ניתוח של נזק אפיתל הופק על ידי Histolytica Entamoeba זיהום

המטרה הכוללת של הליך זה היא להעריך אינטראקציות מוקדמות של פתוגן מארח ואת פוטנציאל הפלישה של TBA. היסטוליטיקה. ראשית הכינו את הטרופוזואיטים השלמים, הטרופוזואיטים, הליזטים המוחלטים או הטרופוזואיטים המופרשים. לאחר מכן דגרו תאי אפיתל מארח עם ריכוזים מתאימים של הטרופוזואיטים השונים.

כעת באמצעות אימונופלואורסצנציה AM, נתח את תרביות האפיתל המטופלות עבור חלבוני ABA histolytica נבחרים המקיימים אינטראקציה עם צמתים הדוקים של תאי האפיתל מודדים גם שינויים במחסום הפרה-תאי על ידי התנגדות חשמלית טרנס-אפיתלית. יחד התוצאות יכולות להדגים פירוק צומת הדוק על ידי TBA Histolytica, וגם להצביע על השתתפותם של הקומפלקסים הנבחרים בתהליך זה. היתרונות העיקריים של טכניקה זו הם השימוש בתוצרים שונים של הטפיל כדי להעריך את הטרנסלוקציה של גורמי אווה היסטו לאפיתל המארח, כמו גם להדגים את השתתפותם של eva אלה.

הגורמים שלו על פתיחת צומת של תאים שלמים בזמנים מוקדמים מאוד של זיהום. שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלות מפתח בתחום האמבה, כגון הבנת האינטראקציות המולקולריות בין טפיל אפיתל וטפיל דיווה. בדרך כלל, אנשים חדשים בשיטה זו יתקשו מכיוון שהם אינם יודעים את הפרופורציה המתאימה של זמני הדגירה של שני זמני התאים לדגירה משותפת, וגם כיצד להשיג את תוצרי ה-ELI השונים וכיצד למדוד TER.

ההשלכות של טכניקה זו משתרעות על הטיפול שלנו ב-amis מכיוון שגורמי vir אלה כגון קומפלקס E-H-C-P-A-D-H 112 יכולים להיות מנוצלים כמטרות באסטרטגיות טיפול חדשות. ארבע. שיטת מבחנה זו יכולה לספק תובנה לגבי ההשתתפות של גורם נגיפי אניקה באינטראקציה ראשונית באתר בית החולים. ניתן ליישם אותו גם על מערכות אחרות כגון inbivo, מודלים של זיהום בעכברי אוגרים, שרקנים, וגם בביופסיות מעיים אנושיות. תרבות.

תאי ה-MDCK ב-10 מיליליטר של מדיה DMEM משלימה ב-5% פחמן דו חמצני ו-37 מעלות צלזיוס. גדל באופן אותנטי אחת פעמים 10 עד החמישית של אמבה היסטוליטיקה ב-15 מיליליטר של TYIS 33, בינוני ב-37 מעלות צלזיוס. כדי לנתק את הטרופוזואיטים, צננו את הצינור במשך חמש עד 10 דקות באמבט מי קרח.

לאחר מכן העבירו את התרבית באופן אספטי לצינור חרוטי וצנטריפוגה ב -360 פעמים G למשך 10 דקות בארבע מעלות צלזיוס. כעת, שפכו בזהירות את הסופרנטנט. הוסף PBS קר כקרח לגלולה והפוך את הצינור מספר פעמים כדי לפזר את התאים לאחר צנטריפוגה.

קבע את מספר הטרופוזואיטים באמצעות ציטומטר המו כדי להניח את הטרופוזואיטים קופאים בחנקן נוזלי למשך דקה אחת, מפשירים בארבע מעלות צלזיוס ומערבולת במרץ. כעת הפעל את הפרוטאזות הקיימות בליזטים עם 0.02% בטא מרקפטואתנול. לדלל תשע פעמים 10 לששת הטרופוזואיטים בשלושה מיליליטר PBS קר כקרח, ולהעביר את התאים לצינור חרוטי של 50 מיליליטר.

כעת הניחו את מתלה הטרופו בזווית אופקית מוטה של חמש מעלות בחממה של 37 מעלות צלזיוס למשך שעתיים כדי לאסוף את המוצרים המופרשים, צנטריפוגה את הצינור ב -360 פעמים G למשך 10 דקות. השתמש במזרק חד פעמי וסטרילי כדי לאסוף בזהירות את הסופרנטנט, הימנע מזיהום הדגימות בטרופוזואיטים מהגלולה. לאחר מכן, כדי לחסל את כל התאים המועברים, העבירו את הסופרנטנט דרך קרום אצטט תאית של 0.22 מיקרון.

כעת הפעל את הפרוטאזות עם 0.02% בטא מרקפטואתנול לתרבית אימונופלואורסצנטית. תאי MDCK על כיסוי זכוכית סטרילית מחליקים בתוך צלחת תרבית תאים מרובת בארות 24. בדוק את התאים במיקרוסקופ ההפוך עד שהם מגיעים למפגש של 100%.

הוסף את התנאים השונים של טרופוזואיטים מדוללים במיליליטר אחד של PBS חם. כלול את תנאי הבקרה של תאי MDCK עם PBS וללא e histolytica, כמו גם תאי MDCK עם התנאים השונים של טרופוזואיטים, אך פולטים דגירה עם נוגדנים ראשוניים. מניחים את צלחת התרבות בחממה למשך שתיים או 30 דקות.

לאחר מכן, שטפו את תאי האפיתל חמש פעמים עם PBS קר כדי לחסל מולקולות לא קשורות או טרופוזואיטים. תקן וחלחל את התאים עם מיליליטר אחד של 96% אתנול למשך דקות בטמפרטורה שלילית של 20 מעלות צלזיוס בתא לח. הוצא את הכיסוי מחליק מהבארות בזהירות.

הסר עודפי נוזלים מהקצה באמצעות נייר סינון וטבל את החלקת הכיסוי כשהתאים פונים כלפי מטה לתוך תמיסת חסימת BSA של 0.5%. דגרו את הדגימות למשך שעה בטמפרטורת החדר. בינתיים, הכינו תערובת של נוגדנים ראשוניים ב-PBS.

הרם את החלקות הכיסוי מתמיסת החסימה. יבש את כל הנוזלים העודפים על נייר פילטר. העבירו את התאים לתמיסת הנוגדנים ודגרו את הדגימות למשך הלילה בארבע מעלות צלזיוס.

שטפו את התאים חמש פעמים עם מיליליטר אחד של PBS כדי להסיר מולקולות לא קשורות. כעת הכינו תערובת של שני הנוגדנים המשניים הפלואורסצנטיים ב-PBS. דגרו את הדגימות בנוגדנים משניים למשך שעה בטמפרטורת החדר בחושך לצביעה גרעינית.

דגרו על התאים למשך שלוש דקות עם 200 מיקרוליטר של תמיסת דאפי של 0.05 מילי-מולרית בטמפרטורת החדר בחושך. כעת, נתח את התכשירים על ידי מיקרוסקופיה קונפוקלית דרך קטעי זאק ומישורי XZ בניסויי דגירה משותפים. באמצעות מעכבי פרוטאז או נוגדן ספציפי, דגרו כל מצב ניסוי למשך 20 דקות בארבע מעלות צלזיוס עם מעכבי פרוטאז או תרבית נוגדנים חד שבטית.

תאי MDCK על תומכים חדירים סטריליים בתא העליון, מניחים 100 מיקרוליטר מהמתלה הסלולרי ובתא התחתון מניחים 600 מיקרוליטר של מדיום DMEM משלים. הנח את מסנני הטרנסוול המוכנים לתוך החממה על מיקרוסקופ הפוך. ודא שהתאים מתכנסים ב-100%.

אסוף ואגר מדיום מהתא העליון של כל טרנסוול ל-50 מיקרוליטר מתערובת מדיה זו. הוסף 50 מיקרוליטר של תרחיף טרופוזואיטים או בקרת PBS. כעת העבירו את התערובות לתא העליון של כל טרנסוול המכיל את תאי MDCK.

טבלו מיד את שתי האלקטרודות STX בכל טרנסוול כדי למדוד את ההתנגדות החשמלית של הטרנס אפיתל. ודא שהאלקטרודה הארוכה יותר נוגעת בתחתית החדר התחתון ושהאלקטרודה הקצרה יותר מכוסה במדיום בתא העליון. ההיסטוליטיקה E תורבתה בתנאי מבטא ונקטפה בשלב הלוגריתמי המאוחר עד שלב הגידול הנייח המוקדם.

כאן, סמן הצומת ההדוק אפס אחד שימש להדמיית מגעי תאים של תאי אפיתל המיוצבים על ידי צמתים הדוקים והיצמדות. אימונופלואורסצנציה עם הנוגדן החד-שבטי שימשה לחקר האינטראקציה של הקומפלקס שמקורו באמבה עם משטח האפיתל יישום של טרופוזואיטים, טרופוזואיטים, ליזטים מוחלטים או מוצרים מופרשים לחד-שכבת האפיתל הביא לקולוקליזציה של הקומפלקס עם צומת הדוק. לאחר 30 דקות התפתח צביעה לא רציפה של ZO אחד בגבולות התא והפנמה בשלפוחית.

שיבוש זה היה בולט ביותר במגעים של תאי MDCK עם טרופוזואיטים וטרופוזואיטים. מיקרוסקופ לייזר קונפוקלי ליזטים כולל הצביע על כך שמתחם האלימות חדר לכיוון החלל הבין-תאי. מיקום משותף עם מגע הטפיל המופרע ze O אחד, שיבש את תפקוד מחסום האפיתל והביא לירידה של 90% בהתנגדות החשמלית של הטרנס אפיתל.

דגירה מוקדמת של הטרופוזואיטים עם נוגדן לקומפלקס או עם מעכבי פרוטאז הביאה להגנה מפני ירידת ה-TER שנלקחה. ביחד. נתונים אלה מצביעים על כך שגם פעילות פרוטאוליטית וגם תכונות הדבקה הם גורמי אלימות חשובים של קומפלקס זה במהלך פלישת היסטוליטיקה. לאחר צפייה בסרטון זה, אתה אמור להבין היטב כיצד לנתח את המנגנונים שבאמצעותם EMBA histolytica ויראלי בגורמים פותחים צמתים הדוקים בזמני זיהום מוקדמים כאשר שולטים בניתוח זה של נזק אפיתל ניתן לבצע תוך שלוש שעות לאחר שמוצרי lya ותרביות התאים מוכנים.

בעת ביצוע הליך זה, חשוב לזכור להקפיד על זמני אינטראקציה מדויקים עבור יונים בעקבות הליך זה. ניתן לבצע שיטות אחרות כמו בדיקות אימונו-משקעים על מנת לענות על שאלות נוספות כמו קשרים אפשריים בין enba, גורמי אלימות היסטוליטיקה וחלבוני אפיתל לאחר התפתחותו. טכניקה זו סללה את הדרך לחוקרים בתחום האינטראקציות הצדדיות לחקור פתוגנזה של AMS בעכברי אוגר, שרקנים וברקמות אנושיות.