פיתוח של התקנים 3D גראפן אלקטרודה dielectrophoretic

פרוטוקול זה מדגים נהלים לייצור נייר גרפן למינציה בתלת-ממד, התקן מיקרו-אלקטרודה, ושיטות ניסוייות למניפולציה של חרוזי פוליסטירן או תאים ביולוגיים באמצעות אלקטרופורזה של זרם ישר (DI) או DEP בתוך ההתקן. מעתה ואילך, נתייחס לדיאלקטרופורזה כ-DEP. ייצור ההתקנים בוצע תחילה על ידי ערימה לסירוגין של שכבות של נייר גרפן בעובי 50 מיקרון ו-N פחות אחת שכבות של סרט פולימר רגיש ללחץ בעובי 100 מיקרון, מה שהניב אלקטרודות של מחצית אות ומחצית הארקה.

לוחצים את השכבות זו לזו, מקצצים אותן, ואז קודחים את המיקרו-באר (micro well) דרך המבנה. לבסוף, מחברים שני מוליכי נחושת לשני קצות ההתקן באמצעות אפוקסי כסף. השלב השני הוא הכנת מדיום DEP במוליכות הרצויה.

לאחר מכן תלוים חרוזי Poly starring בתוך תמיסת המדיום הזו ביחס נפחי מסוים. השלב השלישי והאחרון הוא טעינת המכשיר בתליה המוכנה של החרוזים, התקנתו על במה של המיקרוסקופ, חיבור המכשיר למחולל פונקציות, ובסופו של דבר הפעלת ה-DEP. לבסוף, השתמש במיקרוסקופ כדי להקליט את תגובות ה-DEP ולחקור את תכונות התא או החלקיק באמצעות ניתוח נוסף.

גרפן הוא חומר רב-גוני המשמש בשל חוזקו וכן בשל תכונותיו התרמיות והחשמליות. פרוטוקול זה עושה שימוש בנייר גרפן זול כשכבת אלקטרודה מוליכה במכשיר מיקרו-די-אלקטרופורטי תלת-ממדי המסוגל להבחין בין חלקיקים ותאים עבור יישומים כגון סיווג דם או אבחון רפואי של תאי מחלה. היתרונות של מכשיר מיקרו זה בעל אלקטרודת נייר גרפן כוללים ייצור קל יותר, תפוקת דגימה גבוהה יותר וגמישות גאומטרית.

שדה הבחירה התלת-ממדי הלא-אחיד יכול להניע נפחי דגימה גדולים באמצעות כוחות DP הייחודיים ביכולתם להבדיל בין חלקיקים ותאים פולריזביליים על בסיס תכונותיהם הכימיות והמורפולוגיות האינהרנטיות. הרכיבו את המכשיר הלמינרי באמצעות נייר גרפן וסרט דביק. כאן אנו משתמשים בנייר גרפן הידרופובי בעובי 75 micron מיצרן מסחרי ובסרט דו-צדדי רגיש ללחץ בעובי 100 micron.

ראשית, חתכו נייר גרפן באמצעות להב כירורגי וסרגל ישר למלבנים של 6.7 centimeters על 1.5 centimeter, והשתמשו במספריים כדי לחתוך סרט דביק דו-צדדי לחמש רצועות של 1.3 centimeters על כ-five centimeter. הניחו את השכבה הראשונה של נייר הגרפן על תגית זכוכית נקייה. כסו לאט קצה אחד של נייר הגרפן באמצעות רצועת דבק אחת, והשאירו שוליים של כ-two millimeter כדי להבטיח בידוד בין כל שתי שכבות סמוכות של נייר הגרפן.

הניחו את השכבה השנייה של נייר הגרפן על גבי הסרט. הזיזו אותה ביחס לשכבה הראשונה של נייר הגרפן. הפעילו לחץ מתון מלמעלה כדי להבטיח איטום טוב בין השכבות.

חזור על שני השלבים לעיל עבור השכבות הנותרות, תוך הבטחה שהשכבות העליונה והתחתונה הן שתיהן נייר גרפן. השתמש במספריים כדי להסיר את הסרט המיותר מקצוות ההתקן, תוך השארת שוליים קטנים של כ-1 mm כדי להבטיח בידוד אטום בין שכבות נייר הגרפן. בצע בדיקת בידוד מהירה באמצעות מולטימטר, כאשר הפרובים החיובי והשלילי ממוקמים על המוליכים החשמליים בצדדים מנוגדים של ההתקן.

התנגדות גבוהה של מאות קילו-אוהם בקירוב מעידה על בידוד טוב בין השכבות. כעת המבנה הלמינרי מוכן לקידוח מיקרו-באר. אנו משתמשים במקדח מיקרו (micro mill) כדי לקדוח מיקרו-באר במבנה הלמינרי.

כאן אנו משתמשים במקדח מיקרו (micro end mill) בעל קוטר של 700 micron ואורך חריץ קרוב ל-2.1 millimeter. בחירת מקדח המיקרו נעשית בהתאם לקוטר של מיקרו-הבאר (micro well) ולעובי ההתקן. קבעו את המבנה הלמינרי על משטח הקידוח המיקרוסקופי באמצעות תפסנים, מקמו את המקדח בדיוק מעל המבנה בעזרת בקרים ממוחשבים, והפעילו זרימת אוויר דחוס מעל ההתקן. התחילו את סיבוב המקדח ולאחר מכן הורידו אותו באיטיות אל תוך ודרך מרכז המבנה הלמינרי.

עצור במרחק הגדול מעט מעומק המבנה הלמינרי כדי להבטיח פינוי יסודי של השאריות מהחור החדש. העבר את מקדח הקצה (end mill) מעלה ומטה מספר פעמים דרך מיקרו-הבאר כדי להחליק את הדופן הפנימית.

המשטח הפנימי של המיקרו-באר (micro well) צריך להיות אנכי ונקי ככל האפשר. כדי להשיג מדרגי שדה חשמלי ומעבר אור אופטימליים דרך המיקרו-באר, חתוך חוטי נחושת סטנדרטיים בכיול 32 gauge לשתי חתיכות באורך 3 cm וקפל שתי זוויות ישרות במרחק של 2 cm. ערבב ידנית כ-0.75 mm של חלק A וכ-0.75 mm של חלק B של אפוקסי מוליך כסף.

בתוך מכל קטן, חברו את החוטים על ידי מריחה זהירה של אפוקסי כסף על הקצוות ובין כל שלוש שכבות נייר הגרפן כדי להבטיח מגע טוב בין השכבות. לאחר מכן, מקמו את החוט באורך של one centimeter בין כל שתי שכבות, וסחטו בעדינות את השכבות כדי להסיר עודפי אפוקסי ולהבטיח מגע חשמלי תקין. חזרו על הפעולה עבור הצד השני של המבנה הלמינרי.

הנח את המכשיר השלם על מתקן והכנס לתנור לייבוש למשך לילה בטמפרטורה של 70 °C ובלחץ אטמוספרי אחד. הוצא את המכשיר מהתנור ואמת את הבידוד החשמלי בין מובילי האלקטרודות. בשלב זה נכין תמיסות במגוון מוליכויות על ידי ערבוב של יחסי ריכוזים שונים של תמיסת minol מוכנה מראש בריכוז 290 mOsm/L ושל PBS.

אלו הם תמיסות פשוטות שנבחרו כדי לחקות באופן גס בופר לתרבית תאים. קיים קשר ליניארי בין יחס הנפחים של שתי תמיסות אלו לבין מוליכות התמיסה המתקבלת; ערבבו חרוזי polystar או תאים ביולוגיים עם מדיה למדידת מוליכות ביחס נפחי של 1:100 על ידי פיפט של 10 µL מחרוזי polystar ו-1 mL מתמיסת המדיה אל תוך מבחנה לדגימה.

ערבב את הדגימה ביסודיות באמצעות וורטקס (Vortexing). הצמד את המכשיר לשקופית זכוכית בלחץ מתון באמצעות תפסני נייר מותאמים או תפסנים שווי ערך. בסיס ההצמדה צריך להיות קרוב מספיק למיקרו-באר (micro well) כדי לאטום את המבנה הלמינרי לשקופית הזכוכית ולמנוע דליפה של הדגימה.

יש לשלוט בחוזק הידוק המחבט כדי לא לעוות את המכשיר, דבר שעלול לשנות לרעה את גאומטריית הבאר ואת נתיב האור. חתוךה זכוכית כיסוי בעובי 0.5 millimeter באמצעות חותך זכוכית בעל קצה יהלום, ברוחב המספיק לכיסוי הבאר המיקרוסקופית. חתוך את זכוכית הכיסוי לגודל המתאים והנח אותה בצד. באמצעות מיקרו-מזרק זה, הזרק לאט כ-1 microliter של תמיחת חלקיקי הפוליסטירן אל תוך הבאר המיקרוסקופית. כדי למנוע היווצרות בועות, חזור על ההזרקה אם מופיעות בועות, והקפד לא לפגוע בדפנות הבאר המיקרוסקופית עם המחט החדה. מלא את הבאר המיקרוסקופית מעט מעבר לקיבולתה והחלקה מיד את זכוכית הכיסוי שהוכנה מעל הבאר כדי להסיר עודפי נוזלים, למנוע התאיידות ולהבטיח נפחים הניתנים לשחזור.

עבור כל ניסוי, קיבעו את המיקרו-התקן הלמינרי המלא למבמה של המיקרוסקופ וחברו גנרטור פונקציות. חברו תניבקי תנין מההתקנים לחוטי נחושת, והשתמשו בתוכנת המיקרוסקופ כדי לכוון את המיקוד לצפייה ברורה במיקרו-באר. במרכז המסך כאן, 100 Hz עד 10 MHz ו-15 V.

אותי שיא-למעלה הופעלו על המכשיר. חרו지를 נצפו במיקרו-באר בהגדלה של 10x בגובה של 1 עד 200 מיקרון מעל פני השקופית. לחץ על הכפתור כדי להתחיל בהקלטת המצלמה ובאיסוף הנתונים.

הפעל את אות מחולל הפונקציות שתי שניות לאחר תחילת הקלטת המצלמה. התמונות נשמרות באופן דיגיטלי בקצב של פריים אחד עד חמישה פריימים לשנייה למשך כחמש דקות לצורך ניתוח עוצמה מאוחר יותר. עם סיום הניסוי, הסר את המכשיר פרק את התפסנים.

נקה הן את תגית הזכוכית והן את המכשיר במים עם סבון. לאחר מכן שטוף היטב. בהיעדר שדה חשמלי, החלקיקים שוקעים למכשיר התחתית אך ורק בשל כוח הכבידה. שדות חשמליים סביב 1 kHz גורמים להתנהגות DEP חיובית, המתבטאת בתנועה מעלה במדרג השדה לכיוון נייר הגרפן.

אלקטרודות בשולי מיקרו-הבאר נצפו בשדות חשמליים מעל 100 kilohertz ובטווח ה-megahertz. נצפתה DEP שלילית, שבאה לידי ביטוי בתנועת חרו지를 במורד מדרג השדה החשמלי לעבר מרכז מיקרו-הבאר. מיקרו-התקן זה של אלקטרודת נייר גרפן תלת-ממדי הניב תוצאות ניסיוניות התואמות במידה רבה הן להתנהגות החזויה תיאורטית והן לתוצאות ניסיוניות שדווחו בעבר.

ייצור ההתקן הוא ורסטילי ביותר. ניתן להתאים בקלות את הפרוטוקולים המסופקים עבור התקנים בעלי שכבות רבות יותר או חומרים אחרים. סרטון זה מפרט ייצור של התקן מיקרו DEP בתלת-ממד בשיטת אצווה.

עם זאת, ביישומים עתידיים, ניתן להזרים באופן רציף תרחיפי חלקיקים או תאים דרך המיקרו-באר של המכשיר כדי להשיג תפוקה גבוהה יותר. דוגמה אחת לרב-גוניות של מיון DEP היא שניתן להשתמש בנייר גרפן סופח מים כאלקטרודה וכמסנן בו-זמנית עבור מרכזים של חלקיקים או תאים, או אפילו כחיישנים ביוכימיים אלקטרו-קינטיים. לאחר צפייה בסרטון זה, הצופים צריכים להגיע להבנה טובה של אופן הייצור של מכשיר מיקרו-אלקטרודה מנייר גרפן רב-שכבתי, וכן של אופן הפעלת המכשיר לביצוע ניסויים בחלקיקים או בתאים.