סטטי הידבקות Assay לחקר Integrin ההפעלה בT לימפוציטים

המטרה הכוללת של הליך זה היא לכמת הידבקות תאית. זה מושג על ידי ציפוי ראשון של מיקרו-פלטת 96 בארות עם מולקולות הידבקות בשלב השני. תאי T אנושיים ראשוניים מבודדים מהדם ומסומנים ב-CFSE.

לאחר מכן, תאי ה-T מגורים באמצעות טיפולים כדי להשפיע על הדביקות שלהם. בשלב האחרון, התאים המטופלים מתווספים למיקרופלייט ומותר להדבקה להתרחש. בסופו של דבר, ניתן למדוד את כמות הקרינה לבאר כדי לקבוע את אחוז התאים הדבקים בכל מצב טיפול.

היתרון העיקרי של טכניקה זו על פני שיטות קיימות כמו הוספת תאי T למודל ולאנטריום, הוא שאין צורך בתרבית משותפת של תאי T ותאי erl. שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלות מפתח בתחום האימונולוגיה, כגון כיצד תרופות ספציפיות משפיעות על הידבקות הלימפוציטים? למרות ששיטה זו יכולה לספק תובנה לגבי הביולוגיה של כף הרגל, ניתן ליישם אותה גם על תאי מיי אחרים כגון נויטרופילים.

הדגמה חזותית של שיטה זו היא קריטית מכיוון שקשה לשלוט בשלבים ודורשים דיוק ומיומנות כדי לקודד מיקרו-צלחת עם מולקולות ההדבקה התחל בשטיפת 24 בארות של צלחת 96 בארות עם 50 מיקרוליטר תמיסת שטיפה, ולאחר מכן דגירה על כל באר למעט בארות הבקרה הלא מצופות עם 50 מיקרוליטר של תמיסת ציפוי למשך שעה אחת ב-37 מעלות צלזיוס. לאחר מכן, שאפו בעדינות את תמיסת הציפוי מבלי לאפשר לקצה הפיפטה לגעת בתחתית הבארות. לאחר מכן לאחר שטיפת הבארות עם 50 מיקרוליטר נוספים של תמיסת כביסה, דגרו את המיקרופלייט עם 50 מיקרוליטר תמיסת הידבקות לבאר.

שוב, ב-37 מעלות צלזיוס. לאחר שעה, שאפו בעדינות את תמיסת ההדבקה ושטפו את הבארות פעם נוספת עם 50 מיקרוליטר תמיסת שטיפה כדי לבודד את תאי ה-T, ראשית יש לערבב היטב 50 מיקרוליטר של קוקטייל העשרת תאי T אנושיים לכל מיליליטר דם מלא, ולאחר מכן לדגור את הדם המטופל למשך 20 דקות בטמפרטורת החדר. לאחר מכן, הוסיפו שישה מיליליטר מהדם המטופל ונפח שווה של PBS נטול סידן ומגנזיום מועשר בגלוקוז 1% D לצינור חרוטי של 50 מיליליטר בטמפרטורת החדר וערבבו את התמיסה בעדינות.

לאחר מכן הוסיפו 15 מיליליטר של הכנת לימפו לצינור חרוטי טרי של 50 מיליליטר, והניחו בזהירות את דגימת הדם המדוללת שלהם על מדיום בידוד הלימפוציטים. הפרד את שכבות התאים למשך 20 דקות ב -400 פעמים G ו -20 מעלות צלזיוס עם הניתוק. לאחר מכן השתמש בפיפטה טרייה כדי להסיר את השכבה העליונה, ולהשאיר את שכבת הלימפוציטים ללא הפרעה בממשק.

העבירו את שכבת הלימפוציטים לצינור חרוטי טרי עם פיפטה מציקה חדשה. הוסף תשעה מיליליטר PBS ללימפוציטים ולאחר מכן פזר את התאים באופן שווה לאורך התרחיף על ידי משיכתם בעדינות פנימה והחוצה. סובב את התאים ואז השהה מחדש את הגלולה במדיה.

לאחר מכן מחלקים את התאים לבקבוק תרבית T 75. 20 מיליליטר של אמצעי תרבית כדי לעורר את התאים לאחר תקופת התרבות המתאימה. ראשית, הוסף מדיה חופשית בסרום ל-2.4 כפול 10 לששת תאי ה-T, ולאחר מכן הסרום מרעיב את התאים באינקובטור של 37 מעלות צלזיוס.

לאחר שעתיים, סובב את התאים והשהה מחדש את הגלולה. במיליליטר אחד של PBS, סמן את התאים עם סמן פלואורסצנטי בחושך למשך שמונה דקות בטמפרטורת החדר, ולאחר מכן עצור את התגובה על ידי הוספת 10 מיליליטר של 37 מעלות צלזיוס PBS. לאחר מכן לאחר סיבוב התאים, השעו מחדש את הגלולה ב -1.2 מיליליטר של תמיסת הידבקות מוקדמת.

מחממים את המיקרו-צלחת המצופה ל-37 מעלות צלזיוס, ואז מחלקים את התאים לשמונה אליקוטים של 150 מיקרוליטר ב-1.5. צינורות מיליליטר מגרים צינור אחד עם PMA ב-10 ננוגרם למיליליטר כדי לשמש כבקרה חיובית. השאירו שלושה צינורות לא מטופלים כדי לשרת את הבקרה לגירוי, בקרת הטעינה הלא שטופה והבקרה לציפוי ICAM אחד ולעורר ארבעה צינורות עם ריכוזים שונים של נוגדנים נגד CD שלושה.

לאחר מכן יש להוציא מיד 50 מיקרוליטר של אחד כפול 10 לתאים החמישיים לכל באר של תערובות התאים המגורים לבארות המתאימות במיקרופלייט ולדגור את הצלחת בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך 15 דקות. כדי לקבוע תחילה את אחוז התאים הדבקים, יש לשטוף כל באר עם 150 מיקרוליטר של תמיסת הידבקות חמה. מנערים את הצלחת בעדינות למשך מספר שניות ואז שואבים בזהירות את המדיום מכל באר מבלי לגעת בתחתית הבארות עם קצות הפיפטה.

חזור על הכביסה שלוש פעמים, ושנה את זווית הפיפטה בכל שאיפה. לאחר מכן הפעל את קורא הצלחות ופתח את תוכנת קריאת הצלחות תחת תפריט המשימות. לחץ על חדש כדי להגדיר פרוטוקול חדש.

לאחר מכן, תחת תפריט הפעולות, בחר באפשרות הקריאה. לחץ על עוצמת פלואורסצנט ולחץ על אישור. הזן את אורך גל העירור כ-485 ואת אורך גל הפליטה כ-528.

לאחר מכן, תחת תפריט האפשרויות האופטיות, בחר בתחתית ולחץ על אישור. לאחר מכן חזור לתפריט הפעולות והגדר את הטמפרטורה ל-37 מעלות צלזיוס ולחץ על אישור. לבסוף טען את המיקרופלייט ולחץ על הפעל.

לאחר ייצוא התוצאות לגיליון אלקטרוני, השתמש בנוסחה כדי לחשב את אחוז תאי ההדבקה בתמונות אלה. מוצגת דוגמה לבדיקת הידבקות באמצעות תאי T ראשוניים, מגורה בריכוזים שונים של שלושה נוגדנים נגד CD. התאים הלא מגורים משמשים כבקרה שלילית.

התאים המטופלים ב-PMA משמשים כבקרה חיובית עבור שלושת הנוגדנים נגד CD, הטבלה מציגה את עוצמות הקרינה היחסית של CFSE. תאי T ראשוניים מסומנים מגורים במינונים שונים של נוגדנים מסיסים נגד CD שלושה ומצופים על בארות מצופות IAM אחת. עבור כל מצב, ניתן לחשב את העוצמה הממוצעת של הבארות המשולשות ולהמיר אותה לאחוז היחסי מתוך סך התאים שנטענו.

בניסוי טיפוסי, אחוז התאים שטופלו ב-PMA הוא בין 40 ל-50% בעוד שאחוז התאים הלא מגורים הוא בין 5 ל-10%שימו לב שאחוז התאים הנצמדים עולה ככל שריכוז הנוגדנים נגד CD שלושה המשמשים לגירוי עולה. לאחר שליטה, ניתן לבצע טכניקה זו תוך פחות משלוש שעות אם היא מבוצעת כראוי. בעת ניסיון הליך זה, חשוב לזכור למדוד את הקרינה של באר לא שטופה כדי לקבוע את קלט הקרינה.

ערך קריטי בניתוח נתונים. לאחר צפייה בסרטון זה, אתה אמור להבין היטב כיצד לכמת הידבקות תאית סטטית. אל תשכח שעבודה עם דגימות דם אנושיות עלולה להיות מסוכנת ביותר, ותמיד יש לנקוט באמצעי זהירות כגון לבישת מעיל מעבדה וכפפות בעת ביצוע הליך זה.