ממוצע של ויראלי מעטפת גליקופרוטאין Spikes מאלקטרוני Cryotomography שחזור באמצעות Jsubtomo

המטרה הכוללת של הליך זה היא לחקור את המבנים של קומפלקסים של גליקופרוטאין הקיימים על פני השטח של נגיפים עטופים. זה מושג על ידי איתור חלקיקי הנגיף בנפחים הטומוגרפיים שחושבו בעבר מנתוני מיקרוסקופ קריו אלקטרונים. השלב השני הוא יצירת שני מודלים ראשוניים בלתי תלויים סטטיסטית של קומפלקסי הגליקופרוטאין באמצעות תת-קבוצה מוגדרת ידנית של נתונים.

לאחר מכן, מודלים אלה מזוקקים ולאחר מכן משמשים לזיהוי אוטומטי של כל קומפלקסי הגליקופרוטאין על חלקיקי הנגיף. השלב האחרון הוא לחדד את המבנה של קומפלקס הגליקופרוטאין באמצעות מערך הנתונים המלא. בסופו של דבר, כלי הדמיה מולקולרית משמשים לפירוש המבנה הסופי.

ניתוח מבני תלת מימדי של קוצי גליקופרוטאין אלה הוא בעל ערך רב להבנת פתוגנזה ויראלית כמו גם בתכנון תרופות. היתרון העיקרי של טכניקה זו על פני שיטות קיימות, כגון קריסטלוגרפיה בקרני רנטגן, הוא שטכניקה זו מאפשרת לפתור מבנים של חלבוני ממברנה בסביבת הממברנה הטבעית. טכניקה זו יכולה לעזור לטפל בנושאים מרכזיים בביולוגיה מבנית.

לדוגמא, המבנה של ממברנות רבות המכילות נגיפים. למרות שטכניקה זו יכולה לספק תובנה לגבי קומפלקסים של גליקופרוטאין בנגיפים אלה, ניתן ליישם אותה גם על מערכות אחרות כגון חלבוני ממברנה המשולבים בליפוזומים. את ההליך ידגימו שניים מחברי הקבוצה שלי, סלי ודיוויד ביטל.

כדי להתחיל, פתח קובץ אוטוגרמה במופע B. בחר חלקיקי וירוס באופן ידני בגרמים על ידי הגדרת הקואורדינטות המרכזיות של חלקיק וירוס באמצעות כלי איסוף החלקיקים. חזור על שלב זה עד שכל הגרסאות יעובדו.

שמור קואורדינטות וירוסים בקובץ כוכב. המשך לחזור על תהליך זה עבור כל הטומו. הפעל הבא J sub tomo py במצב חילוץ כדי לחלץ vari באמצעי אחסון משנה לקבצי נפח בודדים, השתמש בקבצי הכוכבים השמורים כקבצי קלט כדי ליצור שני מודלים ראשוניים עצמאיים.

ראשית, פתח את קובץ מפת נפח המשנה של השחלות. במופע B. בחר תת-קבוצה של קוצים בנפחי המשנה של Varian על ידי הגדרת הקואורדינטה המרכזית של ספייק באמצעות כלי איסוף החלקיקים הנגיש דרך חלון ארגז הכלים.

חזור על שלב זה עד שכל הקוצים הברורים יעובדו. שמור קואורדינטות ספייק בקובץ כוכב. חזור על שלב זה עד לעיבוד של כ-200 קוצים של גליקופרוטאין.

לאחר הקצאת תצוגות לגרסאות כמתואר בפרוטוקול הטקסט, צור מסיכת חלל אמיתית באמצעות J sub tomo. צור מסיכה py. לאחר מכן צור מסכת חלל הדדית באמצעות J sub tomo צור מסכת טריז py.

מסיכת החלל ההדדית משמשת להחרגת אזורים באזור הטריז החסר, כתוצאה מאיסוף נתונים טומוגרפיים של ציר יחיד. לאחר מכן, צור שני ממוצעים ראשוניים באמצעות J.Sub tomo צור ממוצעים. PY באמצעות קובץ בחירה שמור כקובץ הקלט.

השימוש באיזציה להפחתת רעש בממוצעים הראשוניים הוא יישור וממוצע איטרטיבי של שני המודלים שנוצרו בעבר עם J sub tomo איטרציה זהב PY. פרטים על שני השלבים של תהליך זה ניתן למצוא בפרוטוקול הטקסט. העריכו את מידת הסימטריה במבנה על ידי בחינת קובץ המפה המסוננת במעבר נמוך שהתקבל בקיירה. לדוגמא, אם הספייק הוא קומפלקס טרימרי, צריכה להיות ניכרת סימטריה משולשת.

המשך ליטוש המבנה כמפורט בפרוטוקול הטקסט. לאחר מכן, צור זרעים הממוקמים באופן שווה על פני השטח של Varian להתאמת תבניות והקצה וקטור תצוגה ראשוני לזרעים על ידי הפעלת JVs py. השתמש בקובצי הכוכבים שנוצרו בעבר מכיוון שקובצי קלט מייצרים בערך פי 1.5 יותר זרעים ממספר הקוצים הצפוי.

וקטור תצוגה זה מתקרב לכיוון הספייק הקרוב ביותר לכל נקודת זרע. לאחר מכן, צור שני ממוצעים בלתי תלויים של פני השטח של הנגיף כמו קודם. לאחר מכן מקד את מיקום הזרעים כמפורט בפרוטוקול הטקסט.

לבסוף, צור קבצי סמן com של קבצי כוכב הזרע המזוקק באמצעות jvs.py. בדוק את הזרעים על ידי פתיחת קבצי CMM וקבצי מפת הוויריון המשויכים. בקיירה.

ודא שהזרעים המזוקקים מיושרים כהלכה ביחס לקרום הנגיף. ניתן לצבוע את הסמנים המעודנים על סמך המתאם הצולב שלהם: מקדמים מאתרים אוטומטית את כל הקוצים בנפחי המשנה של Varian באמצעות התאמת תבנית מקומית סביב זרעים מזוקקים, מיישרים וממוצעים את הקוצים הממוקמים משתמשים בממוצעים שנוצרו מתת-קבוצה של קוצים שנבחרו ידנית כתבניות ראשוניות. פרטים נוספים לתהליך זה ניתן למצוא בפרוטוקול הטקסט כדי להמחיש את התוצאות, לפתוח את המבנה המעודן של הספייק ב-kyira להדמיה.

המשך להתאים את המבנים האטומיים. לאחר מכן צור מודל מורכב של הוויריון באמצעות j Subo צור מודל DO py. לבסוף פתח את המודל המרוכב להדמיה בקיירה.

הדגם הראשוני שוכלל באמצעות 205 דוקרנים שנבחרו ידנית. משולש. סימטריה של השפיץ המרכזי ביותר ניכרה ללא סימטריה כלשהי והוטלה על סבבי הליטוש הבאים לגילוי ידני של כל הקוצים על משטחי הווריאן. 106 זרעים נוצרו עבור כל ויון ברדיוס של 43 ננומטר ומרווח של 20 מעלות, ומיקומם שוכלל באופן איטרטיבי ביחס לממברנה.

מדבקות הספייק של גליקופרוטאין בקורלציה הטובה ביותר שימשו לחישוב הממוצע הסופי. הממוצע פוענח לרזולוציה של 35 אנגסטרום. הוא חשף מבנה קוצים טרימרי באמצע בנוסף לתרומה מסוימת של שישה קוצים שכנים.

מודלים מורכבים של הוואריס שחושבו על ידי הצבת המבנה במיקומים הידועים חשפו מיקום של קוצים על פני השטח של וריאן. מדי פעם, ניכרים טלאים מקומיים של דוקרנים. בעת ניסיון הליך זה, חשוב להשתמש רק בנתונים הטובים ביותר ולבדוק היטב את כל תוצאות הביניים.

בעקבות הליך זה, ניתן להתאים מבני קריסטלוגרפיה של קרני רנטגן לממוצע הסופי כדי לקבל תצוגה מדויקת יותר של אינטראקציות חלבון-חלבון. לאחר צפייה בסרטון זה, אתה אמור להבין היטב כיצד לממוצע מבני גליקופרוטאין מעטפת ויראלית באמצעות J Omo.