Name: Assay התנהגות פשוט לפונקציה של Visual בדיקה ב Laevis Xenopus (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-06-12T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 34 s
Description: למדו שיטה פשוטה להערכת תפקוד ראייה בראשני Xenopus laevis באמצעות מבחן התנהגותי בטנק שחור-לבן. השיטה מאפשרת למדענים לחקור עיבוד חזותי ותפקוד עצבי ביצורים מימיים.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

עבודה זו מומנה על ידי מענקים מהמוסד הלאומי לבריאות: EY015748, EY017964 (MEZ), וEY019517 (ASV). עבודה זו נתמכה גם על ידי המחקר למניעת העיוורון החופשי גרנט למחלקת העיניים והאריות של מרכז ניו יורק. כמו כן, אנו רוצים להודות לטכנאים שלנו בעלי החיים, מתיו Mellini, לטיפולו מצוין של בעלי החיים ולדריכה בלככב בסרטון זה.

טיפול בבעלי חיים Xenopus laevis ראשנים השתמשו במחקר זה גדלו, גדלו וטופלו בהתאם לנהלים שאושרו על ידי IACUC לרפואה של אוניברסיטת צפון מדינת והמדריך לטיפול והשימוש בחי מעבדה. 1. התקנה טרום התנהגות: ראשנים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השג עוברי Xenopus מופרים ממקור זמין באופן מסחרי או במבחנה להפרות ביציות, כפי שתואר לעיל 6. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הנח blastula לעוברי שלב צלחת עצביים ב18 ˚ C ב60 מ&quot;מ צלחות פטרי המכילות 0.1X MMR [10 מניית רינגר הפתרון (MMR) השתנה של X מארק (10 מ&quot;מ MgCl 2; 20 מ&quot;מ KCl; 20 מ&quot;מ CaCl 2; 50 HEPES מ&quot;מ; 1 M NaCl; מותאם pH 7.5, autoclaved ומאוחסן ב RT)] עם האנטיביוטיקה גנטמיצין 50 מיקרוגרם / מיליליטר. שינוי 0.1X MMR בכל יום ולהסיר כל עוברים מתים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ברגע שעובר להגיע לשלב Nieuwkoop ופייבר ~ 27-30 יולי, לעבור העוברי דואר ל0.1X MMR ללא אנטיביוטיקה כדי לאפשר התפתחות חיידקי מעיים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לגדל את הראשנים עד שהם מגיעים לשלב ההאכלה (שלב 45) ולהעביר אותם ל100 מ&quot;מ צלחות פטרי מלא ב0.1X MMR. להאכיל אותם supernatant אבקת סרפד כל יום אחר במשך שבוע, שינוי MMR 0.1X ביום שחלף. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אחרי שבוע אחד בצלחת פטרי 100 מ&quot;מ, להעביר חיות למחצית טנקי גלון מלאים במי צפרדע [אוקיינוס ​​מיידי 0.5 גר &#39;/ ליטר ו -2 dibasic פוספט מ&quot;מ נתרן (Na 2 HPO 4: MW 141.96) pH 6.8]. להאכיל אותם כמו בשלב 2.4, אבל לשנות את המים רק 2-3 פעמים בשבוע, כאשר המים עכורים. לשמור על בעלי החיים במחזור אור הכהה light/12 שעות 12 עם אורות ההפעלה ב -6 בבוקר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הנח את המכל חצי ליטר עם נושאי בדיקה על משטח לבן כמו underpad מעבדה ספסל, O שעה לפחות 12 / N, לפני הבדיקה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ראשני מבחן בשלבי 45-50 כמתואר בשלב 3 להלן. </li></ol> . 2 התקנה טרום התנהגות: Equipmenלא <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניח בצד על שטח של המעבדה עבור assay ההתנהגות. זה צריך להיות באזור עם תאורת ניאון סטנדרטית שקט, עם תנועה נמוכה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן את טנקי בדיקות לבעלי החיים. , טנקי בדיקות חצי ליטר מקונן מורכבים משני חלקים: מיכל פנימי שיחזיק מים וראשנים; ומכל חיצוני עם הגירוי ויזואלי. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> למכל הפנימי, לעשות סימן קטן בפינות בחוץ עם נוכל, 5 סנטימטר מהחלק התחתון; זה קו המים (איור 1 א, קו מקווקו ירוק). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כמו כן, למכל הפנימי, למלא divets במכל (בפינות והמרכז) עם מתחם אינרטי, כמו אלסטומר Sylgard. הערה: הראשנים להשתהות באזורים אלה אם הם לא מלאים פנימה </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> למכל החיצוני, לכסות את המחצית בדיוק אחד מחוץ לטנק אחד עם סרט שחור חשמלי ואת החצי השני עם 1B איור נייר הטישו הלבן. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מקם את הטנקים עליחסינו פטיפון. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> התקנת מצלמות הרשת / חצובה, כך שהוא נמצא מעל למכלי הבדיקה. כוון את המצלמה כדי לאפשר הדמיה של אזור הבדיקה, כפי שמוצג באיור 1 ג. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חבר את מצלמת האינטרנט למחשב עם תוכנת QuickTime Player המותקנת 5. הפעל את המצלמה. בQuickTime Player, תחת קובץ, בחר &quot;חדשה סרט הקלטה.&quot; התקנת assay ההתנהגות תהיה גלויה במחשב מייד. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לעטוף בבד כותנה קלה על כל ההתקנה כדי להפחית סימנים חיצוניים שיכול להשפיע על התנהגות ראשן, כמו גם, להפחית את האור מוחזר על פני השטח של המים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ודא שעוצמת ההארה באמצעי הבד בין 35-50 cd / m 2. </li></ol> 3. Assay ההתנהגות <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מלא את מיכל הבדיקה הפנימי לסימן המים 5 סנטימטר נעשה בשלב 1.2.1 עם מים צפרדע. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שימוש ברשת קטנה, בעדינות להזיז את בעל החיים לתוך טנק בדיקות הפנימי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Q הפתוחuickTime תוכנה במחשב, ושימוש במכל החיצוני כמדריך, ודא שהמצלמה היא מסוגלת לדמיין ולהקליט את אזור הבדיקה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כתוב את שם החיה, תאריך ושעה על פיסת נייר ולהקליט עם המצלמה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הנח את מיכל הבדיקה למכל החיצוני עם הצד השחור של הטנק לאיור מימין 2. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להתחיל להקליט את הסרט מייד לאחר הסדרת הטנק ולהגדיר טיימר למשך 2 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כאשר צפצופי טיימר, להסיר את מיכל הבדיקה הפנימי, לסובב את המכל החיצוני 180 מעלות ומניחים את מיכל הבדיקה הפנימי בתוך הטנק החיצוני. הפעל את שעון העצר. הערה: בצד השחור צריך עכשיו להיות בצד השני. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חזור על שלב 3.7, שמונה פעמים יותר עבור סכום כולל של עשרה ניסיונות. השתמש באיור 2 כמדריך, בודק את כל ניסוי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חזור על assay ההתנהגות בשני ימים נפרדים. </li></ol> 4. רשתית Axotomy <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הניחו לבעלי חיים בtricaine 0.02% עד שהם לא מגיביםלקמצוץ זנב עם # 3 מלקחיים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להמס agarose 1% ב0.1X MMR ולאחר מכן להוסיף לצלחת פטרי 60 מ&quot;מ. לאחר המצונן, להפוך divot מלבני קטן בagarose ולהוסיף את הראשן לdivot עם tricaine 0.02% קטנים, כדי שבעל החיים הוא שקוע בחלקו בנוזל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פירס העור בזווית של 45 תואר מאחורי אזור הגב של העין עם מחט 25 G, בעוד מרענן החיה נגד מלקחיים בצד השני. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> נזהר שלא לגזור את הווריד, הנמצא בסמוך לעצב הראייה, להגיע בזהירות לתוך החור עם # 5 מלקחיים, לגזור את עצב הראייה ולהעיף החוצה את דרכו. אם יש דימום חמור בשל טעות לגזום את העורק, ואז למקם את מהירות של בעלי החיים בtricaine 2% להרדים. זהירות: 2% פתרון tricaine יכול לגרום לחוסר תחושה בבני אדם. פתרון זה צריך להיות מטופלים עם כפפות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי לשחזר את בעלי החיים לאחר ניתוח, למקם את בעלי החיים ב100 מ&quot;מ צלחת פטרי עם 0.7x MMR ו50 גנטמיצין מיקרוגרם / מיליליטר עבור 20 דקות. NeXT, ראשן העברה להחלמה מיכל עם מים צפרדע. בואו O / נ שאר בעלי החיים </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> למחרת בבוקר, לבדוק את תפקוד הראייה כפי שתואר לעיל (שלבים 3.1-3.9). </li></ol> 5. לנתח את התוצאות <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר הניסויים שתסיימו, למדוד את כמות הזמן שהראשן נשאר בצד השחור של הטנק. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> באופן ידני להציג את קטעי הווידאו באמצעות תוכנה המציגה את השעה ומאפשרת השהיה תכופה. תסתכל על זמן תצוגת וידאו. רשום את תחילת המשפט של שתי דקות, וזה כאשר המכל הפנימי מקנן בהצלחה בתוך הטנק החיצוני והוא בריבוע בתצוגה של המצלמה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש במיקום של העיניים של הראשן להגדיר באיזה צד של טנק החיות שוחות ב. הגדר חוצה את הגבול מצד אחד של הטנק האחר רק כאשר שני העיניים חצו את הקו השחור / לבן. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> רשום את ההתחלה ואת הסוף של כל מרווח זמן (בשניות) שהחיה מבלה בצד השחור. השהה ומחדשבסופו של הווידאו כדי להבטיח דיוק. סה&quot;כ שניות בתוך כל ניסוי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קלט מספרים אלה לתוך גיליון ההתנהגות המצורפת. הגיליון יהיה לחשב את היחס בין הזמן שהחיה בילתה בצד הלבן על ידי הפחתת המשך הזמן על הצד השחור של הטנק מהמשפט הכולל 120 שניות ולחלק את הסך כל הזמן בשניות [(120 - שניות בסך הכל בילו על הצד השחור) / 120 שניות]. ממוצעי גיליון יחס זה על כל 10 הניסויים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש במבחן t של סטודנט, לזווג, הפצת שני זנב כדי לקבוע אם הניסויים בין הימים הם משמעותיים (P ≤ 0.05). </li></ol>

<ol><li>Maurer, C. M., Huang, Y. Y., Neuhauss, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Application+of+zebrafish+oculomotor+behavior+to+model+human+disorders%5BTitle%5D)+AND+%22Rev+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Application of zebrafish oculomotor behavior to model human disorders.</a> Rev Neurosci. 22 (1), 5-16 (2011).</li>
<li>Solessio, E., Scheraga, D., Engbretson, G. A., Knox, B. E., Barlow, R. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Circadian+modulation+of+temporal+properties+of+the+rod+pathway+in+larval+Xenopus%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurophysiol%22%5BJournal%5D)">Circadian modulation of temporal properties of the rod pathway in larval Xenopus.</a> J Neurophysiol. 92 (5), 2672-2684 (2004).</li>
<li>Moriya, T., Kito, K., Miyashita, Y., Asami, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preference+for+background+color+of+the+Xenopus+laevis+tadpole%5BTitle%5D)+AND+%22J+Exp+Zool%22%5BJournal%5D)">Preference for background color of the Xenopus laevis tadpole.</a> J Exp Zool. 276 (5), 335-344 (1996).</li>
<li>Viczian, A. S., Solessio, E. C., Lyou, Y., Zuber, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+functional+eyes+from+pluripotent+cells%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Biol%22%5BJournal%5D)">Generation of functional eyes from pluripotent cells.</a> PLoS Biol. 7 (8), (2009).</li>
<li>Choi, R. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cone+degeneration+following+rod+ablation+in+a+reversible+model+of+retinal+degeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Invest+Ophthalmol+Vis+Sci%22%5BJournal%5D)">Cone degeneration following rod ablation in a reversible model of retinal degeneration.</a> Invest Ophthalmol Vis Sci. 52 (1), 364-373 (2011).</li>
<li>Viczian, A. S., Zuber, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tissue+determination+using+the+animal+cap+transplant+%28ACT%29+assay+in+Xenopus+laevis%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Tissue determination using the animal cap transplant (ACT) assay in Xenopus laevis.</a> J Vis Exp. 16 (39), (2010).</li>
<li><a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22Normal+table+of+Xenopus+laevis+%28Daudin%29+%3A+a+systematical+and+chronological+survey+of+the+development+from+the+fertilized+egg+till+the+end+of+metamorphosis%22">Normal table of Xenopus laevis (Daudin) : a systematical and chronological survey of the development from the fertilized egg till the end of metamorphosis</a>. Nieuwkoop, P. D., Faber, J. , Garland Pub. New York. (1994).</li>
<li>Blackiston, D., Shomrat, T., Nicolas, C. L., Granata, C., Levin, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+second-generation+device+for+automated+training+and+quantitative+behavior+analyses+of+molecularly-tractable+model+organisms%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">A second-generation device for automated training and quantitative behavior analyses of molecularly-tractable model organisms.</a> PLoS One. 5 (12), (2010).</li>
<li>Rosemberg, D. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differences+in+spatio-temporal+behavior+of+zebrafish+in+the+open+tank+paradigm+after+a+short-period+confinement+into+dark+and+bright+environments%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Differences in spatio-temporal behavior of zebrafish in the open tank paradigm after a short-period confinement into dark and bright environments.</a> PLoS One. 6 (5), (2011).</li>
<li>Dong, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visual+Avoidance+in+Xenopus+Tadpoles+is+Correlated+With+the+Maturation+of+Visual+Responses+in+the+Optic+Tectum%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurophysiol%22%5BJournal%5D)">Visual Avoidance in Xenopus Tadpoles is Correlated With the Maturation of Visual Responses in the Optic Tectum.</a> J Neurophysiol. 101 (2), 803-815 (2009).</li>
<li>Lan, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Noggin+Elicits+Retinal+Fate+In+Xenopus+Animal+Cap+Embryonic+Stem+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Noggin Elicits Retinal Fate In Xenopus Animal Cap Embryonic Stem Cells.</a> Stem Cells. 27 (9), 2146-2152 (2009).</li>
<li>De Robertis, E. M., Kuroda, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dorsal-ventral+patterning+and+neural+induction+in+Xenopus+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Cell+Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Dorsal-ventral patterning and neural induction in Xenopus embryos.</a> Annu Rev Cell Dev Biol. 20, 285-308 (2004).</li>
</ol>

למחברים אין מה לחשוף.

אנו מדווחים כאן assay מודרך חזון פשוט התנהגותיים שניתן לבצע בקלות בשבוע על ידי אנשי מעבדה מינימאלי מאומנים. בעוד מבחני אחרים דורשים ציוד מיוחד ומומחיות בהתנהגות בעלי חיים, assay זה מאפשר בדיקה מהירה כדי לקבוע תפקוד ראייה. עוד assay התנהגותיות, assay ההימנעות החזותי, פותח כדי לקבוע כיצד tectum תורם לתפיסה חזותית בXenopus 10. כוונון זה אמצעי assay במרחב וברגישות לקונטרסט בתגובה להעברה לעומת רקע יציב, ובכך, יכול למדוד התנהגות מבוססת ראיה מיוחדת יותר מ assay הפשוט ...

laevis Xenopus שימש כאורגניזם מודל ללמוד היווצרות עין. העיניים לפתח במהירות, הולכת וגדלה לפדיון בפחות משבוע לגנים או מסלולי בדיקה שיש להם השפעה על התפתחות ותפקוד ראייה. כדי לבדוק את התפקוד חזותי, תגובת optokinetic וoptomotor נעשתה שימוש בדג זברה וראשני Xenopus, בהתאמה 1,2. בגלל העיניים של ראשני Xenopus הן קטנות יחסית לדג זברה, assay זה מחייב שימוש בציוד מיוחד וצוות מיומן לזהות את הזנב להעיף ועיני תנועת התנהגות העדינה בXenopus. התנהגות חזקה יותר בXenopus היא ההעדפה לשחייה במכל עם רקע לבן, אשר מתואר במסמך 3. בעת ביצוע ראשן במחצית טנק שחור / חצי לבן, הראשן מראש מותמרים שוחה במהירות לצד הלבן של הטנק. אנחנו השתמשנו בעבר assay זה כדי לקבוע אם נגזר תאי pluripotentעיניים היו פונקציונליות 4. כאן אנו מדווחים גרסה מפורטת של assay זה, אשר יכול לשמש כדי לבדוק את תפקוד הראייה של ראשני Xenopus premetamorphic. assay זה הוא פשוט יותר מאשר assay תגובת optomotor, שכן הוא רק דורש מצלמת וידאו מותקן דיגיטלית, תוכנת מצלמה דיגיטלית וציוד סטנדרטי המצוי ברוב מעבדות Xenopus. בנוסף, התגובה נרשמה לא דורשת הכשרה מיוחדת לתוצאות עולים בקנה אחד. תוצאות הנציג שלנו מראות כי אותה הקבוצה של ראשנים, שעברה axotomy כפול רשתית, לשחות באופן אקראי מסביב לטנק. כללנו גם את תוצאות assay ההתנהגות מראשן של נציג, המראה כיצד עין אחת יכולה להיבדק על תגובה חזותית. גיליון עבודה כבר כלול כך שניתן להוסיף מספרים שנרכשו במהלך assay ונותחו. גיליון עבודה זה יכול לשמש כדי לקבוע אם יש להם את הראשנים שנבדקו תגובה חזותית.

<table><tbody><tr><td>1/2 ליטר Flex-Tank עם כיסוי</td><td>eNasco</td><td>SB19271M</td><td>גודל: 5-3/8 אינץ' x 7 אינץ' x 3-3/4 אינץ'</td></tr> <tr><td>סרט</td><td></td><td></td><td></td>חשמלי</tr><tr><td>שחור נייר</td><td></td><td></td><td></td>טישו לבן</tr><tr><td>פטיפון חיסון גדול</td><td>VWR</td><td>50809-022</td><td>גודל: קוטר 114.3 x&nbsp; גובה 76.2 מ"מ (4 1/2&nbsp; x&nbsp; 3 אינץ')</td></tr><tr><td>Durasorb underpad</td><td>VWR</td><td>82004-836</td><td>גודל: 43.2 x 60.1 ס"מ (17 x 24 אינץ')</td></tr><tr><td>Kimwipe</td><td>Krackeler Scientific, Inc.</td><td>1945-34155-CS</td><td></td></tr><tr><td>חצובה</td><td></td> סטנדרטית <td>מצלמת</td> iSight או <td></td></tr><tr><td>מצלמת אינטרנט</td><td>אפל</td><td>M8817LL/A</td><td>טוב לראשנים גדולים יותר אבל קטנים קשה לראות</td></tr><tr><td>מחשב נייד</td><td>אפל / מחשב</td><td>שונים</td><td>השתמשנו ב- MacBook 13 אינץ', 2 GHz Intel Core 2 Duo המריץ MacOSX Lion 10.7.5</td></tr><tr><td>MiniDV מצלמת וידיאו מצלמת וידאו</td><td>SONY</td><td>DCR-HC42</td><td>מחובר באמצעות Firewire למחשב עם 6 מוליכים ו-4 מוליכים אלפא FireWire 400&nbsp;</td></tr><tr><td>תחנת Handycam</td><td>SONY</td><td>DCRA-C121</td><td>זה יכול לשמש לחיבור חוט אש למצלמה</td></tr><tr><td>תוכנת QuickTime Player</td><td>Quicktime</td><td>גרסה 10.1</td><td></td></tr><tr><td>26 G מחט (אורך 5/8 אינץ')</td> <td>VWR</td><td>BD305115</td><td></td></tr><tr><td>Dumont #5 מלקחיים</td><td>Fine Science Tools</td><td>11295-10</td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>חד פעמי</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Gentamicin sulfate [50 מ"ג/מ"ל]</td> <td>Fisher Scientific</td><td>17-528Z</td><td>מאוחסן ב-RT</td></tr><tr><td>Sylgard 184 אלסטומר סיליקון</td><td>Fisher Scientific</td><td>NC9644388-Instant</td><td></td></tr><tr><td>Ocean</td><td>Doctors Foster and Smith</td><td>CD-116528</td><td>תמיסת מלאי = 100 גרם/ליטר מאוחסן ב-RT</td></tr><tr><td>נתרן פוספט די-בסיסי</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S0876</td><td>תמיסת מלאי = 0.4 M מאוחסן ב-RT</td></tr><tr><td>In vitro עוברים מופרים</td><td>eNasco</td><td>LM00490MX</td><td>100 עוברים ליחידה</td></tr></tbody></table>

assay התנהגות פשוט לפונקציה של visual בדיקה ב<em&gt; laevis xenopus</em

A Simple Behavioral Assay for Testing Visual Function in Xenopus laevis

מדידה של תפקוד הראייה בראשנים של הצפרדע, laevis Xenopus, מאפשרת הקרנה לעיוורון בבעלי חיים. תגובת optokinetic היא, התנהגות רפלקסיבית המבוסס על חזון שכבר נצפתה בכל בעלי החוליות שנבדקו. עיני ראשן הם קטנים כל כך התגובה להעיף זנב שימשה כאמצעי חלופי, שדורש טכנאי מיומן כדי להקליט את התגובה העדינה. פיתחנו assay התנהגות חלופי המבוסס על העובדה שראשנים מעדיפים לשחות בצד הלבן של טנק כאשר הוא ממוקם בטנק עם צדדים הן בשחור לבן. Assay שהוצג כאן מהווה חלופה זולה ופשוטה שיוצרת תגובה שנמדדת בקלות. ההתקנה מורכבת מחצובה, מצלמת האינטרנט וטנקים בדיקות מקוננות, זמינה ברוב מעבדות Xenopus. מאמר זה כולל סרט המראה את התנהגותם של ראשנים, לפני ואחרי ניתוק עצב הראייה. על מנת לבדוק את התפקוד של עין אחת, אנחנו גם כוללים ייצוגיםתוצאות sentative של ראשן שבו כל עיניים עברו axotomy רשתית בימים רצופים. מחקרים עתידיים יכולים לפתח גרסה אוטומטית של assay זה לבדיקת הראייה של ראשנים רבים בבת אחת.

דיווחים קודמים הראו כי ראשני Xenopus premetamorphic מעדיפים לשחות בצד הלבן של טנק בשחור / לבן וקראו assay זה, assay העדפות צבע רקע 3 שינינו assay זה על מנת לבדוק את תפקוד הראייה של שני עיניים של ראשנים ב פחות משבוע. בדרך זו, ניתן לאסוף את עיניהם לבדיקה היסטולוגית. אנחנו מראים כאן איך התגובה היא עקב רמזים חזותיים. בסרט 1, הראשנים בלוחות השמאל וימין הם אותם בעלי החיים. בצד השמאל...

Xenopus laevis ראשנים מעדיפים שחייה בצד הלבן של טנק בשחור / לבן. התנהגות זו מונחה על ידי החזון שלהם. בהתבסס על התנהגות זו, אנו מציגים assay פשוט כדי לבדוק את תפקוד הראייה של ראשנים.

Assay התנהגות פשוט לפונקציה של Visual בדיקה ב<em&gt; Laevis Xenopus</em

Measurement of the visual function in the tadpoles of the frog, Xenopus laevis, allows screening for blindness in live animals. The optokinetic response ...

המטרה הכללית של פרוצדורה זו היא לבחון את התפקוד החזותי של ראשנשאיים על ידי תיעוד משך הזמן שבהם שוהה בעל החיים בחציו של מיכל הבדיקה המכוסה בשחור. דבר זה מושג תחילה על ידי גידול ראשנשאיים לשלבים 45 עד 50. השלב השני הוא הקמת מיכל שחציו שחור וחציו לבן, יחד עם מצלמה עבור בדיקת ההתנהגות.בשלב הבא, מקמו מיכל שני עם ראשן בתוך המיכל החיצוני. עבור כל ראשן, רשמו את ההתנהגות המונחית ראייה בעוד הרקע בסביבתו משתנה. השלב האחרון הוא ביצוע כריתת רשתית (retinal ex sodomy) לראשנים, ולאחר מכן חזרו על בדיקת ההתנהגות.בסופו של דבר, נתונים מבדיקה פשוטה וזולה זו משמשים כדי להראות שלראשתנים יש העדפה לשחות בצד אחד של המיכל על פני הצד השני, תחת בדיקות של ראייה פוטוטופית. היתרון העיקרי בשימוש בשיטה זו על פני טכניקות אחרות, כמו התגובה האופטית-קינטית או בדיקת היפפוף הזנב, הוא שמדובר בשיטה פשוטה וזולה המשתמשת בציוד הזמין ברוב המעבדות. כדי להכין את הראשתנים, ראשית, השג עוברים מופריים של xenopus, והנח תמיסת mark's, תמיסת ringers משופרת או MMR המדוללת בפי 10 בתוך צלחות פטרי של 60 millimeter בריכוז של 50 micrograms per milliliter.העבירו עוברים משלב הבלסטולה לשלב לוח העצבים לתוך אנטיביוטיקה מסוג Gentamycin. שלבים 2 עד 15 בטמפרטורה של 18 °C בתוך צלחות פטרי. ברגע שהעוברים מגיעים לשלב של כוס חדשה בערך בין 27 ל-30, העבירו אותם ל-0.1 XMMR ללא אנטיביוטיקה כדי לאפשר צמיחה של חיידקי המעי.כאשר השפנפנים (tadpoles) מגיעים לשלב ההזנה, סביב שלב 45, העבירו אותם לכלי Petri בני 100 מילימטר עם 0.1 XMMR. למחרת, האכילו אותם בתעלה (supernatant) של אבקת סרפד. לאחר שבוע בכלי Petri בני 100 מילימטר, מלאו מיכל של חצי גאלון במי צפרדעים.העבירו את בעלי החיים לאקווריום והמשיכו בלוח הזמנים של ההאכלה בתסנין אבקת נטיה, אך החליפו את המים רק פעמיים עד שלוש פעמים בשבוע. כאשר בעלי החיים נמצאים באקווריומים של חצי גלון, החזיקו אותם במחזור של 12 שעות אור ו-12 שעות חושך, כאשר האורות נדלקים בשעה 6:00 בבוקר. לפני הבדיקה, הניחו את אקווריום חצי הגלון עם נשואי הניסוי על משטח לבן למשך הלילה, לפחות 12 שעות לפני הבדיקה. את בדיקת ההתנהגות יש לבצע באזור שקט עם תנועה מועטה ותחת תאורת פלורסנט סטנדרטית.הכינו שני מיכלי בדיקה בנפח חצי גאלון המוכנסים זה בזה בפינות החיצוניות של מה שיהיה המיכל הפנימי. השתמשו בטוש Sharpie כדי לסמן את קו המים בגובה של 5 cm מעל התחתית. כמו כן, במיכל הפנימי, זהו שקעים כלשהם בחלקו הפנימי.מלאו אותם בתרכובת אינרטית כדי למנוע מהראשניות להשתהות בתוכם. כעת הפנו את תשומת הלב למכל החיצוני השני. לשלב הבא, השגו סרט בידוד שחור ונייר טישיו לבן.השתמשו בסרט הדביק כדי לכסות את החלק החיצוני של מחצית אחת מהמיכל ואת נייר הרקמה כדי לכסות את החלק החיצוני של המחצית השנייה, כפי שמוצג כאן. לאחר הכנת המכלים, הגדירו שולחן מסתובב להסנקה והניחו עליו את המכלים המוכנסים זה בזה. מקמו חצובה ומצלמת רשת כך שהמצלמה תוכל לצלם את פנים המכלים מלמעלה.חברו את מצלמת האינטרנט למחשב עם תוכנה להקלטה והשמעה של וידאו. הדליקו את המצלמה והיערכו לביצוע הקלטת סרטון חדשה. לאחר מכן, כסו את המצלמה ואת המכלים בבד כותנה קל.כדי להפחית רמזים חיצוניים עבור השבבים, השתמש במד לומיננס (luminance meter) ובדוק כי הלומיננס תחת הבד הוא בין 35 ל-50 candles per square meter. התחל את בדיקת ההתנהגות על ידי הוצאת מיכל הבדיקה הפנימי. מלא אותו במי צפרדע עד לסימון של five centimeter.השתמשו ברשת כדי להעביר בעל חיים מהמיכל בנפח חצי גלון למיכל הבדיקה הפנימי במחשב. ודאו שתוכנת ההקלטה פתוחה ומקליטה את אזור הבדיקה לצורך תיעוד. רשמו את שם בעל החיים, התאריך והשעה על דף נייר.הנח זאת תחת המצלמה לצורך הקלטה. לאחר מכן, הגדר טיימר לשתי דקות. בשלב הבא, כוון את המכל החיצוני על גבי השולחן המסתובב, כך שהצד השחור יהיה מימין.כעת מקמו את מיכל הבדיקה בתוך המיכל החיצוני. באזור ההקלטה, סגרו את הווילון והשתמשו במסך המחשב כדי לוודא את כיוונו של המיכל החיצוני. ודאו שהווידאו מוקלט והפעילו את הטיימר.כאשר הטיימר מצפצף, השאירו את כיסוי ההסתר במקומו והוציאו את מיכל הבדיקה הפנימי. לאחר מכן, סובבו את המיכל החיצוני ב-180 מעלות כך שהצד השחור יהיה כעת משמאל. החזירו את מיכל הבדיקה לתוך המיכל החיצוני והפעילו את הטיימר לשתי דקות.שוב, הסירו את המיכל הפנימי. סובבו את המיכל החיצוני ב-180 מעלות, והחזירו את המיכל הפנימי מדי שתי דקות, בסה"כ 10 פעמים. עם הסיום, הפסיקו את הקלטת הווידאו.החזירו את השבב למכל של חצי גלון. הכינו מיקרוסקופ לביצוע ה-retinol ex sodomy. מלאו צלחת פטרי בקוטר 60 מילימטר ב-1%aros המומס ב-0.1 XMMR והניחו לו להתמצק.הסר חתיכה מלבנית קטנה מה-aros בגודלו של השבשב. כאשר תהיה מוכן להמשיך, הוצא את חיית הניסוי והנח אותה ב-0.02%Trica. המשך כאשר היא אינה מגיבה לצביטה בזנב באמצעות פינצטה מספר שלוש.לאחר מכן העבירו את החיה לצלוחית. המשיכו בקיבוע של צלוחית הפטרי על המיקרוסקופ. הכינו את הפינצטה כדי לתמוך בחיה מצד אחד.בצד הנגדי, השתמשו במחט בקוטר 25 gauge כדי לנקב את העור מאחורי האזור הדורסלי של העין בזווית של 45 מעלות, היכנסו בזהירות לחור עם פינסטה מספר 5 וגזרו את העצב האופטי תוך הימנעות מהוריד הסמוך לו. הסיטו את העצב הצידה והוציאו את הפינסטה לאחר הניתוח. המתינו להחלמת בעל החיים על ידי הנחתו בצלחת פטרי בקוטר 100 millimeter עם 0.7 XMMR ו-50 micrograms per milliliter.Gentamycin למשך 20 דקות. לאחר מכן, העבירו את השבבית למכל התאוששות עם מי צפרדע. הניחו את המכל על משטח לבן כהכנה לבדיקה.יש להניח לבעל החיים לנוח במהלך הלילה. למחרת בבוקר, יש להשתמש במבחן ההתנהגותי כדי לבחון את התפקוד הראייתי. סרטון זה מציג נתונים מייצגים עבור הניסוי.משמאל נמצאים בעלי החיים לפני הניתוח, ומימין אותם בעלי חיים לאחר שצירים רטינליים משתי העיניים נכרתו. הדבר מצוין בסכימה בפינות התחתונות. המים הונעו כדי להראות ששום דבר לא נוסף כדי להרחיק את בעלי החיים מהצד השחור או למשוך אותם לצד הלבן.הראשניות שלפני הניתוח מגיבות לצבע הרקע בפחות מ-30 שניות, בעוד שהראשניות העיוורות שוחות ללא מטרה במיכל. תרשים זה מציג את אחוז הזמן שהותה חיה אחת באזורים הלבנים והשחורים תחת שלושה תנאים. ראשית, החיה נצפתה לפני ביצוע ניתוח כלשהו באמצעות הבדיקה.במשך יומיים רצופים לאחר חיתוך העצב האופטי הימני, נצפתה התנהגותו של בעל החיים לאורך יומיים של בדיקה. לבסוף, לאחר ששני העצבים האופטיים נחתכו, בוצעו יומיים נוספים של תצפית באמצעות הבדיקה. בעל החיים שהה זמן רב יותר בצד הלבן של המכל כאשר לפחות עצב אופטי אחד היה תקין.לאחר צפייה בסרטון זה, תגמרו עם הבנה טובה של אופן בדיקת הראייה של ראשני צפרדעים באמצעות ריאגנטים וציוד פשוטים הנמצאים ברוב מעבדות הצפרדעים. בהצלחה בניסויים שלכם.

a-simple-behavioral-assay-for-testing-visual-function-xenopus

Research

JoVE Journal

Neuroscience

מדעי המוח

בדיקת רגישות חזותית לטאות באמצעות פרדיגמה התניה אופרנטית המעסיקה וידאו השמעה אקראית של נקודה kinematograms ו ממוחשבת חסרי חוליות.

בדיקת רגישות חזותית על מהירות ועל כיוון התנועה של לטאות

פיתחנו את תגובת חזותית-Motor כדי לכמת את הפלט המוטורי של דג הזברה הזחל בתגובה במרווחים ו decrements אור. בחנו גם מוטנטים דג הזברה חזון, כולל לא optokinetic (NRC) מוטנטים בתגובה, אשר נחשבו עיוור לחלוטין, כאשר נבדק על ידי assay אחר חזון, רפלקס optokinetic.

Assay ההתנהגות כדי למדוד את התגובה של דג הזברה לשינויים לעוצמות אור

VisioTracker היא מערכת אוטומטית לניתוח הכמותי של ביצועים חזותיים של דגים בוגרים וזחל קטנים המבוססים על ההקלטה של ​​תנועות עיניים. הוא כולל שליטה מלאה על תכונות גירוי חזותיים וניתוח בזמן אמת, המאפשר מחקר תפוקה גבוהה בתחומים כגון פיתוח מערכת ראייה ותפקוד, פרמקולוגיה, מחקרי מעגלים עצביים ואינטגרציה חושית.

VisioTracker, גישה אוטומטית חדשנית לניתוח oculomotor

סרטון זה מתאר את בדיקת התגובה האופטוקינטית בדגי זברה. הסרטון מודד את תנועות העיניים הרפלקסיביות בהתבסס על הגירוי החזותי הנע וקובע את חדות הראייה בדגי זברה.

בדיקת תגובה אופטוקינטית: שיטה למדידת חדות ראייה בדגי זברה

הסרטון מתאר את ההימנעות ובדיקת thigmotaxis של זחלי דגי זברה. הסרטון בוחן את התנהגותם של זחלי דגי זברה בתגובה לגירוי חזותי מרתיע.

הימנעות מדגי זברה ובדיקת תיגמוטקסיס: שיטה בעלת תפוקה גבוהה לבחינת התנהגות הזחלים בתגובה לגירוי חזותי מרתיע

דג הזברה הייתה כלי חשוב לתחומי מחקר רבים. כאן אנו מדגימים שיטה כדי לעורר תגובה חזותית ולחשב את חדות ראייה תפקודיות בדג הזברה המבוגר.

תגובת Optokinetic כמדד כמותי של חדות ראייה בדג הזברה

אנו מציגים שיטה לניתוח אלקטרורטינוגרפי (ERG) של זחלי דג הזברה תוך שימוש בטכניקות מיקרומניפולציה ואלקטרורטינוגרפיה. זוהי שיטה פשוטה ופשוטה לבדיקת תפקוד חזותי של זחלי דג הזברה in vivo.

ניתוח electroretinogram של התגובה החזותית בדג הזברה זחלים

ראשנים של צפרדע רפואית להציע פלטפורמה ייחודית לחקור את תפקוד מערכת העצבים ויוו. אנו מתארים מתודולוגיות להערכה של עיבוד מידע חוש הריח חי צפרדע רפואית הזחלים בתנאים נורמליים לגידול או לאחר פגיעה.

הערכה תפקודית של חוש הריח מסלולים ב ראשנים של צפרדע רפואית חי

, כדי לבחון את ראיית העכבר. ערכנו מבחן מתנשא עכברים הוצבו בזירה מרובעת גדולה עם צג על התקרה שלו. הגירוי החזותי מתנשא בעקביות עורר הקפאת או תגובות הטיסה בעכברים.

באמצעות גירויים חזותיים מתנשא להערכת חזון העכבר

פרוטוקול זה נועד להדגים כיצד להחדיר מיקרוקל DNA/dotap תערובת לתוך eyebuds של יום אחד xenopus זריזה העוברים, וכיצד התמונה ולשחזר חלבון פלורסנט בודדים ירוק (gfp) המבטא האופטית סיבי סוכת ב tectal מידות של . שלמים וחיים של...

הזרקת דנ א לתוך eyebuds ב xenopus זריזה העוברים והדמיה של gfp המבטא האופטי axonal הביע בשלמותו, חי xenopus tadpoles

ניוון עצבי הן בעיניים והן במוח כתוצאה מסוכרת ניתן לראות באמצעות בדיקות התנהגותיות שבוצעו על מכרסמים. מבוך ה-Y, מדד לקוגניציה מרחבית, ותגובת האופטומוטור, מדד לתפקוד חזותי, מספקים תובנה על אבחנות וטיפולים פוטנציאליים.

הערכה התנהגותית של תפקוד חזותי באמצעות תגובת Optomotor ותפקוד קוגניטיבי באמצעות Y-Maze בחולדות סוכרתיות

למדו שיטה פשוטה להערכת תפקוד ראייה בראשני Xenopus laevis באמצעות מבחן התנהגותי בטנק שחור-לבן. השיטה מאפשרת למדענים לחקור עיבוד חזותי ותפקוד עצבי ביצורים מימיים.

Assay התנהגות פשוט לפונקציה של Visual בדיקה ב

גלה סרטונים נוספים