באתרו איתור של תאים אוטוריאקטיבים T מסוג CD4 במוח ולב באמצעות מחלקה מורכבת השני Dextramers סרן histocompatibility
1 באוגוסט 2014
הפרוטוקול כדי לזהות תאי T מסוג CD4 עצמי תגובתי במוח ולב על ידי צביעה ישירה עם הכיתה השנייה dextramers המורכב histocompatibility הגדול תואר בדוח זה. לניתוח מקיף, שיטה אמינה כדי למנות את התדרים של תאים מסוג CD4 + T אנטיגן הספציפי באתר היא גם המציאה.
המטרה הכוללת של פרוצדורה זו היא לזהות תאי T בעלי תגובתיות עצמית בדרגת ספציפיות גבוהה באמצעות פפטידים של MHC Class two. בסרטון זה, רקמה מוחית נאספת ממוחו של עכבר עם אנצפלומיאליטיס אוטואימונית ניסיונית שהודתה באמצעות חלבון פרוטאו-ליפיד של מיאלין. דבר זה מושג תחילה על ידי איסוף זהיר של הרקמות והכנת בלוקים של paraffin.
השלב השני הוא חיתוך הרקמה המוטמעת ב-aros לפרוסות בעובי 200 micrometer באמצעות viome. לאחר מכן, הפרוסות מועברות לתאי רקמה בלוחית 24 בארות, שם הן נצבעות ומקובעות. השלב הסופי הוא העמדת פרוסות הרקמה על סליידים מיקרוסקופיים.
בסופו של דבר, נעשה שימוש במיקרוסקופיה קונפוקאלית כדי להראות את התאים הקשורים ל-dex trimmers ולנוגדן CD four. הגבנו לרעיון זה לראשונה כאשר הדגמנו כי MHC class two dextro ERs היו רגישים יותר מאשר MHC Class two tetramers קונבנציונליים לזיהוי תאי CD four T עצמיים המגיבים לסגמנט ספציפי. באופן כללי, אנשים שאינם מכירים את השיטה יתקשו בכך, כיוון שחיתוך של רקמות טריות והטיפול בהן הם מאתגרים למדי.
הדגמה חזותית של שיטה זו היא קריטית, שכן שלבי החיתוך, הקיבוע והניתוח קשים ללמידה בשל מורכבותם. בנוסף ל-Ting, שני חוקרי פוסט-דוקטורט, Chandy ו-Aaron מהקבוצה שלי ו-Christian מהמעבדה של Dr.Zoe, ידגימו את ההליך הזה. לאחר ההדרה של עכבישים עם אנצפלומיאליטיס אוטואימונית ניסויית (EAE), חשפו את הגולגולת על ידי גזירה של הקרניום בצורה מעגלית באמצעות מספריים מעוקלים, והפנו בזהירות את עצמות הגולגולת בעזרת פינצטה. הוציאו את המוח באמצעות דיסקציה קהה בעזרת סכין מנתחים נקייה.
הפרידו את ה-rerum מהמוחון (cerebellum). העבירו את ה-rerum למבחנה המכילה cold one x phosphate buffered saline או PBS והשאירו את המבחנה על קרח עד לשלב העיבוד. הניחו את ה-rerum בקסטת היסטולוגיה עם תבנית בסיס עמוקה חד-פעמית שנשמרה על קרח.
לאחר מכן, שפכו לתוך הקסטה 4%PBS buffered low melting aros מותך. לחצו מיד בעדינות על המוח הגדול (cerebrum) באמצעות פינצטה כדי לשקע את הרקמה, והשאירו את הקסטה על קרח עד להשלמת ההתמצקות. לאחר ההתמצקות, גזרו את עודפי ה-aeros מכל צדי הרקמה המוטמעת וחשפו מעט את פני השטח הוונטרליים של ה-rerum.
בשלב הבא, מרחו דבק מהיר (super glue) על בלוק רקמת ה-Vibram והעבירו את הרקמה הטמועה ב-aros למשטח המודבק, על ידי הנחת המשטח הוונטרלי החשוף של ה-cerebro מעל הדבק לצורך חיתוך רוחבי. אין להזיז את הרקמה ברגע שהיא נקבעה על הבלוק. הניחו את בלוק ה-vibrate tone המכיל את הרקמה הטמועה ב-aros על קרח והמתינו 15 דקות לייבוש הדבק.
בינתיים, העבירו את תאי הרקמה המוכנים לתוך פלטה של 24 בארות, תא אחד לכל בארה. מלאו את הבארות המכילות את תאי הרקמה ב-1 mL של XPBS קר והשאירו את הפלטה על קרח. לאחר שהדבק התייבש, הורידו את להב הויברם (vibram blade) עד לגובה פני השטח העליונים של הרקמה.
הגדירו את מהירות ה-Vibram ל-0.22 millimeters per second והתחילו בחיתוך בתנועה קדימה כדי ליצור חיתוכים בעובי 200 micrometer. בעזרת מברשת צבעים רכה, העבירו חיתוך מוחי אחד לכל תא רקמה. בלוח ה-24 well plate, השאירו את הלוח על קרח עד לסיום החיתוך כדי למנוע התפרקות של הרקמה.
בשלב הבא, הכין פלטת 24 בארות שנייה על ידי הוספת 300 µL של תערובת המכילה IA of S myelin protio lipid protein 1 39 to 1 51 dextro ונוגדן CD4 לשלוש מהבארות. לאחר מכן, הוסף 300 µL של תערובת הביקורת המכילה IA of S Tyler's murine encephalomyelitis virus 70 to 86 dextro ונוגדן CD4 לקבוצה נוספת של שלוש בארות. המשך בסימון הבארות.
לאחר מכן, העבירו שלושה תאי רקמה המכילים את החתכים המיועדים לצביעה עם dex trimmers ספציפיים לשלושת הבארות המיועדות בלוחית 24 הבארות, כאשר בכל בארה תא אחד. באופן דומה, העבירו את שלושת תאי הרקמה המכילים את החתכים המיועדים לצביעה עם dex streamers מבוקרים לבארות המתאימות. כסו את הבארות במכסה, כאשר בכל בארה תא אחד.
עטפו את הפלטה בנייר אלומיניום והניחו אותה על פלטפורמת נדנוד (rocking platform) המכוונת לסיבוב עדין למשך 1.5 שעות בחשכה ובטמפרטורת החדר. לאחר תקופת האינקובציה, שטפו את נתחי הרקמה על ידי העברתם לבאר נקייה המכילה 1 mL של תמיסת שטיפה XPBS קרה למשך 10 דקות לפחות על פלטפורמת הנדנוד. חזרו על פעולת השטיפה שלוש פעמים.
יש לוודא שחתכי הרקמה אינם מתייבשים, שכן הם עלולים להידבק לדפנות התא. קבעו את החתכים על ידי העברת תאי הרקמה לבאר רעננה בלוחית 24 בארות המכילה 1 mL של פאראפורמאלדהיד 4% בבופר PBS מסונן, והדגירה על פלטפורמת נדנדה למשך שעתיים עם סיבובים עדינים.
לאחר שטיפת הנגדיים שלוש פעמים נוספות, הניחו את הנגדיים הצבועים והמקובעים על עלית מיקרוסקופ נקייה. בעזרת מברשת רכה לצבעי מים, ספגו את עודפי המים ללא מגע בנגדי, והצמידו את הנגדי באמצעות חומר הצמדה. כסו בעזרת כיסוי זכוכית (cover slip) והניחו לעליות להתייבש בטמפרטורת החדר למשך הלילה.
בחדר חשוך, השתמש במערכת מיקרוסקופ קונפוקלי Nikon A one Eclipse 90 I לסריקה שגרתית ולהשגת תמונות. כדי להתחיל, פתח את תוכנת NIS elements AR ובחר בלוח הבקרה בערוצי tetraethyl, rumine, isothiocyanate או trit C ו-cyan five או SCI five. אורכי הגל של העירור והפליטה עבור ערוצי Trit sea ו-sci-fi מופיעים כברירת מחדל.
הקצה את הצבע המדומה ירוק לערוץ Trit Sea ואת הצבע אדום לערוץ SCI five. הנח את הפלטה לבדיקה עלבמה המיקרוסקופית ובצע מיקוד ידני תחת הגדלה של 100 פעמים. הגדר את ה-HV ל-10 ואת ה-offset לאפס, לחץ על focus וכוונן את המתח.
כדי למטב את הלייזרים, לחצו על focus scan כדי לסרוק את החתך מלמעלה למטה וקבעו את רמת ה-Z עבור רכישת התמונה. לאחר מכן, לחצו על CH series ורכשו את התמונה באופן רצית. זהו תאי T CD4 חיוביים או dextro המופיעים כתאים נקודתיים צהובים, בהתבסס על קולוקליזציה של אותות שנוצרו הן מהערוץ האדום והן מהערוץ הירוק.
השתמשו במיקרוסקופ קונפוקאלי Olympus FV 500 BX 60 לצורך ספירה כמותית קלה של תאי T חיוביים ל-CD4 או dextro. כדי להתחיל, פתחו את תוכנת flu ovu. בחרו את הצבעים S SI three ו-SCI five מהתפריט הנפתח ולחצו על apply כדי לטעון את הלייזרים המתאימים.
הנח את הפיתח לבדיקה על במת המיקרוסקופ ובצע מיקוד ידני תחת הגדלה נמוכה; לחץ על focus בעוד לייזר ה-SI three פועל ומקד את המוקד הדלקתי. החלף את העדשה לאובייקטיב בהגדלה של 100 פעמים. הגדר את גודל הקובץ ל-five 12 over five 12 מהתפריט הנפתח, לחץ על focus וכוון את ערכי ה-gain וה-offset של ה-PMT כדי לאפטם את הלייזרים בנפרד עבור SI three ו-sci five; לחץ על Z stage ולאחר מכן לחץ על focus בעוד שני הלייזרים פועלים.
קבעו את עובי במת ה-Z על ידי לחיצה על החיצים למעלה ולמטה. הגדירו את מרווח ה-Z ל-two micrometers. לחצו על stop ובחרו.
בצעו חיפוש במימדי 1, 2, 3. לאחר מכן לחצו על X, y, Z והתחילו ברכישת סדרת תמונות Z עבור האזור הנבחר בתוך המוקד הדלקתי, ושמרו את תמונות סדרת ה-Z כקבצי VI. כדי לשמור קבצי תמונה, בחרו את התמונה מתוך סדרת תמונות ה-Z ושמרו אותה בפורמט TIFF.
שמרו תמיד תמונות multi TIFF. ראשית כדי להגן על הנתונים, השלב הבא הוא לבחון שלושה חתכים זוגיים שנצבעו עם שתי סדרות ה-dex trimmers. ראשית, בצעו את דגימות תמונות ה-Z על ידי סריקת השקופיות בתנועה של אופקי-אנכי למעלה ואופקי-אנכי למטה, כדי למנוע חזרות של סדרות Z באותו מיקוד.
לאחר לכידת סדרת תמונות Z, תנו שמות לקבצים על ידי זיהוי מספרי השקופיות, שם החתכים ומספר תמונות סדרת Z שנלכדו. השתמשו בתוכנת Image J כדי לספור תאי T חיוביים ל-CD4 וחיוביים ל-dextro ביחס למספר הכולל של תאי T חיוביים ל-CD4. בחרו את סוג המונה ב-Image J, סמנו "show all" והתחילו בספירה על ידי לחיצה על מרכזו של כל תא, והמשיכו לספור בתמונות שונות מסדרת Z באמצעות החיצים הצדדיים.
לאחר ספירת כל תאי ה-CD4 T, בחרו בסוג מונה אחר וספרו את תאי ה-CD4 T החיוביים לדקסטר. לחצו על לשונית התוצאות כדי לקבל את המספר הכולל של התאים שנספרו באמצעות שני המונים השונים. זיהוי תאי CD4 T ספציפיים לחלבון myelin protio lipid או PLP בוצע באמצעות חתכים מוחיים טריים שהופקו מעכברי EAE ונצבעו בתערובת המכילה anti CD4 ו-PLP 1 39 to 1 51 Dexters או TMEV 70 to 86 Dexters של בקרה באמצעות LSCM.
ניתוח של חתכי מוח שצבעו בצביעה משולבת מראה תאים חיוביים ל-PLP 1 39 to 1 51 dex trimmers באדום ותאים חיוביים לנוגדן CD four בירוק, בעוד שתאים כפולי-חיוביים הופיעו בצהוב. התאים בצביעה המשולבת הראו נקודות פונקטטיות מסביב להיקף. מאפיין זה לא הופיע בחתך שנצבע עם בקרת TMEV 70 to 86.
בנוסף, בוצע זיהוי של תאי CD4 T ספציפיים למיאוסין לבבי באמצעות צביעה in situ עם cardiac myosin heavy chain alpha 3 34 to 3 52 dexters. ניתוח של תמונות אלו באמצעות LSCM הראה נוכחות של תאים חיוביים ל-MYHC 3 34 to 3 52 dexters בצבע אדום, תאים חיוביים ל-CD4 בצבע ירוק, ותאים הקשורים הן ל-Dexter והן ל-CD4 כתאים נקודתיים צהובים. צביעת הרקע עבור RNA בקרה 43 to 56 Dexters הייתה זניחה. ברגע שהשליטה בטכניקה זו נרכשה, ניתן לבצעה בכ-8 עד 10 שעות, בניגוד לשלושה ימים בפרוטוקולים גבשוים אחרים, בתנאי שהיא מבוצעת כראוי.
בעת ביצוע פרוטוקול זה, חשוב לזכור להכין את הריאגנטים מראש ולעקוב אחר השלבים באופן סיסטמטי. לאחר צפייה בסרטון זה, תרכשו הבנה טובה של אופן חיתוך וצביעת הרקמות לצורך ספירת תאי C-reactive CD four T במטרות הנבחרות.
צפו בתמליל המלא וקבלו גישה לאלפי סרטונים מדעיים
סקירה כללית
מאמר זה מתאר פרוטוקול לזיהוי תאי CD4 T בעלי תגובה עצמית במוח ובלב באמצעות דקסטראמרים של MHC Class II. השיטה מאפשרת ניתוח מקיף של שכיחות תאי CD4 + T ספציפיים לאנטיגן in situ.
מרכיבי מפתח של המחקר
תחום מדעי
- מדעי המוח
- אימונולוגיה
- אוטואימוניות
רקע
- תאי T בעלי תגובה עצמית ממלאים תפקיד קריטי במחלות אוטואימוניות.
- דקסטמרים של MHC Class II הם כלים לזיהוי אוכלוסיות ספציפיות של תאי T.
- ספירה מדויקת של שכיחות תאי T חיונית להבנת התגובות החיסוניות.
- מחקר זה מתמקד במוח ובלב, אזורי מפתח המושפעים ממצבים אוטואימוניים.
מטרת המחקר
- פיתוח שיטה אמינה לזיהוי תאי CD4 T בעלי תגובה עצמית.
- ספירה של שכיחות תאי T ספציפיים לאנטיגן in situ.
- העמקת ההבנה של מנגנונים אוטואימוניים במוח ובלב.
השיטות שנעשה בהן שימוש
- קצירת רקמות מוח ולב מעכברים עם אנצפלומיליטי אוטואימונית ניסויית.
- הכנת חיתוכי רקמה באמצעות מיקרוטום.
- צביעה וקיבוע של חיתוכי הרקמה לצורך ניתוח.
- הרכבת חיתוכים על סליידים מיקרוסקופיים לצורך ויזואליזציה.
תוצאות עיקריות
- זיהוי מוצלח של תאי CD4 T בעלי תגובתיות עצמית ברקמות המוח והלב.
- הדגמת היעילות של MHC Class II dextramers בזיהוי תאי T.
- אספקת שיטה מהימנה לספירת שכיחות תאי T.
- תרומה להבנת התגובות האוטואימוניות ברקמות ספציפיות.
מסקנות
- הפרוטוקול מספק כלי בעל ערך לחקר תאי T בעלי תגובה עצמית.
- הממצאים עשויים להנחות מחקרים עתידיים על מחלות אוטואימוניות.
- נדרשים מחקרים נוספים כדי לבחון את ההשלכות של אוכלוסיות תאי T אלו.
שאלות נפוצות
רלוונטיות תעשייתית למסמך סיכום
זיהוי של תאי CD4 T אוטוראקטיביים ברקמות המטרה מספק תובנה מכניסטית לגבי פתוגנזה של מחלות אוטואימוניות, ובכך תומך בתיקוף של מטרות (target validation) בתחומי הטיפול של נוירו-אימונולוגיה וקרדיולוגיה. ספירה המבוססת על MHC Class II dextramer מאפשרת הערכה כמותית של תדירויות של תאי T ספציפיים לאנטיגן, דבר המסייע בזיהוי של מולקולות מובילות (lead identification) ובאסטרטגיות להפחתת סיכונים בשלב הפרה-קליני. גישה זו תומכת בהחלטות go/no-go מבוססות נתונים על ידי קישור של חדירת תאי חיסון לנזק רקמתי הרלוונטי למחלה במודלים של EAE ו-EAM.
יישומים אסטרטגיים במחקר ופיתוח בביופארמה
גילוי מוקדם ותיקוף מטרה
- ערך מדעי: מאפשר בחינה של היפותזות טיפוליות באמצעות ויזואליזציה של חדירת תאי CD4 T ספציפיים לאנטיגן ברקמות המוח והלב.
- ערך תפעולי: מספק זיהוי ספציפי של אוכלוסיות תאי T אוטוראקטיביים באמצעות MHC Class II dextramers עם בקרות שליליות מתאימות.
- ערך מדעי: תומך בהפחתת סיכונים ביולוגיים באמצעות תצפית ישירה על תאי T ספציפיים ל-PLP 139-151 ו-Myhc 334-352 in situ.
סריקה ופיתוח בדיקות
- ערך מדעי: מייצר נתונים כמותיים של תמונות Z-serial לצורך ניתוח תדירות של תאי CD4 T ספציפיים לאנטיגן בחתכים של רקמות.
- ערך תפעולי: מבסס זרימת עבודה ניתנת לשחזור של צביעה והדמיה באמצעות מיקרוסקופיה קונפוקלית לזיהוי עקבי של תאי T.
- ערך מדעי: מספק מדדים המבוססים על קולוקליזציה (נקודות צהובות) המעידים על פוזיטיביות כפולה לסמני dextramer ו-CD4.
מחקר תרגומי ופרה-קליני
- ערך מדעי: מקשר בין תגובות חיסוניות פריפריאליות לאוטואימוניות ספציפיות לרקמה במודלים של EAE ו-EAM.
- ערך תפעולי: מאפשר השוואה בין-מודלית של דפוסי חדירה של תאי T ברקמות המוח לעומת רקמות הלב.
- ערך מדעי: תומך בהפחתת סיכונים מכניסטית על ידי תיקוף המעורבות של תאי T אוטוראקטיביים באיברים רלוונטיים למחלה.
שילוב תהליכי עבודה וצינורות עיבוד
השיטה משתלבת ברצף הגילוי, החל מתיקוף המטרה ועד לאפיון מודלים פרה-קליניים, ומאפשרת ניטור חיסוני במערכות הרלוונטיות למחלה.
- ביולוגיה של גילוי: תומכת בבדיקת השערות על ידי אישור נוכחותם של תאי T ספציפיים לאנטיגן ברקמות המטרה לאחר השראה של מחלה אוטואימונית.
- סינון: מספקת חיתוכי רקמה מוכנים לבדיקה עם פרוטוקולי צביעה סטנדרטיים לוויזואליזציה מהימנה של תאי מערכת החיסון.
- אנליזה: מספקת מדידות תדירות כמותיות מדימות Z-serial, המאפשרות השוואה סטטיסטית בין תנאי ניסוי לתנאי ביקורת.
- מחקר תרגומי: מגשרת בין שלבי הגילוי לשלבים הפרה-קליניים על ידי קישור זיהוי תאי T לפתולוגיה של הרקמה במודלים של מחלות אוטואימוניות.
- שימוש חוזר ארגוני: מבססת זרימת עבודה תואמת-פלטפורמה לניטור חיסוני במגוון מודלים של מחלות אוטואימוניות.
השפעה תפעולית ועסקית
- ערך מדעי: מגביר את הביטחון החזוי בתיקוף המטרה באמצעות זיהוי ישיר וספציפי של תאי T אוטוראקטיביים.
- ערך תפעולי: משפר את השחזוריות באמצעות תמציות דקסטראמרים (dextramer cocktails), צביעה ונהלי דימיון קונפוקאלי סטנדרטיים.
- ערך אסטרטגי: משפר את קבלת ההחלטות לגבי המשך התהליך (go/no-go) על ידי אספקת ראיות מכניסטיות לפתולוגיה של רקמות המתווכת על ידי המטרה.
- השפעה על הפורטפוליו: מאפשר תיעדוף של מועמדים מותאם סיכון, המבוסס על נתוני חדירת תאי מערכת החיסון ברקמות רלוונטיות.
שיקולי יישום
- דורש מומחיות באיסוף רקמות, חיתוך ומיקרוסקופיה קונפוקאלית לצורך גילוי סיגנל אופטימלי.
- תלוי בגישה למיקרוסקופים קונפוקאליים של סריקת לייזר ופלואורסצנציה עם סטים של מסננים מתאימים.
- מחייב הכנה סטנדרטית של ריאגנטים ותנאי צביעה כדי לשמר את הספציפיות של הדקסטמראים (dextramers).
- כולל שיקולי התאמה בעת יישום השיטה על סוגי רקמות שונים או מודלים של מחלות.
- מוגבל על ידי אוטופלואורסצנציה של הרקמה ואיכות החיתוך, אשר עשויים להשפיע על בהירות התמונה ודיוק הכימות.
שאלות נפוצות בביופארמה
Chapters in this video
0:05
Title
1:49
In Situ Staining of Cerebral Sections with MHC Class II (IAs)/PLP 139-151 Dextramers
6:28
Analysis of Dextramer+ (dext+) CD4+ T Cells by Laser Scanning Confocal Microscopy (LSCM)
10:50
Results: In Situ Detection of Antigen-specific Autoreactive CD4 T Cells by Direct Staining with MHC Class II Dextramers
12:29
Conclusion
