ניתוח של נזק אפיתל הופק על ידי

המטרה הכוללת של הליך זה היא להעריך אינטראקציות מוקדמות בין המארח לפתוגן ואת פוטנציאל הפלישה של .TBA.Histolytica. ראשית, הכינו תכשירי טרופוזואיטים שלמים, טרופוזואיטים, ליזאטים כוללים או טרופוזואיטים מפרישים. לאחר מכן, דגרו תאי אפיתליום של המארח עם ריכוזים מתאימים של הטרופוזואיטים השונים.

כעת, באמצעות אימונופלואורסצנציה של AM, נתחו את תרביות התאים האפיתליאליים המטופלות כדי לזהות חלבונים נבחרים של *E. histolytica* המקיימים אינטראקציה עם הצומתים המהודקים (tight junctions) של התאים האפיתליאליים; כמו כן, מדדו שינויים במחסום הפאראצלולרי באמצעות התנגדות חשמלית טרנס-אפיתליאלית. יחד, התוצאות יכולות להוכיח פירוק של הצומתים המהודקים על ידי *E. histolytica*, וכן להצביע על השתתפותם של קומפלקסים נבחרים בתהליך זה. היתרונות המרכזיים של טכניקה זו הם השימוש במוצרים שונים של הטפיל כדי להעריך את התעתוק (translocation) של גורמי *E. histolytica* אל האפיתל של המארח, וכן כדי להוכיח את השתתפותם של גורמים אלו.

הגורמים לפתיחת חיבורים של תאים שלמים בזמנים מוקדמים מאוד של זיהום. שיטה זו יכולה לסייע במתן תשובות לשאלות מפתח בתחום האמבה, כגון הבנת האינטראקציות המולקולריות בין תאי אפיתל לבין הטפיל. בדרך כלל, אנשים שאינם מכירים את השיטה יתקלו בקשיים מכיוון שאינם יודעים את זמני הדגירה המתאימים, את היחס בין שני סוגי התאים לדגירה משותפת, וכן כיצד להשיג את תוצרי ה-ELI השונים וכיצד למדוד TER.

להשלכות של טכניקה זו יש השפעה על הטיפול במחלות אמיס, שכן גורמים ויראליים אלו, כגון קומפלקס E-H-C-P-A-D-H 112, עשויים לשמש כמטרות באסטרטגיות טיפול חדשניות. רביעי. שיטה זו, המבוצעת in vitro, יכולה לספק תובנות לגבי השתתפותם של גורמים ויראליים של Anica באינטראקציה הראשונית עם אתר החדירה למסלול. ניתן להחיל אותה גם על מערכות אחרות, כגון מודלים של זיהום in vivo בחומסות, עכברים, חזירי גינאה, וכן בביופסיות של מעי אנושי.תרבית.

את תאי ה-MDCK ב-10 milliliters של מצע DMEM מושלם ב-5% carbon dioxide וב-37 degrees Celsius. גדלו באופן אותנטי 1 times 10 to the fifth טרופוזואיטים של vent amoeba histolytica ב-15 milliliters של מצע TYIS 33 ב-37 degrees Celsius. כדי לנתק את הטרופוזואיטים, קררו את המבחנה למשך חמש עד 10 דקות באמבט מי קרח.

לאחר מכן, העבירו את התרבית באופן אספטי לפ attribution tube (מבחנה קונית) וסבבו בצנטריפוגה במהירות של 360 ×g למשך 10 דקות בטמפרטורה של 4°C. כעת, שפכו בזהירות את העליון (supernatant). הוסיפו PBS קר מאוד למשקע והפכו את המבחנה מספר פעמים כדי לפזר את התאים לאחר הצנטריפוגה.

קבעו את מספר הטרופוזואיטים באמצעות המוציטומטר; כדי להמיס את הטרופוזואיטים, הקפיאו אותם בהקפאה מהירה בחנקן נוזלי למשך דקה אחת, הפשיתו בטמפרטורה של 4°C וערבבו במערבל סיבובים (vortex) בעוצמה. כעת, הפעילו את הפרוטאזים הנוכחים בליסאטים באמצעות 0.02% beta mercaptoethanol. דללו 9×10⁶ טרופוזואיטים ב-3 mL של PBS קר בקרח, והעבירו את התאים למבחנה קונית של 50 mL.

כעת מקם את תרחיף הטרופוזואים בזווית אופקית של חמישה מעלות באינקובטור בטמפרטורה של 37 °C למשך שעתיים כדי לאסוף את המוצרים המופרשים, וסובב את המבחנה בצנטריפוגה ב-360 ×g למשך 10 דקות. השתמש במזרק סטרילי וחד-פעמי כדי לאסוף בזהירות את עלון הנוזל (supernatant), תוך הימנעות מזיהום של הדגימות בטרופוזואים מהמשקע. לאחר מכן, כדי לסלק תאים שהועברו, העבר את עלון הנוזל דרך ממбраנת צלולוז אצטט של 0.22 micron.

כעת הפעילו את הפרוטאזות באמצעות 0.02% beta mercaptoethanol עבור תרבית של אימונופלואורסצנציה. תאי MDCK על כיסויים זכוכית סטריליים בתוך צלחת תרבית תאים בעלת 24 בארות. בחנו את התאים תחת מיקרוסקופ הפוך עד שיגיעו ל-100% confluence.

הוסיפו את התנאים השונים של הטרופוזואיטים המדוללים ב-1 ml של PBS חם. כלולו את תנאי הבקרה של תאי MDCK עם PBS וללא E. histolytica, וכן תאי MDCK עם התנאים השונים של הטרופוזואיטים, אך ללא דגירה עם נוגדנים ראשוניים. הניחו את פלטת התרבית באינקובטור למשך 2 או 30 דקות.

בשלב הבא, שטפו את התאים האפיтелиאליים חמש פעמים ב-PBS קר כדי להסיר מולקולות או טרופוזואיטים שאינם קשורים. קבעו וחדירו את התאים באמצעות מיליליטר אחד של אתנול 96% למשך מספר דקות בטמפרטורה של 20- מעלות צלזיוס בתא לחות. הוציאו את כיסויי הזכוכית מהבארים בזהירות.

הסיר נוזלים עודפים מהדפוף באמצעות נייר סינון וטבול את כיסוי הזכוכית, כאשר התאים פונים כלפי מטה, לתוך תמיסת חסימה של 0.5%BSA. דגור את הדגימות למשך שעה אחת בטמפרטורת החדר. במקביל, הכן תערובת של נוגדנים ראשוניים ב-PBS.

הסִירו את לוחות הכיסוי מתמיסת החסימה. ייבשו שאריות נוזלים על נייר סינון. העבירו את התאים לתמיסת הנוגדנים והדגירו את הדגימות למשך לילה בטמפרטורה של 4 °C.

שטפו את התאים חמש פעמים עם 1 mL של PBS כדי להסיר מולקולות שאינן קשורות. כעת הכינו תערובת של שני הנוגדנים המשניים הפלואורסצנטיים ב-PBS. דגרו את הדגימות עם הנוגדנים המשניים במשך שעה אחת בטמפרטורת החדר ובחושך לצורך צביעה גרעינית.

דגרו את התאים למשך שלוש דקות עם 200 µL של תמיסת dappy בריכוז 0.05 mM בטמפרטורת החדר ובחושך. כעת, נתחו את הדגימות באמצעות מיקרוסקופיה קונפוקלית דרך חתכי Zack ומישורי XZ בניסויי דגירה משותפת. באמצעות מעכבי פרוטאז או נוגדן ספציפי, דגרו כל תנאי ניסיוני למשך 20 דקות בטמפרטורה של 4 °C עם מעכבי פרוטאז או תרבית של נוגדן מונוקלונלי.

העבירו תאי MDCK למסנני transwell סטריליים במדור העליון, הניחו 100 µL של תרחיף התאים ובמדור התחתון הניחו 600 µL של מצע DMEM מועשר. הכניסו את מסנני ה-transwell שהוכנו למדגרה על מיקרוסקופ הפוך. ודאו שהתאים הגיעו ל-100% התמזגות (confluency).

אספו ואחדו את המצע מהתא העליון של כל transwell עד לנפח של 50 מיקרוליטרים של תערובת מצע זו. הוסיפו 50 מיקרוליטרים של סספנזיית טרופוזואיטים או בקרת PBS. כעת העבירו את התערובות לתא העליון של כל transwell המכיל את תאי MDCK.

טבול מיד את שתי אלקטרודות ה-STX לתוך כל transwell כדי למדוד את ההתנגדות החשמלית הטרנס-אפיתליאלית. ודא שהאלקטרודה הארוכה נוגעת בתחתית התא התחתון ושהאלקטרודה הקצרה מכוסה במצע בתא העליון. ה-E histolytica גודלו בתנאי accent ונאספו בשלב לוגריתמי מאוחר עד לשלב סטציונרי מוקדם של הצמיחה.

כאן, נעשה שימוש במסמן הצומת המהודק zero one כדי להציג את מגע התאים של תאים אפיתליאליים המיוצבים על ידי צומתים מהודקים וצומתי היצמדות. אימונופלואורסצנציה עם הנוגדן המונוקלונלי שימשה לבדיקת האינטראקציה של הקומפלקס המופק מהאמבה עם פני השטח האפיתליאליים; יישום של טרופוזואיטים, ליסאטים כוללים או תוצרי הפרשה על השכבה האפיתליאלית העליונה הוביל למיקום משותף (colocalization) של הקומפלקס עם הצומת המהודק. לאחר 30 דקות, התפתחה צביעת ZO one מקוטעת בגבולות התאים והפנימה של החלבון לוויקולות.

שיבוש זה היה בולט ביותר במגעים של תאי MDCK עם טרופוזואיטים. מיקרוסקופיה קונפוקלית של ליסאטים כוללים הצביעה הדגימה כי קומפלקס הורגנס (virulence complex) חדר לעבר המרווח הבין-תאי. לוקליזציה משותפת עם צביעת ZO-1 המשובשת בנקודת המגע עם הטפיל הובילה לשיבוש בתפקוד מחסום האפיתי ולדרופ של 90% בהתנגדות החשמלית הבין-אפיתלית (trans epithelial electrical resistance).

דגירה מוקדמת של הטרופוזואיטים עם נוגדן למתחם או עם מעכבי פרוטאז ส่งללה להגנה מפני הירידה ב-TER. נתונים אלו מצביעים על כך שגם פעילות פרוטאוליטית וגם תכונות היצמדות הן גורמי virulent קריטיים של מתחם זה במהלך הפלישה של E. histolytica. לאחר צפייה בסרטון זה, תהיה לכם הבנה טובה של האופן שבו מנתחים את המנגנונים שבאמצעותם גורמי ה-virulence של E. histolytica פותחים צממטים מהודקים בשלבים מוקדמים של הזיהום. כאשר שולטים בניתוח זה, ניתן לבצע את בדיקת הנזק האפיתלי תוך שלוש שעות, ברגע שמוצרי ה-lya ותרביות התאים מוכנים.

בעת ביצוע פרוצדורה זו, חשוב לזכור להקפיד על זמני האינטראקציה המדויקים עבור יונים בהתאם להנחיות. ניתן לבצע שיטות אחרות, כגון בדיקות שיקוע חיסוני (immunoprecipitation), כדי לענות על שאלות נוספות, כגון קשרים אפשריים בין גורמי virulent של enba histolytica לבין חלבונים אפיתליאליים לאחר פיתוחן. טכניקה זו סללה את הדרך עבור חוקרים בתחום האינטראקציות של alside לחקור את הפתוגנזה של AMS בחומsters, עכברים, חזירי גיBי וברקמות אנושיות.