Name: הקלטות תיקון מהדק כל התא מMorphologically- וinterneurons היפוקמפוס זיהה Neurochemically (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-09-30T13:00:00.000+00:00
Duration: 14 min 37 s
Description: למדו לבצע הקלטות תיקון מהדק כל התא מנוירונים מהיפוקמפוס חיוביים לפרואלבומין. שיטה זו מאפשרת לחקור השפעות מדיאטות של קולטני GABA B ולסווג נוירונים מעכבים לפי קריטריונים מורפולוגיים ונוירוכימיים.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

המחברים מבקשים להודות לנד Wolter לקבלת הסיוע הטכני המעולה שלה. חולדות מהונדסים VGAT-ונוס נוצרו על ידי בני הזוג. י &#39;Yanagawa, מ&#39; Hirabayashi וי &#39;קוואגוצ&#39;י במכון הלאומי למדעים פיסיולוגיים, אוקזקי, יפן, באמצעות pCS2-ונוס הניתן על ידי ד&quot;ר א&#39; מיאווקי.

<ol><li>Freund, T. F., Buzsáki, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interneurons+of+the+hippocampus%5BTitle%5D)+AND+%22Hippocampus%22%5BJournal%5D)">Interneurons of the hippocampus.</a> Hippocampus. 6 (4), 347-470 (1996).</li>
<li>Meyer, A. H., Katona, I., Blatow, M., Rozov, A., Monyer, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+labeling+of+parvalbumin-positive+interneurons+and+analysis+of+electrical+coupling+in+identified+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">In vivo labeling of parvalbumin-positive interneurons and analysis of electrical coupling in identified neurons.</a> Journal of Neuroscience. 22, 7055-7064 (2002).</li>
<li>Vida, I., Halasy, K., Szinyei, C., Somogyi, P., Buhl, E. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Unitary+IPSPs+evoked+by+interneurons+at+the+stratum+radiatum-stratum+lacunosum-moleculare+border+in+the+CA1+area+of+the+rat+hippocampus+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Physiolology%22%5BJournal%5D)">Unitary IPSPs evoked by interneurons at the stratum radiatum-stratum lacunosum-moleculare border in the CA1 area of the rat hippocampus in vitro.</a> Journal of Physiolology. 506, 755-773 (1998).</li>
<li>Mody, I., De Koninck, Y., Otis, T. S., Soltesz, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bridging+the+cleft+at+GABA+synapses+in+the+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Bridging the cleft at GABA synapses in the brain.</a> Trends Neurosci. 17 (12), 517-525 (1994).</li>
<li>Bartos, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fast+synaptic+inhibition+promotes+synchronized+gamma+oscillations+in+hippocampal+interneuron+networks%5BTitle%5D)+AND+%22PNAS%22%5BJournal%5D)">Fast synaptic inhibition promotes synchronized gamma oscillations in hippocampal interneuron networks.</a> PNAS. 99, 13222-13227 (2002).</li>
<li>Cobb, S. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synaptic+effects+of+identified+interneurons+innervating+both+interneurons+and+pyramidal+cells+in+the+rat+hippocampus%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Synaptic effects of identified interneurons innervating both interneurons and pyramidal cells in the rat hippocampus.</a> Neuroscience. 79 (3), 629-648 (1997).</li>
<li>Bartos, M., Vida, I., Jonas, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synaptic+mechanisms+of+synchronized+gamma+oscillations+in+inhibitory+interneuron+networks%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Review+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Synaptic mechanisms of synchronized gamma oscillations in inhibitory interneuron networks.</a> Nature Review Neurosci. 8, 45-56 (2007).</li>
<li>Ascoli, G. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Petilla+terminology+nomenclature+of+features+of+GABAergic+interneurons+of+the+cerebral+cortex%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Review+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Petilla terminology nomenclature of features of GABAergic interneurons of the cerebral cortex.</a> Nature Review Neurosci. 9, 557-568 (2008).</li>
<li>Klausberger, T., Somogyi, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neuronal+diversity+and+temporal+dynamics+the+unity+of+hippocampal+circuit+operations%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Neuronal diversity and temporal dynamics the unity of hippocampal circuit operations.</a> Science. 321, 53-57 (2008).</li>
<li>Buhl, E. H., Szilágyi, T., Halasy, K., Somogyi, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Physiological+properties+of+anatomically+identified+basket+and+bistratified+cells+in+the+CA1+areas+of+the+rat+hippocampus+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Hippocampus%22%5BJournal%5D)">Physiological properties of anatomically identified basket and bistratified cells in the CA1 areas of the rat hippocampus in vitro.</a> Hippocampus. 6, 294-305 (1996).</li>
<li>Kawaguchi, Y., Katsumara, H., Kosaka, T., Heizmann, C. W., Hama, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fast+spiking+cells+in+rat+hippocampus+%28CA1+region%29+contain+the+calcium-+binding+protein+parvalbumin%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Res%22%5BJournal%5D)">Fast spiking cells in rat hippocampus (CA1 region) contain the calcium- binding protein parvalbumin.</a> Brain Res. 416 (2), 369-374 (1987).</li>
<li>Booker, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+GABAB-Receptor-Mediated+Effects+in+Perisomatic-+and+Dendrite-Targeting+Parvalbumin+Interneurons%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Differential GABAB-Receptor-Mediated Effects in Perisomatic- and Dendrite-Targeting Parvalbumin Interneurons.</a> Journal of Neuroscience. 33 (18), 7961-7974 (2013).</li>
<li>Uematsu, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+chemical+composition+of+cortical+GABAergic+neurons+revealed+in+transgenic+Venus-expressing+rats%5BTitle%5D)+AND+%22Cerebral+Cortex%22%5BJournal%5D)">Quantitative chemical composition of cortical GABAergic neurons revealed in transgenic Venus-expressing rats.</a> Cerebral Cortex. 18, 315-330 (2008).</li>
<li>Bischofberger, J., Engel, D., Li, L., Geiger, J. R. P., Jonas, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Patch-clamp+recording+from+mossy+fiber+terminals+in+hippocampal+slices%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Patch-clamp recording from mossy fiber terminals in hippocampal slices.</a> Nature Protocols. 1, 2075-2081 (2006).</li>
<li>Houston, C. M., Bright, D. P., Sivilotti, L. G., Beato, M., Smart, T. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intracellular+Chloride+Ions+Regulate+the+Time+Course+of+GABA-Mediated+Inhibitory+Synaptic+Transmission%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Intracellular Chloride Ions Regulate the Time Course of GABA-Mediated Inhibitory Synaptic Transmission.</a> Journal of Neuroscience. 29 (33), 10416-10423 (2009).</li>
<li>Sakmann, B., Neher, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Patch+clamp+techniques+for+studying+ionic+channels+in+excitable+membranes%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+Physiology%22%5BJournal%5D)">Patch clamp techniques for studying ionic channels in excitable membranes.</a> Annual Review Physiology. 46, 455-472 (1984).</li>
<li>Schindelin, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fiji+an+open-source+platform+for+biological-image+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Fiji an open-source platform for biological-image analysis.</a> Nature Methods. 9, 676-682 (2012).</li>
<li>Geiger, J. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Patch-clamp+recording+in+brain+slices+with+improved+slicer+technology%5BTitle%5D)+AND+%22Pflugers+Archives%22%5BJournal%5D)">Patch-clamp recording in brain slices with improved slicer technology.</a> Pflugers Archives. 443, 491-501 (2002).</li>
<li>Malinow, R., Tsien, R. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Presynaptic+enhancement+shown+by+whole-cell+recordings+of+long-term+potentiation+in+hippocampal+slices%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Presynaptic enhancement shown by whole-cell recordings of long-term potentiation in hippocampal slices.</a> Nature. 346, 177-180 (1990).</li>
<li>Vida, I., Bartos, M., Jonas, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Shunting+inhibition+improves+robustness+of+gamma+oscillations+in+hippocampal+interneuron+networks+by+homogenizing+firing+rates%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Shunting inhibition improves robustness of gamma oscillations in hippocampal interneuron networks by homogenizing firing rates.</a> Neuron. 49 (1), 107-117 (2006).</li>
<li>Neu, A., Földy, C., Soltesz, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Postsynaptic+origin+of+CB1-dependent+tonic+inhibition+of+GABA+release+at+cholecystokinin-positive+basket+cell+to+pyramidal+cell+synapses+in+the+CA1+region+of+the+rat+hippocampus%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Physiology%22%5BJournal%5D)">Postsynaptic origin of CB1-dependent tonic inhibition of GABA release at cholecystokinin-positive basket cell to pyramidal cell synapses in the CA1 region of the rat hippocampus.</a> Journal of Physiology. 578 (1), 233-247 (2007).</li>
<li>Baude, A., Bleasdale, C., Dalezios, Y., Somogyi, P., Klausberger, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunoreactivity+for+the+GABAA+receptor+alpha1+subunit%2C+somatostatin+and+Connexin36+distinguishes+axoaxonic%2C+basket%2C+and+bistratified+interneurons+of+the+rat+hippocampus%5BTitle%5D)+AND+%22Cerebral+Cortex%22%5BJournal%5D)">Immunoreactivity for the GABAA receptor alpha1 subunit, somatostatin and Connexin36 distinguishes axoaxonic, basket, and bistratified interneurons of the rat hippocampus.</a> Cerebral Cortex. 17, 2094-2107 (2007).</li>
</ol>

החוקרים מצהירים כי אין להם אינטרסים כלכליים מתחרים.

אנו מתארים שיטה המשלבת טכניקות אלקטרו וneuroanatomical לאפיין פונקציונלי נוירונים morphologically- וneurochemically המזוהים במבחנה; בפרט הסוגים השונים של תוספות מעכבות בקליפת המוח. היבטים מרכזיים של ההליך הם: (1) מיון מוקדם של אח&quot;י הפוטנציאלי; הקלטה תאית והדמית תא עצב (2); ולבסוף ניתוח צורני וimmunocytochemical של אח&quot;י נרשם (3). למרות שמחקר זה התייחס PV-ins בפרט, הפרוטוקול המתואר יכול לשמש להקלטות דומות מכל interneuron או סוגים אחרים עצביים, עם שינוי מינימאלי. <p cla...

מעגלים עצביים בהיפוקמפוס כבר זמן רב את הנושא של בדיקה אינטנסיבית, לגבי שני אנטומיה ופיזיולוגיה, בשל תפקידם החיוני בלמידה ובזיכרון, כמו גם ניווט מרחבי בשני בני אדם ומכרסמים. באותה מידה, ארגון מינרית הבולט, אבל פשוט של ההיפוקמפוס עושה אזור זה נושא מועדף של מחקרי טיפול בתכונות מבניות ותפקודיות של רשתות קליפת המוח. מעגלים בהיפוקמפוס מורכבים מתאים מעוררים עיקריים (&gt; 80%) ו( 10-20%) קטנים יותר, אבל מחזור מגוון מאוד של interneurons המעכב 1-3. Interneurons לשחרר חומצת γ-aminobutyric (GABA) מסופי האקסון הפועל בקולטני GABA ionotropic המהיר (GABA RS) וGABA-B קולטני metabotropic איטי (GABA-B RS) 4. מנגנונים מעכבים אלה לאזן עירור ולהסדיר את הרגישות של תאים עיקריים, ובכךעיתוי ir ודפוס של שחרור. עם זאת, GABA שוחרר מinterneurons פועל לא רק על תאים עיקריים, אלא גם על interneurons עצמם 5,6. קולטנים מראש וpostsynaptic לתווך רגולציה משוב ואינטראקציות הדדיות מעכבות בין הסוגים השונים של interneuron. מנגנונים המעכבים אלה ברשתות interneuron הם האמינו להיות מרכזיים לדור ועיצוב דפוסי פעילות האוכלוסייה, בתנודות מסוימות בתדרים שונים 7. הקלטת תיקון מהדק כל התא היא שיטה מבוססת היטב לבחינת מאפיינים הפנימיים ואינטראקציות הסינפטי של נוירונים. עם זאת, בשל גיוון הרב של סוגי interneuron, חקירה של interneurons המעכב דורשת זיהוי קפדני של התאים שנרשמו. כסוגי היפוקמפוס interneuron מתאפיינים בתכונות ייחודיות מורפולוגיים וביטוי סמן neurochemical, אנטומי בשילוב ודואר immunocytochemicalxamination יכול לספק אמצעי כדי לקבוע 6,8,9 זהות interneuron מדויקות. בעבודה הנוכחית אנו מתארים גישה ניסויית שבו הקלטות תיקון מהדק כל תא מתאי עצב בודד או זוגות synaptically מצמידים משולבות עם תיוג תאיים, ואחריו פוסט הוק-ניתוח צורני וimmunocytochemical, המאפשרים האפיון של איטי GABA-B קולט תיווך השפעות מעכבות בinterneurons המזוהה. כדוגמא, אנו מתמקדים בסוג אחד עיקרי של interneuron, קבוצת משנה של מה שנקרא &quot;תאי הסל&quot; (BC), אשר innervates דנדריטים סומה והפרוקסימלי של מטרות postsynaptic ומאופיין ב&quot; מתחזק מהר &quot;(FS) פריקת דפוס, האקסון צפוף המכסה את שכבת גוף תא, וביטוי של parvalbumin מחייב סידן החלבון (PV) 10,11. interneurons אלה להציג זרמים גדולים postsynaptic מעכבים, כמו גם טרום בולטיםאפנון הסינפטי של הפלט הסינפטי שלהם, בתגובה להפעלת GABA-B R 12. השילוב של טכניקות המתוארות כאן יכול להיות מיושם באופן שווה גם לחקור מנגנונים פנימיים או הסינפטי במגוון רחב של סוגי תאי עצב מזוהים אחרים.

<table><tbody><tr><td>חולדות טרנסגניות vGAT-venus</td><td></td><td></td><td>ראה Uematsu, &lt;em&gt;ואחרים.&lt;/em&gt;, 2008</td></tr><tr><td>משקפי מגן Venus (515 ננומטר)</td><td>.BLS Ltd., הונגריה</td><td></td><td></td></tr><tr><td>כלי ניתוח</td><td>&lt;em&gt;כלומר&lt;/em&gt; FST</td><td></td><td>להוצאת המוח</td></tr><tr><td>ויברטום (Vibratome)</td><td>Leica</td><td>VT1200S</td><td>או מיקרוטום רטוב (vibratome) מתקדם אחר עם תנודה אנכית מינימלית</td></tr><tr><td>תאי החזקת פרוסות</td><td></td><td></td><td>הוכן בהתאמה אישית במעבדה</td></tr><tr><td>מיקרוסקופ IR-DIC אנכי</td><td>Olympus, יפן</td><td>BX50WI</td><td>עם מערכת מיקרו-מניפולטור; &lt;em&gt;כלומר&lt;/em&gt; Luigs and Neumann, Kleindiek &lt;em&gt;וכו'.&lt;/em&gt;</td></tr><tr><td>מצלמת CCD</td><td>Till Photonics</td><td>VX55</td><td></td></tr><tr><td>מערכת LED של 505 ננומטר</td><td>Cairn Research</td><td>מערכת OptiLED</td><td>או נורת כספית או מערכת LED אחרת &lt;em&gt;כלומר&lt;/em&gt; CooLED.&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Multiclamp 700B&amp;nbsp;</td><td>Axon Instruments</td><td></td><td>לחלופין, שני מגברי Axopatch 200B&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>תוכנת רכישת נתונים WinWCP</td><td>ג'ון דמפסטר, אוניברסיטת סטרת'קלייד</td><td></td><td>ניתן להשתמש בכל תוכנה לרכישת נתונים באיכות גבוהה, &lt;em&gt;כלומר&lt;/em&gt; EPHUS, pClamp, Igor וכו'.&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>מכשיר למשיכת אלקטרודות</td><td>Sutter</td><td>P-97</td><td>בשימוש עם סיב-קופסה (box-filament)</td></tr><tr><td>זכוכית בורוסיליקט לפיפטות</td><td>הילגנברג, גרמניה</td><td>1405020</td><td>קוטר חיצוני 2 מ"מ, קוטר פנימי 1 מ"מ, ללא פילמנט</td></tr><tr><td>משאבה פריסטלטית</td><td>Gilson</td><td>Minipuls</td><td>ניתן להשתמש במשאבות אחרות או בהזנה בכבידה תחתית במקום זאת</td></tr><tr><td>מדחום דיגיטלי</td><td></td><td></td><td>התאמה אישית</td></tr><tr><td>מנומטר דיגיטלי</td><td>Supertech, הונגריה</td><td></td><td></td></tr><tr><td>&lt;קישור ל-&quot;http://digitimer.com/products/research/stimulators/&quot; מטרה=&quot;_ריק&quot;&gt;מעורר מתח קבוע מבודד&lt;/a&gt;</td><td><a href="http://www.digitimer.com" target="_blank"><img src="/img/new_window.png" /> .Digitimer Ltd</a></td><td>&lt;קישור ל-&quot;http://digitimer.com/products/research/stimulators/ds2a-isolated-constant-voltage-stimulatorstimulus-isolator/&quot; מטרה=&quot;נא לספק את הטקסט המקור באנגלית לתרגום.&quot;&gt;DS-2A&lt;/a&gt;</td><td></td></tr><tr><td>ביוציטין</td><td>Invitrogen</td><td>B1592</td><td>ידוע גם כ- &amp;epsilon;ביוטינויל-L-ליזין&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>DL-AP5(V) disodium salt</td><td>כימיקלים ביוכימיים של Abcam</td><td>ab120271</td><td></td></tr><tr><td>DNQX sodium salt דו-נתרן</td><td>כימיקלים ביוכימיים של Abcam</td><td>ab120169</td><td>לחלופין NBQX או CNQX</td></tr><tr><td>Gabazine (SR95531)</td><td>Abcam Biochemicals</td><td>ab120042</td><td>לחלופין, ביקוקולין מתיודיד (bicuculline methiodide)</td></tr><tr><td>R-Baclofen</td><td>כימיקלים ביוכימיים של Abcam</td><td>ab120325</td><td></td></tr><tr><td>CGP-55,845 hydrochloride</td><td>Tocris</td><td>1248</td><td></td></tr><tr><td>סטרפטאווידין 647</td><td>Invitrogen</td><td>S32357</td><td></td></tr><tr><td>נוגדן חד-שבטי של עכבר נגד PV</td><td>סוואנט, שווייץ</td><td>235</td><td>ריכוז עבודה 1:5,000-1:10,000</td></tr><tr><td>נוגדן משני אנטי-עכבר&amp;nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td>A11030</td><td>אם משתמשים ב-Venus או ב-GFP במכרסמים תוך שימוש בערוץ אדום (&lt;em&gt;כלומר&lt;/em&gt; מומלץ להשתמש ב- (546 nm).</td></tr><tr><td>סרום עיזים נורמלי</td><td>Vector Labs</td><td>S-1000</td><td></td></tr><tr><td>שקפיות מיקרוסקופיה</td><td></td><td></td><td>כל מותג באיכות גבוהה</td></tr><tr><td>zilu'ot zchuchit</td><td></td><td></td><td>בדרך כלל 22 x 22 מ"מ</td></tr><tr><td>מרווחי אגרוז</td><td></td><td></td><td>בלוק אגר, חתוך בוויברטום לעובי של 300 &amp;mu;מ׳</td></tr><tr><td>מיקרוסקופ קונפוקלי סורק בלייזר</td><td>Olympus, יפן</td><td>Fluoview FV1000</td><td>או מערכת מקבילה אחרת</td></tr><tr><td>Fiji (‏Fiji היא למעשה ImageJ)</td><td>http://fiji.sc/Fiji</td><td></td><td>ראו את Schindelin &lt;em&gt;ואחרים.&lt;/em&gt;, 2012</td></tr></tbody></table>

הקלטות תיקון מהדק כל התא מmorphologically- וinterneurons היפוקמפוס זיהה neurochemically

Whole-cell Patch-clamp Recordings from Morphologically- and Neurochemically-identified Hippocampal Interneurons

interneurons המעכב GABAergic לשחק תפקיד מרכזי במעגלים עצביים במוח. Interneurons מהווה תת קבוצה קטנה של האוכלוסייה העצבית (10-20%), אך מראה רמה גבוהה של הטרוגניות פיזיולוגית, מורפולוגיות, וneurochemical, המשקף פונקציות המגוונות שלהם. לכן, חקירה של interneurons מספקת תובנות חשובות עקרונות הארגון ותפקוד של מעגלים עצביים. זה, עם זאת, דורש גישה פיזיולוגית וneuroanatomical משולב לבחירה וזיהוי של סוגים בודדים interneuron. כל תא תיקון מהדק הקלטה מפרוסות חריפות מוח של בעלי חיים מהונדסים, המבטאים חלבוני ניאון מתחת ליזמים של סמני interneuron ספציפי, מספק שיטה יעילה למקד וelectrophysiologically לאפיין מאפיינים פנימיים והסינפטי של סוגים ספציפיים interneuron. בשילוב עם תיוג צבע תאיים, גישה זו יכולה להתארך עם post hoc מוניתוח rphological וimmunocytochemical, המאפשר זיהוי שיטתי של נוירונים שנרשמו. ניתן להתאים שיטות אלה כדי שיתאימו למגוון רחב של שאלות מדעיות לגבי מאפיינים תפקודיים של סוגים שונים של תאי עצב בקליפת המוח.

תנאי איכות הפרוסה שהיא טובה במידה ניכרת, הקלטה משני מחשבי CA1 וFS-ins ניתן להשיג עם קושי מינימאלי. שורת החולדה המהונדס מבטא ונוס / YFP תחת אמרגן vGAT 13 לא באופן חד משמעי לזהות FS-ins, או אכן BCS. עם זאת הקלטות מתוספות בתוך ומסביב str. pyramidale, שבו הצפיפות של FS-ins היא בדרך כלל גבוהה 1, תוצאות בהסתברות גבוהה של בחירת FS-ins (איור 2). ניתן להבחין FS-ins על ידי המאפיינים הפיסיולוגיים האופייניים שלהם שונים מאלה של שני מחשבי CA1 וRS-...

רשתות קליפת המוח נשלטות על ידי קבוצה קטנה, אך מגוונת של interneurons המעכב. חקירה פונקציונלית של interneurons לכן דורשת הקלטה ממוקדת וזיהוי קפדני. שתואר כאן היא גישה משולבת הכוללת כל תא הקלטות מזוגות בודדים או synaptically מצמידים של נוירונים עם תיוג תאיים, שלאחר הוק מורפולוגיים וניתוח immunocytochemical.

הקלטות תיקון מהדק כל התא מMorphologically- וinterneurons היפוקמפוס זיהה Neurochemically

GABAergic inhibitory interneurons play a central role within neuronal circuits of the brain. Interneurons comprise a small subset of the neuronal ...

המטרה הכוללת של פרוצדורה זו היא לאפיין השפעות המתווכות על ידי קולטן GABA B בנוירונים אינטר-נוירונליים חיוביים ל-parvalbumin שזוהו בהיפוקמפוס. דבר זה מושג תחילה על ידי הפקת פרוסות היפוקמפוס אקוטיות באיכות גבוהה. השלב השני הוא שימוש במיקרוסקופ וידאו כדי לבחור נוירונים על בסיס ביטוי ונוזי של YFP ומאפיינים ידועים של נוירונים חיוביים ל-parvalbumin.בשלב הבא מתבצעות הקלטות patch clamp של תא שלם, כאשר נעשה שימוש בגירוי חוץ-תאי או בהקלטות זוגיות כדי לבחון השפעות המתווכות על ידי קולטן GABA B. השלב הסופי הוא הדמיה של הנוירונים כדי לאשר כי הנוירונים שהוקלטו הם אכן חיוביים ל-par albumin, וכי הם נוירונים מעכבים פרא-סומטיים או דנדריטיים. בסופו של דבר, שיטה זו מאפשרת את אפיון ההשפעות המעכבות המתווכות על ידי קולטן GABA B ומאפשרת סיווג חד-משמעי של הנוירונים הבין-תאיים שהוקלטו.שיטה זו יכולה לספק תשובות לשאלות מפתח בתחום הנוירונים המעכבים (interneurons). לדוגמה, כיצד נוירונים מעכבים מתקשרים זה עם זה, וכיצד העיריות שלהם והפלט הסינפטי שלהם נשלטים על ידי מערכות נוירומודולטוריות. למרות ששיטה זו מספקת תובנות לגבי בקרה GABAergic של נוירונים מעכבים בהיפוקמפוס, ניתן להחיל אותה גם על אזורי מוח אחרים, מערכות נוירומודולטוריות או סוגי תאים אחרים.הוצא את המוח מחולדה טרנסגנית בת 17 עד 24 ימים המבטאת YFP ורידי פלואורסצנטי שנשמרה בסוכרוז carbogen חצי קפוא, A CSF. באמצעות סכין מנתחים, הסר את השליש הפרונטלי של הקורטקס, את המוחון, והפרד בין ההמיספירות. הסר את השטח הדורסלי של הקורטקס כדי ליצור משטח שטוח להדבקת המוח לצורך חיתוך. הדבק את ההמיספירות על משטח ה-viome כאשר אמבט ה-viome מלא בסוכרוז native carbogen קפוא.חיתוך פרוסות רוחב של 300 micrometer של תצורת ההיפוקמפוס ב-A CSF. העברה של כל פרוסה לתא אחסון טבול המכיל סוכרוז בקרבוגן, A CSF בטמפרטורה של 35 °C. 30 דקות לאחר הנחת הפרוסה האחרונה בסוכרוז המחומם, העברת הפרוסות לטמפרטורת החדר לצורך אחסון.משוך פיפטות patch מקפילריות זכוכית כך שיתקבלת התנגדות של שתיים עד ארבעה מגה-אומי (mega ohms). לאחר המילוי, העבר פרוסה של היפוקמפוס לתא ההקלטה, והחזק אותה במקומה באמצעות טבעת פלטינה המשולבת עם סיבי משי בודדים. הנח את התא במערך ההקלטה והתחל בפרפוזיה עם נוזל CSF להקלטה, מחומם וברווי קרבוגן, בקצב זרימה של 5 עד 10 מיליליטר לדקה.השתמשו במצלמה כדי להעריך את איכות הפרוסה תחת אופטיקת I-R-D-I-C בהגדלה של 40x בעזרת עדשה אובייקטיבית. הניחו כי הפרוסה היא באיכות טובה. אם ניתן להבחין במספר רב של תאי פאראמטריאלים עגולים בעלי ניגודיות בינונית בשכבת ה-stratum parameter בעומקים של 20 עד 30 מיקרומטרים מתחת לפני שטח חלקים עם מכתשים קלים.באמצעות תאורת פלואורסצנציה אפי-פלואורסצנטית, זהה נוירונים אינטר-נוירונליים בעלי פריקה מהירה (fast spiking inter neurons) משוערים ככאלה המבטאים YFP ובעלי גוף תא רב-קוטבי גדול בתוך או בקרבת ה-stratum pyramidale. לאחר מכן, מלא את פיפטות ה-patch בתמיסה המכילה ריכוז כלוריד נמוך ורלוונטי פיזיולוגית לצורך זיהוי זרמים פוסט-סינפטיים, והנח אותה במחזיק הפיפטות על ראש המיקרוסקופ. לאחר מכן, החל לחץ חיובי נמוך דרך קו הצינור.הורד את הפפיטה אל פני השטח של הפרוסה, בהיסט קל מהמרכז של הנוירון הנבחר. העלה את הלחץ ל-70 עד 80 millibars והורד במהירות את הפפיטה דרך הפרוסה עד למצב שבו היא נמצאת ממש מעל הסומה של התא הנבחר. לחץ עם הפפיטה כנגד ממברנת התא כדי ליצור בה שקע.בצע שלב זה במהירות. כדי למנוע סימון בביוטין של תאים שכנים, צור אטם בדרגת גיגה-אוהם (giga ohm seal) על ידי שחרור הלחץ ובמקביל הפעלת פקודת מתח של 20 millivolt שלילי על הפיפטה. ברגע שהאיטום מתחיל, הפחת את פקודת המתח לפוטנציאל הממברנה במצב מנוחה הצפוי, שנמצא בדרך כלל בין 60 millivolt ל-70 millivolt שלילי.כעת יש להפעיל פולס קצר של לחץ שלילי כדי לפצח את טלאי הממברנה (membrane patch), ובכך להגיע לתצורת תא שלם (whole cell configuration). באמצעות מצב clamp של זרם, זהה נוירונים בינמיים בעלי פריקה מהירה (fast spiking interneurons) לפי תגובתם לסדרה של פולסי זרם היפר-פולריזציה ודפולריזציה. כדי לצפות בתגובות שעוררו סינפסה, מקם אלקטרודת גרייה חוץ-תאית בתוך הפרוסה, בגבול שבין ה-stratum radiatum ל-stratum lacunosum moleculare.במצב קיבוע מתח (voltage clamp), השתמש במעורר מתח קבוע מבודד כדי להעביר לאקסונים הפרה-סינפטיים רצפים של חמישה גירויים חשמליים של 50 volt, בתדר של גירוי בודד או 200 hertz, מדי 20 שניות. לאחר מכן, הוסף לאמבט אנטגוניסטים של קולטני גלוטמט יונוטרופיים כדי לחשוף את ה-IPSC המונוסינפטי המבודד.בצע בידוד נוסף של ה-IPSC המתווך על ידי קולטן GABA B באמצעות יישום של אנטגוניסט לקולטן GABA a. כדי להתחיל בהקלטות בזוגות (paired recordings), ראשית, בצע הקלטת תא שלם (whole cell recording) של נוירון ביניים פרה-סינפטי כפי שנעשה קודם לכן, ואשש את פנוטיפ הפריקה המהירה (fast spiking phenotype).בשלב הבא, בצעו patch של תא פירמידי ב-CA1 במרחק של 20 עד 100 µm מהנוירון המקשר, תוך החזקת הנוירון המקשר הפרה-סינפטי. במצב current clamp, יישמו פולסים קצרים של זרם דפולריזציה בסף SRA כדי לעורר פוטנציאלי פעולה בנוירון המקשר.אם קיים קשר סינפטי, פוטנציאלי פעולה בנוירון הביניים יגרמו ל-IPCs בתא הפרמטלי ca one תחת קיבוע מתח (voltage clamp). לאחר ביסוס הקשר, עוררו זוגות של פוטנציאלי פעולה בנוירון הביניים הפרה-סינפטי בעל הפריקה המהירה (fast spiking) באמצעות פרוטוקול פולסים זוגי טיפוסי של שני גירויים דפולריזציוניים במרווח של 50 millisecond. לאחר איסוף עקבות הבקרה, הוסיפו ל-A CSF הזורם את הבקלופנ, אגוניסט סלקטיבי לקולטני GABA B, ובכך הפעילו את קולטני GABA B.בשלב הבא, ניתן את האנטגוניסט CGP 55 8 45 כדי לחסום לחלוטין את ההשפעות המתווכות על ידי הרספטור. עם סיום ההקלטה, הוצא לאט את הפיפטה מגוף התא במצב voltage clamp. ככל שההתנגדות הנמדדת בטור (series resistance) עולה, הפחת את מתח הממברנה ל-40- millivolts כדי לאטום את ממברנת הסומה על ידי יצירת outside out patch.בעקבות ההקלטות, קבעו את הפרוסות על ידי טבילה ב-4% para formaldehyde עם 0.1 molar phosphate buffer למשך לילה בטמפרטורה של ארבע מעלות צלזיוס, שטפו ב-phosphate buffer, ולאחר מכן ב-phosphate buffered saline, ובצעו חסימה עם 10% normal goat serum, 0.03% TRITTON X 100 ו-0.05% Sodium azide למשך שעה אחת בטמפרטורת החדר. כדי לסמן ביטוי של par albumin, השתמשו בנוגדן חד-שבטי לעכבר נגד parvalbumin המדולל בתמיסה המכילה 5% normal goat serum, 0.3% TRITTON X 100 ו-0.05% Sodium azide ב-PBS. הדגרימו את הנוגדים הראשוניים למשך יומיים עד שלושה ימים בטמפרטורה של ארבע מעלות צלזיוס. לאחר ההדגירה, שטפו את הפרוסות היטב ב-PBS והחילו נוגדים משניים פלורסצנטיים נגד-US יחד עם חלבון קישור לביוטין שצורף לכרומופור פלורסצנטי, והדגרימו בתמיסה המכילה 3% normal goat serum, 0.1% tritton X 100 ו-0.05% Sodium המדוללים ב-PBS; הדגרימו למשך לילה בטמפרטורה של ארבע מעלות צלזיוס. למחרת, שטפו את הפרוסות באופן נרחב שתיים עד שלוש פעמים ב-PBS, ולאחר מכן בצעו שתי עד שלוש שטיפות ב-phosphate buffer.הצמד את הפרוסות לזכוכיות עצם והשתמש במרווח אגר של 300 µm כדי למנוע את קריסת הפרוסה. לאחר מכן, כסה את הפרוסות בזכוכית כיסוי עם מדיום קיבוע פלואורסצנטי ואטום עם לק ציפורניים. העריך את התגובתיות החסונית של par albumin בנוירוני הביניים באמצעות הגדלה גבוהה ומספר מפתח (numerical aperture) גבוה.תאי עדשת העין נחשבים לתגובתיים חיסונית (immunoreactive) לאלבומין פרא. אם נראה כי הסימון החיסוני תואם למבנים המסומנים בביוטין, יש לצלם סדרת תמונות בציר Z באמצעות מיקרוסקופ קונפוקלי עם סריקת לייזר, תוך הדמיית פלואורסצנציית Aden לצורך זיהוי מורפולוגי ושחזור תלת-ממדי. לאחר מכן, יש לשחזר את התמונה לנוירון בתלת-ממד, תוך שילוב של הסתעפויות דנדריטיות ואקסונליות.התגובה הסינפטית המורכבת של נוירון מעכב בעל פריקה מהירה (fast spiking interneuron) בתגובה לגירוי חוץ-תאי בודד מוצגת כאן. החלת האנטגוניסטים לקולטן גלוטמט יונוטרופי, DNQX ו-APV, בישלה את זרם הפוסט-סינפטי המעכב מונו-סינפטי, או IPSC; החלת האנטגוניסט לקולטן gabaa, Gazin, ביטלה את הרכיב המהיר של ה-IPSC.רצף של חמישה גירוים חשף IPSC איטי המתווך על ידי קולטני GABA B, אשר נחסם על ידי יישום עוקב של CGP. עקבות אלו מראים פוטנציאלי פעולה בנוירון המקשר (interneuron) הקדם-סינפטי בעל הפריקה המהירה, ו-IPSCs יחידתיים בעלי השהיה קצרה בתאי parametal ב-CA1 בתנאי בקרה, לאחר יישום של baclofen בbath ויישום עוקב של CGP. שימו לב כי baclofen מפחית את אמפליטודת ה-IPSC בכ-50%, בעוד שהאנגוניסט לקולטני GABA B הוביל להתאוששות כמעט מלאה של אמפליטודת ה-IPSC.תרשים של מהלך הזמן של אמפליטודת ה-IPSC מראה את ההשפעה של baclofen ו-CGPA. נוירון ביניים בעל פריקה מהירה (fast spiking), המוצג בהגדלה של 20x, בעל סומטה הממוקמת בגבול בין ה-stratum radiatum ל-stratum pyramidale של אזור CA1, עם דנדריטים הנעים אנכית ומקיפים את כל השכבות. בעוד שמרבית האקסון נמצא בתוך ומסביב לשכבת גוף התא, כפי שמאפיין תאי סל (basket cells), תמונה בהגדלה של 60x מראה סלים טיפוסיים של אקסונים הנוצרים מסביב לתאי CA1 pyramidal פוטנציאליים, המסומנים בכוכבית כתתומה. שחזור תלת-ממדי של אותו נוירון ביניים מוצג כאן, כאשר הסומה והדנדריטים בצבע שחור והאקסון בצבע אדום.שכבות ה-ca one מסומנות בכחול לאחר השלמת התהליך. ניתן לבצע טכניקה זו ביום אחד, כאשר ניתוח מורפולוגי לאחר דוקטורט מבוצע על מספר פרוסות בו-זמנית לאחר פיתוחן. גישה משולבת זו סללה את הדרך עבור חוקרים של מעגלים זעירים היפוקמפליים וקורטיקליים לחקור את השונות המורפולוגית-פיזיולוגית, כמו גם את הקשר בין מבנה לתפקוד של סוגי תאי עצב ביניים.

whole-cell-patch-clamp-recordings-from-morphologically

Research

JoVE Journal

Neuroscience

מדעי המוח

פרוטוקול זה מתאר טכניקה הנקראת אלקטרופיזיולוגיה של מהדק טלאי שלם, שהיא שיטה לחקר תכונות חשמליות של נוירוני מאוטנר ותאים רטיקולוספינליים אחרים בעוברים של דגי זברה.

אלקטרופיזיולוגיה של מהדק טלאי תאי שלם: שיטה לחקר תכונות חשמליות של נוירונים

סרטון זה מדגים טכניקה להקלטת מהדק טלאי מפני השטח של הממברנה הדנדריטית. זה עוזר לבחון ישירות את התכונות החשמליות של דנדריטים ותעלות יונים מגודרות מתח בסיסיות בנוירונים דופמינרגיים.

הקלטות מהדק טלאי מהדנדריט של נוירון דופמינרגי בפרוסת מוח

הסרטון מדגים פרוטוקול לחקר אינטראקציות סינפטיות ותגובות עצביות בפרוסת מוח של עכבר נגוע בהיפוקמפוס. היא כוללת הארת נוירונים חושיים ארוכי טווח כדי להפעיל פוטנציאלי פעולה ורישום הפוטנציאלים הפוסט-סינפטיים המעוררים המתקבלים בתא העצב המוקלט באמצעות טכניקת מהדק טלאי של התא כולו.

פוטו-טימולציה והקלטות מהדק טלאי של תא שלם של תאי עצב בפרוסות היפוקמפוס עכבר

סרטון זה מדגים את ההליך לביצוע רישומים אלקטרופיזיולוגיים בתאי עצב מסוג substantia gelatinosa (SG) של פרוסות חוט השדרה, תוך שימוש בטכניקות של מהדק טלאי של תאים שלמים כדי לנתח דפוסי ירי של נוירונים. שיטה זו מאפשרת לחקור תגובות עצביות לגירויים בנוירוני SG של חוט השדרה.

רישום מהדק טלאי של תא שלם בנוירון ג'לטינוזה מהותי של פרוסת חוט השדרה

סרטון זה מדגים את ההליך למיפוי קשרים סינפטיים על ידי אבטחת פרוסת מוח, מיקום פיפטות להשגת תצורות של תאים שלמים, וגירוי נוירונים קדם-סינפטיים להקליט תגובות פוסט-סינפטיות, ובכך להבהיר קישוריות עצבית.

רישום מהדק טלאי זוגי של הקשרים העצביים בפרוסות מוח חריפות

שתואר כאן הוא הליך לקבלת משתרע הקלטה הנוכחית ארוך מערוץ יון אחד עם טכניקת התיקון-clamp מצורף תא. שיטה זו מאפשרת להתבוננות, בזמן אמת, את הדפוס של תצורות ערוץ פתוחות קרובים העומדות בבסיס האות הביולוגית. נתונים אלה להודיע ​​על נכסי ערוץ בממברנות ביולוגיות באין מפריע.

הקלטת תיקון מהדק מצורף תא אחד ערוצים

הקלטות זוגות הן הקלטות סימולטניות של מהדק טלאי תא שלם משני נוירונים המחוברים סינפטית, מה שמאפשר אפיון אלקטרופיזיולוגי ופרמקולוגי מדויק של הסינפסות בין נוירונים בודדים. כאן אנו מתארים את המתודולוגיה והדרישות המפורטות לביסוס טכניקה זו בתרביות פרוסות היפוקמפוס אורגנוטיפיות בכל מעבדה המצוידת באלקטרופיזיולוגיה.

הקלטות תא כל לזווג בפרוסות בהיפוקמפוס Organotypic

הקלטות מהדק טלאי ומילוי ביוציטין תוך-תאי בו זמנית של נוירונים מצומדים סינפטית בפרוסות מוח חריפות מאפשרים ניתוח מתואם של תכונותיהם המבניות והתפקודיות. מטרת פרוטוקול זה היא לתאר את השלבים הטכניים החיוניים של רישום אלקטרופיזיולוגי ממיקרו-מעגלים עצביים והניתוח המורפולוגי שלהם לאחר מכן.

אלקטרו ומורפולוגי אפיון של שבבים עצביים במוח חריף Slices שימוש מותאם Patch-קלאמפ הקלטות

פרוטוקול זה מתאר צעדים פרוצדורליים בסיסיים לביצוע הקלטות תיקון- clamp כל תא. טכניקה זו מאפשרת חקר ההתנהגות החשמלית של נוירונים, וכאשר ביצע פרוסות המוח, מאפשר הערכה של פונקציות עצביים שונים מתא עצב שעדיין משולבים מעגלים במוח השתמרות טוב יחסית.

הקלטות תיקון מהדק כל תא פרוסות המוח

הקלטות מהדק טלאי תת-תאיות מציעות את האפשרות לחקור את התכונות הפונקציונליות של דנדריטים. עם זאת, מבנים עדינים אלה אינם נגישים בקלות בשל קוטרם הקטן. הפרוטוקול המתואר כאן נועד להקל על איסוף הקלטות יציבות ואמינות מהדנדריטים של נוירוני דופמין בפרוסות במבחנה.

הקלטות תיקון מהדק subcellular מן האחוזה Somatodendritic של נוירונים Nigral דופמין

הפרוטוקול הנוכחי מתאר כיצד לבודד ולטהר מיקרוגליה ראשונית בהיפוקמפוס מעכברים בוגרים, ואחריו הוראות לביצוע הקלטות טלאי-מהדק של תאים שלמים על תאים מבודדים אלה באופן חריף.

בידוד ורישום Patch-Clamp של תא שלם של מיקרוגליה בהיפוקמפוס מעכברים בוגרים

למדו לבצע הקלטות תיקון מהדק כל התא מנוירונים מהיפוקמפוס חיוביים לפרואלבומין. שיטה זו מאפשרת לחקור השפעות מדיאטות של קולטני GABA B ולסווג נוירונים מעכבים לפי קריטריונים מורפולוגיים ונוירוכימיים.

הקלטות תיקון מהדק כל התא מMorphologically- וinterneurons היפוקמפוס זיהה Neurochemically

גלה סרטונים נוספים