוג הקולטן-GFP שכותרת 30,31, אספקת קולטנים ספציפיים באמצעות adenovirus לMurine נוירונים חוש הריח 32,33, או ביצוע RT-PCR אחרי הקלטות 17,24,33 יכולים לקשר הקלטות לסוגים בודדים קולט, שיטות אלו נמוכה תפוקה ואינה מתאים למסכים בקנה מידה גדולה. מערכות הקרנת Heterologous הן מדרגי יותר, ושתי צורות עיקריות נמצאות בספרות: כתבי מסלול cAMP ואדנוזין אינוזיטול כתבי מסלול (IP3). על גירוי ריח, או.אר. אס להפעיל מפל איתות התמרה αolf G כי תוצאות בייצור של AMP המחזורי (cAMP) 12. על ידי שיתוף transfecting גן כתב גחלילית בלוציפראז תחת שליטתו של acאלמנט התגובה AMP (CRE), ייצור לוציפראז ניתן למדוד כפונקציה של תגובת ריח, המאפשר כימות של או הפעלה. או הפעלה יכולה גם להיות קשורה למסלול IP3 על ידי שיתוף להביע G-חלבונים כגון G α15/16 או 24,25,34 הכימרה α15-OLF G. אנו בחרנו בassay המוצג כאן מבוסס על שלושה גורמים: (1) שיתוף הביטוי של RTP1 עם קולטני ריח מתויג-Rho משפר את הביטוי של קולטני ריח בתא השטח 19,27; (2) שימוש בגן ​​כתב cAMP מגיב מאפשר למדידה או ההפעלה דרך מסלול השליח השני הקנונית; ו (3) assay הוא מתאים היטב למסכי תפוקה גבוהה. assay לוציפראז תפוקה גבוהה זה חל על מגוון רחב של מחקרים חשובים בתחום לחוש ריח. ראשית, מספר גדול של חדרי ניתוח יכול להיות מוקרן נגד odorant בודד על מנת לקבוע את דפוס הפעלת קולטן עבור spodorant ecific. סוג זה של מחקר זיהה OR7D4 כאו אחראי למתן מענה לandrostenone odorant סטרואידי 8. לעומת זאת, אחד או יכול להיות מוקרן נגד פנל של ניחוחי על מנת לקבוע את פרופיל תגובת קולט 10. כאשר odorant מועמד חוש הריח / או זוגות מזוהים באמצעות מסכי אלה, אינטראקציה יכולה להיות מאושרת על ידי ביצוע ניסוי תגובת מינון בוחן את התגובה של או לריכוזים הולך וגדל של odorant. עקומות מינון תגובה יכולות גם להעריך כיצד שונות גנטיות באו משפיעה בתגובה odorant מבחנה 8,9,11,35, וניתן להרחיב את הלימודים האלה לinterspecific או וריאציה, המאפשרים הבדיקה של אבולוציה קולטן על פני מינים ומוטציות סיבתי באבולוציה 36,37, לבסוף, assay זה יכול לשמש מסך ליריבי ריח כי הם מסוגלים להרגיז או תגובה לodorant במיוחד עבור זוג odorant / קולט ידוע 38,39. לסיכום, זה גבוהassay לוציפראז התפוקה הוא ישים למגוון רחב של מחקרים שיעזרו לאפיין או דפוסי הפעלה ולספק הבנה טובה יותר של קידוד ריח במערכת חוש הריח.

<table><tbody><tr><td>תאי Hana3A</td><td>זמינים ממעבדת מטסונאמי על פי בקשה</td><td></td><td></td></tr><tr><td>RTP1S-pCI</td><td>זמינים ממעבדת מטסונאמי על פי בקשה</td><td></td><td></td></tr><tr><td>M3-R-pCI</td><td>זמינים ממעבדת מטסונאמי על פי בקשה</td><td></td><td></td></tr><tr><td>pCRE-luc</td><td>Agilent</td><td>219076</td><td><a href="http://www.chem.agilent.com/store/ProductDetail.aspx?productID=219076%28Agilent%29">LUC</a></td></tr><tr><td>pSV40-RL</td><td>Promega</td><td>E2231</td><td><a href="http://www.promega.com/products/reporter-assays-and-transfection/reporter-vectors-and-cell-lines/prl-renilla-luciferase-control-reporter-vectors/">RL</a></td></tr><tr><td>Minimum Essential Media, Eagle</td><td>Sigma Aldrich</td><td>M4655</td><td><a href="http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/m4655?lang=en&amp; region=US">MEM</a></td></tr><tr><td>FBS</td><td>Life Technologies</td><td>16000-044</td><td><a href="https://products.invitrogen.com/ivgn/product/16000044? ICID=search-16000044">FBS</a></td></tr><tr><td>PBS (ללא Ca2+ ו-Mg2+)</td><td>Cellgro</td><td>21-040-CV</td><<td>a href="http://cellgro.com/products/balanced-salt-solutions/phosphate-buffered-saline/phosphate-buffered-saline-1x-2.html">PBS</a></td></tr><tr><td>טריפסין (0.05% טריפסין EDTA)</td><td>Life Technologies</td><td>25300</td><td><a href="https://products.invitrogen.com/ivgn/product/25300054? ICID=search-product">Trypsin</a></td></tr><tr><td>CD293</td><td>Life Technologies</td><td>11913-019</td><td><a href="http://products.invitrogen.com/ivgn/product/11913019? ICID=search-11913019">CD293</a></td></tr><tr><td>96-well PDL צלחת לבנה/שקופה</td><td>BD BioCoat</td><td>356693</td><td><a href="http://www.thomassci.com/Supplies/Tissue-Culture-Cellware/_/BD-Biocoat-Poly-D-Lysine-Culture-Dishes?q=356693">צלחות</a></td></tr><tr><td>מגיב טרנספקציה של שומנים: Lipofectamine 2000</td><td>Life Technologies</td><td>11668-019</td><td><a href="https://products.invitrogen.com/ivgn/product/11668019? ICID=search-11668019">Lipofectamine</a></td></tr><tr><td>מצע לוציפראז גחלילית, מרווה לוציפראז גחלילית/Renilla מצע לוציפראז: Dual-Glo Assay</td><td>Promega</td><td>E2980</td><td><a href="http://www.promega.com/products/reporter-assays-and-transfection/reporter-assays/dual_glo-luciferase-assay-system/?__utma=1.1932750276.1376486173.1376486173.1376486173.1&__utmb=1.1.10.1376486173&amp;__utmc=1&__utmx=-&__utmz=1.1376486173.1.1.utmcsr=google|utmc">dual glo</a></td></tr><tr><td>Synergy S2&nbsp;</td><td>BioTek</td><td>SLAD</td><<td>a href="http://www.biotek.com/products/microplate_detection/synergy2_multimode_microplate_reader.html">BioTek S2</a></td></tr>תוכנת <tr><td>קורא Microplate: תוכנת ניתוח נתונים Gen5</td><td>BioTek</td><td>Gen5</td><td><a href="http://www.biotek.com/products/microplate_software/gen5_data_analysis_software.html">Gen5</a></td></tr><tr><td>BIOSTACK</td><td>BioTek</td><td>BIOSTACK2WR</td><td><a href="http://www.biotek.com/products/microplate_software/biostack_microplate_stacker.html">BioStack</a></td></tr><tr><td>Multiflo</td><td>BioTek</td><td>MFP</td><td><a href="http://www.biotek.com/products/liquid_handling/multiflo_microplate_dispenser.html">MultiFlo</a></td></tr><tr><td>300 &#956; l GripTips</td><td>Integra</td><td>4433</td><td><a href="http://www.integra-biosciences.com/sites/us/pipette_tips_griptips_4_e.html">GripTips</a></td></tr><tr><td>12.5 &#956; l GripTips</td><td>Integra</td><td>4414</td><td><a href="http://www.integra-biosciences.com/sites/us/pipette_tips_griptips_4_e.html">GripTips</a></td></tr><tr><td>300 &#956; l GripTips ViaFlo96</td><td>Integra</td><td>6433</td><td><a href="http://www.integra-biosciences.com/sites/us/pipette_tips_griptips_XYZ_4_e.html">XYZ tips</a></td></tr><tr><td>12.5 &#956; l GripTips 384 XYZ</td><td>Integra</td><td>6403</td><td><a href="http://www.integra-biosciences.com/sites/us/pipette_tips_griptips_XYZ_4_e.html">XYZ tips</a></td></tr><tr><td>384ViaFlo</td><td>Integra</td><td>6030</td><td><a href="http://www.integra-biosciences.com/sites/us/96_384_channel_pipette.html">384ViaFlo</a></td></tr><tr><td>TE מאגר</td><td>Macherey Nagel</td><td>740797.1</td><td></td></tr><tr><td>DMSO</td><td>Sigma Aldrich</td><td>D2650-100ML</td><<td>a href="http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/d2650?lang=en&amp; region=US">DMSO</a></td></tr><tr><td>Forskolin</td><td>Enzo Life Sciences</td><td>BML-CN100-0010</td><td><a href="http://www.thomassci.com/007635F0-AA41-4B24-B46A-05723D685997/_/FORSKOLIN-10MG?q=c002e24">FOR</a></td></tr></tbody></table>

ניתוח תפוקה גבוהה של קולטני ריח יונקים: מדידה של קולטן הפעלה באמצעות בלוציפראז פעילות

High-throughput Analysis of Mammalian Olfactory Receptors: Measurement of Receptor Activation via Luciferase Activity

ניחוחות ליצור דפוסים ייחודיים וחופפים של הפעלה קולטני ריח, המאפשרים למשפחה של כ -1,000 עכברי ו400 קולטנים אנושיים להכיר אלפי ניחוחי. ligands odorant פורסמו על פחות מ -6% של קולטנים אנושיים 1-11. זה חוסר הנתונים נובע בחלקו לקשיים תפקודי המבטאים קולטנים אלה במערכות Heterologous. כאן, אנו מתארים שיטה לביטוי המכריע של משפחת חוש הריח קולטן בתאי Hana3A, ואחריו הערכת תפוקה גבוהה של הפעלה קולטני ריח באמצעות assay כתב בלוציפראז. assay זה יכול לשמש כדי (1) פנלי מסך של ניחוחי נגד פנלים של קולטני ריח; (2) לאשר אינטראקציה odorant / קולט באמצעות עקומות מינון תגובה; ו (3) להשוות את רמות הפעלת קולטן בין גרסאות הקולטן. בנתוני הדוגמא שלנו, 328 קולטני ריח הוקרנו נגד 26 הניחוח. זוגות odorant / קולטן עם ציוני תגובה שונים היו אין תמיכה בבחירהטד ונבדק בתגובה מינון. נתונים אלה מצביעים על כך שמסך הוא שיטה יעילה להעשרה לזוגות odorant / קולט שיעברו ניסוי תגובת מינון, כלומר הקולטנים שיש לי תגובה בתום לב לodorant. לכן, assay לוציפראז תפוקה גבוהה זו הוא שיטה יעילה לאפיון קולטנים צעד חיוני חוש הריח לכיוון מודל של קידוד ריח במערכת ההרחה של היונקים.

מסך ראשי נבדק 328 חדרי ניתוח נגד 26 ריחות בריכוז של 100 מיקרומטר. ריכוז ריח זה הוכח כדי להפעיל חלק גדול מחדרי ניתוח עם ligands הידוע 10 ביעילות. ראשית, פעילות לוציפראז המנורמלת הייתה מחושבת על ידי חלוקת קריאת גחלילית בלוציפראז ידי קריאת לוציפראז Renilla. בשלב בא, ערכי baselined היו מחושבים על ידי הפחתת קריאות לוציפראז המנורמלת לשליטה אין ריח מקריאות לוציפראז המנורמלת עבור כל היטב (איור 1). עקומות מינון תגובה בוצעו על 48 odorant / או זוגות מתפזר...

דפוסי הפעלה קולטני ריח לקודד זהות ריח, אך המחסור בנתונים שפורסמו זיהוי ligands odorant לקולטני ריח של יונקים מעכב את ההתפתחות של מודל מקיף של קידוד ריח. פרוטוקול זה מתאר שיטה לזיהוי לתפוקה גבוהה של ligands קולטני ריח וכימות של הפעלת קולט.

Odorants create unique and overlapping patterns of olfactory receptor activation, allowing a family of approximately 1,000 murine and 400 human receptors ...

המטרה הכוללת של הניסוי הבא היא לבצע מדידת תפוקה גבוהה של הפעלת קולטני הריח באמצעות בדיקת לוציפראז. זה מושג על ידי מעבר תאי H 3 A עם וקטורים המכילים חלבונים נלווים, גחלילית ווניל לוציפראז וקולטני ריח על מנת לבטא קולטן ריח אחר. בכל באר של צלחת 96 בארות.כשלב שני, התאים מגורים בריחות. לאחר מכן מתווסף סובסטרט לוציפראז הגורם לתאים שייצרו אנזים לוציפראז לזרוח ובכך לתפקד כמדווח להפעלת קולטני הריח. בסופו של דבר, התוצאות מראות את התגובות של אוכלוסיית קולטני הריח לריחות על סמך הזוהר של כל באר בצלחת.היתרונות העיקריים של טכניקה זו על פני שיטות קיימות כגון אדנובירל, התמרה של נוירונים מקוריים או הדמיית סידן, הם שטכניקה זו גם מתרחבת למסכים בעלי תפוקה גבוהה וגם משתמשת במסלול השליח השני המתווך CM המקורי כדי לבחון את הפעלת קולטני הריח. שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלות מפתח בתחום הריח, כגון התאמת ליגנדים של ריח, כך קולטני ריח, ובחינת השפעת השונות הגנטית על הפעלת קולטני הריח. תאי האנה שלושת A המשמשים בפרוטוקול זה נשמרים במדיה M 10 ב-37 מעלות צלזיוס עם 5% CO2, וצריכים להיות 100% מתכנסים על מנת לצלחת תאים לשאיבה טרנספקציונית מצלחת של 10 סנטימטר של תאים לשטוף תאים.על ידי הוספת 10 מיליליטר PBS, סיבוב הצלחת ושאיבת ה-PBS, הוסיפו שלושה מיליליטר של 0.05% טריפסין EDTA והמתינו כדקה עד שהתאים יתנתקו בטמפרטורת החדר. השבת טריפסין על ידי הוספת חמישה מיליליטר של מדיה M 10 מפרק גושי תאים על ידי דירוג משולש בערך פי 10 עם פיפטה של 10 מיליליטר. פיפטה בזהירות כדי להימנע מהכנסת בועות אוויר למדיה.עבור כל צלחת של 96 בארות העבירו מיליליטר אחד של תאים לצינור חרוטי של 15 מיליליטר. צנטריפוגה בכוח משיכה פי 200 למשך חמש דקות ולשאוף את הסופרנטנט מבלי להפריע לכדורי התא. השעו את התאים ב-12 מיליליטר של פיפטה M 10 50 מיקרוליטר תאים לכל באר מ-96 לוחות הבארות ודגרו למשך הלילה ב-37 מעלות צלזיוס עם 5% CO2.לפני תחילת הליך זה, התבונן בתאים המצופים ביום הקודם כדי להבטיח שטף תקין של כ-30 עד 50% לבאר. החזירו את הצלחות לחממה והמשיכו. כדי להכין את הטרנספקציה, מערבבים את הפלסמידים לביטוי חלבוני אביזרים.לוציפראז גחלילית ולוציפראז וניל רץ דוללו כל אחד לריכוז של 100 ננוגרם למיקרוליטר במאגר TE כדי לגרום לפיפטה של תערובת הפלסמידים להפוך את הפלסמידים למדיום מם לפי הנפחים המצוינים בטבלה זו. עבור כל צלחת 96 באר יש לדלל 18 מיקרוליטר של מגיב טרנספקציה ליפידים ב-450 מיקרוליטר של מדיום mem כדי ליצור את תערובת העברת השומנים. לאחר מכן, פיפטה את הפלסמיד.מערבבים את הפלסמיד עם קולטן הריח המתויג אופסין ותערובת העברת השומנים לצלחת MICROTITER נקייה. כדי להפוך את המתחם למפורט בטבלה זו, חישוב הבאר פלוס 10% חשוב כדי להבטיח נפח מספיק לשלבים הבאים. מערבבים את התמיסה על ידי אוצרות משולשת ודוגרים בטמפרטורת החדר למשך 15 דקות.עצור את התגובה על ידי הוספת M 10 לפי הטבלה. להצלחת הליך זה, חשוב שהתאים לעולם לא יישארו ללא מדיה למשך יותר משתי דקות. בזמן שהפתרונות מתווספים לבארות.הוציאו את התאים מהאינקובטור והפכו את לוחית התא והקישו החוצה את פיפטת המדיה 50 מיקרוליטר של קומפלקס לכל באר ודגרו למשך הלילה ב-37 מעלות צלזיוס עם 5% CO2 ביום שלאחר טרנספקציה של קולטני הריח. התבונן בתאים שעברו טרנספטציה כדי להבטיח שטף תקין של 50 עד 80% לבאר להחזיר את התאים לחממה. הריח דולל לריכוז מלאי של טוחנת אחת ו-DMSO לניסויי סינון מדלל כל תמיסת מלאי של ריח ל-100 מיקרומולר.בנוסף, הכינו בקרת ללא ריח המכילה רק מדיום CD 2 93 כדי לשלוט בהפעלת הרקע של קולטני הריח. הסר את התאים מהחממה והקש החוצה את המדיה מלוחות התאים. פיפטה 25 מיקרוליטר של תמיסת גירוי ריח לכל באר ודגירה ב-37 מעלות צלזיוס עם 5% CO2 למשך ארבע שעות.התחל הליך זה. הפשרת מיליליטר אחד של מצע לוציפראז גחלילית לכל 96. ובכן צלחת הכינו מרווה תגובת לוציפראז גחלילית טרייה והריץ ריאגנט מצע לוציפראז וניל.יש צורך בכמיליליטר אחד של מגיב לכל צלחת ריתוך 96. לאחר מכן, הכן את קורא המיקרו-פלטות הזוהר בתוך סמל המערכת מתחת ללשונית החימום מראש. סמן את התיבה במצב מופעל והגדר את טמפרטורת המכונה ל-25 מעלות צלזיוס מתחת ללשונית המתקן.יש להניח לכל מתקן 1000 מיקרוליטר של 70% אתנול, ואחריו 1000 מיקרוליטר מים מזוקקים. השתמש בכמויות נפרדות של אלכוהול ומים לכל מתקן. יש להניח לכל מתקן 1,500 מיקרוליטר של מתקן אוויר ראשי.אחד עם 1080 מיקרוליטר של מתקן ראשי למצע לוציפראז גחליליות. שניים עם מצע רניל לוציפראז. היזהר לא לזהם את מצעי הלוציפראז.הגדר את הפרוטוקול הבא לקריאת לוציפראז גחלילית ווניל לוציפראז זוהר בתוך התוכנה. תחת תפריט הקובץ. לחץ על פרוטוקולי הדגשת משימות חדשים ולחץ על צור חדש.בחלון הבא יש לבחור את העיגול שליד הפרוטוקול הסטנדרטי. לחץ על אישור. לחץ פעמיים על הנוהל.בצד שמאל של המסך מחלקים 10 מיקרוליטר של מצע לוציפראז גחליליות לכל הבארות באמצעות מתקן אחד מתחת לתפריט הפעולות, לחץ על חלוקה בחלון שלב החלוקה. הגדר את המתקן לאחד. תחול לאף אחד.להוציא נפח ל-10 מיקרוליטר וקצב ל-225 מיקרוליטר לשנייה קליק בסדר. נער את הצלחת למשך 30 שניות תחת תפריט הפעולות, לחץ על טלטול בחלון שלב הניעור. הגדר את העוצמה לבינונית ואת משך הזמן ל-30 קליקים. בסדר.קרא את הזוהר של כל הבארות למשך 0.5 שניות לבאר בתפריט הפעולות. לחץ על קריאה בשיטת הזיהוי של חלון שלב הקריאה לזוהר, סוג קריאה לנקודת קצה, זמן אינטגרציה ל-50, ערכות מסננים לפליטה אחת למיקום אופטיקה שלם, לרווח עליון ל-1, 35 וגובה קריאה ל-1.00 מילימטרים. לחץ על אישור.חלק 10 מיקרוליטר של מצע לוציפראז רץ לכל הבארות באמצעות מתקן שני. הגדר את התנאים כפי שמוצג לשימוש במתקן. אחד מלבד מתקן הגדר לשניים.לנער את הצלחת למשך 30 שניות. קרא את הזוהר של כל הבארות למשך 0.5 שניות לבאר. הסר את המכסה מצלחת 96 הבאר והנח את הצלחת בקורא המיקרופלייט.הפעל את התוכנית שהוגדרה קודם לכן לקריאת זוהר צלחת לאחר השלמת הקריאה. נקה את משאבות מתקן הריאגנטים מסמל המערכת מתחת ללשונית המתקן. טהר 1000 מיקרוליטר של מצע לוציפראז גחלילית ממתקן לוציפראז הגחלילית לתוך צינור התאוששות.כל מתקן עם 1000 מיקרוליטר מים מזוקקים ואחריו 1000 מיקרוליטר של 70% אתנול. ולבסוף, 1,500 מיקרוליטר אוויר המוצגים כאן הם תוצאות ממסך ראשוני שבדק 328 קולטני ריח או OR מול 26 ריחות בריכוז של 100 מיקרומולר. היסטוגרמה זו מתארת את התדירות או הספירה של ערכי לוציפראז בסיסיים המחושבים עבור כל ריח או זוג במסך מכיוון שזוגות הפעלת קולטני הריח דלילים.רוב הערכים מרוכזים באפס וההתפלגות המרכזית הגדולה מעריכה את התפלגות הרעש עבור בדיקה זו. עקומות תגובת מינון בוצעו על 48 ריח או זוגות שחולקו באופן אקראי על פני טווח ערכי הבסיס כפי שמצוין על ידי הפסים הצבעוניים. פסים כחולים הם זוגות שסווגו כאגוניסטים על סמך תגובת המינון המלא, וסורגים אדומים הם זוגות שלא סווגו כאגוניסטים.לאחר מכן הוערך שיעור חיובי אמיתי כנגד שיעור החיובי השגוי באמצעות החבילה הסטטיסטית R. השטח שמתחת לעקומה או UC הוא 0.68, מה שמצביע על כך שריח או זוגות עם ערכי מסך לוציפראז גבוהים יותר נוטים יותר להעביר תגובת מינון מאשר אלה עם ערכים נמוכים יותר. נתונים אלה מצביעים על כך שהמסך הראשוני הוא שיטה שימושית להעשרה עבור ריח או זוגות שיסווגו כאגוניסטים בניסוי תגובה במינון מלא.לאחר שליטה, ניתן לבצע טכניקה זו תוך כשש שעות עבור 5 96 צלחות אולה, לא כולל זמן הדגירה אם היא מבוצעת כראוי. לאחר צפייה בסרטון זה, אתה אמור להיות בעל הבנה טובה כיצד לבצע ניתוח תפוקה גבוהה של קולטני ריח באמצעות גירוי ריח טרנספקציה, ומדידת הפעלה באמצעות בדיקת לוציפראז.

high-throughput-analysis-mammalian-olfactory-receptors-measurement

Research

JoVE Journal

Neuroscience

מדעי המוח

כאן אנו מתארים נהלים לחקר שינויים בביטוי גנים phagocytosis המושרה עם גישה בלוציפראז מבוסס כתב הגן באמצעות מערכת כפולה GloTM Assay בלוציפראז מ Promega.

לימוד biogenesis ממברנה עם Assay בלוציפראז מבוסס Gene כתב

כאן אנו להדגים פרוטוקול לבצע מכתים תא חי, שניתן להשתמש בהם כדי לזהות קולטנים odorant על פני השטח של תאים HEK293T בנוחות. בנוסף, הוא עשוי לשמש גם כדי assay לביטוי פני השטח של קולטנים chemosensory אחרים או GPCRs.

Assaying הביטוי Surface של קולטנים Chemosensory בתוך תאים Heterologous

הסרטון מדגים את בדיקת לוציפראז המשמשת לכימות חלבונים המתויגים בלוציפראז. הבדיקה משתמשת באנזים לוציפראז מהונדס המורכב מקטע גדול שנקשר למקטע הקטן, אשר מצומד עם חלבון מעניין. תת-היחידות הכבולות יוצרות אנזים פעיל שבנוכחות המצע משחרר אות זוהר. אות זה מכומת לאחר מכן באמצעות לומינומטר.

בדיקת לוציפראז: בדיקת תפוקה גבוהה למדידת אותות זוהרים באמצעות ביו-כתבים מבוססי מערכת ננולוציפראז מהונדסים

סרטון זה מדגים את הפרוטוקול למדידת הפעלת קולטן ריח בתאים נגועים באמצעות ביוסנסור מחזורי אדנוזין מונופוספט (cAMP) וזיהוי לומינסנציה. השיטה מיושמת לחקר אינטראקציות קולטן-ליגנד ומסלולי איתות בנוירוני ריח.

מדידת הפעלת קולטן ריח באמצעות בדיקת אדנוזין מונופוספט מחזורית בזמן אמת

מקור: de March, C. A. et. al., ניטור בזמן אמת במבחנה של הפעלת קולטני ריח על ידי ריח בשלב האדים. J. Vis. Exp. (2019)סרטון זה מדגים את השיטה לניטור הפעלה בזמן אמת של קולטני ריח בתאי יונקים רקומביננטיים באמצעות מדידת לומינסנציה. קשירת ריח מפעילה הפעלת חלבון G וייצור cAMP, ומפעילה חלבוני גלו-סנסור הפולטים זוהר בעת קשירת המצע, ומספקים מדד כמותי לתגובת הקולטן.

ניטור בזמן אמת של הפעלת קולטני ריח בתאים רקומביננטיים

אנו מציגים שיטת סינון מהירה וזולה לזיהוי רגולטורים תעתיק באמצעות transfections רובוטית תפוקה גבוהה וassay בלוציפראז כפול זוהר תוצרת בית. פרוטוקול זה במהירות מייצר נתונים פונקציונליים Side-by-צד ישיר לאלפי גנים והוא שינוי בקלות למקד כל גן של עניין.

הקרנה פונקציונלית תפוקה גבוהה באמצעות assay בלוציפראז Dual-זוהר תוצרת בית

השגת הבנה ברמת מערכות של תהליכים תאיים היא מטרה של ביולוגיה של התא המודרנית. אנו מתארים כאן אסטרטגיות לכתבי לוציפראז ריבוב של תפקוד תאי שונים נקודות קצה לחקור את תפקוד גן באמצעות הגנום בקנה מידה ספריות RNAi.

פלטפורמת הקרנה מבוססת לוציפראז Multiplexed לחקירת מלחמה בסרטן הקשורים להעברת אותות בתאים בתרבית

פרוטוקול זה מתאר כיצד להשתמש במיקרוסקופ פלואורסצנטי של השתקפות פנימית כוללת כדי לדמיין ולעקוב אחר קולטנים בודדים על פני תאים חיים ובכך לנתח את הניידות הרוחבית של הקולטן, גודל קומפלקסי הקולטנים וכן לדמיין אינטראקציות קולטן-קולטן חולפות. ניתן להרחיב פרוטוקול זה לחלבוני ממברנה אחרים.

רזולוציה גבוהה ניתוח Spatiotemporal של קולטן Dynamics ידי המולקולה בודדת מיקרוסקופ פלואורסצנטי

ניתוח התכונות הפיזיולוגיות של נוירונים חושי ריח עדיין מתמודד עם מגבלות טכניות. כאן אנו מתעדים אותם באמצעות מהדק טלאי מחורר בהכנה שלמה של אפיתל הריח בעכברים ממוקדי גנים. טכניקה זו מאפשרת לאפיין את תכונות הממברנה ותגובות לליגנדים ספציפיים של נוירונים המבטאים קולטני ריח מוגדרים.

הקלטה מחוררת תיקון מהדק של עכבר עצב סנסורי חוש הריח בneuroepithelium שלמים: ניתוח פונקציונלי של נוירונים הבעת קולטן odorant מזוהה

אפיון הפונקציה של קולטני odorant מגישה חלק חיוני בתהליך deorphanization. אנו מתארים שיטה למדוד את ההפעלה של רצפטורים odorant בזמן אמת באמצעות וזמינותו של המחנה.

לחיות תאים מדידה של Odorant קולטן הפעלה באמצעות Assay המחנה בזמן אמת

מבחינה פיזיולוגית, odorant רצפטורים מופעלים על ידי מולקולות odorant בשאיפה בשלב אדי. עם זאת, ביותר מערכות in vitro לנצל שלב נוזלי odorant גירוי. כאן, אנו מציגים שיטה המאפשרת ניטור בזמן אמת במבחנה של הפעלת קולטן odorant על odorant גירוי בשלב אדי.

בזמן אמת בחוץ גופית ניטור של הפעלת קולטן Odorant מאת Odorant בהשלב אדי

למדו שיטה לניתוח תפוקה גבוהה של קולטני ריח יונקים באמצעות מדידת לומינסנציה של לוציפראז בתאי H3A. השיטה מאפשרת זיהוי מהיר של ליגנדים וקידום הבנת קידוד ריחות במערכת העצבים.

ניתוח תפוקה גבוהה של קולטני ריח יונקים: מדידה של קולטן הפעלה באמצעות בלוציפראז פעילות

גלה סרטונים נוספים