ממוצע של ויראלי מעטפת גליקופרוטאין Spikes מאלקטרוני Cryotomography שחזור באמצעות Jsubtomo

המטרה הכללית של הליך זה היא ללמוד את המבנים של קומפלקסי גליקופרוטאין הנמצאים על פני השטח של נגיפים מעוטפים. הדבר מושג תחילה על ידי איתור חלקיקי הנגיף בנפחים הטומוגרפיים שחושבו בעבר מנתוני מיקרוסקופיה קריוגנית אלקטרונית. השלב השני הוא יצירת שני מודלים ראשוניים בלתי תלויים סטטיסטית של קומפלקסי הגליקופרוטאין באמצעות תת-קבוצה של נתונים שהוגדרה ידנית.

בשלב הבא, מודלים אלו עוברים עידון ולאחר מכן משמשים לזיהוי אוטומטי של כל קומפלקסי הגליקופרוטאין על חלקיקי הווירוס. השלב האחרון הוא עידון המבנה של קומפלקס הגליקופרוטאין באמצעות מערך הנתונים המלא. לבסוף, נעשה שימוש בכלי ויזואליזציה מולקולרית כדי לפרש את המבנה הסופי.

ניתוח מבני בתלת-ממד של דקירות גליקופרוטאין אלו הוא בעל ערך רב להבנת הפתוגנזה של הווירוס וכן לתכנון תרופות. היתרון המרכזי של טכניקה זו על פני שיטות קיימות, כגון קריסטלוגרפיה של קרני X, הוא שהיא מאפשרת לפתור מבנים של חלבוני ממברנה בסביבת הממברנה הטבעית. טכניקה זו יכולה לסייע במתן מענה לנושאים מרכזיים בביולוגיה מבנית.

לדוגמה, המבנה של וירוסים רבים המכילים מעטפת. למרות שטכניקה זו יכולה לספק תובנות לגבי קומפלקסים של גליקופרוטאינים בווירוסים אלה, ניתן להחיל אותה גם על מערכות אחרות, כגון חלבונים ממברנליים השטמועים בליפוזומים. ההליך יודגם על ידי שני חברים מהקבוצה שלי, Slee ו-David Bittel.

כדי להתחיל, פתחו קובץ אוטוגרמה ב-B show. בחרו חלקיקי וירוס באופן ידני באוטוגרמות על ידי הגדרת קואורדינטת המרכז של חלקיק וירוס באמצעות כלי בחירת החלקיקים (particle picking tool). חזרו על שלב זה עד שכל הווריאנטים יעובדו.

שמרו את קואורדינטות הנגיף בקובץ star. המשיכו לחזור על תהליך זה עבור כל ה-tomos. לאחר מכן, הריצו את J sub tomo py במצב חילוץ (extract mode). כדי לחלץ את ה-vari מתוך sub volumes לקבצי נפח (volume files) נפרדים, השתמשו בקבצי ה-star השמורים כקבצי קלט ליצירת שני מודלים ראשוניים בלתי תלויים.

ראשית, פתח את קובץ מפת נפחי המשנה של השחלה. הצג ב-B. בחר תת-קבוצה של קוצים (spikes) בנפחי המשנה של ה-Varian על ידי הגדרת קואורדינטת המרכז של קוץ באמצעות כלי בחירת החלקיקים (particle picking tool) הנגיש דרך חלון סרגל הכלים.

חזור על שלב זה עד שכל הספייקים (spikes) המובחנים בבירור יעובדו. שמור את קואורדינטות הספייקים בקובץ star. חזור על שלב זה עד שעיבודם של כ-200 ספייקים של גליקופרוטאין יסתיים.

לאחר הקצאת הזוויות למשתנים כפי שמתואר בפרוטוקול הטקסט, צור מסיכת מרחב ממשי באמצעות J sub tomo. צור mask py. לאחר מכן, צור מסיכת מרחב הדדי באמצעות J sub tomo create wedge mask py.

מסכת המרחב ההדדי משמשת להחרגת אזורים באזור הפלח החסר (missing wedge), הנובע מאיסוף נתונים טומוגרפיים בציר בודד. לאחר מכן, צור שני ממוצעים ראשוניים באמצעות J.Sub tomo create averages. PY, תוך שימוש בקובץ בחירה שמור כקובץ קלט.

השתמשו בנרמול כדי להפחית רעשים בממוצעים הראשוניים, ואז בצעו יישור וממוצע איטרטיביים של שני המודלים שנוצרו קודם לכן באמצעות J sub tomo iterate gold PY. פרטים על שני השלבים בתהליך זה ניתן למצוא בפרוטוקול הכתוב. העריכו את דרגת הסימטריה במבנה על ידי בחינת קובץ המפה שעבר סינון מעביר-נמוך ב-kyira. לדוגמה, אם הספייק הוא קומפלקס טרימרי, סימטריה תלת-צירים צריכה להיות ניכרת.

המשך את עידון המבנה כפי שמפורט בפרוטוקול הטקסט. לאחר מכן, ייצר זרעים הממוקמים באופן אחיד על פני השטח של Varian לצורך התאמת תבנית, והקצה וקטור מבט ראשוני לזרעים על ידי הרצת JVs py. השתמש בקובצי ה-star שנוצרו קודם לכן כקבצי קלט, וייצר כמות של זרעים הגדולה פי 1.5 בקירוב ממספר ה-spikes הצפוי.

וקטור תצפית זה מקריב את כיוון הספייק הקרוב ביותר לכל נקודת זרע. לאחר מכן, צור שני ממוצעים בלתי תלויים של פני השטח של הווירוס כפי שנעשה קודם לכן. לאחר מכן, דייק את מיקום נקודות הזרע כפי שמפורט בפרוטוקול הכתוב.

לבסוף, צור קובצי סימון com של קובצי seed star המזוקקים באמצעות jvs.py. בחן את ה-seeds על ידי פתיחת קובצי ה-CMM וקובצי מפת ה-virion הנלווים. ב-kyira.

וודאו שהזרעים המזוקקים (refined seeds) מיושרים כהלכה ביחס לממברנת הווירוס. ניתן לצבוע את הסימנים המזוקקים על בסיס מקדמי המתאם הצולב (cross correlation coefficients) שלהם. אתרו באופן אוטומטי את כל הספייקים (spikes) בנפחי המשנה של הווריאנט באמצעות התאמת תבנית מקומית סביב הזרעים המזוקקים, יישרו והביאו לממוצע את הספייקים שאותרו. השתמשו בממוצעים שהופקו מקבוצת חלקים של ספייקים שנבחרו ידנית כתבניות ראשוניות. פרטים נוספים לתהליך זה ניתן למצוא בפרוטוקול הכתוב. כדי להציג את התוצאות, פתחו את המבנה המזוקק של הספייק ב-kyira לצורך ויזואליזציה.

המשיכו להתאמה של המבנים האטומיים. לאחר מכן, צרו מודל מורכב של הוויריון באמצעות j Subo Create model DO py. לבסוף, פתחו את המודל המורכב להדמיה ב-kyira.

המודל הראשוני שופר באמצעות 205 קוצים שנבחרו ידנית. סימטריה תלת-פיתול של הקוץ המרכזי ביותר הייתה ניכרת ללא החלת סימטריה כלשהי, והיא הוטבקה בסיבובי השיפור הבאים לצורך זיהוי ידני של כל הקוצים על פני השטחים של Varian. 106 זרעים נוצרו עבור כל vion ברדיוס של 43 nanometers ובמרווח של 20 degrees, ומיקומם שופר באופן איטרטיבי ביחס לממברנה.

החלקים מהדגימות של הגליקופרוטאין spike בעלי המתאם הטוב ביותר שימשו לחישוב הממוצע הסופי. הממוצע הובא לרזולוציה של 35 אנגסטרום. הוא חשף מבנה spike טרימרי במרכז, בנוסף לתרומה מסוימת מששת דגימות spike שכנות.

מודלים מורכבים של ה-varis, שחושבו על ידי הצבת המבנה במיקומים ידועים, חשפו מיקום של spikes על פני השטח של ה-Varian. לעיתים, ניכרו אזורים של spikes בעלי סדר מקומי. בעת ביצוע הליך זה, חשוב להשתמש רק בנתונים הטובים ביותר ולבדוק בקפידה את כל תוצאות הביניים.

בעקבות הליך זה, ניתן להתאים מבני קריסטלוגרפיית קרני X לממוצע הסופי כדי לקבל תמונה מדויקת יותר של אינטראקציות בין חלבונים. לאחר צפייה בסרטון זה, תהיה לכם הבנה טובה לגבי האופן שבו מבצעים מיצוע של מבני גליקופרוטאין של מעטפת נגיפית באמצעות J Omo.