Assay התנהגות פשוט לפונקציה של Visual בדיקה ב Laevis Xenopus
12 ביוני 2014
Xenopus laevis ראשנים מעדיפים שחייה בצד הלבן של טנק בשחור / לבן. התנהגות זו מונחה על ידי החזון שלהם. בהתבסס על התנהגות זו, אנו מציגים assay פשוט כדי לבדוק את תפקוד הראייה של ראשנים.
המטרה הכוללת של הליך זה היא לבחון את התפקוד החזותי של ראשנים על ידי רישום משך הזמן שהחיה מבלה על מחצית ממיכל הבדיקה המכוסה בשחור. זה מושג על ידי העלאת ראשנים לשלבים 45 עד 50. השלב השני הוא להקים מיכל חצי שחור וחצי לבן יחד עם מצלמה לבדיקת ההתנהגות.
לאחר מכן, הניחו מיכל שני עם ראשן לתוך המיכל החיצוני. עבור כל רשומת ראשנים, ההתנהגות מונחית הראייה כרקע בסביבתה משתנה. השלב האחרון הוא לבצע מעשה סדום ברשתית על הראשנים ולאחר מכן לחזור על מבחן ההתנהגות.
בסופו של דבר, נתונים מהבדיקה הפשוטה והזולה הזו משמשים כדי להראות שלראשנים יש העדפה לשחות בצד אחד של המיכל על פני הצד השני, תחת בדיקות של ראיית פוטוטופ. היתרון העיקרי בשימוש בשיטה זו על פני טכניקות אחרות כמו התגובה הקינטית האופטית או בדיקת היפוך הזנב, הוא שמדובר בשיטה זולה ופשוטה המשתמשת בציוד הזמין ברוב מעבדות האופוס. כדי להכין את הראשנים, ראשית, השג עוברי קסנופוס מופרים, שים סימנים, צלצולים מותאמים או MMR מדולל בפקטור של 10 ב-60 מילימטר צלחות פטרי עם 50 מיקרוגרם למיליליטר.
אנטיביוטיקה של גנטמיצין ממקמת את בלסטולה לעוברים בשלב הצלחת העצבית. שלבים 2 עד 15 ב-18 מעלות צלזיוס בצלחות הפטרי. ברגע שהעוברים מגיעים לכוס חדשה לטובת שלב של כ-27 עד 30, החליפו אותם ל-0.1 XMMR ללא אנטיביוטיקה כדי לאפשר צמיחת חיידקי מעיים.
כאשר הראשנים מגיעים לשלב ההזנה בסביבות שלב 45, העבירו אותם לצלחות פטרי של 100 מילימטר עם 0.1 XMMR. למחרת, האכילו אותם באבקת סרפד. לאחר שבוע בצלחת פטרי 100 מילימטר, מלאו מיכל של חצי ליטר במי צפרדעים.
העבירו בעלי חיים למיכל והמשיכו בלוח הזמנים של האכלת אבקת הסרפד, אך החליפו את המים רק פעמיים עד שלוש בשבוע. כאשר בעלי החיים נמצאים במיכלי חצי ליטר, שמור אותם באור של 12 שעות, מחזור חושך של 12 שעות עם אורות נדלקים בשעה 6:00 בבוקר לפני הבדיקה, הנח את מיכל חצי ליטר עם הנבדקים על משטח לבן למשך הלילה למשך 12 שעות לפחות לפני הבדיקה. בדיקת ההתנהגות צריכה להיעשות באזור שקט ודל תנועה עם תאורת פלורסנט סטנדרטית.
הכן שני מיכלי בדיקה מקננים של חצי ליטר בפינות החיצוניות של מה שיהיה המיכל הפנימי. השתמש בשארפי כדי לסמן את קו המים בחמישה סנטימטרים מעל התחתית. גם עבור המיכל הפנימי, זהה את כל החריצים בחלק הפנימי שלו.
מלאו אותם בתרכובת אינרטית כדי למנוע ראשנים להתעכב בהם. כעת הפנה את תשומת הלב למיכל החיצוני השני. לשלב הבא, השג סרט חשמלי שחור ונייר טישו לבן.
השתמש בסרט כדי לכסות את החלק החיצוני של מחצית אחת של המיכל ובנייר הטישו כדי לכסות את החלק החיצוני של השני כפי שמוצג כאן. לאחר הכנת המיכלים, הקימו פטיפון חיסון והניחו עליו את הטנקים המקוננים. מקם חצובה ומצלמת רשת כך שהמצלמה תוכל לצלם את פנים הטנקים מלמעלה.
חבר את מצלמת האינטרנט למחשב באמצעות תוכנת לכידת וידאו והשמעה. הפעל את המצלמה והתכונן להקלטת סרט חדשה. לאחר מכן עטפו בד כותנה קל משקל מעל המצלמה והמיכלים.
כדי להפחית רמזים חיצוניים לראשנים, השתמש במד זוהר ובדוק שהבהירות מתחת לבד היא בין 35 ל-50 נרות למ"ר. התחל את בדיקת ההתנהגות על-ידי אחזור מיכל הבדיקה הפנימי. מלאו אותו במי צפרדע עד לסימן חמישה סנטימטרים.
השתמש ברשת כדי להעביר בעל חיים ממיכל חצי ליטר שלו למיכל הבדיקה הפנימי במחשב. ודא שתוכנת ההקלטה פתוחה ומקליטה את אזור הבדיקה לשמירת רשומות. כתוב את שם החיה, התאריך והשעה על פיסת נייר.
הנח את זה מתחת למצלמה להקלטה. לאחר סיום זה, הגדר מראש טיימר לשתי דקות. לאחר מכן, כוון את המיכל החיצוני על הפטיפון, כך שהצד השחור יהיה בצד ימין.
כעת הנח את מיכל הבדיקה במיכל החיצוני. באזור ההקלטה, סגור את הווילון והשתמש במסך המחשב כדי להבטיח את כיוון המיכל החיצוני. ודא שהווידאו מוקלט והפעל את הטיימר.
כאשר הטיימר מצפצף, שמור את הווילון במקומו והסר את מיכל הבדיקה הפנימי. לאחר מכן, סובב את המיכל החיצוני 180 מעלות כך שהצד השחור יהיה כעת משמאל. החזר את מיכל הבדיקה למיכל החיצוני והפעל את הטיימר של שתי הדקות.
שוב, הסר את המיכל הפנימי. סובב את המיכל החיצוני ב-180 מעלות, והחלף את המיכל הפנימי כל שתי דקות בסך הכל 10 פעמים. בסיום, הפסק את הקלטת הווידאו.
החזר את הראשן למיכל חצי ליטר שלו. הכינו מיקרוסקופ לביצוע מעשה סדום ברטינול. ממלאים צלחת פטרי בגודל 60 מילימטר ב-1% ארוס מומס ב-0.1 XMMR ונותנים לה להתמצק.
הסר חתיכה מלבנית קטנה של הארוס בגודל הראשנים. כשמוכנים להמשיך, שלפו את חיית הניסוי והניחו אותה ב-0.02%Trica. המשיכו כשהוא לא מגיב לצביטה בזנב עם מלקחיים מספר שלוש.
ואז העבירו את החיה לתבשיל. המשך על ידי הרכבת צלחת הפטרי על המיקרוסקופ. התכוננו לחזק את החיה עם מלקחיים בצד אחד.
בצד הנגדי, השתמש במחט בגודל 25 כדי לנקב את העור מאחורי האזור הגבי של העין בזווית של 45 מעלות, הושיט יד בזהירות לתוך החור עם מספר חמש, מלקחיים וחתוך את עצב הראייה תוך הימנעות מהווריד שלידו. הפוך את העצב מהדרך ומשוך את המלקחיים לאחר הניתוח. שחזר את החיה על ידי הנחתה בצלחת פטרי של 100 מילימטר עם 0.7 XMMR ו-50 מיקרוגרם למיליליטר.
גנטמיצין למשך 20 דקות. לאחר מכן, העבירו את הראשן למיכל התאוששות עם מי צפרדע. הנח את המיכל על משטח לבן לקראת הבדיקה.
תנו לבעל החיים לנוח למשך הלילה. למחרת בבוקר השתמש במבחן ההתנהגותי כדי לבדוק את תפקוד הראייה. סרט זה מציג נתונים מייצגים עבור הניסוי.
משמאל החיות לפני הניתוח, מימין אותן חיות לאחר שאקסוני הרשתית משתי העיניים נקטעו. זה מסומן על ידי הסכימה בפינות התחתונות. המים הופרעו כדי להראות שלא נוסף דבר כדי להדוף את החיות מהצד השחור או למשוך אותן לצד הלבן.
הראשנים לפני הניתוח מגיבים לצבע הרקע תוך פחות מ-30 שניות בעוד הראשנים העיוורים שוחים ללא מטרה סביב המיכל. תרשים זה מציג את אחוז הזמן שהושקע באזורים הלבנים והשחורים עבור בעל חיים בודד בשלושה תנאים. ראשית, החיה נצפתה לפני כל ניתוח באמצעות הבדיקה.
יומיים רצופים לאחר כריתת עצב הראייה הימני, נצפתה התנהגותו במשך יומיים של בדיקות. לבסוף, לאחר ששני עצבי הראייה נקטעו, היו עוד יומיים של תצפית עם הבדיקה. החיה בילתה ימים נוספים בצד הלבן של המיכל כאשר לפחות עצב ראייה אחד היה שלם.
לאחר צפייה בסרטון זה, אתה אמור להבין היטב כיצד לבדוק את הראייה של ראשנים באמצעות ריאגנטים וציוד פשוטים שנמצאים ברוב מעבדות הצפרדעים. בהצלחה בניסויים שלך.
צפו בתמליל המלא וקבלו גישה לאלפי סרטונים מדעיים
סקירה כללית
ראשנים של Xenopus laevis מפגינים העדפה לשחייה בצד הלבן של מיכל שחור/לבן, מה שמצביע על כך שההתנהגות שלהם מונחית על ידי הראייה. מחקר זה מציג מבחן פשוט להערכת התפקוד החזותי של ראשנים.
מרכיבי מחקר עיקריים
תחום המדע
- מדעי המוח
- ביולוגיה התנהגותית
- מדעי הראייה
רקע
- Xenopus laevis הוא אורגניזם מודל נפוץ בביולוגיה התפתחותית.
- העדפות חזותיות של ראשנים יכולות לספק תובנות לגבי יכולות החישה שלהם.
- הבנת התפקוד החזותי חיונית לחקר ההתנהגות בסביבות מימיות.
- ניתן להשתמש בתהליך זה כדי להעריך את ההשפעה של שינויים סביבתיים על ההתנהגות החזותית.
מטרת המחקר
- לבדוק את התפקוד החזותי של ראשני Xenopus laevis.
- להקים מבחן התנהגותי שמודד את הזמן שמושקע בחלקי מיכל שונים.
- לחקור כיצד רמזים חזותיים משפיעים על התנהגות הראשנים.
שיטות ששימשו
- גידול ראשנים לשלבים 45 עד 50 לצורך הבדיקה.
- הקמת מיכל שמחציתו שחורה והמחצית השנייה לבנה לצורך מבחן ההתנהגות.
- רישום הזמן שמושקע על ידי ראשנים בכל קטע של המיכל.
- ביצוע בדיקת רשתית חיצונית על הראשנים וחזרה על המבחן.
תוצאות עיקריות
- ראשנים הפגינו העדפה משמעותית לצד הלבן של המיכל.
- נצפו שינויים התנהגותיים כאשר סביבת הרקע השתנתה.
- המבחן מדד ביעילות את התפקוד החזותי על סמך העדפות השחייה.
- ניתוח הרשתית סיפק תובנות לגבי היכולות החזותיות של הראשנים.
מסקנות
- ניתן להעריך ביעילות את התפקוד החזותי של ראשני Xenopus laevis באמצעות מבחן התנהגותי פשוט זה.
- התוצאות מצביעות על כך שהראייה ממלאת תפקיד קריטי בהנחיית התנהגות הראשנים.
- שיטה זו יכולה לשמש למחקרים נוספים על עיבוד חושי באוכלוסיות מימיות.
שאלות נפוצות
Executive Industry Relevance
This assay provides a low-cost, scalable method for evaluating visual function in a vertebrate model, supporting early-stage target validation in neuroscience drug discovery. By quantifying visually guided behavior, it enables mechanistic de-risking of compounds affecting sensory pathways. The approach offers translational continuity from basic vision research to preclinical assessment of neuroactive substances.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of visual pathway function through quantifiable behavioral readouts.
- Operational Value: Uses readily available equipment, reducing barriers to adoption in discovery labs.
- Predictive Value: Supports hypothesis testing for compounds targeting retinal or neural processing targets.
Screening & Assay Development
- Assay Readiness: Generates quantitative preference metrics suitable for high-throughput adaptation.
- Reproducibility: Standardized tank setup and lighting conditions ensure consistent results across operators.
- Scalability: Nested tank design allows parallel testing, supporting future automation for compound screening.
Translational & Preclinical Research
- Disease Relevance: Models visual dysfunction relevant to retinal degeneration and neurodevelopmental disorders.
- Mechanistic De-risking: Distinguishes between general locomotor effects and specific visual impairment via contralateral testing.
- Translational Continuity: Bridges phenotypic screening with functional validation in a disease-relevant system.
Pipeline & Workflow Integration
The assay fits within early discovery workflows, particularly for target validation and lead identification in neuroscience programs focused on visual processing.
- Discovery Biology: Supports functional validation of visual targets by linking genetic or pharmacological manipulation to measurable behavior.
- Screening: Provides a platform for primary or secondary screening of compounds affecting visual-guided behavior.
- Analytics: Outputs time-in-zone measurements that enable statistical comparison between control and treatment groups.
- Translational Research: Connects to preclinical models by assessing functional outcomes of retinal or neural interventions.
- Enterprise Reuse: Represents a reusable behavioral platform adaptable across multiple neuroscience projects.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases confidence in target engagement by reducing false positives from non-specific motor effects.
- Operational Value: Low cost and simplicity promote widespread adoption without specialized training.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions by providing early functional readouts on sensory pathways.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of compounds based on behavioral specificity.
Implementation Considerations
- Requires basic animal husbandry skills for Xenopus tadpole maintenance and staging.
- Dependent on standard video recording equipment and lighting-controlled environments.
- Necessitates behavioral observation training to ensure consistent assay execution.
- May require adaptation for automated tracking in large-scale screening applications.
- Limited to visual function assessment; does not capture other sensory modalities.
