טכניקת הכנה רב שלבים לשחזר חוגים מתחם המטבוליט מרובים לעומק וניתוח Metabolomic אינפורמטיבי
11 ביולי 2014
האמינות של תוצאות בניסויי metabolomics תלוי באפקטיביות והשחזור של הכנת המדגם. תאר היא שיטה קפדנית ומעמיקה שבמאפשרת מיצוי של מטבוליטים מנוזלים ביולוגיים עם האפשרות של המשך ניתוח עד אלפי תרכובות, או רק את שיעורי המתחם של עניין.
המטרה הכוללת של הליך זה היא להדגים אמצעי יעיל לפיצול מטבוליטים בנוזלים ביולוגיים מורכבים על מנת להשיג דגימות פשוטות לכיסוי משופר של המטבולום. זה מושג על ידי זינוק ראשון של כל דגימה בתקנים פנימיים כדי לפקח על יכולת השחזור של הכנת הדגימה ותנאי המכשיר. השלב השני הוא הוספת מתנול קר כקרח לכל דגימה כדי לזרז את החלבונים שאחרת עלולים להפריע לכרומטוגרפיה ולניתוח הבאים על ידי ספקטרומטריית מסה.
לאחר מכן, שלב מיצוי הנוזל הנוזלי מפריד בין המטבוליטים ההידרופיליים להידרופוביים. השלב האחרון הוא מיצוי שלב מוצק כדי לפרק עוד יותר את מטבוליטים של השומנים לפוספוליפידים, חומצות שומן ושומנים ניטרליים. בסופו של דבר, שיטה משולבת רב-שלבית זו משמשת להצגת הפרדה יעילה, יכולת שחזור מצוינת וכיסוי משופר של מטבולום הפלזמה.
היתרון העיקרי של טכניקה זו על פני שיטות קיימות, כגון מיצוי מתנול פשוט, הוא שאנו משיגים כיסוי מטבוליט משופר, במיוחד של שומנים, וזה חשוב בעת ביצוע מחקרי פרופיל מטבולומי או כאשר שומנים מעניינים במיוחד. לפני משקעי החלבון, הכינו את הדגימות תחילה להפשיר דגימות לטמפרטורת החדר. לאחר מכן, ספיקו את הדגימות עם תקנים פנימיים ISTD שהוכנו מראש.
כל הריכוזים הסטנדרטיים הותאמו לפי הצורך על סמך הרגישות של מכשור MS ו-HPLC בו נעשה שימוש. לניתוח, ספייק כל דגימה עם 10 מיקרוליטר. כל אחת מהתמיסות הסטנדרטיות ההידרופיליות וההידרופוביות מזנקת כל דגימה עם 10 מיקרוליטר של תמיסת בקרה חיובית אחת x שתיים x או ארבע x חיובית.
לאחר שכל הדגימות עברו תקנים פנימיים ופתרונות בקרה חיוביים, מערבל כל דגימה למשך 10 שניות. כדי להתחיל במשקעי חלבון, הוסף 400 מיקרוליטר מתנול קר כקרח לכל דגימה. מערבולת למשך 10 שניות לכל צנטריפוגה שפופרת באפס מעלות צלזיוס למשך 15 דקות ב-18,000 פעמים.
G, כדור חלבון אמור להיווצר בתחתית הצינור. לאחר הצנטריפוגה העבירו את כל הסופרנטנט לצינור תרבית זכוכית חדש ואז ייבשו תחת חנקן. שאריות מיובשות אלה יעברו מיצוי נוזלי מאוחר יותר.
לניתוח של חלק גלולת החלבון, הוסף מיליליטר אחד של אתר חיפושית מתיל טורט או MTBE למערבולת גלולת החלבון הלבנה או הלבנה למשך 30 שניות לכל צינור וצנטריפוגה באפס מעלות צלזיוס למשך 15 דקות ב-18,000 פעמים. G שפכו את שכבת ה-MTBE לצינור תרבית זכוכית חדש. מכיוון שגודל הגלולה ישתנה בין הדגימות, חשוב לשאוף באופן עקבי את אותה כמות MTBE עבור כל הדגימות.
לדוגמה, אם ניתן להוציא רק 900 מיקרוליטר עבור הדגימה עם הכמות הנמוכה ביותר של סופרנטנט, אז שפכו 900 מיקרוליטר. עבור כל הדגימות, הוסף עוד מיליליטר אחד של MTBE למערבולת כדורי החלבון למשך 30 שניות, ולאחר מכן צנטריפוגה באפס מעלות צלזיוס או 15 דקות. הוסף 18, 000 פעמים G כמו קודם, שאב את שכבת ה- MTBE והוסף לצינורות תרבית הזכוכית שהוכנו קודם לכן.
יבש את הדגימות על ידי זרימת חנקן והשהה מחדש ב-200 מיקרוליטר של מתנול כלורופורם אחד לאחד. העבירו כל דגימה לצינור צנטריפוגה וצנטריפוגה באפס מעלות צלזיוס למשך 15 דקות ב-18,000 פעמים G.לאחר מכן, השתמשו בפיפטות זכוכית כדי להעביר את הסופרנטנט לבקבוקוני הברגה של דגימת הרכב. כדי להתחיל בהליך זה, השתמש בפיפטה מזכוכית כדי להוסיף שלושה מיליליטר MTBE לשאריות המתנול המיובשות שהוכנו קודם לכן ומערבולת למשך 30 שניות.
לאחר מכן, הוסיפו 750 מיקרוליטר מים לכל צינור ומערבולת למשך 10 שניות. צנטריפוגה בכ -200 פעמים G למשך 10 דקות בטמפרטורת החדר, שתי שכבות נפרדות נראות לאחר הצנטריפוגה, יש לשאוב בזהירות 2.5 מיליליטר משכבת ה- MTBE העליונה מבלי לזרוק את השכבה המימית שמתחתיה ולהעביר לתרבית זכוכית נקייה. שניים. הוסף שלושה מיליליטר MTBE לחלק המים הנותר של כל דגימה.
ומערבולת 10 שניות לכל צנטריפוגה שפופרת בערך פי 200 G למשך 10 דקות. בטמפרטורת החדר יש לשאוב שלושה מיליליטר MTBE מבלי לקבל מים ולשלב עם צינור ה- MTBE הקודם. שבר MTBE זה יעבור מיצוי פאזה מוצק מאוחר יותר.
רכזו את השכבה המימית שנותרה על ידי ייבוש תחת חנקן. השעו מחדש את השאריות ב-100 מיקרוליטר של אחד, והוסיפו 400 מיקרוליטר מתנול קר כקרח לכל מערבולת צינור, ולאחר מכן העבירו לצינור מיקרו-צנטריפוגה. השאירו בטמפרטורה שלילית של 80 מעלות צלזיוס למשך 20 עד 30 דקות כדי לאפשר לכל החלבון שנותר לשקע במתנול.
הצנטריפוגה הבאה באפס מעלות צלזיוס למשך 15 דקות ב 18, 000 פעמים G, אמור להיות משקע לאורך צד הצינור לאחר הצנטריפוגה לשאוב 450 מיקרוליטר של סופרנטנט מבלי לשאוב את המשקעים ולהעביר לצינור מיקרו צנטריפוגה נקי. יבש לחלוטין ברכז צנטריפוגלי ואקום בטמפרטורה של לא יותר מ- 45 מעלות צלזיוס למשך כשעה עד שעתיים. השעו מחדש את הסופרנטנט המיובש ב -200 מיקרוליטר של 5% אצטיל ניטריל מים ומערבולת.
העבירו בקצרה דגימות למכוניות, דגימה, בקבוקונים והקפאו בטמפרטורה שלילית של 80 מעלות צלזיוס. כדי להתחיל בהליך למיצוי פאזה מוצקה, יבש את שבר ה-MTBE שהושג בעבר בזרימה טובה של חנקן ב-35 מעלות צלזיוס למשך 10 עד 15 דקות. כאשר שברי ה-MTBE יבשים לחלוטין, עצרו את זרימת החנקן והשעו במהירות כל דגימה במיליליטר אחד של כלורופורם באמצעות מערבולת פיפטה מזכוכית.
שטפו בקצרה ומרככו את מיצוי הפאזה המוצקה או מחסנית SPE פעמיים עם 400 מיקרוליטר הקסאן. השליכו את הפסולת והחליפו בצינור איסוף זכוכית חדש. הוסף את הדגימה לעמודת SPE, החל ואקום ואסוף את הזרימה.
בעזרת פיפטת זכוכית, הוסף מיליליטר אחד של שניים לאלכוהול איזופרופיל כלורופורם אחד לעמוד SPE ואסוף את הזרימה באותם צינורות זכוכית. זהו השבר הנייטרלי. יבש את השבר הנייטרלי מתחת לחנקן למשך 10 עד 15 דקות.
כדי למזער את החמצון בעזרת פיפטת זכוכית, הוסף מיליליטר אחד של חומצה אצטית 5% באתיל אתר לעמודת SPE ואסוף את הזרימה. זהו חלק חומצות השומן. יבש את חלק חומצות השומן מתחת לחנקן למשך 10 עד 15 דקות כדי למזער את החמצון באמצעות קצות פלסטיק.
הוסף 800 מיקרוליטר מתנול למחסנית SPE ואסוף את הזרימה דרכה בצינורות חרוטיים מפלסטיק של 15 מיליליטר, זהו חלק הפוספוליפידים. העבירו את שבר הפוספוליפידים לצינורות צנטריפוגה של 1.5 מיליליטר, יבשו את הדגימות עם רכז צנטריפוגלי ואקום בטמפרטורה של 45 מעלות צלזיוס למשך כשעה עד שעה וחצי. לבסוף, ראוס משהה כל אחת מהדגימות משלושת השברים ב-200 מיקרוליטר של 100% מתנול מעביר למכוניות, דגימות, בקבוקונים, ומאוחסן במקפיא שלילי של 80 מעלות צלזיוס.
היעילות של שיטת M-T-B-E-S-P-E במיצוי תקני שומנים ומטבוליטים אנדוגניים מודגמת בסך הכל מיצוי טוב יותר וכיסוי טוב יותר של המטבוליטים הושגו בהשוואה לשיטות אחרות כגון מיצוי מתנול או מיצוי MTBE בלבד כאשר מספר התכונות הושווה באמצעות תוכנה איכותית וכמותית. לאחר ניתוח lc MS, ההשוואה של שברי M-T-B-E-S-P-E הראתה חפיפה מינימלית בין שלושת השברים לאחר SPE, מה שמדגים את היעילות בהפרדת המטבוליטים ההידרופוביים למחלקות הכימיות שלהם לזיהוי מטבוליט בטוח יותר. בנוסף, התאוששות התקנים הפנימיים בשברים בשיטת M-T-B-E-S-P-E, NR 12 הראתה כי התקנים הפנימיים נרמזו בשבר הקשור לסוג הכימי שלהם.
כדי להעריך את יכולת השחזור הכרומטוגרפית של הנתונים, הכנת דגימת הנתונים בוצעה על שלוש דגימות QC פלזמה נפרדות, וכל דגימה הוזרקה בשלוש עותקים במכשיר LCM MSS. החפיפה העקבית מדגימה את יכולת השחזור של הכנת המכשיר והדגימה. העלייה ברעש הכימי שנצפתה במצב היינון השלילי של חלק חומצות השומן עשויה לנבוע ממזהמים בממיסי LCM S.
לכן, נותחו רק מטבוליטים שרמזו לפני תשע דקות. אל תשכח שעבודה עם כלורופורם, MTBE, אתיל אתר, ואפילו הריאגנטים הנפוצים יותר המשמשים בשיטה זו עלולה להיות מסוכנת ביותר ויש לנקוט תמיד באמצעי זהירות כגון לבישת מעיל מעבדה, כפפות והגנה על העיניים וביצוע הכנת דגימה במכסה אדים בעת ביצוע הליך זה.
סקירה כללית
מאמר זה מציג שיטה מקיפה למיצוי מטבוליטים מנוזלים ביולוגיים, המשפרת את המהימנות והשחזוריות של מחקרי מטבוליזום. הטכניקה מאפשרת ניתוח של מגוון רחב של תרכובות, תוך התמקדות מיוחדת במטבוליטים של ליפידים.
מרכיבי מפתח של המחקר
תחום מדע
- מטבולימיקה
- הכנת דגימות ביולוגיות
- ספקטרומטריית מסות
רקע
- מטבולימיקה נשענת על הכנת דגימה יעילה לקבלת תוצאות מהימנות.
- נוזלים ביולוגיים מורכבים דורשים הפרדה מדויקת לשלבים (fractionation) כדי לפשט את הניתוח.
- שיטות קיימות לרוב חסרות כיסוי מקיף של מטבוליטים.
- טכניקות משופרות הן חיוניות למחקרי פרופיל (profiling), ובמיוחד בנוגע לליפידים.
מטרת המחקר
- להדגימה של שיטה רב-שלבית למיצוי מטבוליטים.
- לשיפור הכיסוי של המטבולום בפלסמה.
- להגברת השחזוריות בניסויי מטבולימיקה.
שיטות שבהן נעשה שימוש
- הוספה של סטנדרטים פנימיים לדגימות לצורך ניטור השחזור.
- השקעת חלבונים באמצעות מתנול קר מאוד.
- מיצוי נוזל-נוזל להפרדה בין מטבוליטים הידרופיליים להידרופוביים.
- מיצוי פאזה מוצקה לצורך פרקציונציה נוספת של מטבוליטי ליפידים.
תוצאות עיקריות
- השגת הפרדה יעילה של מטבוליטים באמצעות השיטה המתוארת.
- הוכחה של שחזוריות מצוינת בין דגימות שונות.
- כיסוי משופר של מטבוליטים ליפידיים בהשוואה לשיטות מסורתיות.
- תיקוף יעילות השיטה עבור מחקרי פרופיל מטבולומיקה.
מסקנות
- שיטת המיצוי רב-שלבית משפרת באופן משמעותי את ניתוח המטבוליטים.
- כיסוי ליפידי משופר הוא קריטי למחקרי מטבולומיקה מקיפים.
- טכניקה זו מציעה גישה מהימנה עבור חוקרים בתחום.
שאלות נפוצות
רלוונטיות תעשייתית למנהלים
טכניקה זו לפרקציונציה רב-שלבית של מטבוליטים נותנת מענה לצוואר בקבוק קריטי במטבוליזים: הכנה לא עקבית של דגימות המובילה לנתונים שאינם מהימנים. באמצעות אפשור כיסוי משופר של מטבוליטים ליפידיים והפרדה הדירה של מחלקות תרכובות, היא מגבירה את הביטחון החזוי בתהליכי תיקוף מטרות וגילוי ביומרקרים. השיטה תומכת בהפחתת סיכונים של היפותזות גילוי מוקדמות באמצעות פרקציונציה מבוססת מידע כימי, ובכך משפיעה ישירות על תעדוף הפורטפוליו בתחומי מחלה ממוקדי-ליפידים.
יישומים אסטרטגיים במחקר ופיתוח בביופארמה
גילוי מוקדם ותיקוף מטרה
- ערך מדעי: מאפשר בחינה של היפותזות טיפוליות המתווכות על ידי ליפידים באמצעות הפרדה של חומצות שומן, ליפידים ניטרליים ופוספוליפידים לצורך ניתוח ממוקד.
- ערך תפעולי: מפחית עמימות מכניסטית באמצעות העשרה של מחלקות כימיות, ובכך תומך בזיהוי בטוח יותר של מטבוליטים בביאור מסלולים מטבוליים.
- ערך חיזוי: משפר את השחזוריות באמצעות התאוששות של תקן פנימי לאורך הפראקציות, מה שמחזק את אמינות הנתונים לצורך קבלת החלטות של go/no-go בתעדוף מטרות.
סריקה ופיתוח בדיקה
- ערך מדעי: מייצר דגימות מופרדות בעלות מורכבות כימית מופחתת, מה שמאפשר זיהוי מדויק ורגיש יותר של מטבוליטים בריכוז נמוך במסעות סריקה.
- ערך תפעולי: מבצע סטנדרטיזציה להכנת הדגימות על פני פרקציות הידרופיליות והידרופוביות, ובכך משפר את השחזוריות ואת תפוקת הבדיקה בפלטפורמות מטבולומיקה.
- ערך אסטרטגי: מקל על שימוש חוזר בפלטפורמה על ידי יצירת פרקציות הניתנות לאחסון (למשל, משק תאי חלבון) לצורך אנליזה רטרוספקטיבית, ובכך מגביר את יעילות הערכת התרכובות.
מחקר תרגומי ופרה-קליני
- ערך מדעי: תומך במערכות רלוונטיות למחלות על ידי היתמכו של פרקציונציה של פלזמה, BALF ו-CSF — נוזלים מרכזיים במודלים של מחלות דלקתיות, ניווניות עצביות ומטבוליות.
- ערך תפעולי: מבטיח המשכיות טרנסלציונלית משלב הגילוי ועד לתיקוף פרה-קליני, באמצעות כיסוי עקבי של מטבוליטים ואנליזה ספציפית לפרקציה.
- הפחתת סיכונים: מגביר את הביטחון החיזוי במערכי סממנים ביולוגיים (biomarker panels) על ידי הפחתת תוצאות שגויות שליליות בזיהוי מטבוליטים ליפידיים, הודות לשיפור בהתאוששות הספציפית למחלקה.
שילוב תהליכי עבודה וקווי עיבוד
השיטה משתלבת ברצף הגילוי, החל מבדיקת השערות ועד לזיהוי מובילים (leads), במיוחד במקרים שבהם מטבוליזם של ליפידים רלוונטי מבחינה מכניסטית למחלה או לתגובה לתרופה.
- ביולוגיה של גילוי: תומך בהבהרת מסלולים ובהפחתת סיכונים ביולוגיים על ידי בידוד מחלקות ליפידים המעורבות באיתות, דלקת ודינמיקה של ממברנות.
- סריקה: מספק פראקציות מוכנות לבדיקה עם פלטים כמותיים המתאימים להשוואת השפעות של תרכובות על מטבוליזם של ליפידים.
- אנליטיקה: מאפשר השוואה בין פראקציות באמצעות נורמליזציה של סטנדרט פנימי, ומספק קריאות חסונות סטטיסטית להשוואת תנאים.
- מחקר תרגומי: מקשר לרציפות פרה-קלינית באמצעות ניתוח ספציפי לפראקציה של ביומרקרים בנוזלים הרלוונטיים למחלה, כגון CSF ופלזמה.
- שימוש חוזר ארגוני: מציב את תהליך העבודה כיכולת ניתנת לשימוש חוזר, שבה משקעים ופראקציות מאוחסנים ומאפשרים ניתוח איטרטיבי ללא צורך בחילוץ מחדש.
השפעה תפעולית וארגונית
- ערך מדעי: ביטחון חיזוי בזיהוי מטבוליטים באמצעות הפרדה של מחלקות כימיות והפחתת חפיפה ספקטרלית.
- ערך תפעולי: סטנדרטיזציה ויכולת שחזור באמצעות מעקב אחר סטנדרט פנימי ופרקציונציה עקבית בין סוגי דגימות שונים.
- ערך אסטרטגי: קבלת החלטות טובה יותר לגבי המשך התקדמות (go/no-go) על ידי הפחתת תוצאות שליליות שגויות בניתוח נתיבי ליפידים, ובכך הפחתת הסיכון הביולוגי בשלבים מאוחרים.
- השפעה על הפורטפוליו: תיעדוף מטרות מותאם סיכון המבוסס על כיסוי מקיף של מטבוליטי ליפידים במודלים של מחלות.
שיקולי יישום
- דורש מומחיות בביוכימיה של ליפידים ובטכניקות הפרדה (fractionation) כדי לפרש תוצאות ספציפיות למחלקה (class-specific).
- תלוי בגישה לצנטריפוגה, למרכזים בוואקום ולכלי זכוכית התואמים לשימוש עם כלורופורם, MTBE ואתיל אתר.
- מחייב סטנדרטיזציה בין צוותים של נפחי הממסים ופרוטוקולי שאיבה כדי להבטיח הדירות (reproducibility) בין אתרים שונים.
- כולל שיקולי התאמה לנפחי דגימה משתנים (עד 50 µL) ומטריצות נוזליות כגון פלזמה, BALF או CSF.
- כולל מגבלות מעשיות כגון טיפול בממסים מסוכנים (כלורופורם, MTBE, אתיל אתר) הדורשים שימוש במנדף כימי ובציוד מגן אישי (PPE).
