8 בספטמבר 2014
הבנת המצעים העצביים של ההתנהגות דורשת רישום של אנסמבל מעגלי המוח. בגלל יכולת המעקב הגנטית שלו, העכבר מציע מודל לדיסקציה של מעגלים וחיקוי מחלות. כאן מתוארת שיטה לתכנון וייצור בדיקות ממוזערות המתאימה למיקוד מבנה המוח העמוק בעכבר.
המטרה הכוללת של הליך זה היא לתכנן ולבנות שתל חזק וקל משקל במיוחד עם אלקטרודות מתכווננות באופן עצמאי מחלקים זמינים מסחרית הניתנים להתאמה אישית כדי להתמקד בכל אזור במוח וניתן יהיה להתאים אותם בקלות לשימוש במגוון מינים של בעלי חיים קטנים. ראשית, מזוהה אזור העניין במוח ויש למפות את סידור אלקטרודות ההקלטה. זה יקבע את העיצוב של גוף הכונן ותחתית הכונן.
השלב השני הוא ליצור את גוף הכונן שיאכלס את כונני המיקרו הבודדים, כמו גם את החלקים העליונים, שיישאו את האלקטרודות באמצעות תוכנת עבודה מוצקה. לאחר מכן, מכינים את החלק התחתון המכיל את צינורות ההנחיה לאלקטרודות וחרוט מגן. השלב האחרון הוא להרכיב את ההיפר-כונן במלואו על ידי הכנסת החלק התחתון לגוף הכונן, בניית כונן המיקרו הבודד, חיבור לוח הממשק האלקטרוני וטעינת כונני המיקרו באלקטרודות.
בסופו של דבר, ההיפר-דרייב מושתל וניתן להשיג הקלטות של יחידה אחת ממספר אזורים במוח. בגלל הקלות שבה ניתן להתאים אישית את ההיפר-דרייב ולהגדיל אותו, הוא יועיל למספר החוקרים העובדים במגוון שונה של מודלים של בעלי חיים. לכן שתלים חזקים וקלים מאפשרים לנו להשיג הקלטות אנסמבל עצבי יציב ולהתנהג בחופשיות עכברים תוך כדי ביצוע משימות פסיכופיזיות.
כדי להתחיל בהליך, זהה את אזור המוח המעניין. במקרה שלנו, זהו גרעין הג'נטל הצדדי בקואורדינטות AP שלילי 2.3 עד שלילי 2.7 מילימטרים. ה- LGN הוא הרחב ביותר ואזור זה משמש לעיצוב תחתית הכונן.
פתח את תוכנת העבודה המוצקה ובחר את המישור הקדמי. צייר את הפרופיל הדו-ממדי של הכונן באמצעות פונקציית הסקיצה, שתכלול את קווי המתאר של ידיות בסיס הכונן וחצאי פוליאמיד. ודא שקווי המתאר אינם מכילים פערים פתוחים.
לאחר מכן, בחר גם את המישור הקדמי וגם את המישור הימני ולחץ על צור ציר. לאחר מכן לחץ על פונקציית הבסיס של הבוס המסתובב. בחרו בפרופיל הדו-ממדי הכחול וסובבו את הפרופיל הדו-ממדי סביב הציר ב- 360 מעלות.
כדי ליצור את בסיס הכונן התלת-ממדי, לחצו על וילון תחת כיוון אחד והזינו 360 מעלות כזווית הסיבוב. לאחר מכן, צור חצי חריץ פוליאמיד אחד על ידי בחירת קו המתאר המודגש ושימוש בפונקציית הסיבוב כדי לסובב את קווי המתאר ב-13 מעלות סביב הציר המרכזי. לאחר מכן, בחר את קווי המתאר עבור נקודות האחיזה וסובב אותו ב-15 מעלות סביב הציר המרכזי כדי ליצור את נקודת האחיזה השנייה.
השתמש בפונקציית דוגמת המילוי המעגלית בתפריט התכונות, לחץ על דוגמת מילוי מעגלית ובחר בציר המרכזי כציר הסיבוב. בחר 180 מעלות כזווית ושתיים כמספר המופעים, וודא שנקודת האחיזה הראשונה נבחרה תחת תכונות לתבנית ליצירת 16 חצאי חריצי פוליאמיד. באמצעות פונקציית הדפוס המעגלי, בחר את חצי חריץ הפוליאמיד הראשון כתכונות לתבנית.
חזור על התבנית 16 פעמים על-ידי הזנת 16 במספר המופעים ו- 22.5 מעלות בזווית. הגדר מישור חדש בלחיצה על הכרטיסייה מישור תחת גיאומטריית הפניה. בחר את שני הצדדים של אחד מחריצי הפוליאמיד העליונים כדי ליצור מישור חדש.
מישור זה הוא המקום שבו ימשיך השקע. שרטט את קווי המתאר המעגליים של חור הבורג וחור הפוליאמיד על מישור זה. עבור מסילות נגד מומנט, הגדר קו מרכזי בין שני הצדדים של החריצים העליונים של הפוליאמיד.
לאחר מכן צייר את מסילות האנטי מומנט על ידי יצירת שני עיגולים בניצב לקו המרכז שמרכז את הרדיוס האחד שלנו זה מזה, ולאחר מכן חיתוך קווי המתאר האמצעיים ליצירת שקע הכונן המיקרו, כולל חור הבורג, חור הפוליאמיד ומסילת האנטי מומנט. לחץ על בסיס הבוס כדי ליצור את המסילה נגד מומנט ובחר שחול עיוור של 10 מילימטרים כלפי מעלה ושני מילימטרים כלפי מטה. לאחר מכן הוסף פילה 0.3 מילימטר לקצוות באמצעות פונקציית הפילה.
כדי להגביר עוד יותר את החוזק של חור הבורג וחור הפוליאמיד, לחץ על extrude, חתוך ובחר עיוור. שלושה מילימטר חתכים לשני היורדים למטה וכמה מילימטרים למעלה. לאחר מכן דפוס את שקע הכונן המיקרו 16 פעמים תוך שימוש במרכז כציר הסיבוב בחלק העליון של הידית.
צייר תיבה של שלושה מילימטר על שלושה מילימטר החל מהקצה המרכזי של ידית הכונן הפונה לציר המרכזי. הוצא את שני המילימטרים האלה כלפי מעלה. באמצעות פונקציית הבוס האקסטרודי, צייר עיגולים בקוטר מילימטר אחד במקומות בהם ברגי ה- EIB ימשיכו לאחר מכן.
בצע חתך שחול של 1.5 מילימטר כדי ליצור חור. לאחר מכן דפוס את הקופסה והחור פעמיים. באמצעות פונקציית הדפוס המעגלי, בצע חיתוכי שחול נוספים בגוף הכונן כדי להפחית עוד יותר את המשקל על ידי ציור דפוס במישור הקדמי ושימוש בפונקציית הדפוס המעגלי.
לאחר מכן, צייר סקיצה עליונה עם המידות המצוינות במילימטרים. לאחר מכן השתמש בבסיס הבוס האקסטרוד כדי ליצור מודל תלת מימד שלו. הוסף פילה מילימטר אחד לפינות באמצעות פונקציית הפילה לאחר השלמת תכנון הכונן, ניתן להדפיס את גוף הכונן והחלקים העליונים דרך רוב שירותי הדפסת התלת מימד.
בהליך זה, הניחו חתיכה קטנה של סרט דו צדדי על משטח ישר וחתכו את צינורות הפוליאמיד בגודל 31 לחתיכות של כשמונה סנטימטרים. לאחר מכן, הניחו את השכבה הראשונה של צינורות ההנחיה קרוב ככל האפשר זה לזה על הקלטת הדו-צדדית. לאחר מכן טפחו כמות קטנה של דבק ציאנואקרילט דק על שכבת הפולימידים.
ואז הניחו במהירות שכבה שנייה של פוליאמיד. לאחר מכן, צור מציין מיקום סיבים אופטיים באמצעות צינורית בגודל 26. ודא שהצינורית משומנת באמצעות חומר סיכה על בסיס טפלון לפני שילובה במכלול.
לאחר מכן החל קו של ארבעה עד חמישה מילימטר אפוקסי בניצב לצרור הפוליאמיד. לאחר שהאפוקסי התקשה, לאחר שעתיים-שלוש, הסר את הסרט מהשכבה התחתונה והחל מחדש את האפוקסי בצד השני. לאחר שהאפוקסי התקשה, שוב, הסר את הצינורית בגודל 26.
בצע חתך באמצע באמצעות סכין גילוח כדי ליצור שתי מטריצות פוליאמיד, שכל אחת מהן יכולה לשמש להיפר-דרייב אחד. כעת, הדפיסו את תבנית החרוט על דף נייר שקיפות וחתכו גיליון מתאים של נייר אלומיניום כבד. מרחו שכבת אפוקסי על נייר האלומיניום ואז מרחו במהירות את נייר השקיפות בעזרת חפץ כבד או דיבל עץ, החליקו את האפוקסי כך שהוא יתפזר באופן שווה.
לאחר מכן, גזרו את תבנית החרוט והדקו אותה יחד באמצעות קליפ תנין. לבסוף, השתמש בטפטוף נוסף של אפוקסי כדי להדביק לצמיתות את החלקים להרכבת כונן המיקרו. ראשית, חבר את ה-EIB לגוף הכונן באמצעות שני ברגים.
לאחר מכן הכנס מחדש את הצינורית בגודל 26 דרך מטריצת צינור ההנחיה של פוליאמיד. יישר את מטריצת הפוליאמיד עם גוף הכונן באמצעות חור הסיב האופטי ב-EIB כדי להבטיח שצינורות ההנחיה מאונכים ל-EIB. לאחר מכן, חבר את המטריצה לגוף הכונן עם אפוקסי וודא שלא יזרום אפוקסי לצינורות ההנחיה או לגוף הכונן.
לבסוף, עודף אפוקסי מוסר באמצעות דרמל לאחר מכן מפה כל צינור מנחה במטריצת הפוליאמיד לתושבת מתאימה על הקיר הפנימי של גוף הכונן. החלק טבעת קטנה של פוליאמיד בגודל 33 מעל כל צינור מנחה ולתוך התושבת. לאחר מכן מרחו כמות קטנה של דבק ציאנואקרילט כדי להדביק כל צינור מנחה.
לבסוף, חבר את כל המנגנון לקיר הפנימי של גוף הכונן בעזרת אפוקסי וחתוך את הפוליאמיד כך שיבלטו ממש מעל השפה הפנימית. לאחר מכן, בנה מכלול כונן מיקרו על ידי הכנסת אחד הברגים שנבנו בהתאמה אישית דרך החור המרכזי של חלק עליון, ואחריו אחד מחמשת הקפיצים המילימטריים. החלק את החור החיצוני של החלק העליון מעל אחת המסילות והניע בעדינות את הבורג.
לאחר מכן הסע את הבורג עד שהקפיץ יגיע לאורכו הדחוס המינימלי. וחזור על תהליך זה עבור כל כונן מיקרו מסילה. לאחר מכן, הפוך את מערך ההנעה הפוך ושים לב לסידור מטריצת צינור המדריך.
הוא משמש מאוחר יותר למיפוי המיקום של צינור ההנחיה המתאים לכל כונן מיקרו. לאחר מכן רשום את זהות כונן המיקרו המתאים. כעת הכנס צינור poly IDE לכל צינור מנחה מתחתית בסיס הכונן.
תן לצינור המנשא להשתרע מילימטר אחד עד שניים מהחלק העליון של כונן המיקרו המונמך במלואו. לאחר מכן רשום את זהות כונן המיקרו המתאים. על התצלום.
חבר את צינור הפוליאמיד לתמיכת כונן המיקרו עם אפוקסי והקפד לא לתת לו לעבור דרך כונן המיקרו אל הקפיץ או הבורג. לאחר מכן, חתוך את כל צינורות הפולימיד בגובה ראש בורג הכונן המיקרו ושטוף בתחתית מטריצת הפולימיד. לאחר מכן, התקן את ה-EIB לבסיס הכונן באמצעות שני ברגים.
בשלב זה, מערך הכוננים מוכן לטעינה עם TROs או טרוס סטריאו. לאחר הטעינה, הפוך את הכונן והורד בזהירות את חרוט המיגון מעל הכונן כך שרק החלק התחתון בולט להצמיד את חרוט המיגון על ידי הצמדת החרוט לגוף הכונן באפוקסי. לאחר חיבור החרוט, הפשיטו חתיכה קטנה של חוט נירוסטה והצמידו אותה ל- EIB.
מגרדים את חלק האלומיניום הפנימי של החרוט בעזרת מחט וטוחנים את חוט הפלדה לקונוס בעזרת צבע כסף. לאחר שצבע הכסף התייבש, חזקו אותו עם טיפה של אפוקסי. הנה תמונה של עכבר שנע בחופשיות עם ההיפר-דרייב מושתל.
ואלה הדוגמאות לשתי הקלטות צורת גל של יחידה אחת מהעכבר הזה. מוצג כאן קטע עטרה של מוח העכבר שמדגיש את גרעין הגנרל הצדדי שבו חלק מהאלקטרודות הונמכו. והנה דוגמה להיסטוגרמות זמן הגירוי של שני נוירוני LGN המיושרים לגירוי חזותי.
הנה קטע העטרה המדגיש את ההיפוקמפוס שבו הורדו קבוצה נוספת של אלקטרודות. דוגמה לרישום פוטנציאלי בשדה מקומי של אדווה בהיפוקמפוס מוצגת כאן עם הניסיון המתאים, ניתן להרכיב היפר-דרייב חדש תוך יום אחד. ניתן לשלב את הכוננים שפותחו בהליך זה עם טכניקות אחרות כגון אופטוגנטיקה על מנת לעורר ולתעד מתת-אוכלוסיות מזוהות של נוירונים.
מאמר זה מתאר שיטה לתכנון וייצור של גששים (probes) ממוזערים להקלטה של מעגלים מוחיים בעכברים. הדגש הוא על יצירת שתלים קלי משקל שניתן להתאימם לאזורי מוח שונים.
אלקטרודות רב-מגשריות (multi-electrode probes) קלות משקל וניתנות לכיוונון מאפשרות הקלטות יציבות של מקבצי נוירונים בעכברים בעלי התנהגות חופשית, ובכך תומכות בתיקוף יעדים ובצמצום סיכונים מכניסטיים בתהליכי גילוי תרופות למדעי המוח. העיצוב הניתן להתאמה מאפשר מיקוד מדויק של אזורי מוח, דבר המשפר את רמת הביטחון החזויה במודלים פרה-קליניים. יכולת ההרחבה (Scalability) בין מינים שונים משפרת את הרצף התרגומי ואת יעילות מיון תיקי הפיתוח.
השיטה משתלבת ברצף הגילוי, החל מבדיקת השערות ועד לזיהוי מולקולות מובילות (leads), תוך תמיכה בקריאות עצביות המוכנות לבדיקה (assay-ready) ובתיקוף של מודלים חזויים.