הערכה לא פולשנית של לב חריגות בניסויית אוטואימוניות דלקת שריר לב על ידי תהודה מגנטית מיקרוסקופית הדמיה בעכבר

המטרה הכוללת של פרוצדורה זו היא לקבוע ליקויים בתפקוד הלב באמצעות דימוי של לבבות בבעלי חיים חיים הסובלים ממחלת לב דלקתית. דבר זה מושג תחילה על ידי השראת המחלה, לדוגמה, מיוקרדיטיס (myocarditis). השלב השני הוא הכנת בעל החיים לדימוי במיקרוסקופיה של תהודה מגנטית (magnetic resonance microscopy), והנחתו בתושבת לבעלי חיים.

בשלב הבא, העכבר ממוקם בתוך המגנט לרכישת תמונות של הלב. השלב האחרון הוא ניתוח הפרמטרים התפקודיים של הלב באמצעות תוכנת הסגמנטציה (segment software). בסופו של דבר, טכניקה זו משמשת לחישוב הנפח הדיאסטולי הסופי ואחוז הפליטה בעכברים הלוקים במיוקרדיטיס אוטואימונית.

היתרון המרכזי של טכניקה זו על פני שיטות קיימות, כגון היסטופתולוגיה, הוא שהיא אינה פולשנית ומספקת תצוגה תלת-ממדית ברזולוציה גבוהה של הלב. שיטה זו יכולה לסייע במתן מענה לשאלות מפתח בתחום הקרדיולוגיה הנוגעות לאבחון מחלות לב דלקתיות. בדרך כלל, אנשים שאינם מכירים את השיטה יתקשו בביצועה בשל חוסר ניסיון בהכנת בעלי חיים לרכישת מיקרו-דימויים באמצעות תהודה מגנטית.

לפיכך, הדגמה חזותית של שיטה זו היא קריטית. התחל את הפרוטוקול זה תחילה בהכנת תמיסת פפטיד להשראת מיוקרדיטיס אוטואימונית: המס פפטיד cardiac myosin heavy chain alpha 3 34 to 3 52 בתוך phosphate buffered saline עד לריכוז סופי של 2 mg ל-1.5 mL. לאחר מכן, הכן את ה-pertussis toxin על ידי הוספת 1 mL של phosphate buffered saline סטרילי 1x לבקבוקון המכיל 50 µg של pertussis toxin ליופיליזד.

כדי להגיע לריכוז מלאי של 50 nanograms per microliter. לאחר מכן, העבירו 20 microliters מהמלאי למבחנה סטרילית של 1.5 milliliter והוסיפו 980 microliters של phosphate buffered saline סטרילי בריכוז one x כדי להגיע לריכוז עבודה של one nanogram per microliter. הכינו גם adjuvant פרונטלי מלא או CFA על ידי הוספת 40 milligrams של mycobacterial tuberculosis, H 37 RV או תמצית MTB ל-10 milliliters של CFA כדי להגיע לריכוז סופי של five milligrams per milliliter.

כעת הכינו את ת emulsion של הפפטיד ו-CFA כדי להכין מנה של 1.5 מיליליטר של emulsion; העבירו 750 מיקרוליטר של תמיסת פפטיד cardiac myosin heavy chain alpha peptide 3 34 to 3 52 למבחנה אחת בנפח 1.5 מיליליטר, והעבירו נפח שווה של CFA המועשר ב-MTB extract למבחנה נוספת בנפח 1.5 מיליליטר. לאחר מכן, בעזרת מזרק lure lock של 3 מיליליטר, שאבו תחילה את תמיסת הפפטיד, ולאחריה את ה-C-F-A-M-T-B extract. חברו את המזרק לברז תלת-כיווני (three-way stop cock) וחברו את המוצא השני של הברז למזרק ריק של 3 מיליליטר.

כווננו את פתח המעבר של ברז המעבר, כך שתערובת ה-peptide CFA תזרום ממזרק אחד לשני עם התנגדות סבירה. ערבב על ידי דחיפת התוכן ממזרק אחד לשני באופן חוזר למשך כדקה אחת, ולאחר מכן הנח את כל המערכת על קרח למשך כשלוש דקות.

חזור על הליך זה לפחות 10 פעמים. קבע את עקביות האמולסיה על ידי הנחה זהירה של טיפה זעירה על מים עומדים בביਕਰ זכוכית של 100 milliliter. הטיפה לא אמורה להתפזר במים; אם היא מתפזרת, המשך בערבוב עד להשגת העקביות הרצויה.

העבירו את תוכן האמולסיה ממזרקים של 3 mL למזרק של 1 mL עם Lure lock, על ידי החלפת אחד משני המזרקים של 3 mL המחוברים לברז העצירה (stop cock) במזרק של 1 mL. לאחר מכן, חברו מחט במידה 27.5 gauge.

הזריקו 150 microliters של תחליב פפטיד CFA במינונים מחולקים באופן תת-עורי לשני אזורי המפשעה בעכברים נקביים מסוג aj בני שש עד שמונה שבועות. לאחר מכן, ניתן 100 microliters של תרחיף רעל צניפת (pertussis toxin) באופן תוך-פעטוני לכל חיה ביום אפס וביום השני לאחר החיסון. חזרו על הליך החיסון ביום השביעי על ידי מתן 150 microliters של תחליב פפטיד CFA במינונים מחולקים באופן תת-עורי משני צידי העצם הסטרנום.

הכינו את האמולסיה זו באופן טרי כפי שמתואר. לאחר מכן, ביום ה-21, העבירו את בעלי החיים לדימות MRM. כדי להכין את בעלי החיים לדימות, ראשית הניחו כל עכבר בתא להשראת הרדמה המכיל תערובת אוויר ו-2% ISO fluorine, עם פד חימום לשמירה על חום הגוף.

לאחר מכן, העבירו את בעל החיים למחזיק בעלי חיים המעוצב במיוחד. קבעו את הראש באמצעות מוט נשיכה כדי להקפיא את בעל החיים במצב שכיבה על הבטן. החלק הקדמי של האף צריך להיכנס לתוך קונוס האף כדי לשמור על ההרדמה.

הפעילו את מחמם נשיבת האוויר כאשר צינור הפלט שלו מוכנס לתוך התושבת האנכית של הסורק, כדי לשמור על טמפרטורת הגוף של החיה במהלך הניסוי. שמרו על הרדמה בריכוז של 1% עד 2% isof fluorine עם קצב זרימה של 2 mL לדקה לאורך כל סשן ההדמיה. ודאו את יעילות ההרדמה באמצעות צביטה של בהונות.

בשלב הבא, הגדירו חיישן כרית פנאומטי וגשש טמפרטורה רקטלי כדי לנטר את הנשימה ואת טמפרטורת הגוף לאורך כל סבב ההדמיה. יש לחבר גם חיישן פולסימטריה אופטי לקרסול השמאלי, וליצור קיבוע של כף הרגל באמצעות לולאת חוט וסרט הדבקה כדי לשמור על מיקומה. ההדמיה תתבצע באמצעות gating של אותות הנשימה והלב ללא שימוש בחומרי ניגוד.

יש להשתמש במגנט בעל חור אנכי רחב של 9.4 Tesla כדי להשיג תמונות מיקרוסקופיה של תהודה מגנטית בתלת-ממד וברזולוציה גבוהה. לאחר הכנת החיה, מקם את העכבר בסורק כך שהלב יהיה ממוקם במרכז שדה הראייה. לאחר מכן, הפעל את ממשק ההדמיה, בחר בתפריט "סוג מחקר חדש" (new study type) בשורת הפקודות, פתח את עמוד הכיוון (tune page) ולאחר מכן בחר ב-"הפעל גשש, כוון וכושר עצמי" (start probe, tune and autoscale).

השתמשו בכפתורי הכיוונון וההתאמה (tune match) המרוחקים בקצה הסליל כדי לכוון את סליל ה-RF לתדר התהודה של הפרוטון, 400 megahertz. לאחר מכן, עברו לדף הטרי-סריקה (pre-scan). כדי להריץ את כיול התדר וההספק, לחצו על כפתור המהיר x, Y, Z כדי להעלות את דף השיימינג (shimming).

לאחר מכן, בחרו את כל החזרות ובצעו כיול שדה מגנטי אוטומטי (auto shimming). בחרו רצף סקר (scout sequence). שנו את שדה הראייה ל-35 millimeters.

השאירו את שאר הגדרות ברירת המחדל והפעילו את הרצף. אם הלב אינו נמצא במרכז שדה הראייה, כווננו את מיקום מחזיק בעל החיים, בצעו כיוון מחדש (retune) של סליל ה-RF ורכשו מחדש את תמונת הסקר (scout). לאחר מכן, בחרו ברצף ה-gem.

הזינו את פרמטרי הרכישה המוצגים כאן בלשונית הרכישה (acquire) כדי לקבל שני מישורים אורתוגונליים לאורך הציר הקצר והארוך של הלב. לאחר מכן, בחרו ברצף ה-cine כדי לאסוף את תמונות ה-cine של הציר הקצר במדידת רמות החמצן בדם (pulse oximetry gage) ומדדו את הפרמטרים האנטומיים והפונקציונליים של החדר השמאלי. הזינו את הפרמטרים המוצגים כאן כדי לקבל את רצף ה-cine בשיטת gradient echo.

כווננו את המיקום ואת הזווית של פרוסות הדימות בהתבסס על מבט לאורך הציר הארוך של הלב. לאחר מכן, הפעילו את הרצף. ברגע שהדימות הושלם.

המיר את התמונות שהושגו לפורמט DICOM באמצעות לשונית ה-IO והעבר את הקבצים המתאימים למרכז הנתונים לעיבוד. בסיום הליך ההדמיה, אפשר לבעל החיים להתאושש מההרדמה בתוך כלוב עם מכסה מסונן. אין להשאיר את העכבר ללא השגחה עד שיחזור למצב של הכרה מספקת כדי לשמור על שכיבה על הבטן (sternal recumbent).

כאן, נעשה שימוש בתוכנת segment כדי לנתח את הפרמטרים האנטומיים והתפקודיים של החדר השמאלי. התחילו בטעינת תמונות cine בפורמט DICOM לתוך התוכנה. לאחר מכן, בחרו ב-MRGE כטכניקת ההדמיה, ב-cine כסוג התמונה וב-short axis mid ventricular.

במישור תצוגת התמונה, הגדירו את מסגרות הזמן שישמשו עבור סוף הדיאסטולה וסוף הסיסטולה באמצעות תפריטי המשנה "set current timeframe to end diastole" ו-"set current timeframe to end systole" בתפריט העריכה (edit), בהתאמה. לאחר מכן, השתמשו בכפתורי הפקודה LV, ולאחר מכן endo ו-EPI בלוח הבקרה הימני התחתון. כדי לשרטט ידנית את החדר השמאלי, האנדוקרדיום והאפיקרדיום בהתאמה, הסירו את השרירים הפפילריים על ידי לחיצה על כפתור הפקודה המתאים.

על מנת להגביר את דיוק החישובים, קראו את פרמטרי החדר השמאלי שנמדדו, כגון נפח דיאסטולי, נפח סיסטולי, נפח פעימה וסיבוב פליטה (ejection fraction), בלוח העליון מימין. לאחר מכן, השתמשו בכפתור הפקודה mis ולאחר מכן בכפתור הפקודה של קליבר המדידה (measurement caliper) כדי למדוד את פרמטרי החדר השמאלי, כגון עובי הדופן וקוטר החדר. לבסוף, הקפידו להשתמש באפשרות השמירה של שניים ערימות התמונות והסגמנטציה (save both image stacks and segmentation) כדי לשמור את התמונות, כולל הסגמנטציות בפורמט dot mat, לצורך עיבוד חוזר של התמונות במידת הצורך.

ניתן לראות כאן את הזווית שבה נחתך הלב לצורך רכישת דימוי במבט דו-חדרי. כאן ניתן לראות עלייה של פי 1.5 בקירוב בעובי החדרי השמאלי, המעידה על פגמים מבניים בלבבות של עכברים שסבלו ממיוקרדיטיס אוטואימונית ניסיונית בהשוואה לעכברים בריאים. תפוקת הלב, שנמדדה על סמך נפח החדרי השמאלי והנפח הדיאסטולי וסינון הדחף (ejection fraction), הייתה נמוכה בעכברים שסבלו ממיוקרדיטיס אוטואימונית בהשוואה לעכברים בריאים.

לבסוף, הלבבות מקבוצות הטיפול שלעיל נבדקו לדלקת באמצעות צביעה של hematoxylin, eosin ו-toin; הערכה היסטולוגית של לבבות מעכברי myocarditis, אך לא מעכברים בריאים, הראתה חדירות לימפוציטים מולטיפוקאליות. בעת ביצוע הליך זה, חשוב לוודא שטמפרטורת גוף החיה נשארת קבועה, כך שקצב הלב וקצב הנשימה לא ישתנו באופן משמעותי במהלך הניסויים. דבר זה קריטי לקבלת תוצאות הניתנות לשחזור.

לאחר צפייה בסרטון זה, תרכשו הבנה טובה של טכניקת מיקרוסקופיה בתהודה מגנטית להערכת הפרעות תפקודיות במחלות לב דלקתיות, כגון מיוקרדיטיס בעכברים. אך זכרו כי עבודה עם שדות מגנטיים חזקים עלולה להיות מסוכנת ביותר, ולכן מחזיק החיות ורכיבים אחרים חייבים להיות לא-מגנטיים.