גלוטמין שטף הדמיה באמצעות חיישני מקודדים גנטיים
31 ביולי 2014
מאמר זה ידגים כיצד לעקוב אחר דינמיקת גלוטמין בתאים חיים באמצעות סריג. חיישני מקודדים גנטי מאפשרים ניטור בזמן אמת של מולקולות ביולוגיות ברזולוציה subcellular. עיצוב ניסיוני, פרטים טכניים של ההגדרות הניסיוניות, ושיקולים לניתוחים שלאחר ניסוי יידונו לחיישני גלוטמין מקודד גנטי.
המטרה הכללית של פרוצדורה זו היא לצלם תעתוק של גלוטמין באמצעות נשא המבוטא באופן הטרולוגי בתאים חיים, תוך שימוש בחיישני העברה של אנרגיה במערכת רזוננס (Förster resonance energy transfer) או חיישני FRET. דבר זה מושג תחילה על ידי טרנספקציה של תאי COS-7 עם חיישן גלוטמין ונשא. החיישן מורכב מתורם FRET המוחדר לחלבון קושר גלוטמין חיידקי, ומקבל FRET בקצה ה-C של החלבון הקושר גלוטמין.
השלב השני הוא הקמת מערכת פרפוזיה ודימות של התאים בזמן אמת באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי הפוך. השלב הסופי הוא ניתוח התמונות והדמיה של דינמיקת הגלוטמין. בסופו של דבר, ניתן לזהות פעילות של נשאים בתא בודד באמצעות חיישני FRET אלו.
היתרון המרכזי של טכניקה זו על פני שיטות קיימות, כגון מדידה המבוססת על כרומטוגרפיה, הוא קבלת רזולוציה מרחבית-זמנית גבוהה בהרבה. טכניקה זו מורכבת משלושה חלקים: טרנספקציה של תאים עם חלבוני חיישן, דימוי בזמן אמת וניתוח לאחר הניסוי. בניסוי זה נעשה שימוש בתאי Seven בשל פעילות הובלת הגלוטמין האנדוגנית הנמוכה שלהם.
זריעת התאים תבוצע בצפיפות של כ-70% עד 80% ב-DMEM בתוספת 10% cosmic calf serum או CCS ו-100 units per milliliter של Penicillin streptomycin בצלחת זכוכית בעלת שמונה בארות. יש לדגור ב-37 °C, 5% CO2, ו-100% לחות למשך 24 שעות.
לאחר 24 שעות, החליפו את מצע הגידול ב-DMEM פלוס 10%CCS ללא אנטיביוטיקה וגדלו למשך הלילה ב-37 °C, 5%CO2 ו-100%לחות. ביום הטרנספקציה, הוסיפו 0.4 µg מכל אחד מה-plasma DNA המקודד עבור ה-glutamine sensor ועבור ה-tagged obligatory amino acid exchanger m cherry A SCT ל-50 µL של מצע נטול סרום.
הוסיפו 1 µL של ריאגנט טרנספקציה ל-50 µL של מצע ללא סרום, ערבבו בעדינות והדגירו (אינקובציה) בטמפרטורת החדר למשך חמש דקות. לאחר מכן, ערבבו את התמיסה המכילה את ה-DNA עם ריאגנט הטרנספקציה המדולל והדגירו בטמפרטורת החדר למשך 20 דקות. לאחר 20 דקות, הוסיפו בעדינות את תערובת ריאגנט הטרנספקציה מעל תאי ה-cost seven וערבבו בעדינות על ידי נעיRatings של התא.
דגרו למשך 24 שעות ב-37 °C, 5% CO2 ולחות של 100% לאחר 24 שעות. החליפו את המצע ל-DMEM בתוספת 10% CCS ו-100 units של penicillin streptomycin. החזירו את התאים לאינקובטור לפני תחילת הפרפוזיה.
הכינו את תמיסורי הפרפוזיה A עד F בהתאם למתכונים המופיעים בכתב העת המצורף. חברו ברזי סגירה למזרקים של 50 מיליליטר. סגרו את ברזי הסגירה ומלאו את המזרקים בתמיסורי הפרפוזיה.
פתחו את הברז למשך זמן קצר כדי למלא את חלל הראש בברז בתמיסת בופר. לאחר מכן, הפעילו את מערכת הפרפוזיה בכבידה בעלת שמונה ערוצים בעזרת עיפרון פרפוזיה ובחרו במצב ידני.
תחת אפשרות תפריט הבחירה, הניחו מיכל פסולת מתחת לעט הפרפוזיה. להצלחת ניסוי זה, חשוב להגדיר את הפרפוזיה באופן שימזער את הסחף ואת מעבר התמיסה.
הפעילו ידנית את הפתחים על ידי לחיצה על המספרים המתאימים ומלאו את הצינורות במים. באמצעות מזרק של 10 milliliter, סגרו את הפתחים, הניחו את המזרקים המכילים את תמיסות הבאפר A עד F בפתחים אחד עד שישה של מערכת הפרפוזיה, ופתחו את ברזי העצירה. לאחר מכן.
פתח שוב את הפתחים כדי להחליף את המים בתוך הצינוריות בתמיסות הבאפר. קצב הזרימה צריך להיות סביב 0.8 milliliters per minute. לחץ פעם אחת על cancel בבקר הפרפוזיה כדי לחזור לתפריט בחירת הפונקציות.
עברו לאפשרות עריכת התוכנית, ולאחר מכן הזינו את פרוטוקול הפרפוזיה המצוין בטבלה זו. שמרו את תוכנית הפרפוזיה. התאים מדויקים 48 עד 72 שעות לאחר הטרנספקציה.
שטפו את בארות התחתית הזכוכיתית פעמיים עם תמיפת פרפוזיה A, תוך הקפדה לא לשטוף את התאים. הניחו את התחתית הזכוכיתית על שולחנה של מיקרוסקופ הפלואורסצנציה. חברו את מערכת הפרפוזיה לתא.
במקרה של שימוש בתא פתוח, הגדירו משאבה נוספת שתסיר את תמיסת הפרפוזיה מהתא. פתחו את תוכנת הדימוג של ה-slide book. התחילו שקופית חדשה באמצעות פונקציית המיקוד, ואתרו תאים המבטאים את החיישן ואת A SCT two M cherry באמצעות סטים מתאימים של מסננים.
כווננו את ההגבר (gain) על ידי לחיצה על לשונית המצלמה והזזת סרגל הגרירה תחת gain. כמו כן, התאימו את הגדרת מסנן הצפיפות הניטרלית (neutral density filter) מתוך התפריט הנפתח של neutral density filter. לחצו על image capture, ולאחר מכן בחלון הרכישה (acquisition), הגדירו את המסננים שבהם תשתמשו.
הדימות יבוצע בשלושה ערוצים: עירור תור ופליטת תור, עירור מקבל ופליטת מקבל. לחצו על כפתור הבדיקה כדי להתאים את זמן החשיפה על ידי הקלדת זמן החשיפה הרצוי בתיבה שליד הגדרות המסנן; יש לחשוף את כל שלושת הערוצים למשך אותו פרק זמן.
סמנו אזור עניין (ROI) באמצעות כלי האזורים. בחרו ב-time-lapse בתיבת סוג הצילום. לאחר מכן, הגדירו את המרווח ואת נקודות הזמן עבור הניסוי.
בשלב הבא, סמנו אזור שאינו מכיל תאים פלואורסצנטיים כדי שישמש להפחתת רקע (background subtraction). לחצו קליק ימני על האזור שסומן והגדירו אותו כרקע. באופן אידיאלי, יש להשתמש בתאים שאינם מבטאים את החיישנים כאזור הרקע, כדי להביא בחשבון הן את האוטופלואורסצנציה והן את פלואורסצנציית הרקע שזוהתה על ידי המצלמה.
בחרו את התוכנית הרצויה תחת אפשרות select function run programs, עברו לתוכנית השמורה ולאחר מכן לחצו על enter בבקר הפרפוזיה. התוכנית טעונה כעת, ולחיצה על כל מקש תפעיל את הפרפוזיה כדי להבטיח שגם הפרפוזיה וגם ניסוי הדימות יתחילו בו-זמנית. לחצו על כפתור ה-start בחלון הלכידה בתוך לחיצה על מקש בבקר הפרפוזיה.
מוצגים כאן ניסויי מהלך זמן טיפוסיים באמצעות תאים המבטאים במשותף את הנשא s CT two וחיישני FRET לגלוטמין בעלי זיקה של 8 mM ו-100 µM. זרימה פנימה (Influx) של גלוטמין מזוהה על ידי שינוי ביחסי עוצמת הפלואורסצנציה בין התורם mtfp one למקבל Venus. מוצגת כמו כן זרימה פנימה של גלוטמין בנוכחות אלנין, המהווה סובסטרט.
ניתן לבחון את הספציפיות של נשאים גם באמצעות החיישנים. במקרה זה, תאים נטענו מראש ב-glutamine ולאחר מכן הוספו חומצות אמינו שונות לפרפוז החוץ-תאי. כשמונה סובסטראטים, כפי שצפינו, השרו זרימה של glutamine, בעוד שחומצות אמינו שאינן סובסטראטים לא עשו זאת.
היעדר שינויים ביעילות ה-FRET עם הוספת סובסטרט יכול לנבוע ממספר סיבות, כגון קיבולת ספיגה נמוכה של הסובסטרט הנבדק, כפי שניתן לראות בתאים המבטאים את החיישן של 8 millimolar או החיישן של 100 micromolar. אך אלו אינם מבטאים את הנשא sCT2 כדי לאשר שהשינוי ביעילות ה-FRET נובע מהשינוי בפועל בסובסטרט ולא משינוי בפרמטרים אחרים. אותו פרוטוקול פרפוזיה מבוצע תוך שימוש בתאים המבטאים חיישן שצפוי להיות רווי תחת התנאים הניסויים.
ובדוגמה זו, האפיניות של החיישן היא 1.5 micromolar. לאחר צפייה בסרטון זה, אמורה להיות לכם הבנה טובה של אופן הדמיית הדינמיקה של מטבוליטים באמצעות חיישני fret. אל תשכחו שיש לטפל בתרביות תאים כראוי בהתאם לנוהלי העבודה הסטנדרטיים כדי למזער את הסיכון לחשיפה.
צפו בתמליל המלא וקבלו גישה לאלפי סרטונים מדעיים
סקירה כללית
מאמר זה מדגים את השימוש ב-FRET למעקב אחר דינמיקת גלוטמין בתאים חיים. הוא דן בתכנון הניסויי, בפרטים הטכניים ובשיקולים לניתוחים לאחר הניסוי תוך שימוש בחיישני גלוטמין מקודדים גנטית.
מרכיבי מפתח של המחקר
תחום המדע
- מדעי המוח
- ביולוגיה של התא
- ביופיזיקה
רקע
- גלוטמין היא חומצת אמינו חיונית המעורבת בתהליכים מטבוליים שונים.
- ניטור דינמיקת הגלוטמין יכול לספק תובנות לגבי מטבוליזם תאי.
- חיישני FRET מאפשרים דימיוג בזמן אמת של מולקולות ביולוגיות.
- חיישנים מקודדים גנטית מאפשרים רזולוציה סוב-צלולית בתאים חיים.
מטרת המחקר
- להדמיית הובלת גלוטמין בתאים חיים.
- לניצול חיישני FRET למעקב אחר פעילות נשאיים.
- לניתוח דינמיקת גלוטמין ברמת התא הבודד.
שיטות שנעשה בהן שימוש
- טרנספקציית תאים עם חיישן גלוטמין ונשא.
- הקמת מערכת פרפוזיה לדימות בזמן אמת.
- שימוש במיקרוסקופ פלואורסצנטי הפוך לצורך דימות.
- ניתוח תמונות להדמיית דינמיקה של גלוטמין.
תוצאות עיקריות
- דימוג מוצלח של הובלת גלוטמין בתאים חיים.
- זיהוי פעילות נשאיים באמצעות חיישני FRET.
- השגת ניטור בזמן אמת של דינמיקת גלוטמין.
- מתן תובנות לגבי חילוף חומרים תאי על ידי המחקר.
מסקנות
- חיישני FRET יעילים לניטור דינמיקה של גלוטמין.
- המתודולוגיה מאפשרת ניתוח מפורט של פעילות נשאי חומרים.
- גישה זו יכולה לשפר את ההבנה של תהליכים מטבוליים בתאים חיים.
שאלות נפוצות
רלוונטיות תעשייתית למנהלים
דימות בזמן אמת של הובלת מטבוליטים באמצעות חיישני FRET מקודדים גנטית מאפשר בחינה מדויקת של קינטיקת הנשאים וספציפיות של הסובסטרט ברזולוציה של תא בודד. גישה זו תומכת בתיקוף מטרות על ידי אספקת קריאות כמותיות ודינמיות של פעילות הנשאים בתאים חיים, ובכך מפחיתה עמימות מכניסטית בשלבי הגילוי המוקדמים. השיטה משפרת את הביטחון החזוי בזיהוי מובילים (leads) על ידי קישור תפקודי הנשא למצבים מטבוליים תאיים הרלוונטיים למודלים של מחלות.
יישומים אסטרטגיים במחקר ופיתוח בביופארמה
גילוי מוקדם ותיקוף מטרה
- ערך מדעי: מאפשר תצפית ישירה על פעילות נשאי גלוטמין, ובכך תומך בתיקוף פונקציונלי של נשאי מומסים כמטרות טיפוליות.
- ערך תפעולי: מספק נתונים בזמן אמת ברזולוציה סוב-סלולרית, המבהירים את קינטיקת הנשא ואת הספציפיות לסובסטרט, ללא צורך בליסיס של תאים או במבחני נקודת סוף.
- ערך ניבוי: מסייע בהפחתת סיכונים מכניסטיים על ידי אישור זרימה המתווכת על ידי נשאים תחת תנאי סובסטרט מוגדרים, ובכך משפר את הביטחון בהיפותזות הנוגעות למעורבות המטרה (target engagement).
סריקה ופיתוח בדיקה
- ערך מדעי: יוצר שינויים כמותיים ביחסי פלואורסצנציה המשמשים כקריאות בזמן אמת עבור הערכת תפקוד נשאים במערכי בדיקה של תאים חיים.
- ערך תפעולי: מאפשר ניטור סטנדרטי וניתן לשחזור של פעילות נשאים תחת תנאי פרפוזיה, ובכך תומך ביכולת הרחבה של הבדיקה לצורך סריקת תרכובות.
- מוכנות לסריקה: מאפשר זיהוי של שטפי זרימה ספציפיים לסובסטרט ופרופילי עיכוב, ובכך מכין את המערכת להערכת השפעות של מודולטורים על פעילות הנשאים.
מחקר תרגומי ופרה-קליני
- המשכיות תרגומית: תומך בניתוח הרלוונטי למחלה על ידי אפשור חקירה ספציפית לסוג התא של הובלת גלוטמין במודלים המבטאים נשאי חלבון רלוונטיים.
- הלימה פרה-קלינית: מספק מדדים מטבוליים דינמיים שיכולים להתואם לתוצאות פנוטיפיות, ובכך תומך בהחלטות קידום מותאמות סיכון.
- תובנה מכניסטית: מסייע להבחין בין השפעות ספציפיות לנשאי חלבון לבין שינויים מטבוליים שאינם במטרה (off-target), ובכך מגביר את הביטחון במטרה במהלך תיקוף פרה-קליני.
שילוב תהליכי עבודה וצנרת עיבוד
השיטה משתלבת בתהליכי עבודה של גילוי מוקדם על ידי מתן אפשרות להערכה פונקציונלית בזמן אמת של נשאי חומרים (transporters) לאחר זיהוי המטרה, ובכך היא מספקת מידע לאופטימיזציה של מולקולות מובילות (lead optimization) באמצעות פרופיל פעילות דינמי.
- ביולוגיה של גילוי: תומך בבדיקת היפותזות על תפקוד נשאים באמצעות ויזואליזציה של זרימת substrat בתאים חיים, ובכך מבהיר את התפקיד הביולוגי במסלולים מטבוליים.
- סריקה: מספק פלטים כמותיים בזמן אמת המתאימים להערכת השפעות של תרכובות על קינטיקה וספציפיות של נשאים בפורמט מבוסס פרפוזיה.
- אנליטיקה: מייצר מדידות פלואורסצנציה רציומטריות המאפשרות השוואה של פעילות הנשאים בין תנאים שונים, מה שמאפשר מיון נתונים מבוסס-נתונים.
- מחקר תרגומי: מקשר לרציפות פרה-קלינית על ידי אספקת נתוני זרימת מטבוליטים בהקשרים תאיים רלוונטיים למחלה, ותמיכה במחקרים מכניסטיים המותאמים לסממנים ביולוגיים.
- שימוש חוזר ארגוני: מבסס פלטפורמת דימוג רב-פעמית לניטור דינמיקה של נשאי חומצות אמינו על פני מספר יעדים וקווי תאים.
השפעה תפעולית וארגונית
- ערך מדעי: מגביר את הביטחון החזוי בתיקוף המטרה על ידי הפחתת אי-הוודאות במנגנון הנשא ובספציפיות של הסובסטרט.
- ערך תפעולי: משפר את השחזוריות והסטנדרטיזציה של בדיקות נשאי חומרים באמצעות פרפוזיה מבוקרת ודימוי בזמן אמת.
- ערך אסטרטגי: משפר את קבלת החלטות ה-go/no-go על ידי אספקת נתונים פונקציונליים ודינמיים המפחיתים את הסיכון בבחירת המטרה בשלב מוקדם של תהליך הפיתוח.
- השפעה על הפורטפוליו: מאפשר תעדוף של מטרות נשאי חומרים מותאם סיכון, בהתבסס על פרופילי פעילות כמותיים ומתוחקים בתאים חיים.
שיקולי יישום
- דורש מומחיות בשיבוט מולקולרי, דימוי תאים חיים וגילוי אותים מבוסס FRET.
- תלוי בגישה למיקרוסקופ פלואורסצנציה הפוך עם מערכות מסננים עבור עירור ופליטה של תורם/מקבל, ומערכת פרפוזיה להחלפת תמיסות.
- מחייב סטנדרטיזציה של יעילות הטרנספקציה, רמות ביטוי של החיישן וחיסור רקע לאורך הניסויים.
- כולל שיקולי התאמה עבור זוגות שונים של נשא-חיישן, כולל התאמת זיקה ותיקוף ביטוי.
- מוגבל על ידי הטווח הדינמי של החיישן ואפקטים פוטנציאליים של רוויה, אשר יש לאפיין לצורך כימות מדויק של השטף.
