Name: גלוטמין שטף הדמיה באמצעות חיישני מקודדים גנטיים (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-07-31T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 23 s
Description: למד הדמיה של דינמיקת גלוטמין בתאים חיים באמצעות חיישני FRET מקודדים גנטית. שיטה זו מאפשרת ניטור בזמן אמת של פעילות נשאים ומספקת רזולוציה מרחבית-זמנית גבוהה לחקר מטבוליזם תאי.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

עבודה זו נתמכה על ידי מענק NIH 1R21NS064412, NSF מענק 1,052,048 וJeffress זיכרון אמון מענק J-908.

1. לדוגמא הכנה הערה: במקרים רבים ניסויי זלוף לשטוף את חלק משמעותי של תאים, מה שיכול להיות בעיה מתסכלת. אמנם לא הכרחי עבור כל שורות תאים, משטחי זכוכית כיסוי ציפוי עם פולי-L-ליזין (להוסיף 1.0 ml/25 2 סנטימטר של פתרון 0.01% על פני השטח, דגירה&gt; 5 דקות, לשטוף פעמיים עם מים כיתה תרבית תאים, ויבשים ב ארון הבטיחות הביולוגי) משפר את הידבקות תא. כמו כן, להיות מודע לרמת הבטיחות הביולוגית (מנהלת הליגה) של הקו הסלולרי בשימוש, ופעל על פי נוהל העבודה הרגיל שאושר על ידי משרד בריאות ובטיחות הסביבתי המקומי. בניסוי זה, תאי cos7 שימשו עקב פעילות תחבורת גלוטמין אנדוגני נמוכה (ראה איור 4). <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תאי הזרע cos7 ב ~ confluency 70-80% בנשר בינוני השתנה Dulbecco (DMEM) + 10% נסיוב עגל קוסמי ו100 U / ml פניצילין / סטרפטומיצין, או על coverslips זכוכית סטרילית 25 מ&quot;מ מונח בתרבות 6 היטבצלחת או שקופיות זכוכית תחתונה 8 היטב. לדגור על 37 מעלות צלזיוס, 5% CO 2, לחות 100% ל24 שעות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להחליף את מצע הגידול לDMEM +10% בסרום קוסמי עגל (ללא אנטיביוטיקה), על פי הפרוטוקול של היצרן. לגדול O / N ב 37 מעלות צלזיוס, 5% CO 2 בלחות 100%. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוספת 0.4 מ&quot;ג כל אחת של ה-DNA פלסמיד קידוד חיישן גלוטמין (pcDNA3.1, נשא חיישן FLIPQTV3.0 תחת CMV אמרגן 10) וASCT2 mCherry מתויג 10-50 סרום ללא מדיה מיליליטר (Opti-ממ) ומערבבים בעדינות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 1 מיליליטר של מגיב transfection 50 מיליליטר סרום ללא מדיה. לדגור על RT במשך 5 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מערבבים את שני פתרונות המכילים DNA (שלב 1.3) ומגיב transfection (שלב 1.4) ו דגירה עבור 20 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעדינות להוסיף את מגיב transfection על גבי התאים ומערבבים בעדינות על ידי נדנדה הקאמרית. דגירה של 24 שעות על 37 מעלות צלזיוס, 5% CO 2, לחות 100%. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר 24 שעות, להחליף הבינוני עד DMEM + 10% עגל סרום קוסמישל פניצילין / סטרפטומיצין (CCS) + 100 יחידה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תאים הם צילמו 48-72 לאחר transfection שעה. </li></ol> 2. ניסוי זלוף הערה: לתאי cos7 השתמשו בניסוי זה, תקשורת זלוף והקאמרי הוחזקו על RT וסביבת CO 2 ריכוז. עם זאת, יש להשתמש אם התאים בשימוש דורשים טמפרטורה גבוהה יותר ו-CO 2 שליטת ריכוז להישרדות, במה מיקרוסקופ מחוממת ו / או תא סביבתי. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן AF חיץ זלוף (ראה רשימה של חומרים). צרף ברזים למיניהם ל50 מיליליטר מזרקים, לסגור את הברזים למינים ולאחר מכן למלא אותם עם פתרונות זלוף. פתח את ברזלים לתקופה קצרה כדי למלא את החלל בראש בברזלים עם למאגר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לעבור על 8 ערוצים, מערכת זלוף הכבידה להאכיל עם עיפרון זלוף, ולאחר מכן בחר באפשרות &quot;מצב ידני&quot; תחת אפשרות בחירת פונקציה. הנח מיכל פסולת בעיפרון זלוף. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> באופן ידנילהפעיל את הנמלים על ידי לחיצה על המספרים המתאימים ולמלא את tubings באמצעות 10 מזרק מיליליטר המכיל מים, ולאחר מכן לסגור את הנמל. ברגע שהיציאות מלאות במים, לקבוע את המזרקים המכילים מאגרי AF ביציאה 1-6 של מערכת זלוף, ולאחר מכן פתח את הברזים למיניהם. לפתוח את היציאות שוב כדי להחליף את המים בצינורות עם החוצצים. קצב הזרימה צריך להיות סביב 0.8 מיליליטר / דקה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחץ על ביטול פעם אחת בבקר זלוף לחזור לתפריט &quot;בחר פונקציה&quot;. לעבור לאפשרות &quot;תכנית ערוך&quot;, ולאחר מכן להקליד את פרוטוקול זלוף מפורט בטבלה 1. שמרו את תכנית זלוף. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קח את התאים מחוץ לחממה. שטוף פעמיים עם חיץ זלוף, ולאחר מכן קבע את התאים על הבמה. חבר את מערכת זלוף לתא. אם נעשה שימוש בתא פתוח, הוקם משאבה נוספת שמסירה את פתרון זלוף מהחדר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פתח את תוכנת Slidebook. התחל שקופית חדשה. הערה:ההליך הבא הוא ספציפי לתוכנת Slidebook, אלא גם תוכנות אחרות כגון MetaFluor וNis-Element יכולות לשמש לסוג של הדמיה שתוארה כאן. באופן תיאורטי ניתן לבצע ניסויים באמצעות כל תוכנה המאפשרת הדמיה בזמן כמובן, וניתן לנתח רצפי התמונה שלאחר ניסוי באמצעות תוכנה כגון ImageJ (http://rsbweb.nih.gov/ij/) או פיג&#39;י (http:/ / Fiji.sc / פיג&#39;י). עם זאת, תוכנה המאפשרת ניטור של יחס acceptor / תורם בזמן אמת היא שימושית מאוד. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הר השקופיות על הבמה מיקרוסקופ פלואורסצנטי. מצא תאי שיתוף מבטא את החיישן וASCT-mCherry באמצעות מערכות סינון מתאימות (ראה רשימה של חומרים) תחת פונקצית &quot;פוקוס&quot;. התאם רווח על ידי לחיצה על לשונית &quot;מצלמה&quot; ומחליק את פס השקף תחת &quot;רווח&quot;. כמו כן, להתאים את הגדרת מסנן צפיפות הניטרלית מתפריט הנפתח מסנן צפיפות ניטראלי. הערה: אם קוביית המסנן אינה כוללת מסנן עין, אין להשתמש בחלקי העין מאז שוראור עירור T-גל מזיק לעיניים. השתמש במסך המחשב כדי למצוא את התאים במקום. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לרכוש תמונות של תאים with donor ( mTFP1) ex donor(mTFP1) em , donor ( mTFP1) ex acceptor(venus) em and acceptor ( mTFP1) ex acceptor(venus) em m channels (מסננים שצוינו ברשימה של חומרים). לחץ על &quot;לכידת תמונה&quot;, ולאחר מכן בחלון הרכישה, לציין את המסננים שהולכים להיות בשימוש. לחץ על לחצן &quot;בדיקה&quot; כדי להתאים את זמן חשיפה על ידי הקלדת זמן חשיפה הרצויה בתיבה ליד הגדרות מסננים. הערה: כל שלושה הערוצים צריכים להיות חשופים לאותו האורך. בעת כוונון הפרמטרים ההדמיה, לקחת את שינוי סריג יעילות הצפוי ולקפל להגדיל בחשבון: לדוגמא, אם את יעילות סריג צפויה לעלות פי 2 במהלך הניסוי, צריכים להיות מותאמים פרמטרים הדמיהכך שעוצמתם Acceptor לשעבר תורם במצב המנוחה צריכה להיות &lt;50% מהערך המקסימאלי שניתן להקליט על ידי המכשיר, כך שהערוץ שאינו הופך להיות רווי במהלך הניסוי. אות מהתאים שכותרתו צריכה להיות לפחות גבוהה יותר פי שלוש מזה שבאזור הרקע. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צייר אזור של עניין באמצעות כלי אזורים בתוכנה. לחלופין, ניתן להשתמש בתוכנת פונקציה כדי לבחור פיקסלים מעל עוצמה מסוימת, ולאחר מכן הוסבה לאזורים. כדי לעשות זאת, לחץ על מסיכה - מגזרי, ואז להעביר את סרגל הגלילה כדי להדגיש את האזורים הרצויים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בחר באפשרות &quot;זמן לשגות&quot; בתיבת הסוג ללכוד, ולאחר מכן לציין את המרווח (10 שניות בניסוי הזה) ונקודות זמן לניסוי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צייר אזור באזור ללא כל תאי ניאון. אזור זה משמש לחיסור רקע. לחץ לחיצה ימנית באזור נמשך, ולאחר מכן להגדיר אותו כרקע. הערה: באופן אידיאלי, תאים שאיןיש להשתמש לא מבטאים את החיישנים כמו זו של אזור הרקע לחשבון עבור שני autofluorescence ותפרחת הרקע זוהתה על ידי המצלמה. אם אין תאים כאלה זמינים בשדה ראיה, יש להשתמש לפחות באזור ללא תאים כדי להסביר את הקרינה הרקע. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בחר את התכנית הרצויה תחת &quot;בחר פונקציה - הפעלת תוכניות&quot; אפשרות. לעבור לתכנית הצילה (ראה שלב 2.3), ולאחר מכן פגע ENTER בבקר זלוף. עכשיו התכנית נטענת, ולהכות על מקש כלשהו יפעיל את זלוף. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ודא זלוף וניסוי ההדמיה להתחיל באותו הזמן על ידי לחיצה על כפתור &quot;התחל&quot; בחלון הלכידה באותו הזמן כמו לחיצה על מקש בבקר זלוף. הערה: מומלץ להקליט timepoint בי הפתרונות הוחלפו (זה יכול להיעשות באמצעות &quot;אורים&quot; פונקציה, נמצאים בתוך כרטיסיית הרכישה). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לבצע את אותה USI פרוטוקול זלוףng תאים לבטא חיישן שצפוי להיות או רווי או לא מאוגד תחת תנאי הניסוי. הערה: כאן, FLIPQTV3.0_1.5μ, שהוא רווי בתנאי הניסוי, משמש כביקורת, איור 6 ניסויי שליטה כזו נחוצים כדי לוודא ששינוי סריג יעילות הוא כתוצאה מהשינוי בפועל במצע ולא. כתוצאה מהשינוי בפרמטרים אחרים כגון pH הסלולרי. </li></ol> 3. ניתוח שלאחר ניסוי <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בדוק אם להיסחף מדגם אירע במהלך הניסוי. צייר אזורים של העניין (ROI) זה על התמונה שצולמה בtimepoint 0, ולאחר מכן להעביר את סרגל הגלילה בחלק העליון של חלון ההדמיה ולבדוק אם התאים נפולת של ROIs בתמונות שצולמו מאוחר יותר בניסוי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אם כן, אז להשתמש בפונקצית המעקב כדי לתקן את הסחף על ידי ראשון, יצירת מסכות סביב התאים על ידי בחירת מסכה - מגזרי, ולאחר מכן להחליק את השורה שמציינת את הפסקת לגדולותhlight האזורים המכילים תאים. עקוב אחר האזורים על ידי לחיצה מסכה - מעקב אחר חלקיקים - מעקב אחר חלקיקי יסוד. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מחדש לצייר ROIs ואזור רקע בעת צורך. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לייצא את העצמה הממוצעת של ROIs במהלך הניסוי. לחץ סטטיסטיקה - יצוא - נתוני היחס / timelapse. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כאשר סריג יעילות וכימות של ריכוז מצע אינה הכרחיים, עלילה כמובן יחס העצמה (Acceptor לשעבר תורם, / em התורם לשעבר תורם) כשלוח של הדינמיקה של המצע הזמן. כדי לקבוע את ריכוז cytosolic, לחשב את מקסימלי ומינימאלי שינוי יחס (כלומר, שבירווה והעדר המצע, בהתאמה), Δr מקסימום - דקות Δr, על ידי רגרסיה לא לינארית של Δratio (Δr) עם המשוואה הבאה: x Δr = [S] / (d + K [S]) (Δr <sub&gt; מקסימום - דקות Δr) + Δr דקות שבו [S] הוא ריכוז המצע בcytosol. שימוש Δr מקסימום - ערכי Δr דקות הושגו, הרוויה (S) של החיישן בΔr נתון מחושב כ S = (Δr - Δr דקות) / (Δr מקסימום - דקות Δr) S נוסף ניתן להמיר את ריכוז המצע [S] באמצעות המשוואה הבאה: S = [S] / (d + K [S]) הערה: עוצמת ערוץ em Acceptor לשעבר Acceptor צריכה להיות גם זמם לבחון אם תנאי הניסוי השפיעו על הקרינה של acceptor ישירות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כאשר להיסחף בסיסי בשל צילום הלבנה הוא ציין, לבצע תיקון בסיס. כדי לעשות זאת, עלילה העוצמות של תורם acceptor לאורך זמן (איור 5 א). ואז לזהות את הנקודות הזמן משמש להבסיס דואר, על פי העיכוב במערכת זלוף ופעילות ההובלה של תא המסוים (איור 5). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חישוב הולם polynominal שמגדירה את נקודת ההתחלה. לאחר מכן, לנרמל את עוצמת הגלם מtimepoint לבסיס (איור 5 ג). לחשב את יחס העצמה (Acceptor לשעבר תורם, / em התורם לשעבר תורם) מעוצמות תורם acceptor המנורמלת. </li></ol>

<ol><li>Haussinger, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+hepatic+ammonia+metabolism%3A+the+intercellular+glutamine+cycle%5BTitle%5D)+AND+%22Adv+Enzyme+Regul%22%5BJournal%5D)">Regulation of hepatic ammonia metabolism: the intercellular glutamine cycle.</a> Adv Enzyme Regul. 25, 159-180 (1986).</li>
<li>Haussinger, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hepatic+glutamine+metabolism%5BTitle%5D)+AND+%22Beitr+Infusionther+Klin+Ernahr%22%5BJournal%5D)">Hepatic glutamine metabolism.</a> Beitr Infusionther Klin Ernahr. 17, 144-157 (1987).</li>
<li>Watford, M., Chellaraj, V., Ismat, A., Brown, P., Raman, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hepatic+glutamine+metabolism%5BTitle%5D)+AND+%22Nutrition%22%5BJournal%5D)">Hepatic glutamine metabolism.</a> Nutrition. 18, 301-303 (2002).</li>
<li>Mustroph, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Profiling+translatomes+of+discrete+cell+populations+resolves+altered+cellular+priorities+during+hypoxia+in+Arabidopsis%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+USA%22%5BJournal%5D)">Profiling translatomes of discrete cell populations resolves altered cellular priorities during hypoxia in Arabidopsis.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 106, 18843-18848 (2009).</li>
<li>Sasagawa, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quartz-Seq%3A+a+highly+reproducible+and+sensitive+single-cell+RNA+sequencing+method%2C+reveals+non-genetic+gene-expression+heterogeneity%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Biol%22%5BJournal%5D)">Quartz-Seq: a highly reproducible and sensitive single-cell RNA sequencing method, reveals non-genetic gene-expression heterogeneity.</a> Genome Biol. 14, R31(2013).</li>
<li>Sabatini, B. L., Oertner, T. G., Svoboda, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+life+cycle+of+Ca%282%2B%29+ions+in+dendritic+spines%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">The life cycle of Ca(2+) ions in dendritic spines.</a> Neuron. 33, 439-452 (2002).</li>
<li>Okumoto, S., Jones, A., Frommer, W. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+imaging+with+fluorescent+biosensors%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Plant+Biol%22%5BJournal%5D)">Quantitative imaging with fluorescent biosensors.</a> Annu Rev Plant Biol. 63, 663-706 (2012).</li>
<li>Newman, R. H., Fosbrink, M. D., Zhang, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetically+encodable+fluorescent+biosensors+for+tracking+signaling+dynamics+in+living+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Chemical+reviews%22%5BJournal%5D)">Genetically encodable fluorescent biosensors for tracking signaling dynamics in living cells.</a> Chemical reviews. , 111-3666 (2011).</li>
<li>Okumoto, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+approach+for+monitoring+cellular+metabolites+and+ions+using+genetically+encoded+biosensors%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Biotech%22%5BJournal%5D)">Imaging approach for monitoring cellular metabolites and ions using genetically encoded biosensors.</a> Curr Opin Biotech. 21, 45-54 (2010).</li>
<li>Gruenwald, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visualization+of+glutamine+transporter+activities+in+living+cells+using+genetically+encoded+glutamine+sensors%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Visualization of glutamine transporter activities in living cells using genetically encoded glutamine sensors.</a> PLoS One. 7, e38591(2012).</li>
<li>Chaudhuri, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protonophore-+and+pH-insensitive+glucose+and+sucrose+accumulation+detected+by+FRET+nanosensors+in+Arabidopsis+root+tips%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Journal%22%5BJournal%5D)">Protonophore- and pH-insensitive glucose and sucrose accumulation detected by FRET nanosensors in Arabidopsis root tips.</a> Plant Journal. 56, 948-962 (2008).</li>
<li>Chen, T. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ultrasensitive+fluorescent+proteins+for+imaging+neuronal+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Ultrasensitive fluorescent proteins for imaging neuronal activity.</a> Nature. 499, 295-300 (2013).</li>
<li>Jiang, D. W., Zhao, L. L., Clapham, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome-Wide+RNAi+Screen+Identifies+Letm1+as+a+Mitochondrial+Ca2%2B%2FH%2B+Antiporter%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Genome-Wide RNAi Screen Identifies Letm1 as a Mitochondrial Ca2+/H+ Antiporter.</a> Science. , 326-147 (2009).</li>
<li>Barnett, N. L., Pow, D. V., Robinson, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inhibition+of+Muller+cell+glutamine+synthetase+rapidly+impairs+the+retinal+response+to+light%5BTitle%5D)+AND+%22Glia%22%5BJournal%5D)">Inhibition of Muller cell glutamine synthetase rapidly impairs the retinal response to light.</a> Glia. 30, 64-73 (2000).</li>
<li>Rothstein, J. D., Tabakoff, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Alteration+of+Striatal+Glutamate+Release+after+Glutamine-Synthetase+Inhibition%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurochem%22%5BJournal%5D)">Alteration of Striatal Glutamate Release after Glutamine-Synthetase Inhibition.</a> J Neurochem. 43, 1438-1446 (1984).</li>
<li>Gu, S., Villegas, C. J., Jiang, J. X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+regulation+of+amino+acid+transporter+SNAT3+by+insulin+in+hepatocytes%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Differential regulation of amino acid transporter SNAT3 by insulin in hepatocytes.</a> J Biol Chem. 280, 26055-26062 (2005).</li>
<li>Palmada, M., Speil, A., Jeyaraj, S., Bohmer, C., Lang, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+serine%2Fthreonine+kinases+SGK1%2C+3+and+PKB+stimulate+the+amino+acid+transporter+ASCT2%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem+Bioph+Res+Co%22%5BJournal%5D)">The serine/threonine kinases SGK1, 3 and PKB stimulate the amino acid transporter ASCT2.</a> Biochem Bioph Res Co. 331, 272-277 (2005).</li>
<li>Bröer, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+astroglial+ASCT2+amino+acid+transporter+as+a+mediator+of+glutamine+efflux%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurochem%22%5BJournal%5D)">The astroglial ASCT2 amino acid transporter as a mediator of glutamine efflux.</a> J Neurochem. 73, 2184-2194 (1999).</li>
<li>Wallace, D. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-spike+detection+in+vitro+and+in+vivo+with+a+genetic+Ca2%2B+sensor%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Single-spike detection in vitro and in vivo with a genetic Ca2+ sensor.</a> Nature. 5, 797-804 (2008).</li>
<li>Haugh, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Live-cell+fluorescence+microscopy+with+molecular+biosensors%3A+what+are+we+really+measuring%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys+J%22%5BJournal%5D)">Live-cell fluorescence microscopy with molecular biosensors: what are we really measuring.</a> Biophys J. 102, 2003-2011 (2012).</li>
<li>San Martin, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+genetically+encoded+FRET+lactate+sensor+and+its+use+to+detect+the+Warburg+effect+in+single+cancer+cells%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">A genetically encoded FRET lactate sensor and its use to detect the Warburg effect in single cancer cells.</a> PLoS One. 8, e57712(2013).</li>
<li>Palmer, A. E., Tsien, R. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measuring+calcium+signaling+using+genetically+targetable+fluorescent+indicators%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Measuring calcium signaling using genetically targetable fluorescent indicators.</a> Nat Protoc. 1, 1057-1065 (2006).</li>
<li>Ponsioen, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detecting+cAMP-induced+Epac+activation+by+fluorescence+resonance+energy+transfer%3A+Epac+as+a+novel+cAMP+indicator%5BTitle%5D)+AND+%22Embo+Rep%22%5BJournal%5D)">Detecting cAMP-induced Epac activation by fluorescence resonance energy transfer: Epac as a novel cAMP indicator.</a> Embo Rep. 5, 1176-1180 (2004).</li>
<li>Joseph, J., Seervi, M., Sobhan, P. K., Retnabai, S. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High+throughput+ratio+imaging+to+profile+caspase+activity%3A+potential+application+in+multiparameter+high+content+apoptosis+analysis+and+drug+screening%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">High throughput ratio imaging to profile caspase activity: potential application in multiparameter high content apoptosis analysis and drug screening.</a> PLoS One. 6, e20114(2011).</li>
<li>Jiang, D., Zhao, L., Clapham, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome-wide+RNAi+screen+identifies+Letm1+as+a+mitochondrial+Ca2%2B%2FH%2B+antiporter%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Genome-wide RNAi screen identifies Letm1 as a mitochondrial Ca2+/H+ antiporter.</a> Science. 326, 144-147 (2009).</li>
<li>Ma, H., Gibson, E. A., Dittmer, P. J., Jimenez, R., Palmer, A. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-throughput+examination+of+fluorescence+resonance+energy+transfer-detected+metal-ion+response+in+mammalian+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Am+Chem+Soc%22%5BJournal%5D)">High-throughput examination of fluorescence resonance energy transfer-detected metal-ion response in mammalian cells.</a> J Am Chem Soc. 134, 2488-2491 (2012).</li>
</ol>

אין מה לחשוף.

ההצלחה של ניסויי הדמיה תלויה בגורמים קריטיים כמה. אחד הגורמים הללו הוא הזיקה של חיישנים המשמשת, כפי שפורט לעיל. ריכוז מוחלט של המצע בתא subcellular של עניין, עם זאת, הוא לעתים קרובות לא ידוע. לכן אנו ממליצים לנסות חיישנים מרובים עם זיקות מעד למצוא אחד שפועל תחת תנאי ניסוי הרצויים הטוב ביותר. לדוגמא, במקרה שלנו אנחנו transfected תאי cos7 עם חיישני גלוטמין עם 1.5μ, 100μ, 2 מ &#39;, ו8m (איור 3 ומידע לא מוצגים). <p class="jove_content" style=";text-align:right;di...

בשל התקדמות מרשימה בטכנולוגיות המאפשרת בדיקה של transcriptome וproteome ברמה תאית, זה הפך כעת ברור כי ביוכימיה והשטף של מטבוליטים ויונים וכתוצאה מכך הם מאוד תאים מסוג ספציפי. לדוגמא, בכבד של היונקים, השפלה גלוטמין רציפה וסינתזה מתבצעות בו זמנית על ידי תאי periportal ותאי perivenous בהתאמה, האכלת אמוניום למעגל האוריאה בסוג התא לשעבר תוך צריכת אמוניה עודפת ב1-3 האחרון. במקרים מסוימים, את ההטרוגניות ביוכימיים משמעותית הוא זוהה גם ב&quot; סוג תא &quot;יחיד 4, 5. בנוסף לסגולי מרחבית כגון, הרמות תאיות של מטבוליטים ויונים הן מאוד דינמיות (למשל, מולקולות איתות כגון Ca 2 + ונוקלאוטידים מחזוריים). דפוסי spatiotemporal של מטבוליטים ויונים לעתים קרובות משחקים תפקיד קריטי בהעברת אותות. Monitoring דינמיקה הסלולר של מטבוליטים ויונים, לעומת זאת, מהווה אתגר ייחודי. במקרים רבים השינוי בריכוזים הם מהירים וחולפים, שהודגם על ידי המקרה של מולקולות איתות כגון Ca 2 +, אשר דועך בתוך ~ 20 אלפיות שניים בקוצים הדנדריטים 6. בנוסף, מידור של מסלולים ביוכימיים בתוך ובין התאים עושה את זה קשה לכמת את הדינמיקה של מטבוליטים ויונים באמצעות מיצוי וכרומטוגרפיה עמודה / טכניקות ספקטרומטריית מסה. חיישני מקודד גנטי למולקולות ביולוגיות המשמשים כיום באופן נרחב בשל הרזולוציה spatiotemporal הגבוהה המאפשרת הנסיין ללמוד דינמיקה קצרת מועד ו / או ממודרת מולקולרית (הנסקרת ב 7, 8). בערך ניתן לחלק את חיישני מקודדים גנטי אלה לשתי קטגוריות; חיישנים מבוססי עוצמה וחיישני ratiometic. חיישנים מבוססי עוצמה בדרך כלל מורכבים של תחום מחייב ושפעתחלבון orescent (FPS), והמומס מחייב לתחום המחייב משנים את עוצמת הניאון. חיישני Ratiometic, לעומת זאת, מנצלים לעתים קרובות העברת פוסטר התהודה אנרגיה (סריג) בין שני FPS המתפקדים כזוג סריג. חיישנים אלה כוללים תחום מחייב ושתי תמונות בשניה, והמומס המחייב גורם שינוי בסריג יעילות בין שתי תמונות בשניה. מספר גדול של חיישנים למטבוליטים ויונים חשובים מבחינה ביולוגית פותחו בעשור האחרון 8, 9. אחת האפשרות מרגשת המוצע על ידי חיישני מקודדים גנטי כזה הוא השימוש שלהם בניתוח ברזולוציה הגבוהה של תהליכי הובלת קרום, שלא היה קל בעבר כדי לזהות ברמה התאית. חיישני מקודדים גנטי להקל על הניתוח של מנגנוני הובלה כגון סגוליות מצע וpH תלות 10, 11. יתר על כן, בשילוב עם מיל הגנטיources כגון הספרייה של RNAi בונה לאורגניזמים מודל, ניתן כיום לבצע חיפושי הגנום לתהליכי הובלת רומן באמצעות חיישנים מקודדים גנטי. ואכן, שימוש בעופרת חיישן מקודד גנטי לגילוי של מובילי uncharacterized בעבר במקרים רבים 12, 13. לאחרונה, המעבדה שלנו פיתחה סדרה של חיישן מבוסס סריג לגלוטמין. אנחנו הוכיחו כי רמות גלוטמין הסלולרי ניתן דמיינו באמצעות חיישני גלוטמין סריג כזה 10. חיישנים אלה כוללים תורם סריג (mTFP1) מוכנס לתוך חלבון גלוטמין מחייב חיידקי glnH, וacceptor סריג (ונוס) בC-Termini של glnH (איור 1). סריג יעילות של חיישנים אלה להקטין על הכריכה של גלוטמין, וכתוצאה מכך הירידה של יחס עוצמת acceptor / תורם. ויסות עדינה של תהליכי הובלת גלוטמין היא חשובה בתהליכים ביולוגיים כגון neurotransm14 ission, 15 והתחזוקה של מחזור אוריאה בכבד 1, 16, 17. כאן אנו מראים את המתודולוגיה של ניתוח פעילות תחבורה עם חיישני סריג לגלוטמין, באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי רחב בתחום ההגדרה. המטרה של ניסויים המוצגים כאן הן לזהות פעילויות טרנספורטר בתא בודד ולבחון את הספציפיות מצע של טרנספורטר הביע transiently.

<table><tbody><tr><td>מיקרוסקופ פלואורסצנטי הפוך</td><td>אולימפוס</td><td>IX81F-3-5</td><td>מיקרוסקופ פלואורסצנטי הפוך שווה ערך מספקים אחרים יתאים גם</td></tr> הוא.<tr><td>מסנן עירור (mTFP1)</td><td>אומגה אופטי</td><td>3RD450-460</td><td>רוחב פס 450-460 ננומטר</td></tr><tr><td>מסנן עירור (נוגה)</td><td>Chroma</td><td>ET500/20</td><td>רוחב פס 490-510 ננומטר</td></tr><tr><td>מסנן פליטה (mTFP1)</td><td>Chroma</td><td>HQ495/30m</td><td>רוחב פס 475-505 ננומטר</td></tr><tr><td>מסנן פליטה (נוגה)</td><td>Chroma</td><td>ET535/30m</td><td>רוחב פס 520-550 ננומטר</td></tr><tr><td>מראה דיכרואית (ערוצי FRET)</td><td>Chroma</td><td>470dcxr</td><td>מעבר ארוך, 470 ננומטר מנותק</td></tr><tr><td>מראה דיכרואית (ערוץ YFP)</td><td>Chroma</td><td>89002bs</td><td>מעביר 445-490 ננומטר, 510-560 ננומטר, 590-680 ננומטר</td></tr><tr><td>mסט מסנני דובדבן</td><td>Chroma</td><td>49008</td><td>עירור 540-580 ננומטר, מעבר ארוך דיכרואי עם 585 ננומטר מנותק, מסנן פליטה 595-695 ננומטר</td></tr><tr><td>מקור אור</td><td>אולימפוס</td><td>U-LH100L-3-5</td><td>מקור אור LED או הלוגן המייצר עוצמת אור יציבה, מנורות כספית אינן מומלצות</td></tr><tr><td>מצלמת CCD</td><td>Qimaging</td><td>Rolera-MGi EMCCD</td><td></td></tr><tr><td>Apochromatic fluorescence objective</td> מערכת זלוף <td>אולימפוס</td><td></td><td></td></tr><tr><td>, ValveBank II</td><td>AutoMate Scientific</td><td>[01-08]</td> <td>מערכות זלוף אחרות המאפשרות החלפת פתרונות מהירה יעבדו גם</td></tr><tr><td>תאי זרימה למינרית</td><td>C& L מכשירים</td><td>VC-MPC-TW</td><td>תאי זרימה לרמינאריים אחרים יעבדו גם הם.</td></tr><tr><td>שקופיות תא</td><td>Lab-Tek</td><td>154534</td><td>לניסויים בתא פתוח</td></tr><tr><td>משאבת זלוף</td><td>Thermo Scientific</td><td>74-046-12131</td><td>לניסויים בתא פתוח</td></tr><tr><td>תוכנה התומכת במדידות רציומטריות</td> ספר שקופיות <td>חדשנות הדמיה אינטליגנטית</td><td>5.5</td><td></td></tr><tr><td>ארון בטיחות ביולוגית זרימה למינרית</td><td>ESCO</td><td>LA-3A2</td><td></td></tr><tr><td>Isotemp CO2 </תת>אינקובטור</td><td>Thermo Scientific</td><td>13-255-25</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco's MEM (DMEM)</td><td>Hyclone</td><td>SH30243.01</td><td></td></tr><tr><td>סרום עגל קוסמי</td><td>Hyclone</td><td>SH3008703</td><td></td></tr><tr><td>פניצילין/סטרפטומיצין</td><td>Hyclone</td><td>SV30010</td><td></td></tr><tr><td>מדיום נטול סרום לטרנספקציה (OPTI-MEM I)</td><td>Invitrogen</td><td>31985</td><td>בשימוש עם ליפופקטמין 2000</td></tr><tr><td>תמיסת פולי-L-ליזין</td><td>Sigma</td><td>P4707</td><td></td></tr><tr><td>כיסוי זכוכית עגול 25 מ"מ מחליק</td><td>Thermo Scientific</td><td>12-545-102</td><td>במקרה של שימוש ב-VC-MPC-TW</td></tr> ניתן <tr>להשתמש גם<td>ב-Lipofectamine 2000</td><td>Invitrogen</td><td>11668027</td> ניתן <td>להשתמש גם בריאגנטים אחרים של טרנספקציה.</td></tr><tr><td>תמיסה A (מאגר האנק)</td><td></td><td></td><td>9.7 גרם מלח HANK (Sigma H1387), 0.35 גרם NaHCO3, 5.96 גרם HEPES עד 1 ליטר, pH מותאם ל-7.35 עם תמיסת NaOH</td></tr><tr><td>B</td><td></td><td></td><td>תמיסה A + 0.04 מ"מ Gln</td></tr><tr><td>פתרון C</td><td></td><td></td><td>פתרון A + 0.2 מ"מ Gln</td></tr><tr><td>פתרון D</td><td></td><td></td><td>פתרון A + 1 מ"מ Gln</td></tr><tr><td>פתרון E</td><td></td><td></td><td>פתרון A + 5 מ"מ Gln</td></tr><tr><td>פתרון F</td><td></td><td></td><td>פתרון A + 5 מ"מ אלה</td></tr></tbody></table>

גלוטמין שטף הדמיה באמצעות חיישני מקודדים גנטיים

Glutamine Flux Imaging Using Genetically Encoded Sensors

חיישני מקודדים גנטי מאפשרים ניטור בזמן אמת של מולקולות ביולוגיות ברזולוציה subcellular. מגוון עצום של חיישנים כאלה למולקולות ביולוגיות הפך זמין בשנים האחרונות 15, שחלקם הפך לכלי חיוני המשמשים באופן שיגרתי במעבדות רבות. אחד היישומים המרגשים של חיישני מקודדים גנטי הוא השימוש בחיישנים אלה בחקירת תהליכי הובלה תאיות. מאפיינים של מובילים כגון קינטיקה וספציפיות מצע יכולים להיחקר ברמה תאית, המספקים אפשרויות לניתוחי תאים מסוג מסוימים של פעילות הובלה. במאמר זה, נדגים כיצד ניתן לצפות דינמיקת טרנספורטר באמצעות חיישן גלוטמין מקודד גנטי לדוגמא ירושלים. עיצוב ניסיוני, פרטים טכניים של ההגדרות הניסיוניות, ושיקולים לניתוחים שלאחר ניסוי יידונו.

ניסויים בזמן קורס טיפוסיים מיוצגים באיור 2. בניסויים אלו, סריג חיישני גלוטמין עם זיקות של 8 מ&quot;מ (FLIPQTV3.0_8m, איור 2 א ו -2) ו100 מיקרומטר (FlipQTV3.0_100 μ C ו-D) היו שיתוף הביע עם ASCT2 חובה מחליף חומצת אמין 18 בתאי cos7 10. זרם של גלוטמין הוא זוהה כשינוי ביחסי עוצמת הקרינה בין התורם (mTFP1) וacceptor (ונוס) (איור 2 א ו 2 ג). בזרימת של גלוטמין בנוכחות מצע אחר (עלא) הוא הוכיח גם באופן...

מאמר זה ידגים כיצד לעקוב אחר דינמיקת גלוטמין בתאים חיים באמצעות סריג. חיישני מקודדים גנטי מאפשרים ניטור בזמן אמת של מולקולות ביולוגיות ברזולוציה subcellular. עיצוב ניסיוני, פרטים טכניים של ההגדרות הניסיוניות, ושיקולים לניתוחים שלאחר ניסוי יידונו לחיישני גלוטמין מקודד גנטי.

Genetically encoded sensors allow real-time monitoring of biological molecules at a subcellular resolution. A tremendous variety of such sensors for ...

המטרה הכללית של פרוצדורה זו היא לצלם תעתוק של גלוטמין באמצעות נשא המבוטא באופן הטרולוגי בתאים חיים, תוך שימוש בחיישני העברה של אנרגיה במערכת רזוננס (Förster resonance energy transfer) או חיישני FRET. דבר זה מושג תחילה על ידי טרנספקציה של תאי COS-7 עם חיישן גלוטמין ונשא. החיישן מורכב מתורם FRET המוחדר לחלבון קושר גלוטמין חיידקי, ומקבל FRET בקצה ה-C של החלבון הקושר גלוטמין.השלב השני הוא הקמת מערכת פרפוזיה ודימות של התאים בזמן אמת באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי הפוך. השלב הסופי הוא ניתוח התמונות והדמיה של דינמיקת הגלוטמין. בסופו של דבר, ניתן לזהות פעילות של נשאים בתא בודד באמצעות חיישני FRET אלו.היתרון המרכזי של טכניקה זו על פני שיטות קיימות, כגון מדידה המבוססת על כרומטוגרפיה, הוא קבלת רזולוציה מרחבית-זמנית גבוהה בהרבה. טכניקה זו מורכבת משלושה חלקים: טרנספקציה של תאים עם חלבוני חיישן, דימוי בזמן אמת וניתוח לאחר הניסוי. בניסוי זה נעשה שימוש בתאי Seven בשל פעילות הובלת הגלוטמין האנדוגנית הנמוכה שלהם.זריעת התאים תבוצע בצפיפות של כ-70% עד 80% ב-DMEM בתוספת 10% cosmic calf serum או CCS ו-100 units per milliliter של Penicillin streptomycin בצלחת זכוכית בעלת שמונה בארות. יש לדגור ב-37 °C, 5% CO2, ו-100% לחות למשך 24 שעות.לאחר 24 שעות, החליפו את מצע הגידול ב-DMEM פלוס 10%CCS ללא אנטיביוטיקה וג

glutamine-flux-imaging-using-genetically-encoded-sensors

Research

JoVE Journal

Bioengineering

הנדסה ביולוגית

הליך culturing נוזלי מבוסס מחלק...

תפוקה גבוהה הקרנת ו biosensing עם פלורסנט ג elegans מתחים

סרטון זה מדגים הערכת שחרור ופינוי גלוטמט בסינפסות קורטיקוסטריאליות בודדות בפרוסת מוח של עכבר. גירוי חשמלי מאפשר שחרור גלוטמט בסינפסה. הגלוטמט המשתחרר משנה את הפלואורסצנטיות של חלבון החיישן, אשר דועכת עם הזמן, מה שמעיד על יעילות שחרור וסילוק.

ניתוח שחרור ופינוי גלוטמט בסינפסה של נוירון יחיד בפרוסת מוח של עכבר

תיאור כיצד לכייל את חיישני העברת פורסטר התהודה האנרגיה משולבים ביולוגיים (FIBS) בפרופיל מטבולי אתר מוצג. FIBS ניתן להשתמש כדי למדוד את הרמות תאית של מטבוליטים noninvasively סיוע בפיתוח מודלים מטבוליים והקרנת תפוקה הגבוהה של תנאי Bioprocess.

FIBS מאופשר פולשנית מטבולית פרופיל

כתב יד זה מתאר את השימוש fluorogenic מקודד גנטית כתבים ביישום של הדמיה לחיות תאים עבור הבחינה של xenobiotic-induced סטרס חמצוני. זו גישה נסיונית מציע רזולוציית ייתכן ללא תחרות, רגישות וספציפיות תוך הימנעות רבים את חסרונותיה של שיטות קונבנציונליות המשמש את הגילוי של רעילות סטרס חמצוני.

הדמיה גישות הערכות של רעילות לחץ חימצוני באמצעות חיישנים Fluorogenic מקודד גנטית

המטרה של פרוטוקול זה נועד להקל על המחקר של קולטני NMDA (NMDAR) בקנה מידה גדול יותר, לאפשר הבחינה של תופעות modulatory של מולקולות קטנות ושימושיהם טיפולית.

וזמינותו תפוקה גבוהה סידן השטף ללמוד קולטני NMDA עם רגישות גליצין/D-סרין, גלוטמט

ג'יברלין תפיסה חיישן 1 (GPS1) הוא הראשון פורסטר תהודה אנרגיה מבוססת על העברת החיישן למדידת רמות הסלולר של ג'יברלין phytohormones עם רזולוציה גבוהה ייתכן. פרוטוקול זה מדווח על השיטה כדי להמחיש ולכמת רמות ג'יברלין הסלולר באמצעות את החיישן nlsGPS1 גנטית מקודד ב hypocotyls תודרנית וטיפים שורש.

ג'יברלין הסלולר להמחיש רמות שימוש באנרגיה תהודה פורסטר NlsGPS1 העברה (סריג) ביוסנסור

איתות סידן מערכתי המופעל על ידי גלוטמט חוץ-תאי הוא קריטי לגיוס תגובות הגנת הצמח לפצעים מכניים ולתקפת אוכלי עשב בצמחים. מאמר זה מתאר שיטה לדמיין את הדינמיקה המרחבית והטמפורלית של שני גורמים אלה באמצעות צמחי תאליאנה ערבידופסיס המבטאים ביוסנסורים פלואורסצנטיים רגישים לסידן וגלוטמט.

שדה רחב, הדמיה בזמן אמת של אותות פצע מקומיים ומערכתיים ב Arabidopsis

ספיגת הגלוקוז מוגברת בתאי העצב המוטוריים של Drosophila המושפעים מחלבון מחייב DNA TAR (TDP-43), כפי שצוין על ידי חיישן גלוקוז מבוסס FRET, מקודד גנטית.

מדידת ספיגת גלוקוז במודלים של דרוסופילה של פרוטאינופתיה TDP-43

מאמר זה מתאר פרוטוקול כדי לקבוע הבדלים במצב redox בזאלי ו redox תגובות perturbations חריפה בהיפוקמפוס ראשוני נוירונים קליפת המוח באמצעות מיקרוסקופיה חיה קונפוצלית. ניתן להחיל את הפרוטוקול על סוגי תאים ומיקרוסקופים אחרים עם שינויים מינימליים.

הדמיה חיה של מצב גלוטתיון גלוטתיון מיטוכונדריאלי בנוירונים ראשוניים באמצעות מחוון רצומטרי

פרוטוקול זה מציג תהליך סינון סטנדרטי עם תפוקה גבוהה עבור מיקרואורגניזמים תעשייתיים. הוא כולל בניית ספריית מוטנטים באמצעות מוטגנזה של ARTP, ביצוע סקר חיובי לטיפות באמצעות מיקרופלואידיקה אוטומטית, ולאחר מכן אימות התוצאות. אמינות זרימת העבודה אושרה על ידי סינון זני B. coagulans בעלי תפוקה גבוהה.

סקר מהיר של מוטנטים של חיידקים קואגולנס המופרזים בחומצה L-לקטית באמצעות פלטפורמה מיקרופלואידית אוטומטית של טיפות

למד הדמיה של דינמיקת גלוטמין בתאים חיים באמצעות חיישני FRET מקודדים גנטית. שיטה זו מאפשרת ניטור בזמן אמת של פעילות נשאים ומספקת רזולוציה מרחבית-זמנית גבוהה לחקר מטבוליזם תאי.

גלוטמין שטף הדמיה באמצעות חיישני מקודדים גנטיים

גלה סרטונים נוספים