Assay התנהגות פשוט לפונקציה של Visual בדיקה ב
12 ביוני 2014
Xenopus laevis ראשנים מעדיפים שחייה בצד הלבן של טנק בשחור / לבן. התנהגות זו מונחה על ידי החזון שלהם. בהתבסס על התנהגות זו, אנו מציגים assay פשוט כדי לבדוק את תפקוד הראייה של ראשנים.
המטרה הכללית של פרוצדורה זו היא לבחון את התפקוד החזותי של ראשנשאיים על ידי תיעוד משך הזמן שבהם שוהה בעל החיים בחציו של מיכל הבדיקה המכוסה בשחור. דבר זה מושג תחילה על ידי גידול ראשנשאיים לשלבים 45 עד 50. השלב השני הוא הקמת מיכל שחציו שחור וחציו לבן, יחד עם מצלמה עבור בדיקת ההתנהגות.
בשלב הבא, מקמו מיכל שני עם ראשן בתוך המיכל החיצוני. עבור כל ראשן, רשמו את ההתנהגות המונחית ראייה בעוד הרקע בסביבתו משתנה. השלב האחרון הוא ביצוע כריתת רשתית (retinal ex sodomy) לראשנים, ולאחר מכן חזרו על בדיקת ההתנהגות.
בסופו של דבר, נתונים מבדיקה פשוטה וזולה זו משמשים כדי להראות שלראשתנים יש העדפה לשחות בצד אחד של המיכל על פני הצד השני, תחת בדיקות של ראייה פוטוטופית. היתרון העיקרי בשימוש בשיטה זו על פני טכניקות אחרות, כמו התגובה האופטית-קינטית או בדיקת היפפוף הזנב, הוא שמדובר בשיטה פשוטה וזולה המשתמשת בציוד הזמין ברוב המעבדות. כדי להכין את הראשתנים, ראשית, השג עוברים מופריים של xenopus, והנח תמיסת mark's, תמיסת ringers משופרת או MMR המדוללת בפי 10 בתוך צלחות פטרי של 60 millimeter בריכוז של 50 micrograms per milliliter.
העבירו עוברים משלב הבלסטולה לשלב לוח העצבים לתוך אנטיביוטיקה מסוג Gentamycin. שלבים 2 עד 15 בטמפרטורה של 18 °C בתוך צלחות פטרי. ברגע שהעוברים מגיעים לשלב של כוס חדשה בערך בין 27 ל-30, העבירו אותם ל-0.1 XMMR ללא אנטיביוטיקה כדי לאפשר צמיחה של חיידקי המעי.
כאשר השפנפנים (tadpoles) מגיעים לשלב ההזנה, סביב שלב 45, העבירו אותם לכלי Petri בני 100 מילימטר עם 0.1 XMMR. למחרת, האכילו אותם בתעלה (supernatant) של אבקת סרפד. לאחר שבוע בכלי Petri בני 100 מילימטר, מלאו מיכל של חצי גאלון במי צפרדעים.
העבירו את בעלי החיים לאקווריום והמשיכו בלוח הזמנים של ההאכלה בתסנין אבקת נטיה, אך החליפו את המים רק פעמיים עד שלוש פעמים בשבוע. כאשר בעלי החיים נמצאים באקווריומים של חצי גלון, החזיקו אותם במחזור של 12 שעות אור ו-12 שעות חושך, כאשר האורות נדלקים בשעה 6:00 בבוקר. לפני הבדיקה, הניחו את אקווריום חצי הגלון עם נשואי הניסוי על משטח לבן למשך הלילה, לפחות 12 שעות לפני הבדיקה. את בדיקת ההתנהגות יש לבצע באזור שקט עם תנועה מועטה ותחת תאורת פלורסנט סטנדרטית.
הכינו שני מיכלי בדיקה בנפח חצי גאלון המוכנסים זה בזה בפינות החיצוניות של מה שיהיה המיכל הפנימי. השתמשו בטוש Sharpie כדי לסמן את קו המים בגובה של 5 cm מעל התחתית. כמו כן, במיכל הפנימי, זהו שקעים כלשהם בחלקו הפנימי.
מלאו אותם בתרכובת אינרטית כדי למנוע מהראשניות להשתהות בתוכם. כעת הפנו את תשומת הלב למכל החיצוני השני. לשלב הבא, השגו סרט בידוד שחור ונייר טישיו לבן.
השתמשו בסרט הדביק כדי לכסות את החלק החיצוני של מחצית אחת מהמיכל ואת נייר הרקמה כדי לכסות את החלק החיצוני של המחצית השנייה, כפי שמוצג כאן. לאחר הכנת המכלים, הגדירו שולחן מסתובב להסנקה והניחו עליו את המכלים המוכנסים זה בזה. מקמו חצובה ומצלמת רשת כך שהמצלמה תוכל לצלם את פנים המכלים מלמעלה.
חברו את מצלמת האינטרנט למחשב עם תוכנה להקלטה והשמעה של וידאו. הדליקו את המצלמה והיערכו לביצוע הקלטת סרטון חדשה. לאחר מכן, כסו את המצלמה ואת המכלים בבד כותנה קל.
כדי להפחית רמזים חיצוניים עבור השבבים, השתמש במד לומיננס (luminance meter) ובדוק כי הלומיננס תחת הבד הוא בין 35 ל-50 candles per square meter. התחל את בדיקת ההתנהגות על ידי הוצאת מיכל הבדיקה הפנימי. מלא אותו במי צפרדע עד לסימון של five centimeter.
השתמשו ברשת כדי להעביר בעל חיים מהמיכל בנפח חצי גלון למיכל הבדיקה הפנימי במחשב. ודאו שתוכנת ההקלטה פתוחה ומקליטה את אזור הבדיקה לצורך תיעוד. רשמו את שם בעל החיים, התאריך והשעה על דף נייר.
הנח זאת תחת המצלמה לצורך הקלטה. לאחר מכן, הגדר טיימר לשתי דקות. בשלב הבא, כוון את המכל החיצוני על גבי השולחן המסתובב, כך שהצד השחור יהיה מימין.
כעת מקמו את מיכל הבדיקה בתוך המיכל החיצוני. באזור ההקלטה, סגרו את הווילון והשתמשו במסך המחשב כדי לוודא את כיוונו של המיכל החיצוני. ודאו שהווידאו מוקלט והפעילו את הטיימר.
כאשר הטיימר מצפצף, השאירו את כיסוי ההסתר במקומו והוציאו את מיכל הבדיקה הפנימי. לאחר מכן, סובבו את המיכל החיצוני ב-180 מעלות כך שהצד השחור יהיה כעת משמאל. החזירו את מיכל הבדיקה לתוך המיכל החיצוני והפעילו את הטיימר לשתי דקות.
שוב, הסירו את המיכל הפנימי. סובבו את המיכל החיצוני ב-180 מעלות, והחזירו את המיכל הפנימי מדי שתי דקות, בסה"כ 10 פעמים. עם הסיום, הפסיקו את הקלטת הווידאו.
החזירו את השבב למכל של חצי גלון. הכינו מיקרוסקופ לביצוע ה-retinol ex sodomy. מלאו צלחת פטרי בקוטר 60 מילימטר ב-1%aros המומס ב-0.1 XMMR והניחו לו להתמצק.
הסר חתיכה מלבנית קטנה מה-aros בגודלו של השבשב. כאשר תהיה מוכן להמשיך, הוצא את חיית הניסוי והנח אותה ב-0.02%Trica. המשך כאשר היא אינה מגיבה לצביטה בזנב באמצעות פינצטה מספר שלוש.
לאחר מכן העבירו את החיה לצלוחית. המשיכו בקיבוע של צלוחית הפטרי על המיקרוסקופ. הכינו את הפינצטה כדי לתמוך בחיה מצד אחד.
בצד הנגדי, השתמשו במחט בקוטר 25 gauge כדי לנקב את העור מאחורי האזור הדורסלי של העין בזווית של 45 מעלות, היכנסו בזהירות לחור עם פינסטה מספר 5 וגזרו את העצב האופטי תוך הימנעות מהוריד הסמוך לו. הסיטו את העצב הצידה והוציאו את הפינסטה לאחר הניתוח. המתינו להחלמת בעל החיים על ידי הנחתו בצלחת פטרי בקוטר 100 millimeter עם 0.7 XMMR ו-50 micrograms per milliliter.
Gentamycin למשך 20 דקות. לאחר מכן, העבירו את השבבית למכל התאוששות עם מי צפרדע. הניחו את המכל על משטח לבן כהכנה לבדיקה.
יש להניח לבעל החיים לנוח במהלך הלילה. למחרת בבוקר, יש להשתמש במבחן ההתנהגותי כדי לבחון את התפקוד הראייתי. סרטון זה מציג נתונים מייצגים עבור הניסוי.
משמאל נמצאים בעלי החיים לפני הניתוח, ומימין אותם בעלי חיים לאחר שצירים רטינליים משתי העיניים נכרתו. הדבר מצוין בסכימה בפינות התחתונות. המים הונעו כדי להראות ששום דבר לא נוסף כדי להרחיק את בעלי החיים מהצד השחור או למשוך אותם לצד הלבן.
הראשניות שלפני הניתוח מגיבות לצבע הרקע בפחות מ-30 שניות, בעוד שהראשניות העיוורות שוחות ללא מטרה במיכל. תרשים זה מציג את אחוז הזמן שהותה חיה אחת באזורים הלבנים והשחורים תחת שלושה תנאים. ראשית, החיה נצפתה לפני ביצוע ניתוח כלשהו באמצעות הבדיקה.
במשך יומיים רצופים לאחר חיתוך העצב האופטי הימני, נצפתה התנהגותו של בעל החיים לאורך יומיים של בדיקה. לבסוף, לאחר ששני העצבים האופטיים נחתכו, בוצעו יומיים נוספים של תצפית באמצעות הבדיקה. בעל החיים שהה זמן רב יותר בצד הלבן של המכל כאשר לפחות עצב אופטי אחד היה תקין.
לאחר צפייה בסרטון זה, תגמרו עם הבנה טובה של אופן בדיקת הראייה של ראשני צפרדעים באמצעות ריאגנטים וציוד פשוטים הנמצאים ברוב מעבדות הצפרדעים. בהצלחה בניסויים שלכם.
צפו בתמליל המלא וקבלו גישה לאלפי סרטונים מדעיים
סקירה כללית
ראשנשאי *Xenopus laevis* מראים העדפה לשחייה בצד הלבן של מיכל שחור/לבן, מה שמעיד על כך שהתנהגותם מונחית על ידי ראייה. מחקר זה מציג בדיקה פשוטה להערכת התפקוד החזותי של ראשנשאי צפרדע.
מרכיבי מחקר מרכזיים
תחום המדע
- מדעי המוח
- ביולוגיה התנהגותית
- מדע הראייה
רקע
- Xenopus laevis הוא אורגניזם מודל נפוץ בביולוגיה של ההתפתחות.
- העדפות חזותיות של ראשני קרפדה יכולות לספק תובנות לגבי היכולות החושיות שלהם.
- הבנת התפקוד החזותי היא קריטית ללימוד התנהגות בסביבות מימיות.
- ניתן להשתמש במערך בדיקה זה כדי להעריך את השפעתם של שינויים סביבתיים על התנהגות חזותית.
מטרת המחקר
- בדיקת התפקוד החזותי של ראשני *Xenopus laevis*.
- ביסוס בדיקה התנהגותית המודדת את הזמן המושקע במקטעים שונים של המיכל.
- חקירת האופן שבו רמזים חזותיים משפיעים על התנהגות ראשני הצפרדע.
שיטות שנעשה בהן שימוש
- גידול השבחים לשלבים 45 עד 50 לצורך בדיקה.
- הקמת מיכל שחציו אחד שחור וחציו השני לבן עבור מבחן ההתנהגות.
- תיעוד הזמן שהשבחים שהו בכל חלק של המיכל.
- ביצוע כריתת רשתית (retinal ex sodomy) לשבחים וחזרה על המבחן.
תוצאות עיקריות
- הראשניות הראו העדפה משמעותית לצד הלבן של המיכל.
- נצפו שינויים התנהגותיים כאשר הסביבה ברקע שונתה.
- הבדיקה מדדה ביעילות את התפקוד החזותי על בסיס העדפות שחייה.
- ניתוח הרשתית סיפק תובנות לגבי היכולות החזותיות של הראשניות.
מסקנות
- ניתן להעריך ביעילות את התפקוד הוויזואלי של ראשני Xenopus laevis באמצעות בדיקה התנהגותית פשוטה זו.
- התוצאות מעידות כי לראייה תפקיד מכריע בהכוונת התנהגות השבבים.
- ניתן להחיל שיטה זו על מחקרים נוספים בנושא עיבוד תחושתי באורגניזמים מימיים.
שאלות נפוצות
רלוונטיות תעשייתית למנהלים
בדיקה זו מספקת שיטה בעלות נמוכה וניתנת להרחבה להערכת תפקוד חזותי במודל של חולייתנים, התומכת בתיקוף של מטרות בשלבים מוקדמים של גילוי תרופות למדעי העצבים. באמצעות כימות של התנהגות מונחית ראייה, היא מאפשרת הפחתת סיכונים מכניסטית של תרכובות המשפיעות על מסלולים תחושתיים. הגישה מציעה רציפות תרגומנית ממחקרי ראייה בסיסיים להערכה פרה-קלינית של חומרים נוירו-אקטיביים.
יישומים אסטרטגיים במחקר ופיתוח בביופארמה
גילוי מוקדם ותיקוף מטרה
- ערך מדעי: מאפשר חקירה של תפקוד המסלול הוויזואלי באמצעות מדדים התנהגותיים מדידים.
- ערך תפעולי: משתמש בציוד זמין, ובכך מפחית את המחסומים לאימוץ במעבדות מחקר.
- ערך ניבואי: תומך בבדיקת השערות עבור תרכובות המכוונות למטרות רטינליות או למטרות עיבוד עצבי.
סריקה ופיתוח בדיקות (Assay Development)
- מוכנות הבדיקה: מייצר מדדי העדפה כמותיים המתאימים להתאמה לסריקה בעתקת תפוקה גבוהה (high-throughput).
- שחזוריות: הגדרה סטנדרטית של המיכל ותנאי התאורה מבטיחים תוצאות עקביות בין מפעילים שונים.
- יכולת הרחבה: תכנון של מיכלים מקוננים מאפשר בדיקה במקביל, ובכך תומך באוטומציה עתידית לסריקת תרכובות.
מחקר תרגומי ופרה-קליני
- רלוונטיות למחלה: מדמה תפקוד לקוי של הראייה הרלוונטי לניוון רשתית ולהפרעות התפתחותיות נוירולוגיות.
- הפחתת סיכונים מכניסטית: מבדילה בין השפעות מוטוריות כלליות לבין ליקוי ראייה ספציפי באמצעות בדיקה של הצד הנגדי.
- המשכיות תרגומית: מגשרת בין סריקה פנוטיפית לבין תיקוף תפקודי במערכת הרלוונטית למחלה.
שילוב בתוך תהליכי עבודה וצנרת עיבוד
הבדיקה מתאימה לתהליכי עבודה בשלבי הגילוי המוקדמים, ובמיוחד עבור תיקוף מטרות וזיהוי מובילים (lead identification) בתוכניות נוירו-מדעיות המתמקדות בעיבוד חזותי.
- ביולוגיה של תגליות: תומכת בתיקוף תפקודי של מטרות חזותיות על ידי קישור מניפולציה גנטית או פרמקולוגית להתנהגות מדידה.
- סריקה: מספקת פלטפורמה לסריקה ראשונית או משנית של תרכובות המשפיעות על התנהגות מונחית-ראייה.
- אנליזה: מייצרת מדידות של זמן-בשטח (time-in-zone) המאפשרות השוואה סטטיסטית בין קבוצות ביקורת לקבוצות טיפול.
- מחקר תרגומי: מקשרת למודלים פרה-קליניים על ידי הערכת תוצאות תפקודיות של התערבויות רשתיות או עצביות.
- שימוש חוזר ארגוני: מהווה פלטפורמה התנהגותית הניתנת לשימוש חוזר וניתנת להתאמה לאורך מספר פרויקטים במדעי המוח.
השפעה תפעולית ועסקית
- ערך מדעי: מגביר את הביטחון במעורבות המטרה על ידי הפחתת תוצאות חיוביות שגויות הנובעות מהשפעות מוטוריות לא ספציפיות.
- ערך תפעולי: עלות נמוכה ופשטות מקדמות אימוץ נרחב ללא צורך בהכשרה מיוחדת.
- ערך אסטרטגי: משפר החלטות לגבי המשך או הפסקת הניסוי (go/no-go) באמצעות אספקת מדדים תפקודיים מוקדמים של מסלולים חושיים.
- השפעה על הפורטפוליו: מאפשר תיעוד סדרי עדיפויות של תרכובות מותאם סיכון, בהתבסס על ספציפיות התנהגותית.
שיקולי יישום
- דורש מיומנויות בסיסיות בגידול בעלי חיים לצורך תחזוקה וקביעת שלבי התפתחות של ראשני Xenopus.
- תלוי בציוד הקלטת וידאו סטנדרטי ובסביבה עם בקרת תאורה.
- מחייב הכשרה בתצפית התנהגותית כדי להבטיח ביצוע עקבי של הבדיקה.
- עשוי לדרוש התאמה למעקב אוטומטי ביישומים של סריקה רחבה.
- מוגבל להערכת תפקוד חזותי; אינו לוכד אופנויות חושיות אחרות.
