הקלטות תיקון מהדק כל התא מMorphologically- וinterneurons היפוקמפוס זיהה Neurochemically

המטרה הכוללת של הליך זה היא לאפיין את ההשפעות המתווכות של קולטן GABA B בתאי עצב בין-עצביים חיוביים של ההיפוקמפוס שזוהו. זה מושג על ידי ייצור פרוסות היפוקמפוס חריפות באיכות גבוהה. השלב השני הוא שימוש במיקרוסקופ וידאו כדי לבחור נוירונים על סמך ביטוי YFP ורידי ומאפיינים ידועים של נוירונים חיוביים לאלבומין.

לאחר מכן מתקבלות הקלטות מהדק תיקון תא שלם וגירוי חוץ-תאי או הקלטות זוגיות משמשות לבחינת ההשפעות המתווכות של קולטן GABA B. השלב האחרון הוא לדמיין את הנוירונים ולאשר שהנוירונים המוקלטים הם למעשה חיוביים לאלבומין והם נוירונים מעכבים פארא-סומטיים או דנדריטיים. בסופו של דבר, שיטה זו מאפשרת לאפיין את ההשפעות המעכבות בתיווך קולטן GABA B ומאפשרת סיווג חד משמעי של הנוירונים הבין-נוירונים המוקלטים.

שיטה זו יכולה לענות על שאלות מפתח בתחום הבין-נוירונים. לדוגמה, כיצד נוירונים בין-עצביים מתקשרים זה עם זה, כיצד הריגוש שלהם, התפוקה הסינפטית שלהם נשלטת על ידי מערכות נוירומודולטוריות. למרות ששיטה זו מספקת תובנה לגבי GABAergic, שליטה בהיפוקמפוס על נוירונים, ניתן ליישם אותה גם על אזורי מוח אחרים, מערכות נוירומודולטוריות או סוגי תאים.

קח את המוח מחולדה טרנסגנית בת 17 עד 24 יום המבטא YFP ורידי פלואורסצנטי השמור בסוכרוז קרבוגן קפוא למחצה, CSF באמצעות אזמל, הסר את השליש הקדמי של קליפת המוח, המוח הקטן, והפרד את ההמיספרות. הסר את המשטח הגבי של קליפת המוח כדי לספק משטח שטוח להדבקת המוח לחתך. הדביקו את חצאי הכדור על במת ה-viome עם אמבט ה-viome מלא בסוכרוז מקורי קרבוגן.

CSF חתך פרוסות רוחביות של 300 מיקרומטר של תצורת ההיפוקמפוס. מעבירים כל פרוסה לתא החזקה שקוע המכיל סוכרוז קרבוגן, CSF בטמפרטורה של 35 מעלות צלזיוס. 30 דקות לאחר הנחת הפרוסה האחרונה בסוכרוז המחומם, CSF מעביר את הפרוסות לטמפרטורת החדר לאחסון.

משוך פיפטות תיקון מנימי זכוכית כך שתושג התנגדות פיפטה של שניים עד ארבעה מגה אוהם. לאחר מילוי, העבירו פרוסת היפוקמפוס לתא ההקלטה, והחזיקו אותה במקומה עם טבעת פלטינה מתוחה בסיבי משי בודדים. הנח את החדר במערך ההקלטה והתחל בזילוף עם הקלטת CSF מחוממת קרבוגן בקצב זרימה של חמישה עד 10 מיליליטר לדקה.

השתמש במצלמת וידאו כדי להעריך את איכות הפרוסה תחת אופטיקה I-R-D-I-C בהגדלה אובייקטיבית של פי 40. נניח שהפרוסה באיכות טובה. אם ניתן לראות מספר רב של תאי פרמטאל עגולים בעלי ניגודיות בינונית בפרמטר השכבה בעומקים של 20 עד 30 מיקרומטר מתחת למשטח חלק ומכתש קל.

באמצעות תאורה פלואורסצנטית אפי, זהה נוירונים בין-עצביים מהירים כאלו המבטאים YFP ורידי עם סומטי רב-קוטבי גדול בשכבה parama או בסמוך אליה. לאחר מכן, מלאו את פיפטות התיקון בתמיסה המכילה ריכוז כלוריד נמוך ורלוונטי מבחינה פיזיולוגית לזיהוי זרמים פוסט-סינפטיים והניחו אותה במחזיק הפיפטה על שלב הראש. לאחר מכן הפעל לחץ חיובי נמוך דרך קו הצינור.

הורד את הפיפטה אל פני הפרוסה, קוזז מעט למרכז הנוירון שנבחר. הגדל את הלחץ ל-70 עד 80 מיליבר והורד במהירות את הפיפטה דרך הפרוסה ממש מעל הסומה של התא הנבחר. לחץ את הפיפטה על קרום התא כדי לייצר עליו גומה.

בצע שלב זה במהירות. על מנת למנוע תיוג ביוטין של תאים שכנים, צור אטם ג'יגה אוהם על ידי שחרור הלחץ ובו זמנית הפעלת פקודת מתח שלילית של 20 מילי-וולט על הפיפטה. לאחר תחילת האיטום, הפחת את פקודת המתח לפוטנציאל הממברנה במנוחה הצפוי בדרך כלל בין שלילי 70 לשלילי 60 מילי-וולט.

כעת הפעל דופק קצר של לחץ שלילי כדי לקרוע את תיקון הממברנה, ובכך להשיג את כל תצורת התא. באמצעות מצב מהדק זרם, זהה נוירונים בין-נוירונים מהירים על ידי תגובתם למשפחה של היפרפולריזציה לפולסי זרם דה-פולריזציה. כדי לצפות בתגובות מעוררות סינפטית, מקם אלקטרודת גירוי חוץ-תאית בפרוסה בגבול שכבת הרדיום ורישום מולקולרי של שכבה לון.

במצב מהדק מתח, השתמש בממריץ מתח קבוע מבודד כדי להעביר רכבות בודדות או 200 הרץ של חמישה גירויים חשמליים של 50 וולט לאקסונים הקדם-סינפטיים כל 20 שניות. לאחר מכן, יש למרוח אנטגוניסטים של קולטני גלוטמט יונוטרופיים על האמבטיה על מנת לחשוף את המונוס המבודד. IPSC סינפטי.

לבודד עוד יותר את קולטן GABA B בתיווך IPSC עם יישום אנטגוניסט קולטן GABA A. כדי להתחיל הקלטות מותאמות. ראשית, קבע רישום תא שלם של נוירון בין-סינפטי פרה-סינפטי כמו קודם ואשר את הפנוטיפ המהיר.

לאחר מכן, טלאו תא פרמטאלי CA אחד במרחק של 20 עד 100 מיקרומטר מהנוירון הבין-סינפטי המחזיק את הנוירון הבין-סינפטי. במצב מהדק נוכחי. החל פולסים קצרים של זרם דפולריזציה של סף SRA כדי לעורר פוטנציאל פעולה בתא העצב הבין-נוירוני.

אם קיים חיבור סינפטי, פוטנציאל הפעולה בתא העצב הבין-נוירוני גורם ל-IPCs במתח המהודק לתא פרה-מתכתי אחד. לאחר יצירת קשר, עורר זוגות של פוטנציאל פעולה בתא העצב הבין-עצבי המהיר הפרה-סינפטי עם פרוטוקול דופק זוגי טיפוסי של שני גירויים דה-פולריזציה במרווח של 50 אלפיות השנייה. לאחר איסוף עקבות הבקרה, יש למרוח את בקלופן אגוניסט קולטן GABA B הסלקטיבי על ה-CSF A, ובכך להפעיל את קולטני GABA B.

לאחר מכן, יש למרוח את האנטגוניסט CGP 55 8 45 כדי לחסום באופן מלא את ההשפעות המתווכות של הקולטן. לאחר השלמת ההקלטה, משוך לאט את הפיפטה מגוף התא בכרךtagclamp. ככל שההתנגדות הנמדדת בסדרה עולה, הפחת את מתח הממברנה ל-40 מילי-וולט שלילי כדי לאטום את הממברנה הסומטית על ידי יצירת תיקון חיצוני החוצה.

לאחר ההקלטות, תקן את הפרוסות על ידי טבילה ב-4%para formaldehyde עם מאגר פוספט מולארי של 0.1 למשך הלילה בארבע מעלות צלזיוס מאגר פוספט שוטף, ואז בתמיסת מלח חוצצת פוספט ובלוק עם 10% סרום עיזים רגיל 0.03% TRITTON X 100 ו-0.05% נתרן אזיד למשך שעה בטמפרטורת החדר כדי לתייג לביטוי אלבומין par, השתמש בנוגדני עכבר חד שבטי נגד פרוואלבומין מדולל בתמיסה המכילה 5% סרום עיזים רגיל, 0.3% TRITTON X 100 ו-0.05% נתרן אזיד ב-PBS דוגרים על הנוגדנים העיקריים למשך יומיים-שלושה בארבע מעלות צלזיוס. לאחר הדגירה, יש לשטוף היטב את הפרוסות ב-PBS, למרוח נוגדנים משניים פלואורסצנטיים אנטי-US יחד עם סיכת חלבון קושר ביוטין המצומד לפלואורוכרום ולדגור בתמיסה המכילה 3% סרום עיזים רגיל, 0.1% טריטון X 100 ו-0.05% נתרן מדולל ב-PBS בדגירה למשך הלילה בארבע מעלות צלזיוס. למחרת שטפו את הפרוסות בנדיבות פעמיים-שלוש עם PBS ולאחר מכן שתיים עד שלוש שטיפות במאגר פוספט.

הרכיבו את הפרוסות על שקופיות זכוכית והשתמשו במרווח אגר של 300 מיקרומטר כדי למנוע את קריסת הפרוסה. לאחר מכן מכסים, מחליקים את הפרוסות במדיום הרכבה פלואורסצנטי ואוטמים בלכה לציפורניים. להעריך את התגובתיות החיסונית של הנוירון הבין-אלבומין עם הגדלה גבוהה וצמצם מספרי.

תאי עדשה אובייקטיביים נחשבים אימונו-ריאקטיביים עבור אלבומין. אם נראה כי תיוג חיסוני מתיישב עם המבנים המסומנים בביוטין, צלם סדרת תמונות של ציר Z עם מיקרוסקופ קונפוקלי סורק לייזר, הדמיית עדן פלואורסצנטי לזיהוי מורפולוגי ושחזור תלת מימדי. לאחר מכן שחזר את התמונה לנוירון בתלת מימד, תוך שילוב ארבוריזציה דנדריטית ואקסונלית.

התגובה הסינפטית המורכבת של תא עצב בין-תאי מהיר בתגובה לגירוי חוץ-תאי יחיד מוצגת כאן. יישום אנטגוניסטים של קולטני גלוטמט יונוטרופיים, מבודדי DNQX ו-A PV, הזרם הפוסט-סינפטי המעכב המונוס סינפטי או יישום IPSC של אנטגוניסט קולטן ה-gabaa. גזין ביטל את המרכיב המהיר של ה-IPSC.

רכבת של חמישה גירויים חשפה IPSC איטי בתיווך קולטן GABA B, שנחסם על ידי יישום עוקב של CGP. עקבות אלה מראים פוטנציאל פעולה ב-PSCs הפרה-סינפטיים, המהירים וה-PSCs היחידתיים הקצרים בתאי פרמטאל CA 1 בתנאי בקרה לאחר האמבטיה, מריחת בקלופן ויישום לאחר מכן של CGP. שימו לב שבקלופן מפחית את משרעת ה-IPSC בכ-50% ואילו אנטגוניסט הקולטן GABA B הביא להתאוששות כמעט מלאה של משרעת ה-IPSC.

תרשים מהלך זמן של משרעת IPSC מראה את ההשפעה של בקלופן ו-CGPA בין-נוירונים מהירים המוצגים בהגדלה של פי 20 היו סומאטה הממוקמת בגבול השכבה רדיום ובובת פארמה של אזור ca one עם דנדריטים הפועלים אנכית ומתפרשים על כל השכבות. בעוד שרוב האקסון נמצא בשכבת גוף התא וסביבה כאופייני לתאי סל, תמונת הגדלה של פי 60 מציגה סלים טיפוסיים של אקסונים הנוצרים סביב סלטה פרמטאלית אחת, המסומנים בכוכבית כתומה. שחזור תלת מימדי של אותו תא עצב מוצג כאן עם הסומה והדנדריטים בשחור והאקסון באדום.

השכבות של ה-ca one מתוחמות בכחול לאחר שליטה. ניתן לבצע טכניקה זו ביום אחד עם ניתוח מורפולוגי פוסט-דוקטורט המבוצע על מספר פרוסות בבת אחת לאחר פיתוחה. גישה משולבת זו סללה את הדרך לחוקרים של מיקרו מעגלים בהיפוקמפוס ובקליפת המוח לחקור את המגוון הפיזיולוגי המורפולוגי כמו גם את יחסי הגומלין של פונקציית המבנה של סוגי נוירונים.