Name: איסוף והפקת DNA רוק לסידור הדור הבא (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-08-27T15:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 58 s
Description: למדו שיטה יעילה לבידוד DNA גנומי באיכות גבוהה מרוק שלם לשימוש ב-PCR וריצוף. הפרוטוקול מספק פתרון חסכוני ללא פגיעה בתפוקה ובאיכות ה-DNA.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

עבודה זו מומנה על ידי המכונים הלאומיים לבריאות R01 (DC009453 תמיכה ב-CWB).

הערה: לפני מתן דגימות רוק כל הנושאים נתנו הסכמה מדעת התואמת את הקווים המנחים לטיפול בבני אדם בבית החולים לילדים בפריסה ארצית. .1 רוק איסוף ואחסון <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לפני אוסף רוק, להבטיח כי הפה של הנושא הוא ללא מזון או חומרים זרים אחרים על ידי בעל העניין לשטוף את פיהם במים והימנעות אכילה או שתייה במשך 30 דקות לפני איסוף הדגימה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פתח צינור צנטריפוגות 15 מ&quot;ל עם 2.5 מ&quot;ל של חיץ ייצוב DNA 2 והקפד להימנע מלגעת בחלק הפנימי של הכובע או צינור, ויש לי את הנושא לירוק 2.5 מ&quot;ל של רוק לפתרון החיץ. שים לב: איסוף יותר מ 2.5 מ&quot;ל של רוק יכול להוביל להשפלת מדגם מיחס מספק של מדגם לחיץ ייצוב DNA. איסוף רוק מעט מדי יפחית תשואות הצפויות מהפרוטוקול. כדי להעריך את היקפי גבייה, להשתמש במעברי הצבע הממוספרים בצד של tהוא הצינור. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להחליף כובע ומערבבים על ידי היפוך עד לקבלת התערובת הומוגני. טלטול נמרץ הוא לא הכרחי. אחסן את הדגימות ב RT עבור אחסון לטווח קצר או 4 ° C לאחסון לטווח ארוך (&gt; 3 חודשים). </li></ol> 2 הכנות ראשוניות ותמוגה תא <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לפני תחילת ההפקה, לחמם אמבט מים ל37 מעלות צלזיוס, ולהכין דלי קרח. שלושה 15 צינורות מ&quot;ל צנטריפוגות חרוטי יהיה צורך עבור כל דגימה שחולצה. שלושה צינורות ישמשו כדי להחזיק את התא גלולה וחלבון, gDNA חילוץ הסופי, וsupernatants isopropanol ואתנול. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להשיג דוגמאות קרקע מאחסון, ודגימות הפכו כמה פעמים ואז מערבולת במהירות בינונית במשך 15 שניות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לוותר 2.5 מ&quot;ל של מדגם לתוך צינור צנטריפוגות נקי 15 מ&quot;ל, ולהוסיף 5 מ&quot;ל של תא תמוגה פתרון. מערבבים את המדגם 50 פעמים על ידי היפוך, ולדגור על RT למשך 30 דקות. </li></ol> הסרת .3 RNA <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 40 μl של RNase סולution ב100 מ&quot;ג / מ&quot;ל, ולדגור על 37 מעלות צלזיוס למשך 15 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את המדגם מאמבט המים 37 מעלות צלזיוס ומגניבה על קרח למשך 3 דקות. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר הדגירה RNase, להעלות את הטמפרטורה של המים באמבטיה ל65 מעלות צלזיוס למשך הצעד להחזרת נוזלי DNA של הפרוטוקול. </li></ol></li></ol> .4 חלבון והסרת שומנים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 50 μl של proteinase K פתרון ב20 מ&quot;ג / מ&quot;ל, לערבב כמה פעמים על ידי היפוך, ולדגור על RT למשך תקופה מינימאלית של 30 דקות. הערה: זוהי נקודת השהיה אפשרית לפרוטוקול. לאחר התוספת של proteinase K הפתרון, המדגם יכול להיות מאוחסן על 4 מעלות צלזיוס עד ליכול להסתיים החילוץ. האחסון בC ° 4 עד 24 שעה לא הוצג להיות השפעה משמעותית על תשואות מיצוי או איכות DNA. אחסון לטווח ארוך, בשלב זה לא נבדק. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוספת 1.7 מ&quot;ל של פתרון משקעים חלבון, מערבולת במרץ ל20 שניות במהירות גבוהה, ומניחים על קרח עבור 10 דקות. </li&gt; <li style=";text-align:right;direction:rtl"> ברגע שהדגימות התקררו על קרח עבור 10 דקות, צנטריפוגות במשך 10 דקות ב 3,000 XG ו4 מעלות צלזיוס. החלבונים זירז חייבים ליצור גלולה חזקה להמשיך. אם גלולה היא לא חזקה או הפתרון הוא עדיין מעונן, יכולות להיות מקוררות על דגימות קרח למשך 5 דקות נוספות וצנטריפוגה חוזרת ונשנית. הדגימות חייבות להיות כל הזמן על קרח כדי להבטיח גלולה הדוקה. </li></ol> .5 בידוד וטיהור של gDNA <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לתוך צינור צנטריפוגות נקי 15 מ&quot;ל, pipet 5 מ&quot;ל של אלכוהול איזופרופיל ו8 μl של טהור גליקוגן פתרון ב20 מ&quot;ג / מ&quot;ל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> יוצקים את supernatant המכיל gDNA משלב 4.3 לתוך הצינור המכיל האלכוהול איזופרופיל וגליקוגן פתרון, והותיר אחריו את כדור החלבון זירז. ברגע שsupernatant נוסף, לערבב בעדינות המדגם 50 פעמים על ידי היפוך וצנטריפוגות במשך 30 דקות ב 3,000 XG ו4 ° C.. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> יוצקים את supernatant לאט לתוך צינור 15 מ&quot;ל נקי. לאחר הסרת supernatant, להוסיף 1 מ&quot;ל של אתנול 70% ללשטוף את הכדור על ידי נדנדה לאט ובעדינות נעו אתנול על גלולה זירז כמה פעמים. שמור אתנול בצינור. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר השטיפה הראשונית, צנטריפוגות המדגם 1 דקות ב2,000 XG ו20 מעלות צלזיוס. ניתן לעשות צעד צנטריפוגה זה ברמת 4 מעלות צלזיוס או 20 מעלות צלזיוס. אין השפעה משמעותית של טמפרטורה הוכחה בשלב זה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> , בעקבות לשטוף וצנטריפוגה הראשוניות של גלולה לשפוך לאט לשטוף אתנול מהצינור וזורקים, ולאחר מכן לבצע לשטוף את השני על ידי חזרה על שלבי 5.3 ו5.4. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר הסרת supernatant מלשטוף את השני, לאפשר את גלולה לייבוש באוויר במשך 15 דקות. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אם המדגם לא התייבש לחלוטין, אוויר יבש לעוד דקות 15. </li></ol></li></ol> .6 Rehydration של gDNA <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר המדגם התייבש, להוסיף 300 μl של טריס-EDTA לרעננות גלולה gDNA המיובש. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מערבולת המדגם במשך 5 שניות במהירות בינונית ומניחים באמבט מים חמים 65 מעלות צלזיוס במשך שעה 1. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את הדגימות מאמבט המים ודגירת O / N ב RT. הערה: כל מוצרים וחומרים כימיים המשמשים מפורטים בלוח חומרים, כמו גם לוח 4. </li></ol>

<ol><li>Quinque, D., Kittler, R., Kayser, M., Stoneking, M., Nasidze, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+saliva+as+a+source+of+human+DNA+for+population+and+association+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Evaluation of saliva as a source of human DNA for population and association studies.</a> Analytical Biochemistry. 353, 272-277 (2006).</li>
<li>Min, J. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High+mircosatellite+and+SNP+genotyping+success+rates+established+in+a+large+number+of+genomic+DNA+samples+extracted+from+mouth+swabs+and+genotypes%5BTitle%5D)+AND+%22Twin+Research+and+Human+Genetics%22%5BJournal%5D)">High mircosatellite and SNP genotyping success rates established in a large number of genomic DNA samples extracted from mouth swabs and genotypes.</a> Twin Research and Human Genetics. 9, 501-506 (2006).</li>
<li>Dlugos, D. J., Scattergood, T. M., Ferraro, T. N., Berrettinni, W. H., Buono, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recruitment+rates+and+fear+of+phlebotomy+in+pediatric+patients+in+a+genetic+study+of+epilepsy%5BTitle%5D)+AND+%22Epilepsy+%26+Behavior%22%5BJournal%5D)">Recruitment rates and fear of phlebotomy in pediatric patients in a genetic study of epilepsy.</a> Epilepsy & Behavior. 6, 444-446 (2005).</li>
<li>Etter, J. F., Neidhart, E., Bertand, S., Malafosse, A., Bertrand, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Collecting+saliva+by+mail+for+genetic+and+cotinine+analyses+in+participants+recruited+through+the+internet%5BTitle%5D)+AND+%22European+Journal+of+Epidemiology%22%5BJournal%5D)">Collecting saliva by mail for genetic and cotinine analyses in participants recruited through the internet.</a> European Journal of Epidemiology. 20, 833-838 (2005).</li>
<li>Hansen, T. V., Simonsen, M. K., Nielsen, F. C., Hundrup, Y. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Collection+of+blood%2C+saliva%2C+and+buccal+cell+samples+in+a+pilot+study+on+the+danish+nurse+cohort%3A+Comparison+of+the+response+rate+and+quality+of+genomic+DNA%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Epidemiol+Biomarkers+Prev%22%5BJournal%5D)">Collection of blood, saliva, and buccal cell samples in a pilot study on the danish nurse cohort: Comparison of the response rate and quality of genomic DNA.</a> Cancer Epidemiol Biomarkers Prev. 16, 2072-2076 (2007).</li>
<li>Van Schie, R. C. A. A., Wilson, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Saliva%3A+A+convenient+source+of+DNA+for+analysis+of+bi-allelic+polymorphisms+of+fc%CE%B3+receptor+iia+%28cd32%29+and+fc%CE%B3+receptor+iiib+%28cd16%29%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Immunological+Methods%22%5BJournal%5D)">Saliva: A convenient source of DNA for analysis of bi-allelic polymorphisms of fcγ receptor iia (cd32) and fcγ receptor iiib (cd16).</a> Journal of Immunological Methods. 208, 91-101 (1997).</li>
<li>Dawes, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Estimates%2C+from+salivary+analyses%2C+of+the+turnover+time+of+oral+mucosal+epithelium+in+humans+and+the+number+of+bacteria+in+an+edentulous+mouth%5BTitle%5D)+AND+%22Archives+of+Oral+Biology%22%5BJournal%5D)">Estimates, from salivary analyses, of the turnover time of oral mucosal epithelium in humans and the number of bacteria in an edentulous mouth.</a> Archives of Oral Biology. 48, 329-336 (2003).</li>
<li>Bahlo, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Saliva-derived+DNA+performs+well+in+large-scale%2C+high-density+single-nucleotide+polymorphism+microarray+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Epidemiol+Biomarkers+Prev%22%5BJournal%5D)">Saliva-derived DNA performs well in large-scale, high-density single-nucleotide polymorphism microarray studies.</a> Cancer Epidemiol Biomarkers Prev. 19, 794-798 (2010).</li>
<li>Hu, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genotyping+performance+between+saliva+and+blood-derived+genomic+dnas+on+the+dmet+array%3A+A+comparison%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">Genotyping performance between saliva and blood-derived genomic dnas on the dmet array: A comparison.</a> PLoS ONE. 7 (3), e33968(2012).</li>
<li>Simmons, T. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Increasing+genotype-phenotype+model+determinism%3A+Application+to+bivariate+reading%2Flanguage+traits+and+epistatic+interactions+in+language-impaired+families%5BTitle%5D)+AND+%22Human+Heredity%22%5BJournal%5D)">Increasing genotype-phenotype model determinism: Application to bivariate reading/language traits and epistatic interactions in language-impaired families.</a> Human Heredity. 70, 232-244 (2010).</li>
<li>Zeugin, J. A., Hartley, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ethanol+precipitation+of+DNA%5BTitle%5D)+AND+%22Focus%22%5BJournal%5D)">Ethanol precipitation of DNA.</a> Focus. 7, 1-2 (1985).</li>
<li>Li, H., Durbin, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fast+and+accurate+short+read+alignment+with+Burrows-Wheeler+Transform%5BTitle%5D)+AND+%22Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">Fast and accurate short read alignment with Burrows-Wheeler Transform.</a> Bioinformatics. 25, 1754-1760 (2009).</li>
<li>McKenna, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Genome+Analysis+Toolkit%3A+a+MapReduce+framework+for+analyzing+next-generation+DNA+sequencing+data%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Res%22%5BJournal%5D)">The Genome Analysis Toolkit: a MapReduce framework for analyzing next-generation DNA sequencing data.</a> Genome Res. 20, 1297-1303 (2010).</li>
<li>DePristo, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+framework+for+variation+discovery+and+genotyping+using+next-generation+DNA+sequencing+data%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Genetics%22%5BJournal%5D)">A framework for variation discovery and genotyping using next-generation DNA sequencing data.</a> Nature Genetics. 43, 491-498 (2011).</li>
</ol>

למחברים אין מה לחשוף.

ההליך הנוכחי הוא פרוטוקול מיצוי DNA מותאם שהשתפר במידה ניכרת תשואה של DNA משקל המולקולרי הגבוה בהשוואה לשיטות סטנדרטית, מבלי להתפשר על איכות DNA. השלב הקריטי עם ההשפעה הגדולה ביותר על התשואה ביותר היה צעד 5.2, הכולל צעד צנטריפוגה כבר במהלך משקעים אתנול מכל פרוטוקול שפורסם סקר כאן, חוץ מאחד שלא הופץ באופן נרחב 11. לא חל שינויים באיכות DNA הקשורים לצנטריפוגה עוד זה התגלו, המצביע על כך שרוב DNA הזמינים מאוסף רוק שלם הוא לא מושפל וגבוה משקל מולקולרי. <p class="jove_cont...

קבלת DNA באיכות גבוהה עבור מחקרים גנטיים אנושיים היא חיונית בתהליך גילוי גנים למחלות. דם, אם כי דורש הליך פולשני וגם להיות יקר יותר מאשר אוסף רוק, הוא מועדף ליצירת שורות תאים הונצחו כמקור אינסופי של DNA, או iPSCs ללימודים פונקציונליים, ולפעמים DNA הדם משמש בעת שורות תאים אינן זמינות. עם זאת, קבלת דם דורשת phlebotomist מאומן ויש לו דם מחצית חיים קצרים יותר מאשר רוק 1. DNA מרוק הוא פחות יקר וקל יותר להשגה, שכן הוא יכול להיות שנאסף ונשלח באמצעות הדואר ללא הצורך בphlebotomist, ובכך להגדיל בריכות נושא הפוטנציאל הרבה מעבר לאגן ההיקוות של בתי חולים ומעבדות 2. הרשמה למחקר ניתן לשפר את האיכות יש לי נושאים האפשרות של מתן דגימת רוק במקום דם 3, 4. חששות לגבי הכמות והאיכות של DNA מרוק יכולים להיות המוגבלים הנרחבדואר למרות מחקרים שנעשה לאחרונה מחקרים רבים המראים את התאמתו של כל רוק, עם ממוצע של 4.3 x 10 5 תאים למיליליטר, לבדיקות DNA על פני שיטות מטליות buccal המבוגרות שלא לקבל כמויות משמעותיות של רוק 2, 3, 4, 5, 6. בעוד ספרות צנועה קיימת מראה את ההתאמה של DNA רוק השלם נגזר עבור יישומי גנוטיפ כולל שיטות המבוסס על microarray 8, 9, רצף 10, אין מחקרים בחנו הדור הבא (NGS). המטרה לייעול פרוטוקול חילוץ זה כל DNA הרוק הייתה למקסם את הכמות ואיכות עבור יישומי גנטיקה בדרך יעילה עלות שמיושמת בקלות במעבדות עם חומרים כימיים וחומרים נפוצים. מיצוי DNA מרוק דורש מספר הליכים: 1) איסוף ואחסון, טיפול RNase 2) תמוגה תא, 3), 4) ממטרים חלבון, 5) משקעים אתנול, 6) להחזרת נוזלי DNA. פתרון DNA ייצוב הצפת, שתוארבעבר 2, פונקציות כראוי ללא שינוי. שום ניסיון לייעל את טיפול RNase וצעדים להחזרת נוזלי DNA נעשה. לכל שלב שנותר, מספר משתנה שיכול להשפיע על תשואה זוהו. כל אחד ממשתנים היו מניפולציות באופן אישי ושיפור בתפוקה ואיכות הוערך סטטיסטי. עבור משתנים שהוצגו כדי לשפר את התשואה ו / או איכות DNA, הערכים אופטימליים נכללו בפרוטוקול הסופי.

<table><tbody><tr><td>15 מ"ל צינורות צנטריפוגה</td><td>פישר</td><td>12-565-268</td><td></td></tr><tr><td>תמיסת ליזה תאים</td><td>Qiagen</td><td>158908</td><td></td></tr><tr><td>Proteinase K</td><td>Sigma</td><td>P6556</td><td></td></tr><tr><td>תמיסת משקעים חלבון</td><td>Qiagen</td><td>158912</td><td></td></tr><tr><td>Isopropanol</td><td>Fisher</td><td>A416-4</td><td></td></tr><tr><td>גליקוגן</td><td>EZ-BioResearch</td><td>S1003</td><td></td></tr><tr><td>70% אתנול</td><td>פישר</td><td>04-355-305</td><td></td></tr><tr><td>Tris-EDTA (TE)</td><td>Fisher</td><td>BP2473-1</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Fisher</td><td>AC194090010</td><td></td></tr><tr><td>Tris HCl</td><td>Fisher</td><td>BP1757-100</td><td></td></tr><tr><td>EDTA (0.5 מ') תמיסת</td><td>Fisher</td><td>03-500-506</td><td></td></tr><tr><td>נתרן דודציל סולפט</td><td>פישר</td><td>BP166-100&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>מערבולת אנלוגית מערבולת</td><td>מיקסר פישר</td><td>02-215-365</td><td></td></tr><tr><td>צנטריפוגה 5810R</td><td>אפנדורף</td><td>5811 000.010</td><td></td></tr></tbody></table>

איסוף והפקת dna רוק לסידור הדור הבא

Collection and Extraction of Saliva DNA for Next Generation Sequencing

המקור המועדף ל-DNA במחקר גנטי אנושי הוא דם, או קווי תאים שמקורם בדם, מכיוון שמקורות אלה מניבים כמויות גדולות של DNA באיכות גבוהה. עם זאת, מיצוי DNA מהרוק יכול להניב DNA באיכות גבוהה עם מעט או ללא פירוק/פיצול המתאים למגוון בדיקות DNA ללא הוצאה של פלבוטומיסט ואף ניתן לרכוש אותו בדואר. עם זאת, נכון לעכשיו, לא הוצגו בספרות פרוטוקולי איסוף/מיצוי DNA של רוק לריצוף הדור הבא. פרוטוקול זה מייעל פרמטרים של איסוף/אחסון רוק ומיצוי DNA כך שיהיו באיכות ובכמות מספיקים לבדיקות DNA בסטנדרטים הגבוהים ביותר, כולל גנוטיפ מיקרו-מערך וריצוף הדור הבא.

כדי לקבוע פרמטרים אופטימליים להפקה DNA סדרה של עקירות DNA מזווגות בוצעה. דגימת רוק אחת פוצלה וכל מנה שנבדקה עם אחד משני ערכים אפשריים עבור משתנה נתון. לפחות שמונה חזרות של כל בדיקה לזווג בוצעו (למשל, דגימת רוק אחת הייתה aliquoted לבדוק חילוץ עם או בלי הדגירה C ° 50 ראשונית). אופטימיזציה הייתה מבוססת על ארבעה מדדים סטנדרטיים: תשואה כוללת DNA, ערך 260/280, ערך 260/230, ובדיקה ויזואלית של DNA electrophoresed להעריך פיצול. לא כל הצירופים האפשריים של המשתנים הוערכו אינטראקציות...

מיצוי DNA מרוק יכול לספק מקור זמין ל-DNA במשקל מולקולרי גבוה, עם מעט פירוק/פיצול. פרוטוקול זה מספק פרמטרים אופטימליים לאיסוף/אחסון רוק ומיצוי DNA כדי שיהיו באיכות ובכמות מספיקים לבדיקות DNA במורד הזרם עם דרישות איכות גבוהות.

איסוף והפקת DNA רוק לסידור הדור הבא

The preferred source of DNA in human genetics research is blood, or cell lines derived from blood, as these sources yield large quantities of high quality ...

המטרה הכללית של פרוצדורה זו היא להפיק DNA גנומי באיכות גבוהה מרוק מלא. דבר זה מושג תחילה על ידי ליזיס של התאים לשחרור ה-DNA. השלב השני של הפרוצדורה הוא הסרת זיהומים של RNA וחלבונים.השלב השלישי הוא להשקיע את ה-DNA הגנומי ולהסיר זיהומים או אי-ניקיות שנותרו. השלב הסופי הוא להחזיר את ה-DNA הגנומי למצב מומס (rehydrate) עבור יישומים המשכיים כגון PCR וריצוף. בסופו של דבר, ספקטרופוטומטריה ואמפליפיקציה יכולות להראות כי ה-DNA הגנומי שנאסף הוא באיכות גבוהה.היתרון המרכזי של טכניקה זו על פני ערכות איסוף הוא שהעלויות יופחתו באופן משמעותי ללא כל פגיעה בתנובת. חצי שעה לפני איסוף הרוק, על הנבדקים לשטוף את הפה במים ולאחר מכן להימנע מאכילה או שתייה עד ללקיחת הדגימה. לצורך לקיחת הדגימה, הנחו את הנבדק לירוק בדיוק 2.5 milliliters של רוק לתוך מבחנה של 15 milliliter המכילה 2.5 milliliters של תמיפת ייצוב DNA.אין לגעת בחלק הפנימי של המבחנה או בחלק הפנימי של הפקק. במהלך תהליך זה, סגרו את המבחנה עם הפקק והומוגניזו את התערובת באמצעות הפיכות ולא על ידי ניעור. לאחר מכן, אחסנו את הדגימה בטמפרטורת החדר לטווח קצר או ב-4 °C למשך עד שלושה חודשים.ההכנות כוללות חימום אמבט מים ל-37 °C והכנת שלוש מבחנות בנפח 15 milliliters. התחל בהפיכה של הדגימה מספר פעמים, ולאחר מכן ערבב אותה ב-vortex במהירות בינונית למשך 15 שניות. העבר 2.5 milliliters מהדגימה לאחת המבחנות.הוסיפו חמישה מיליליטר של תמיסת ליזיס של תאים לאליקוט וערבבו את תמיסת הליזיס לתוך הדגימה על ידי היפוך המבחנה 50 פעמים. לאחר ערבוב הדגימה, השאירו אותה לדגירה למשך 30 דקות. בטמפרטורת החדר, לאחר חצי שעה, הוסיפו 40 מיקרוליטר של RNA A בריכוז של 100 מיליגרם למילילטר לתמיסת התאים שעברו ליזיס.לאחר מכן, הפו את המבחנה במהירות חמש פעמים. הדגרו את תגובת ה-RNA בטמפרטורה של 37 °C למשך 15 דקות. לאחר מכן, קררו את המבחנה על קרח למשך שלוש דקות.בשלב זה, הגבירו את טמפרטורת אמבט המים ל-65 °C. לאחר מכן, הוציאו את המבחנה מהקרח. הוסיפו 50 µL של proteinase K וערבבו, ולאחר מכן דגרו את התגובה בטמפרטורת החדר למשך 30 דקות או במשך 16 עד 24 שעות בטמפרטורה של 4 °C.בהמשך, הוסיפו 1.7 milliliters של תמיסה להשקעת חלבונים, וערבבו את המבחנה ב-vortex למשך 20 שניות במהירות גבוהה. לאחר מכן, קררו את הדגימה על קרח למשך 10 דקות. לאחר הקירור, סבבו את הדגימה בצנטריפוגה למשך 10 דקות ב-3000 Gs ובטמפרטורה של ארבע degrees Celsius.אם המשקע אינו דחוס, קררו את הדגימה למשך חמש דקות נוספות וסבבו אותה שוב בצנטריפוגה למשך חמש דקות. חזרו על תהליך זה עד לקבלת משקע דחוס. הקפידו להשאיר את הדגימה קרה בכל עת.התחל את בידוד ה-DNA על ידי הכנת מבחנה נקייה של 15 milliliter עם חמישה milliliters של isopropanol ושמונה microliters של תמיסת glycogen בריכוז 20 milligrams per milliliter. לאחר מכן, העבר את הנוזל העליון של הדגימה שסבבה לצנטריפוגה למבחנה זו. השלך את המשקע, וערבב את הדגימה 50 פעמים על ידי היפוך.בשלב הבא, סובבו את הדגימה בצנטריפוגה במהירות של 3000 Gs ובטמפרטורה של ארבע מעלות צלזיוס למשך 30 דקות. שפכו את הנוזל העליון למבחנה נקייה אחרת בנפח 15 מיליליטר, הרחק מהמשקע. הוסיפו מיליליטר אחד של 70% ethanol ונערו בעדינות ביד על צדה למשך 30 שניות.לאחר מכן, סבב את תמיסת האתנול בצנטריפוגה למשך דקה ב-2000 Gs ובטמפרטורה של 4°C או 20°C. השלף את הנוזל העליון על ידי שפיכה איטית שלו, ולאחר מכן הוסף אתנול נוסף אל המשקע (pellet). נער את המבחנה בעדינות ביד וחזור על פעולת הסבב.לאחר מכן, שפכו שוב את האתנול באיטיות. במהלך השטיפה, המשקע עלול להתרחב. אם הוא ניתק, וודאו שהוא נשאר בתמיסת האתנול ואינו נדבק לדפנות או למכסה של המבחנה.אין להפוך את המבחנה במהלך שטיפה זו. לאחר השטיפות באתנול, השאירו את המבחנה לייבוש באוויר למשך 15 עד 30 דקות. לאחר מכן, המיסו מחדש את משקע ה-genomic DNA על ידי הוספה של 300 µL של tris EDTA.לאחר מכן, ערבבו את הדגימה במיקסר (vortex) במהירות בינונית למשך חמש שניות והעבירו אותה למקלח מים בטמפרטורה של 65 °C למשך שעה. לאחר החימום במקלח, השאירו את הדגימה לדגירה למשך לילה בטמפרטורת החדר; למחרת, ה-DNA יהיה מוכן לשימוש. בבדיקת אלקטרופורזה על ג'ל של דגימות מיצוי DNA מרוק, יופיעו באופן תקין פסי DNA בעלי משקל מולקולרי גבוה, ללא מריחה (smearing) המעידה על DNA מעובד או פגום. שלב הסרת ה-RNA הוא הכרחי ויעיל מאוד.לאחר עיכול ה-RNAs, היחס בין 260 nanometer ל-280 nanometer עומד בממוצע על 1.74. חשוב לציין כי ה-DNA מתאים לריצוף בסביבת תפוקה גבוהה (high throughput sequencing). ערכה להעשרה של מטרות (target enrichment kit) הוחלה על 24 דגימות המכוונות ל-2.6 megabases של DNA; 12 דגימות עם ברקודים רצפו בכל נתיב (lane).לכל 24 הדגימות היו נתוני NGS באיכות גבוהה, וניתן היה לזהות פולימורפיזמים של נוקלאוטיד בודד נדירים. לאחר צפייה בסרטון זה, תרכשו הבנה טובה לגבי אופן מיצוי DNA גנומי באיכות גבוהה מרוק שלם.

collection-and-extraction-of-saliva-dna-for-next-generation-sequencing

Research

JoVE Journal

Medicine

רפואה

בהתחשב רוק הדגימה עבור יישומים קליניים בעתיד, כמו סוכריה על מקל (LLUF) בדיקה ultrafiltration היה מפוברק להשתלב בחלל הפה האנושי. ניתוח ישיר של רוק לא מעוכל על ידי NanoLC-LTQ ספקטרומטריית מסה הפגינו את היכולת של בדיקות LLUF להסיר חלבונים גדולים וחלבונים שפע גבוהות, ולהפוך נמוך שפע לזיהוי פפטידים יותר.

רוק הדגימה האדם Peptidome ילידים באמצעות בדיקה Lollipop-Like Ultrafiltration: פשט ולשפר גילוי פפטיד של ספקטרומטריית מסה קלינית

Bisulfite amplicon sequencing (BSAS) היא שיטה לכימות מתילציה של ציטוזין באזורים גנומיים ממוקדים של עניין. שיטה זו משתמשת בהמרת ביסולפיט בשילוב עם הגברת PCR של אזורי יעד לפני ריצוף הדור הבא כדי לייצר כימות מוחלט של מתילציה של DNA ברמה ספציפית לבסיס.

ממוקד DNA מתילציה ניתוח על ידי רצף של הדור הבא

כתב יד זה מתאר גישה אוטומטית לבחירת גודל ג'ל לטיהור מקטעי DNA לריצוף הדור הבא. טכנולוגיית הריינג'ר מספקת אוטומציה מלאה של כל תהליך העמסת ג'ל אגרוז, ניתוח אלקטרופורטי ושחזור של שברי DNA ממוקדים המאפשרים ספריות ריצוף מהדור הבא בתפוקה גבוהה ובאיכות גבוהה.

בחירת גודל האוטומטי ג&#39;ל כדי לשפר את האיכות של ספריות רצף הדור הבא הוכן מדגימות סביבתיות מים

אנחנו מתארים שיטה יעילה, איתנה, וחסכונית לחילוץ חומצות גרעין מן מטליות לאפיון של קהילות חיידקי באמצעות רצף amplicon הגן 16S rRNA. השיטה מאפשרת גישה עיבוד משותף סוגי מדגם מרובים ויכול להכיל מספר תהליכים טיפוליים במורד הזרם.

הפקת חומצות גרעין יעיל 16S rRNA ג&#39;ין רצף עבור בקטריאלי קהילת אפיון

Metagenomics שימש לחקירת המיקרוביום של מזון בקר תחמיץ. הניתוח בוצע על ידי ריצוף רובה ציד. גישה זו שימשה לאפיון הרכב הקהילה המיקרוביאלית בתוך מזון הבקר.

Metagenomic ניתוח של תחמיץ

ההשוואה ואופטימיזציה של שתי שיטות העשרה DNA DNA organellar צמח מוצגים: צנטריפוגה ההפרש הדיפרנציאלי ואת החלוקה של gDNA הכולל מבוסס על מצב מתילציה. אנו מעריכים את כמות הדנ"א וכתוצאה מכך, מדגימים ביצועים ברצף של הדור הבא, וקוראים את הפוטנציאל לשימוש ברצף המולקולה החד-פעמית.

מיטוב וניתוח השוואתי של הצמח DNA Organnelar העשרה שיטות מתאים עבור הדור הבא רצף

כאן אנו מתארים פרוטוקול פשוט כדי ליצור פרופילי טביעת אצבע DNA על ידי הגברת VNTR לוקוס D1S80 מ- DNA תא אפיתל.

יישום של טביעת אצבע DNA באמצעות לוקוס D1S80 בשיעורי מעבדה

מתואר כאן פרוטוקול מיצוי DNA באמצעות חרוזים מגנטיים כדי לייצר עקירות DNA באיכות גבוהה יתושים. עקירות אלה מתאימות לגישת רצף של הדור הבא במורד הזרם.

פרוטוקול מיצוי DNA יתוש מבוסס חרוז מגנטי לרצף הדור הבא

פרוטוקול זה מפרט גישה מקיפה עבור כתות, רצף, ואת הרכב הגנום ההיברידי דה נובו של חיידקי השתן. הוא מספק הליך לשחזור ליצירת רצפי גנום מעגליים שלמים שימושיים בחקר יסודות גנטיים כרומוזומליים ואקסטרכרומוזומליים התורמים לקולוניזציה של שתן, פתוגנזה והפצת התנגדות מיקרוביאלית.

הרכבה הגנום ההיברידית דה נובו לייצור גנומים שלמים של חיידקי השתן באמצעות טכנולוגיות רצף קצרות וארוכות

אנו מציגים שיטה אופטימלית למיצוי DNA מליחה מזוהמת באמצעות שיטת מיצוי מבוססת מטריצה בשילוב עם טיהור חרוזים מגנטיים לריצוף ממוקד במורד הזרם של Mycobacterium tuberculosis.

מיצוי DNA מבוסס מטריצה לריצוף ממוקד של הדור הבא על דגימות ליחה מטוהרות

למדו שיטה יעילה לבידוד DNA גנומי באיכות גבוהה מרוק שלם לשימוש ב-PCR וריצוף. הפרוטוקול מספק פתרון חסכוני ללא פגיעה בתפוקה ובאיכות ה-DNA.

איסוף והפקת DNA רוק לסידור הדור הבא

גלה סרטונים נוספים