Name: פרוטוקול להדביק Elegans Caenorhabditis עם Typhimurium סלמונלה (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-06-26T15:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 50 s
Description: חקור אינטראקציות מארח-פתוגן ב-Caenorhabditis elegans באמצעות הדבקה ב-Salmonella typhimurium ושימוש ב-RNAi לזיהוי גנים חיוניים להגנה. פרוטוקול זה מאפשר ניתוח שרידות התולעים ומספק מסגרת למחקרי מנגנוני הגנה מול זיהומים.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

אנו מודים לד&quot;ר דיאן Baronas-ואל לקריאה ביקורתית של כתב היד. עבודה זו נתמכה על ידי Charles E. מידט מכללת FAU של גרנט זרע המדע ומלגות מהזדקנות הרפואית אליסון הקרן לKJ

1. צלחות XLD (קסילוז יזין Desoxycholate) אגר אגר XLD הוא מדיום גידול סלקטיבי לסלמונלה, שמופיע כמושבות שחורות על צלחות אגר XLD. עם זאת, אם אין חשש לזיהום, ניתן להחליף צלחת LB רגילה. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשקול את אגר XLD 5.5 g ו resuspend ב 5 מיליליטר מים deionized. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מערבבים היטב עד שכל אגר הוא רטוב. הוספת 95 מיליליטר מים deionized עד שכל הגושים נעלמים והבינוני הוא resuspended לחלוטין. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מרתיחים את המדיום כדי להמס לחלוטין (לא חיטוי). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מגניב הבינוני בטמפרטורת חדר כדי 50 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> יוצקים 25 אגר מיליליטר בכל 95 x 15 מ&quot;מ צלחת (גובה x קוטר) (צלחות חתומות עם Parafilm יכולות להיות מאוחסן על 4 מעלות צלזיוס למשך עד חודש 1). </li></ol> 2. צמיחה נמטודות בינוני (NGM) RNAi האכלת צלחות הכנת ג צלחות elegans NGM כבר תוארו בעבר 1<html> 9. הנה הליך מתואר בקצרה להוסיף אמפיצילין האנטיביוטיקה ואיזופרופיל inducer הכימי RNAi β-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG) לתקשורת NGM לעשות צלחות האכלת RNAi. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להמס 3 גרם NaCl ו2.5 peptone גרם Bacto בליטר המים deionized 1. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוספת 17 אגר Bacto גרם לכלי התקשורת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> החיטוי התקשורת 45 דקות ולקרר את התקשורת ל50 מעלות צלזיוס באמבט מים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להוסיף את הפתרונות הבאים: כולסטרול מיליליטר 1 (5 מ&quot;ג / מיליליטר ב95% אתנול), 1 מיליליטר 1 M CaCl 2, 1 מיליליטר 1 M MgSO 4, ו25 מיליליטר 1 M חיץ אשלגן זרחה (pH 6.0). מערבבים היטב. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 1 מיליליטר 1 M IPTG ו500 אמפיצילין μl (100 מ&quot;ג / מיליליטר במים סטריליים). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מערבבים את הפתרון טוב ויוצקים לתוך 60 x 15 מ&quot;מ (גובה x קוטר) צלחות פטרי באמצעות סיוע Pipet ו25 מיליליטר פיפטה סרולוגיות בעקבות הליכי סטרילי. ממלא כל צלחת עם אגר מיליליטר 12. ניתן לאחסן צלחות על 4 מעלות צלזיוס עד חודש 1. </li></ol>&quot;Jove_title&quot;&gt; 3. הכן את בעלי חיים שטופלו RNAi לזיהום גן autophagy החיוני BEC-1 משמש כדוגמא כדי לבחון את תפקודו של גן מארח בהגנה מפני זיהום סלמונלה. הפרוצדורות הן באיור 1 ולוח 1. הפרוטוקול להכנת חיות שטופלו ב-RNAi לזיהום הבא, עם היום של כל שלב ניסיוני שניתן בסוגריים. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחסן האכלת RNAi BEC-1 ובקרת וקטור הריק L4440 RNAi האכלת חיידקים על ידי הצבת פתית של -80 חיידקים קפואים מעלות צלזיוס ל -2 מיליליטר מדיום LB בתוספת 100 מ&quot;ג / מיליליטר אמפיצילין (יום 1). חזור על פעולה זו פעם בשבוע במהלך כל הניסוי יש חיידקי RNAi טריים. אחסן את התרבות במקרר 4 ° C, כאשר אינו בשימוש. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> זרעים של תרבות חיידקי RNAi לילה 100 מיליליטר על צלחות RNAi. הכן שלושה RNAi BEC-1 ושלוש השליטה v הריקEctor צלחות RNAi. דגירה הצלחות ב 37 ° C במשך לילה (יום 2). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את צלחות RNAi מ37 מעלות צלזיוס החממה ולאפשר להם להתקרר לטמפרטורת חדר על הספסל. תרים הרמפרודיטים N2 סוג בר L4 ייזונו היטב, ולהעביר אותם ל-BEC 1 RNAi ולשלוט צלחות RNAi וקטור ריקות. הנח שלושה תולעים לכל צלחת, על צלחות בשלושה עותקים. באותו היום, להכין צלחות RNAi כמתואר בשלב 3.2 (יום 3). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה צלחות RNAi עם תולעים בחממת 20 מעלות צלזיוס במשך 36-40 תולעי שעה ומעביר לצלחות RNAi מקבילה טריות מוכנות בשלב 3.3. אחרי התולעים מועברים, דגירה הצלחות בחממת C ° 20 ל64 שעה (יום 4). </li></ol> 4. הכן סלמונלה לזיהום <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> סלמונלה Streak -80 ° C מניות קפוא על צלחת אגר XLD 1 ו דגירה את הצלחת על 37 ° C במשך הלילה (יום 5 </strong&gt;). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פיק מושבה סלמונלה השחורה מבודדת היטב ולחסן אותו בכ -2 מיליליטר מדיום LB על 37 מעלות צלזיוס עם רעד הלילה (יום 6). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תרבות לילה זרע 80 מיליליטר סלמונלה על 1 ג elegans 60 x 15 מ&quot;מ (גובה x קוטר) צלחת אגר NGM ולהכין 6 צלחות בסך הכל. דגירה הצלחות בטמפרטורת חדר למשך 6 שעות. תרבות החיידקים צריכה להתייבש ויוצרת דשא על הצלחת (יום 7). </li></ol> 5. תולעים שטופלו ב-RNAi להדביק עם סלמונלה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העבר את BEC-1 ולשלוט הרמפרודיטים ריקים וקטור טופלו RNAi L4 N2 (צאצאים של תולעים שהוקמו בשלב 3) לצלחות סלמונלה שטופלה RNAi. הנח 40 תולעים לכל צלחת על 3 צלחות עבור כל קבוצה. דגירה צלחות התולעת ב20 מעלות צלזיוס במשך 48 שעות (יום 7). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן את הסט אחד של צלחות RNAi טריות כמתואר בשלבי 3.1 ו3.2 (יום 7 ו <strong&gt; יום 8). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר 48 זיהום שעה, להעביר תולעים הנגועים בסלמונלה לצלחות RNAi המתאימות מוכנות בשלב 5.2 ולדגור על 20 ° C (יום 9). </li></ol> 6. הישרדות Assay <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ציון ההישרדות של תולעים יומיים ולהעביר את תולעים לצלחות RNAi מתאימים טריות בתקופת הטלת הביצים. להכין סט של צלחות RNAi טריות לפני כל העברת תולעת כמתואר בשלבי 3.1 ו3.2. לגעת בגוף התולעת (הראש, חלק וזנב באמצע) בעדינות עם חוט פלטינה שיטח סוף. תולעת הוא הבקיע כמת אם לא תנועה של גוף התולעת הוא ציינה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ציון ההישרדות של תולעים ביום או בכל יום אחר, ולהעביר את תולעים לצלחות RNAi מתאימים טריות פעמיים בשבוע אחרי התולעים יפסיקו להטיל ביצים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אחרי הכל התולעים למות, בריכת נתוני הישרדות מצלחות בשלושה עותקים כסט נתונים אחד. קלט נתוני ההישרדות של כל קבוצה לתוך תוכנה סטטיסטית מתאימה כגון GraphPad Prism ליצור עקומות הישרדות ולבצע ניתוח הישרדות Kaplan-Meier. כל הניסוי חוזר על עצמו לפחות פעם אחת כדי לאשר את המסקנה. </li></ol>

<ol><li>Riddle, D. L., Blumenthal, T., Meyer, B. J., Priess, J. R. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aRiddle%2C+DL+%22C.+elegans+II%22">C. elegans II</a>. , (1997).</li>
<li>Brenner, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Genetics+of+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">The Genetics of Caenorhabditis elegans.</a> Genetics. 77, 71-94 (1974).</li>
<li>Aballay, A., Ausubel, F. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Caenorhabditis+elegans+as+a+host+for+the+study+of+host-pathogen+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Caenorhabditis elegans as a host for the study of host-pathogen interactions.</a> Curr Opin Microbiol. 5, 97-101 (2002).</li>
<li>Kurz, C. L., Ewbank, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Caenorhabditis+elegans%3A+an+emerging+genetic+model+for+the+study+of+innate+immunity%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Genet%22%5BJournal%5D)">Caenorhabditis elegans: an emerging genetic model for the study of innate immunity.</a> Nat Rev Genet. 4, 380-390 (2003).</li>
<li>Mylonakis, E., Aballay, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Worms+and+flies+as+genetically+tractable+animal+models+to+study+host-pathogen+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Infection+and+Immunity%22%5BJournal%5D)">Worms and flies as genetically tractable animal models to study host-pathogen interactions.</a> Infection and Immunity. 73, 3833-3841 (2005).</li>
<li>Ford, M. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+descriptive+study+of+human+Salmonella+serotype+typhimurium+infections+reported+in+Ontario+from+1990+to+1997%5BTitle%5D)+AND+%22Can+J+Infect+Dis%22%5BJournal%5D)">A descriptive study of human Salmonella serotype typhimurium infections reported in Ontario from 1990 to 1997.</a> Can J Infect Dis. 14, 267-273 (2003).</li>
<li>Voetsch, A. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((FoodNet+estimate+of+the+burden+of+illness+caused+by+nontyphoidal+Salmonella+infections+in+the+United+States%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Infect+Dis%22%5BJournal%5D)">FoodNet estimate of the burden of illness caused by nontyphoidal Salmonella infections in the United States.</a> Clin Infect Dis. 38 Suppl 3, (2004).</li>
<li>Aballay, A., Yorgey, P., Ausubel, F. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Salmonella+typhimurium+proliferates+and+establishes+a+persistent+infection+in+the+intestine+of+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Biol%22%5BJournal%5D)">Salmonella typhimurium proliferates and establishes a persistent infection in the intestine of Caenorhabditis elegans.</a> Curr Biol. 10, 1539-1542 (2000).</li>
<li>Alegado, R. A., Tan, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Resistance+to+antimicrobial+peptides+contributes+to+persistence+of+Salmonella+typhimurium+in+the+C.+elegans+intestine%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Resistance to antimicrobial peptides contributes to persistence of Salmonella typhimurium in the C. elegans intestine.</a> Cell Microbiol. 10, 1259-1273 (2008).</li>
<li>Jia, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Autophagy+genes+protect+against+Salmonella+typhimurium+infection+and+mediate+insulin+signaling-regulated+pathogen+resistance%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Autophagy genes protect against Salmonella typhimurium infection and mediate insulin signaling-regulated pathogen resistance.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106, 14564-14569 (2009).</li>
<li>Tenor, J. L., McCormick, B. A., Ausubel, F. M., Aballay, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Caenorhabditis+elegans-based+screen+identifies+Salmonella+virulence+factors+required+for+conserved+host-pathogen+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Biol%22%5BJournal%5D)">Caenorhabditis elegans-based screen identifies Salmonella virulence factors required for conserved host-pathogen interactions.</a> Curr Biol. 14, 1018-1024 (2004).</li>
<li>Levine, B., Klionsky, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+by+self-digestion%3A+molecular+mechanisms+and+biological+functions+of+autophagy%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Cell%22%5BJournal%5D)">Development by self-digestion: molecular mechanisms and biological functions of autophagy.</a> Developmental Cell. 6, 463-477 (2004).</li>
<li>Birmingham, C. L., Smith, A. C., Bakowski, M. A., Yoshimori, T., Brumell, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Autophagy+controls+Salmonella+infection+in+response+to+damage+to+the+Salmonella-containing+vacuole%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Autophagy controls Salmonella infection in response to damage to the Salmonella-containing vacuole.</a> J Biol Chem. 281, 11374-11383 (2006).</li>
<li><a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+C.+elegans+Sequencing+Consortium.+Genome+sequence+of+the+nematode+C.+elegans%3A+a+platform+for+investigating+biology%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">The C. elegans Sequencing Consortium. Genome sequence of the nematode C. elegans: a platform for investigating biology.</a> Science. 282, 2012-2018 (1998).</li>
<li>Fire, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Potent+and+specific+genetic+interference+by+double-stranded+RNA+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Potent and specific genetic interference by double-stranded RNA in Caenorhabditis elegans.</a> Nature. 391, 806-811 (1998).</li>
<li>Kamath, R. S., Martinez-Campos, M., Zipperlen, P., Fraser, A. G., Ahringer, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effectiveness+of+specific+RNA-mediated+interference+through+ingested+double-stranded+RNA+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Biol%22%5BJournal%5D)">Effectiveness of specific RNA-mediated interference through ingested double-stranded RNA in Caenorhabditis elegans.</a> Genome Biol. 2, 1-10 (2001).</li>
<li>Liang, J., Xiong, S., Savage-Dunn, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Using+RNA-mediated+interference+feeding+strategy+to+screen+for+genes+involved+in+body+size+regulation+in+the+nematode+C+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Using RNA-mediated interference feeding strategy to screen for genes involved in body size regulation in the nematode C elegans.</a> J. Vis. Exp. (72), (2013).</li>
<li>Fraser, A. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+genomic+analysis+of+C.+elegans+chromosome+I+by+systematic+RNA+interference%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Functional genomic analysis of C. elegans chromosome I by systematic RNA interference.</a> Nature. 408, 325-330 (2000).</li>
<li>Stiernagle, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Maintenance+of+C.+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22WormBook%3A+the+online+review+of+C+elegans+biology%22%5BJournal%5D)">Maintenance of C. elegans.</a> WormBook: the online review of C elegans biology. , 1-11 (2006).</li>
<li>Aballay, A., Ausubel, F. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Programmed+cell+death+mediated+by+ced-3+and+ced-4+protects+Caenorhabditis+elegans+from+Salmonella+typhimurium-mediated+killing%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Programmed cell death mediated by ced-3 and ced-4 protects Caenorhabditis elegans from Salmonella typhimurium-mediated killing.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 98, 2735-2739 (2001).</li>
<li>Melendez, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Autophagy+genes+are+essential+for+dauer+development+and+lifespan+extension+in+C.+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Autophagy genes are essential for dauer development and lifespan extension in C. elegans.</a> Science. 301, 1387-1391 (2003).</li>
</ol>

החוקרים מצהירים כי אין להם אינטרסים כלכליים מתחרים.

סי אלגנס הוא אורגניזם מודל גנטי פשוט שאוכלת חיידקים כמקור התזונתי שלה. לפיכך, קל להחליף החיידקים שבמזון הרגיל שלו עם הפתוגן מעיים כדי לחקור את יחסי הגומלין בין ג elegans ופתוגן שנבחר. במסמך פרוטוקול מתואר לשלב זיהום סלמונלה ו-C elegans RNAi האכלת טיפול כדי לבחון את התפקיד של גנים מארח בהגנה מפני זיהום סלמונלה. פרוטוקולי זיהום קודמים לחשוף ג תולעי elegans לחיידקים פתוגניים כוללים סלמונלה במהלך חייהם 20. בפרוט...

נמטודות הקרקע המתגוררות ללא Caenorhabditis elegans היא אורגניזם מודל פשוט וגנטי צייתן שימוש ללמוד הרבה שאלות ביולוגיות. ג elegans דומיננטי קיים כהרמפרודיטים דישון עצמיים. זכרים שנוצרו באופן ספונטני על ידי אי - חוסר התאמה של כרומוזום X במהלך 1,2 gametogenesis. בנוכחותו של מזון בשפע, ג elegans לפתח ברציפות בארבעה שלבי זחל למבוגרים. טמפרטורה גם משפיעה ג פיתוח elegans; פיתוח מהיר יותר היא נצפתה בטמפרטורות גבוהות יותר. במעבדה, ג elegans הוא תרבית בטמפרטורה סטנדרטית של C ° 20 על צלחות אגר עם coli Escherichia זרע החיידק (זן OP50) כמזון 1,2. בעשור האחרון, ג elegans התפתחה האורגניזם חסר חוליות ללמוד אינטראקציות בין המאכסן לפתוגן 3-5. בטבע, ג elegans אוכל חיידקים כnutrien1,2 המקור לא. האוכל שלה נורמלי חיידקים במעבדה, OP50, ניתן להחליף בקלות עם פתוגנים אחרים כדי לבחון את יחסי הגומלין בין ג elegans וכל פתוגן שנבחר. בתנאים אלה, המעי הוא האתר העיקרי של הזיהום. אכן, מגוון רחב של חיידקים פתוגנים הוכח להדביק קטלני ג elegans 3-5. סלמונלה חיידק גראם שלילי היא הפתוגן במערכת העיכול שגורם למחלות שמקורן במזון לבני אדם ברחבי העולם 6,7. ג elegans הוא מארח מודל טוב לסלמונלה typhimurium כחיידק הזה משכפל ותערוכות דלקות מעיים מתמשכות 8-10. ג elegans נעשה שימוש כדי לזהות גם רומן וארסיות סלמונלה ידועה קודם לכן גורמי 11. מעניין לציין, כי ג מערכת חיסונית elegans מגבילה הצלחת שכפול סלמונלה. זה כבר דווח בעבר כי inhibition של גנים autophagy הופך שכפול סלמונלה מוגבר בג elegans, וכתוצאה מכך למוות המוקדם של תולעים נגועים 10. Macroautophagy (המכונה במסמך זה כלautophagy) הוא תהליך דינמי הכולל ארגון מחדש של קרומי subcellular לעקל ציטופלסמה ואברונים למסירה הליזוזום לפירוק 12. Autophagy דווח להגביל את שכפול סלמונלה בג elegans ואצל יונקי 10,13. ג הגנום elegans היה הגנום תאיים אוקריוטים הראשון רצף; הוא מגיב לטיפול RNAi 14-16. יתר על כן, יכול להיות מנוהל ביעילות על ידי חשיפת RNAi תולעים לבלוע חיידקים המכילים פעמיים תקועים RNA של גן המטרה, המכונה RNAi האכלת 16,17. ספריות האכלת הגנום כולו RNAi כבר נוצרו עבור RNAi הגנום הקרנת 16,18. בזאת, הפרו זיהום סלמונלהtocol בשילוב עם RNAi האכלה כדי לאפשר ג הבדיקה גנים elegans של עניין ביכולתם על מנת להגן מפני זיהום סלמונלה.

<table><tbody><tr><td>LB מרק</td><td>פישר</td><td>BP9723-500</td><td></td></tr><tr><td>XLD אגר</td><td>EMD כימיקלים</td><td>1.05287.0500</td><td></td></tr><tr><td>בקטו אגר</td><td>פישר</td><td>DF0140-01-0</td><td></td></tr><tr><td>פפטון</td><td>פישר</td><td>BP1420-500</td><td></td></tr><tr><td>נתרן כלורי</td><td>פישר</td><td>S671-500</td><td></td></tr><tr><td>סידן כלורי</td><td>פישר</td><td>C69-500</td><td></td></tr><tr><td>מגנזיום גופרתי</td><td>פישר</td><td>M65-500</td><td></td></tr><tr><td>IPTG</td><td>זהב ביוטכנולוגיה</td><td>12481C50</td><td></td></tr><tr><td>כולסטרול</td><td>סיגמא</td><td>C8667-25G</td><td></td></tr><tr><td>אמפיצילין</td><td>פישר</td><td>BP1760-25</td><td></td></tr><tr><td>סלמונלה טיפימוריום</td><td>ATCC</td><td>צלחת</td> פטרי ATCC14028 <td></td></tr><tr><td>95 x 15 מ"מ</td><td>פישר</td><td>FB0875714G</td><td></td></tr><tr><td>צלחת פטרי 60 x 15 מ"מ&nbsp;</td><td>פישר</td><td>08-757-13A</td><td></td></tr><tr><td>פלקון פיפט סרולוגי</td><td>פישר</td><td>13-668-2</td><td></td></tr><tr><td>פלקון אקספרס פיפט-אייד</td><td>פישר</td><td>13-675-42</td><td></td></tr><tr><td>MaxQ6000 אינקובטור טלטול&nbsp;</td>חממת <td>Thermo Scientific</td><td>SHKE6000-7</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Percival</td><td>I-36DL</td><td></td></tr></tbody></table>

פרוטוקול להדביק<em&gt; elegans caenorhabditis</em&gt; עם<em&gt; typhimurium סלמונלה</em

A Protocol to Infect Caenorhabditis elegans with Salmonella typhimurium

בעשור האחרון, ג elegans התפתחה האורגניזם חסר חוליות ללמוד אינטראקציות בין מארחים ופתוגנים, כולל ההגנה המארחת נגד סלמונלה typhimurium חיידק גראם שלילי. סלמונלה קובעת זיהום מתמשך במעי של ג elegans ותוצאות במוות המוקדם של בעלי חיים נגועים. מספר מנגנוני חסינות זוהה בג elegans כדי להתגונן מפני זיהומי סלמונלה. Autophagy, מסלול השפלה lysosomal אבולוציונית שימור, הוכח להגביל את שכפול סלמונלה בג elegans וביונקים. הנה, בפרוטוקול מתואר להדביק ג elegans עם typhimurium סלמונלה, שבו התולעים נחשפים לסלמונלה לזמן מוגבל, בדומה לזיהום סלמונלה בבני אדם. זיהום סלמונלה מקצר את תוחלת החיים של ג באופן משמעותי elegans &lt;/ Em&gt;. שימוש בגן autophagy החיוני BEC-1 כדוגמא, אנחנו בשילוב שיטת זיהום זה עם ג elegans RNAi האכלת גישה והראה פרוטוקול זה יכול לשמש כדי לבחון את תפקידו של ג גנים מארח elegans בהגנה מפני זיהום סלמונלה. מאז ג elegans ספריות RNAi הגנום כולו זמינות, פרוטוקול זה מאפשר למסך באופן מקיף לג גנים elegans כי להגן מפני סלמונלה ופתוגנים מעיים אחרים באמצעות ספריות RNAi הגנום כולו.

ב 20 ° C, תוחלת החיים הממוצעת של תולעי N2 סוג בר היא 17 ימים (איור 2 א וטבלה 2). זיהום סלמונלה מקטין באופן משמעותי את תוחלת החיים הממוצעת של תולעי N2 ל10.5 ימים (p = 0.0002, בדיקת יומן דרגה) (איור 2A ). אם ג גן elegans ממלא תפקיד חשוב בהגנה מפני זיהום סלמונלה, הוא ניבא כי עיכובה יהיה להקנות את רגישות לזיהום סלמונלה. למעשה, בהשוואה לבעל...

סי אלגנס התפתחה כמודל גנטי חדש כדי לחקור אינטראקציות בין המאכסן לפתוגן. כאן אנו מתארים פרוטוקול להדביק ג elegans עם typhimurium סלמונלה בשילוב עם טכניקת התערבות RNAi גדיל פעמיים כדי לבחון את התפקיד של גנים מארח בהגנה מפני זיהום סלמונלה.

פרוטוקול להדביק<em&gt; Elegans Caenorhabditis</em&gt; עם<em&gt; Typhimurium סלמונלה</em

In the last decade, C. elegans has emerged as an invertebrate organism to study interactions between hosts and pathogens, including the host defense ...

המטרה הכללית של פרוצדורה זו היא להדביק את ה-elegans ב-salmonella כדי לבחון אינטראקציות בין מאחס לפתוגן. הדבר מושג תחילה על ידי עיכוב ביטוי של גן במאחס באמצעות RNAi. השלב השני של הפרוצדורה הוא הדבקת תולעים שעברו טיפול ב-RNAi ב-salmonella.את הזיהום עוצרים על ידי העברת התולעים המזוהמות לצלחות הזנה של rna eye שאינן פתוגניות. השלבים הסופיים הם תיעוד הישרדותן של התולעים המזוהמות. חשבו את שיעור ההישרדות מנתונים אלו, ובסופו של דבר זהו גנים החיוניים להגנה מפני salmonella.את הפרוצדורה תדגים ג'ולי ג'ון, טכנאית ממעבדה. התחילו בהכנת צלחות התרבית הנדרשות. ראשית, הכינו צלחות אגר XLD.הם סלקטיביים לסלמונלה, המופיעה כמושבות שחורות בצלחות אלו. יש לוודא כי מבצעים השהיה של אגר XLD במים בריכוז של גרם אחד למיליליטר לפני הערבוב לנפח המים המלא. אין לבצע עיקור באוטוקלאב.אגר זה חומם באמצעות פלטה חשמלית. המשיכו בהכנת פלטות XLD בקוטר 95 מילימטר, תוך הוספת 25 מיליליטר של אגר לכל פלטה. להכנת פלטות הזנה מסוג NGM עם RNAI, כדי ליצור את מה שנקרא פלטות RNAI, השתמשו בשיטות סטנדרטיות; בקצרה, הוסיפו אמפיסילין והמשרה הכימי של RNAi, IPTG, למצע לאחר עיקור באוטוקלאב.לאחר הקירור, יש למלא צלחות בנפח 60 מילימטר עם 12 מיליליטר של אגר; הצלחות נשמרות עד חודש, בטמפרטורה של 4°C לפני השימוש. ראשית הן מדגרות עם חיידקים. בדוגמה זו, Beck one הוא הגן המטרה כיוון שהוא חיוני להגנה מפני salmonella.התחילו בהכנת תרביות ה-RNAI והביקורת. הוסיפו פתית של חיידקים קפואים מאחסון של 80- מעלות צלזיוס לשני מיליליטר של lb עם אמפיסילין. החיידקים צריכים לבטא את ה-RNAi או לא לבטאו, אך עדיין להכיל וקטור ריק.העבירו את שני התרביות הללו לאינקובטור והבקיעו אותם למשך הלילה. יש לבצע זאת על בסיס שבועי כדי שהבקטריות יהיו זמינות תמיד למחרת. זרעו 100 µL מהתרבית לתוך צלחות ה-RNA eye.הכינו לפחות שלוש מבחנות מכל סוג של פלטה, הן עבור הקבוצה הניסויית והן עבור קבוצת הביקורת. דגרו פלטות אלו בטמפרטורה של 37 °C למשך לילה. למחרת, הביאו את הפלטות לטמפרטורת החדר.לאחר מכן, העבירו לצלחות הרמפרודיטים מסוג wild type N two בשלב L four שהוזנו היטב. שלושה תולעים לצלחת יספיקו. דגרו את הצלחות הללו בטמפרטורה של 20 °C באותו היום.הכינו פלטות RNAi נוספות עם חיידקים מתרבים. לאחר 36 עד 40 שעות ב-20 degrees Celsius, העבירו את התולעים מפלטות ה-RNAi הראשונות לפלטות ה-RNAi החדשות. לאחר מכן, החזירו אותן ל-20 degrees Celsius למשך 64 שעות נוספות.התחילו במריחה של מStarSXml של salmonella מהמקפיא של 80- מעלות צלזיוס על פלטת XLD. דגרו את הפלטה ב-37 מעלות צלזיוס למשך לילה. למחרת, בחרו מושבה שחורה מבודדת מהפלטה והחדירו אותה לשני מיליליטר של lb.הגדירו את המכשיר לנער למשך הלילה בטמפרטורה של 37 °C עד למחרת בבוקר. השתמשו ב-LB המחודיד כדי לזרוע שש צלחות NGM. מרחו 80 µL על כל צלחת; לאחר שישה שעות בטמפרטורת החדר, תרבית החיידקים אמורה להתייבש ותגדיל להיווצרות של Lawn על צלחות ה-NGM.לאחר מכן, העבירו את התולעים שטופלו ב-RNAi ואת התולעים מקבוצת הביקורת לשש צלחות. העמיסו 40 תולעים לכל צלחת והדגירו אותן בטמפרטורה של 20 °C למשך 48 שעות. החל משלב זה, הכינו מדי יום צלחות RNAi חדשות.זאת כדי שהם יהיו מוכנים בעוד יומיים ובכל יום לאחר מכן עבור בדיקת ההישרדות. לאחר 48 שעות, העבירו את התולעים המודבקות בחזרה לצלחות RNAi שהוכנו טרי או לצלחות ביקורת עם וקטור ריק. החזירו צלחות אלו לאינקובטור בטמפרטורה של 20 degree Celsius לאחר מכן, מדי יום בסביב זמן הטלת הביצים שלהן.בצעו דירוג של הישרדות התולעים והעבירו את השורדות לצלחות RNA עיניות טריות כדי לדרג את ההישרדות. נגעו בעדינות בבטן התולעת באמצעות תיל פלטינה שטוח. אם אין תגובה, התולעת מתה.במהלך תקופת הטלת הביצים. יש לזהות את התולעים אשר מתו עקב היגיינה פנימית. יש להסיר תולעים אלו באופן שוטף.הנתונים יהיו מסודרים באופן משמעותי אם תולעת חלבון זו תיספר בבירור כתולעת ניסויית. ברגע שהתולעת מפסיקה להטיל ביצים, יש להעבירה לצלחות RNAI טריות פעמיים בשבוע בלבד. לאחר מות האוכלוסיות, רכז את הנתונים שלהן ושרטט את ההישרדות שלהן על עקומות Kaplan-Meier.בלא קשר למסקנה, בצעו את הניסוי לפחות פעמיים כדי להיות בטוחים. בטמפרטורה של 20 °C, תווי החיים החציוני של תולעי N two מסוג wild type הוא 17 ימים. זיהום ב-Salmonella מקצר באופן משמעותי את תווי החיים החציוני של תולעי N two ל-10.5 ימים, כפי שצפוי בטיפול ב-Beck one RNAi.ירידה בשיעור ההישרדות לאחר זיהום בסלמונלה. תוחלת החיים הממוצעת ירדה מ-10.5 לתשעה ימים, וגם תוחלת החיים המקסימלית הייתה קצרה משמעותית. ממצא התומך בתפקידו של Beck one בהגנה של sea elegance מפני זיהום.בעלי חיים שטופלו ב-Beck one RNAi, אך לא טופלו ב-salmonella. לא נצפה שינוי משמעותי באורך החיים. לאחר צפייה בסרטון זה, תהיה לכם הבנה טובה של אופן ביצוע גישת ה-RNA ושל פרוטוקול ההדבקה לבחינת תפקידו של גן המארח בהגנה מפני זיהום ב-salmonella.

a-protocol-to-infect-caenorhabditis-elegans-with-salmonella

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

אימונולוגיה וזיהומים

מקור: צ'ן, י. ואחרים. הערכת אלימות ופתוגנזה של זיהום Aeromonas במודל Caenorhabditis elegans . J. Vis. Exp. (2018)הסרטון הזה מדגים בדיקת הישרדות באמצעות C. elegans למידול פתוגנזה של Aeromonas , שבה בליעת חיידק דרך הפה מובילה לזיהום במעי ולמוות, ומאפשרת הערכה כמותית של אלימות חיידקית במערכת מארחת חיה.

מידול פתוגנזה של Aeromonas ב-C. elegans באמצעות מבחן הישרדות

Wormsorter מאפשר מסכי גנטיים בelegans Caenorhabditis ידי מיון תולעים לפי ביטוי של כתבי ניאון. כאן, אנו מתארים את השימוש חדש: מיון על פי קולוניזציה על ידי פתוגן-GFP-לבטא, ואנו מעסיקים אותו כדי לבחון את התפקיד הבין היטב הכרת הפתוגן בייזום תגובה חיסונית.

הפרדה אוטומטית של<em&gt; ג elegans</em&gt; יישבו variably ידי פתוגן חיידקים

סי אלגנס בדרך כלל הוא גדל על צלחות אגר מוצקות או נוזליים בתרבויות זרע עם א ' coli. כדי למנוע תוצרי לוואי חיידקים מבלבול מחקרי טוקסיקולוגי ותזונתיים, אנו מנוצלים מדיום נוזלי axenic, CeHR, לגדול ולסנכרן מספר רב של תולעים עבור מגוון רחב של יישומים במורד הזרם.

Culturing Elegans Caenorhabditis בAxenic נוזלית מדיה ובריאה של תולעים מהונדסים ידי microparticle הפצצה

כאן, אנו מציגים את תולעים נימיות Caenorhabditis elegans כמודל מארח רב-תכליתי ללמוד אינטראקציה מיקרוביאלי.

נמטודות. Caenorhabditis Elegans - מודל רב תכליתי In Vivo ללמוד אינטראקציות מארח-חיידק

דג זברה (רזבורה rerio) הופכים נפוץ חוליות במודל חיה מושבת חיידקים, פתוגנזה. פרוטוקול זה המתאר את השימוש protozoan סנדלית caudatum כרכב שמקורם במזון זיהום בדג זברה הזחלים. Caudatum פ ברצון ולהרזיה חיידקים, לקבל נלקח על ידי דג זברה זחל דרך ההתנהגות טרף ושהם הטבעיים.

באמצעות את Protozoan סנדלית caudatum כמו רכב עבור זיהומים שמקורם במזון הזחלים דג זברה

פרוטוקול זה מתאר מודל העכבר של סלמונלה פיברוזיס המעי מונחה הדומה הסימנים העיקריים מפתח פתולוגי של מחלת קרוהן כולל דלקת קיר ופיברוזיס. שיטה זו יכולה לשמש כדי להעריך גורמים מארחים לשנות את התוצאות הפיברוטיות באמצעות עכברים מוטציה המתוחזקות על C57Bl/6 רקע גנטי.

סלמונלה כרונית זיהום דלקת מעיים פיברוזיס

הפרוטוקול הבא מתאר את הפיתוח והאופטימיזציה של זרימת עבודה בתפוקה גבוהה עבור גידול תולעים, הדמיה פלואורסצנטית ועיבוד תמונה אוטומטי כדי לכמת אגרגטים של פוליגלוטמין כהערכה של שינויים בפרוטאוסטזיס.

אוטומציה של כימות מצטבר ב - Caenorhabditis elegans

הזיהום של Caenorhabditis elegans על ידי הטפיל המיקרוספורידי Nematocida parisii מאפשר לתולעים לייצר צאצאים שעמידים מאוד לאותו פתוגן. זוהי דוגמה לחסינות תורשתית, תופעה אפיגנטית לא מובנת היטב. הפרוטוקול הנוכחי מתאר את המחקר של חסינות תורשתית במודל תולעת הניתנת למתיחה גנטית.

חקר חסינות תורשתית במודל Caenorhabditis elegans של זיהום מיקרוספורידיה

חיידקי מעיים עשויים להשפיע באופן חיובי או שלילי על בריאות המארח שלהם באמצעות מנגנונים ספציפיים או שמורים. Caenorhabditis elegans היא פלטפורמה נוחה לסינון עבור חיידקים כאלה. הפרוטוקול הנוכחי מתאר סינון בתפוקה גבוהה של 48 חיידקים מבודדים להשפעה על עמידות לעקה של נמטודה, המשמשים כפרוקסי לבריאות התולעים.

הקרנה בתפוקה גבוהה של מבודדים מיקרוביאליים עם השפעה על בריאות Caenorhabditis elegans

פרוטוקול זה מתאר שיבוש של 96 קידוחים של קאנורהבדיטיס אלגאן (Caenorhabditis elegans ) המיושבים בחיידקים בעקבות שיתוק קר והלבנת פני השטח כדי לסלק חיידקים חיצוניים. התרחיף המתקבל מצופה על לוחות אגר כדי לאפשר כימות מדויק בתפוקה בינונית של עומס חיידקים במספר גדול של תולעים בודדות.

שימוש בנתונים של תולעת בודדת כדי לכמת את ההטרוגניות באינטראקציות של Caenorhabditis elegans-Bacterial

חקור אינטראקציות מארח-פתוגן ב-Caenorhabditis elegans באמצעות הדבקה ב-Salmonella typhimurium ושימוש ב-RNAi לזיהוי גנים חיוניים להגנה. פרוטוקול זה מאפשר ניתוח שרידות התולעים ומספק מסגרת למחקרי מנגנוני הגנה מול זיהומים.

פרוטוקול להדביק

גלה סרטונים נוספים