Name: בימוי דופאמין Neuron בידול מתאי גזע pluripotent האדם (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-09-15T13:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 40 s
Description: למד פרוטוקול ממוקד ליצירת נוירונים דופמינרגיים ממקורות תאי גזע פלוריפוטנטיים אנושיים. השיטה מאפשרת מחקר מולקולרי של מחלת פרקינסון ופיתוח טיפולים תאיים חדשניים.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

המחברים מודים לחברי מעבדת Renee Reijo Pera על העזרה במהלך פיתוח הפרוטוקול הזה ובמהלך הכנת כתב היד הזה. עבודה זו נתמכת על ידי המעבדה המשותפת של המכון לרפואה רגנרטיבית בקליפורניה (CIRM) (CL-00518).

.1 הכנת תרבות מדיה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן פיברובלסטים עובריים בינוני עכבר (MEF) על ידי שילוב הבא: 445 מ&quot;ל DMEM, פתרון מניות 5 מ&quot;ל 100x פניצילין / אמפיצילין 50 מ&quot;ל סרום שור העובר (FBS), ו. שמור בינוני מעוקר מסנן ב 4 מעלות צלזיוס למשך לא יותר מ14 ימים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להכין מדיום תרבות hPSC על ידי שילוב הבא סרום המכיל: 385 מ&quot;ל / F12, 5 מ&quot;ל 100x פתרון פתרון מניות חומצת אמינו, 5 מ&quot;ל 100x פניצילין / מניית אמפיצילין, 5 מ&quot;ל 100x החלפת סרום נוקאאוט 100 מ&quot;ל (KSR), DMEM שאינו חיוני -mercaptoethanol פתרון מניות, ו10 ng / ml bFGF. שמור בינוני מעוקר מסנן ב 4 מעלות צלזיוס למשך לא יותר מ 10 ימים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להכין מדיום סרום ללא mTeSR1 על ידי שילוב הבא: 400 בינוני מ&quot;ל mTeSR1 בסיסי, 100 מ&quot;ל 5x תוספת, ו5 מ&quot;ל 100x פתרון מניות פניצילין / אמפיצילין. שמור בינוני על 4 מעלות צלזיוס למשך לא יותר מ 10 ימים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן פתרון מניות IV 10x collagenase: לשקול את כוח IV collagenase 0.5 גרם, ולפזר אותו עם 50 מ&quot;ל DMEM / F12 ולעקר מסנן. הפוך aliquots ומלאת אותם ב-20 מעלות צלזיוס במשך חודשים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן 0.1% פתרון ג&#39;לטין: לשקול את 0.5 ג&#39;לטין g (מעור שור, מהסוג B) כוח ולפזר אותו במים ללא יונים. שמור פתרון מעוקר החיטוי בטמפרטורת חדר למשך שבועות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להכין מדיום בידול KSR ידי שילוב הבא: 410 מ&quot;ל DMEM, 75 מ&quot;ל KSR, 5 מ&quot;ל 100x פתרון שאינו חיוני מניית חומצת אמינו, 5 מ&quot;ל 100x פניצילין / פתרון מניות אמפיצילין, 5 מ&quot;ל 100X -mercaptoethanol פתרון מניות. שמור בינוני מעוקר מסנן ב 4 מעלות צלזיוס למשך לא יותר מ 10 ימים. הערה: KSR משתנה ממגרש למגרש, אשר עשוי להשפיע על יעילות הבידול. לכן זה טוב יותר כדי לבחון כמה קבוצות של KSR למצוא את הטוב ביותר עבור בידול. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להכין מדיום בידול N2 על ידי שילוב הבא: 98 מ&quot;ל DMEM, תוספת 1 מ&quot;ל 100x N2 ו1 מ&quot;ל 100x פתרון מניות פניצילין / אמפיצילין. שמור בינוני מעוקר מסנן ב 4° C עבור לא יותר מ 10 ימים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להכין מדיום בידול B27 על ידי שילוב הבא: בינוני neurobasal 480 מ&quot;ל, 10 מ&quot;ל 50x B27 תוספת, 5 מ&quot;ל 100X GlutaMAX פתרון מניות, ו5 מ&quot;ל 100x פתרון מניות פניצילין / אמפיצילין. שמור בינוני מעוקר מסנן ב 4 מעלות צלזיוס למשך לא יותר מ 10 ימים. </li></ol> 2 תרבות של hESCs וhiPSCs על תאי מזין MEF HESCs H9 התקבל מWiCell מכון המחקר וhiPSCs הוקמו במעבדה Reijo Pera דרך התמרה בתיווך רטרווירוס של יאמאנאקה גורמי OCT3 / 4, Sox2, KLF4, וג-MYC 18. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לפחות יום אחד לפני מעבר תא, להכין כמה צלחות ג&#39;לטין על ידי הוספת ג&#39;לטין 1 מ&quot;ל 0.1% לגם 1 של 6 גם צלחות, ודגירת צלחות על 37 מעלות צלזיוס במשך דקות לפחות 30. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר דגירה, ג&#39;לטין לשאוב מצלחות, וזרע הקרנה מומת תאי MEF לצלחות בצפיפות של 1.6 x 10 5 תאים/ גם במדיום MEF באמצעות hemocytometer לספור את התאים. הערה: לחלופין להכין מתקני האכלת MEF מוקדם ככל 3 ימים לפני מעבר תא. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תאי מעבר יום אחד לאחר ציפוי ניזונים MEF: בינוני לשאוב מhPSCs, להוסיף 1 מ&quot;ג / IV collagenase מ&quot;ל לתאים במ&quot;ל 1 / טוב, ודגירת תאים ב 37 מעלות צלזיוס במשך שעה 1. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> במהלך דגירה זה, לשטוף את מתקני האכלת MEF פעם עם PBS, ולאחר מכן להוסיף בינוני חם (37 ° C) המכיל סרום hPSC תרבות ב1.5 מ&quot;ל / טוב. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אחרי שעה 1, הקש על צלחת התרבות כמה פעמים, כך שרוב המושבות לא עברו התמיינות תנתק מהצלחות, ואילו המושבות מובחנות להישאר מחובר. לאסוף בזהירות את המושבות הצפות, ולהעביר אותם לתוך צינור 15 מ&quot;ל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף בעדינות את הצלחת פעם אחת עם חם (37 ° C) DMEM / F12 ולהעביר DMEM / F12 לתוך צינור 15 מ&quot;ל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צנטריפוגה הצינורות ב179 XG במשך 3 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בינוני לשאוב מהצינורות, נזהר שלא להפריע את הכדור. הוספת מלחמהמדיום התרבות מ &#39;hPSC, פיפטה התאים מעלה ומטה מספר פעמים כדי לשבור אותם בצבירים קטנים ומערבבים אותם היטב. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העבר את התאים על גבי מתקני האכלת MEF חדשים ב1: 3-1: 6 יחס. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשנות את המדיום כל יום והמעבר התאים כל 5-6 ימים. </li></ol> .3 הכנת התאים לדיפרנציאציה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ביום אחד לפחות לפני ההכנה של תאים, להכין כמה צלחות Matrigel (3 בארות בדרך הכלל של צלחת 6 היטב). לדלל את Matrigel עם קר (4 ° C) DMEM / F12 ב1:40 ולהוסיף 1 מ&quot;ל Matrigel לכל טוב של 6 גם צלחות. דגירה צלחות Matrigel בלילה 4 ° C.. הערה: אפשר לאטום צלחות Matrigel עם Parafilm ומלאה אותם על 4 מעלות צלזיוס במשך זמן רב ככל אחד בשבוע. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להשתמש בתאים (ראה שלב 2) 4 ימים לאחר המעבר. הסר את כל המושבות מובחנות מהצלחות. בינוניים לשאוב מצלחת התרבות, להוסיף 1 מ&quot;ל Accutase לכל טוב, ודגירת תאים ב 37 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> במהלך הדגירה, להכין כמה ג&#39;לatin צלחות על ידי הוספת 1 מ&quot;ל ג&#39;לטין ל1 גם של 6 גם צלחות. הנח צלחות אלה וMatrigel-הצלחות שהוכנו יום לפני בחממה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר הדגירה של 5 דק &#39;, או כאשר תאים הפכו חצי צף, תאי פיפטה מעלה ומטה מספר פעמים כדי להפוך אותם לתאים בודדים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> איסוף תאים בודדים לתוך 15 צינורות מ&quot;ל, ו צנטריפוגות ב XG 258 במשך 3 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תאי Resuspend עם כמות מתאימה של סרום המכיל מדיום תרבות hPSC, ולהוסיף Thiazovivin לריכוז הסופי של 2 מיקרומטר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העברת תאים לצלחות ג&#39;לטין מצופה ב1: 1, ותאי דגירה ב37 מעלות צלזיוס במשך 30 דקות כדי להסיר מתקני האכלת MEF. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להעביר את תאי צינור חרוטי 15 מ&quot;ל, להוסיף סרום מתאים המכיל בינוני hPSC ולספור את התאים עם hemocytometer. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צנטריפוגה התאים ב258 XG במשך 3 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> במהלך צנטריפוגות, להוסיף Thiazovivin לנכס בינוני mTeSR1 לעשות ריכוז של 2 מיקרומטר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר צנטריפוגה,spirate הבינוני ומוסיף בינוני mTeSR1 מתאים עם Thiazovivin כך שיש 1.8 x 10 5 תאים / בינוני מ&quot;ל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קח את צלחות Matrigel מן החממה, לשאוב Matrigel ולהוסיף 2 מ&quot;ל של התאים המעורבים על גם 1 של 6 גם הצלחות. הערה: צפיפות התאים צריכה להיות 3.6 x 10 4 תאים / 2 סנטימטר של שטח פנים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> החזר את הצלחות בחזרה לחממה, ולתת לתאים לצרף ל24 שעות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 24 שעות לאחר ציפוי התאים, לשאוב מדיום ישן ולהוסיף 2 מ&quot;ל בינוני mTeSR1 חדש לכל טוב ולתת תאים לגדול במשך שעה 24 אחרת לפני שמתחיל את הבידול. </li></ol> התמיינות תאים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> התחל בידול 48 שעות לאחר replating התאים על גבי צלחות Matrigel. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מדיום התרבות לשאוב מן הצלחת, לשטוף תאי פעם עם PBS, ולהוסיף 2 מ&quot;ל של מדיום הבידול הבא בכל טוב: בינוני בידול KSR תוספת 10 מיקרומטר SB431542 ו100 ננומטר LDN-193189. מארק היום הזה כD0 של בידול. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שנה בינונית בכל יום מD0 לD20. הערה: אפשר להכין מדיום לשימוש לא יותר מ 2 ימים בכל פעם. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש במדיום הבא לD1 וD2: בינוני בידול KSR תוספת 10 מיקרומטר SB431542, 100 ננומטר LDN-193,189, 0.25 מיקרומטר SAG, 2 purmorphamine מיקרומטר, ו50 ng / ml FGF8b. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש במדיום הבא לD3 וD4: בינוני בידול KSR תוספת 10 מיקרומטר SB431542, 100 ננומטר LDN-193,189, 0.25 מיקרומטר SAG, 2 purmorphamine מיקרומטר, 50 ng / ml FGF8b, ו3 CHIR99021 מיקרומטר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להשתמש במדיום לD5 וD6 הבא: 75% בינוניים KSR בידול תוספת 25% בינוניים בידול N2 בתוספת 100 ננומטר LDN-193,189, 0.25 מיקרומטר SAG, purmorphamine 2 מיקרומטר, 50 ng / ml FGF8b, ו3 מיקרומטר CHIR99021. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להשתמש במדיום לD7 וD8 הבא: 50% בינוניים KSR בידול תוספת 50% בינוניים בידול N2 בתוספת 100 ננומטר LDN-193,189 ו3 מיקרומטר CHIR99021.</li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש במדיום הבא לD9 וD10: 25% בינוני בידול KSR תוספת 75% בינוני בידול N2 בתוספת 100 LDN-193,189 ו3 CHIR99021 מיקרומטר ננומטר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש במדיום הבא לD11 וD12: בינוני בידול B27 בתוספת 3 מיקרומטר CHIR99021, 10 ng / ml BDNF, 10 ng / ml GDNF, 1 ננוגרם / מ&quot;ל ​​TGF3, חומצה אסקורבית 0.2 מ&quot;מ ו0.1 מ&quot;מ cAMP. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש במדיום הבא לשאר בידול: בינוני בידול B27 בתוספת 10 ng / ml BDNF, 10 ng / ml GDNF, 1 ננוגרם / מ&quot;ל ​​TGF3, חומצה אסקורבית 0.2 מ&quot;מ ו0.1 מ&quot;מ cAMP. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בסביבות D16 של בידול, להכין כמה / צלחות Laminin / פיברונקטין פולי-L-ornithine. לדלל פולי-L-ornithine פתרון מניות עם (4 ° C) הקר PBS ל15 מיקרוגרם / מ&quot;ל, להוסיף 1 מ&quot;ל ול1 מתוך 6 גם צלחות, ודגירת הצלחות על 37 מעלות צלזיוס למשך הלילה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשאוב את פתרון פולי-L-ornithine, לשטוף את הצלחות 3 פעמים עם מים סטריליים ולאחר מכן אוויר יבש הצלחות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לדלל סול מניית lamininution עם קר (4 ° C) PBS עד 1 מיקרוגרם / מ&quot;ל, להוסיף 1 מ&quot;ל לגם אחד 6 גם צלחות, ודגירת הצלחות על 37 מעלות צלזיוס למשך הלילה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשאוב את פתרון laminin, לשטוף את הצלחות 3 פעמים עם מים סטריליים ולאחר מכן אוויר יבש הצלחות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לדלל פתרון מניות פיברונקטין עם קר (4 ° C) PBS ל2 מיקרוגרם / מ&quot;ל, להוסיף 1 מ&quot;ל ול1 מתוך 6 גם צלחות, ודגירת הצלחות על 37 מעלות צלזיוס למשך הלילה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צלחות חותם עם Parafilm ומניח אותם על 4 מעלות צלזיוס במשך זמן רב ככל שבועיים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר 20 ימים של בידול, replate תאים ל/ צלחות Laminin / פיברונקטין פולי-L-ornithine. בינוני בידול לשאוב, להוסיף 1 מ&quot;ל Accutase החם (37 ° C) ול1 מתוך 6 גם צלחות, ודגירת תאים ב 37 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> במהלך הדגירה, למקם את / צלחות Laminin / פיברונקטין פולי-L-ornithine בחממה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר הדגירה של 5 דק &#39;, או כאשר תאים הפכו חצי צף, בעדינות תאי פיפטה מעלה ומטה מספר פעמים כדילהפוך אותם לתאים בודדים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאסוף את התאים בודדים לתוך צינורות חרוטי 15 מ&quot;ל, ולהוסיף את הכמות המתאימה של מדיום neurobasal לספירת תאים, אשר תשתנה בהתאם להרחבה (לאחר 11 ימים של בידול, תאים עשויים להרחיב 15-20 קיפול). ספירת התאים באמצעות hemocytometer. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צנטריפוגה התאים ב258 XG במשך 3 דקות. לשאוב supernatant, וresuspend תאים עם מדיום בידול B27, כך שריכוז התא הוא 1 x 10 6 תאים / מ&quot;ל בינוני. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פיברונקטין לשאוב מהצלחות, לשטוף פעמיים עם PBS, ולהוסיף 2 מ&quot;ל תאים גם 1 של 6 גם צלחות. הערה: צפיפות התאים לreplating צריכה להיות 2 x 10 5 תאים / 2 סנטימטר של שטח פנים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שנה בינונית 24 שעות מאוחר יותר כדי להסיר את כל תאים מתים שאינם מחוברים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שנה בינונית בכל יום אחר עד נקודות הזמן הרצויות לניסוי נתון. </li></ol>

<ol><li>Freed, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Will+embryonic+stem+cells+be+a+useful+source+of+dopamine+neurons+for+transplant+into+patients+with+Parkinson%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Will embryonic stem cells be a useful source of dopamine neurons for transplant into patients with Parkinson's disease.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 99, 1755-1757 (2002).</li>
<li>Perrier, A. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Derivation+of+midbrain+dopamine+neurons+from+human+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Derivation of midbrain dopamine neurons from human embryonic stem cells.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101, 12543-12548 (2004).</li>
<li>Park, C. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+and+in+vivo+analyses+of+human+embryonic+stem+cell-derived+dopamine+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neurochemistry%22%5BJournal%5D)">In vitro and in vivo analyses of human embryonic stem cell-derived dopamine neurons.</a> Journal of Neurochemistry. 92, 1265-1276 (2005).</li>
<li>Buytaert-Hoefen, K. A., Alvarez, E., Freed, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+tyrosine+hydroxylase+positive+neurons+from+human+embryonic+stem+cells+after+coculture+with+cellular+substrates+and+exposure+to+GDNF%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Generation of tyrosine hydroxylase positive neurons from human embryonic stem cells after coculture with cellular substrates and exposure to GDNF.</a> Stem Cells. 22, Dayton, Ohio 669-674 (2004).</li>
<li>Zeng, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dopaminergic+differentiation+of+human+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Dopaminergic differentiation of human embryonic stem cells.</a> Stem Cells. 22, Dayton, Ohio 925-940 (2004).</li>
<li>Yan, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Directed+differentiation+of+dopaminergic+neuronal+subtypes+from+human+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Directed differentiation of dopaminergic neuronal subtypes from human embryonic stem cells.</a> Stem Cells. 23, 781-790 (2005).</li>
<li>Schulz, T. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differentiation+of+human+embryonic+stem+cells+to+dopaminergic+neurons+in+serum-free+suspension+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Differentiation of human embryonic stem cells to dopaminergic neurons in serum-free suspension culture.</a> Stem Cells. 22, 1218-1238 (2004).</li>
<li>Park, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+dopaminergic+neurons+in+vitro+from+human+embryonic+stem+cells+treated+with+neurotrophic+factors%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroscience+Letters%22%5BJournal%5D)">Generation of dopaminergic neurons in vitro from human embryonic stem cells treated with neurotrophic factors.</a> Neuroscience Letters. 359, 99-103 (2004).</li>
<li>Cho, M. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Highly+efficient+and+large-scale+generation+of+functional+dopamine+neurons+from+human+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Highly efficient and large-scale generation of functional dopamine neurons from human embryonic stem cells.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105, 3392-3397 (2008).</li>
<li>Cooper, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differentiation+of+human+ES+and+Parkinson%27s+disease+iPS+cells+into+ventral+midbrain+dopaminergic+neurons+requires+a+high+activity+form+of+SHH%2C+FGF8a+and+specific+regionalization+by+retinoic+acid%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+and+Cellular+Neurosciences%22%5BJournal%5D)">Differentiation of human ES and Parkinson's disease iPS cells into ventral midbrain dopaminergic neurons requires a high activity form of SHH, FGF8a and specific regionalization by retinoic acid.</a> Molecular and Cellular Neurosciences. 45, 258-266 (2010).</li>
<li>Chambers, S. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Highly+efficient+neural+conversion+of+human+ES+and+iPS+cells+by+dual+inhibition+of+SMAD+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Highly efficient neural conversion of human ES and iPS cells by dual inhibition of SMAD signaling.</a> Nature Biotechnology. 27, 275-280 (2009).</li>
<li>Sanchez-Danes, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+generation+of+A9+midbrain+dopaminergic+neurons+by+lentiviral+delivery+of+LMX1A+in+human+embryonic+stem+cells+and+induced+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Human+Gene+Therapy%22%5BJournal%5D)">Efficient generation of A9 midbrain dopaminergic neurons by lentiviral delivery of LMX1A in human embryonic stem cells and induced pluripotent stem cells.</a> Human Gene Therapy. 23, 56-69 (2012).</li>
<li>Fasano, C. A., Chambers, S. M., Lee, G., Tomishima, M. J., Studer, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+derivation+of+functional+floor+plate+tissue+from+human+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Efficient derivation of functional floor plate tissue from human embryonic stem cells.</a> Cell Stem Cell. 6, 336-347 (2010).</li>
<li>Kriks, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dopamine+neurons+derived+from+human+ES+cells+efficiently+engraft+in+animal+models+of+Parkinson%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Dopamine neurons derived from human ES cells efficiently engraft in animal models of Parkinson's disease.</a> Nature. 480, 547-551 (2011).</li>
<li>Xi, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Specification+of+midbrain+dopamine+neurons+from+primate+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Specification of midbrain dopamine neurons from primate pluripotent stem cells.</a> Stem Cells. 30, 1655-1663 (2012).</li>
<li>Kirkeby, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+regionally+specified+neural+progenitors+and+functional+neurons+from+human+embryonic+stem+cells+under+defined+conditions%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Generation of regionally specified neural progenitors and functional neurons from human embryonic stem cells under defined conditions.</a> Cell Reports. 1, 703-714 (2012).</li>
<li>Mendez, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+type+analysis+of+functional+fetal+dopamine+cell+suspension+transplants+in+the+striatum+and+substantia+nigra+of+patients+with+Parkinson%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Brain%3A+a+Journal+of+Neurology%22%5BJournal%5D)">Cell type analysis of functional fetal dopamine cell suspension transplants in the striatum and substantia nigra of patients with Parkinson's disease.</a> Brain: a Journal of Neurology. 128, 1498-1510 (2005).</li>
<li>Takahashi, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induction+of+pluripotent+stem+cells+from+adult+human+fibroblasts+by+defined+factors%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Induction of pluripotent stem cells from adult human fibroblasts by defined factors.</a> Cell. 131, 861-872 (2007).</li>
<li>Nishimura, K., Takahashi, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Therapeutic+application+of+stem+cell+technology+toward+the+treatment+of+Parkinson%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Biological+%26+Pharmaceutical+Bulletin%22%5BJournal%5D)">Therapeutic application of stem cell technology toward the treatment of Parkinson's disease.</a> Biological & Pharmaceutical Bulletin. 36, 171-175 (2013).</li>
<li>Smidt, M. P., Burbach, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((How+to+make+a+mesodiencephalic+dopaminergic+neuron%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews.+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">How to make a mesodiencephalic dopaminergic neuron.</a> Nature Reviews. Neuroscience. 8, 21-32 (2007).</li>
<li>Wang, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Noggin+and+bFGF+cooperate+to+maintain+the+pluripotency+of+human+embryonic+stem+cells+in+the+absence+of+feeder+layers%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemical+and+Biophysical+Research+Communications%22%5BJournal%5D)">Noggin and bFGF cooperate to maintain the pluripotency of human embryonic stem cells in the absence of feeder layers.</a> Biochemical and Biophysical Research Communications. 330, 934-942 (2005).</li>
<li>Chen, J. K., Taipale, J., Young, K. E., Maiti, T., Beachy, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Small+molecule+modulation+of+Smoothened+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Small molecule modulation of Smoothened activity.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 99, 14071-14076 (2002).</li>
</ol>

המחברים מצהירים שאין להם אינטרסים פיננסיים מתחרים.

תאי גזע pluripotent אדם (כולל שני hESCs וhiPSCs) יכולים להיות מובחנים במבחנה כדי לייצר רוב, אם לא כולם, סוגי תאים של הגוף שלנו, כולל תאי עצב DA, שהודגם במחקרים קודמים 19. כאן, המבוסס על ידע מפיתוח נוירון דופאמין העוברי 20 ופרוטוקולים שפורסמו ממעבדות אחרות 14,15, אנחנו מותאמים תנאי התרבות עבור הדור של תאי עצב DA מhESCs וhiPSCs. פרוטוקול זה הוא יעיל, לשחזור ויש לנו ליישם פרוטוקול זה שתואר כאן לקווי H1 וH9 hESC ולקווי hiPSC משני חולי פרקינסון...

ניתן למצוא נוירונים דופאמין (DA) במספר אזורים במוח, כולל המוח התיכון, ההיפותלמוס, רשתית, ונורות חוש הריח. נוירונים A9 DA בסעיפי nigra substantia compacta (SNpc) שליטת ההתנהגות ותנועה על ידי הקרנה לסטריאטום במוח הקדמי ולהרכיב את המערכת המוטורית אקסטרה. ניוון של תאי עצב A9 DA מוביל למחלת פרקינסון (PD), המהווה את ההפרעה השנייה בשכיחותה האנושית ניווניות וחשוכות מרפא כיום. טיפול בתחליפי תא הוא אחת האסטרטגיות המבטיחות ביותר לטיפול במחלת פרקינסון 1, ולכן, חלה התעניינות רבה בנובעים נוירונים A9 DA מתאי גזע pluripotent אנושיים (hPSCs), כולל שני תאי גזע עובריים אנושיים (hESCs) ו התאים אחרונים אנושיים מושרה גזע pluripotent (hiPSCs). מחקרים רבים ניסו להפיק תאי עצב A9 DA מhPSCs תוך שימוש בשיטות שונות. דיווחים המוקדמים כל הנוירונים DA שנוצרו באמצעות עצבישלב אב שושנה. על ידי שיתוף culturing עם MS5 2 או PA6 3-5 תאי סטרומה, עם או בלי גורמי גדילה חיצוניים ל2-4 שבועות, ל &#39;Studer ועמיתים ושלוש קבוצות אחרות מושרה בהצלחה hESCs לייצר רוזטות העצבית. לאחר מכן הם העשירו את רוזטות אלה על ידי נתיחה מכאנית או עיכול אנזימטי להבחנה נוספת. בדיווחים אחרים, חוקרים שנוצרו רוזטות העצבית דרך גוף embryoid (EB) צף בידול תרבות 6-9. מאוחר יותר, חוקרים שהוקמו בשיטת monolayer מבוססת בידול 10,11, שבו הם מצופים hESCs וhiPSCs על מטריצה ​​סלולרית נוספת, הוסיפו גורמי גדילה שונים בתרבות כדי לגרום להתמיינות של hPSCs לתאי עצב DA, אשר מחקה בפיתוח נוירון DA העוברי vivo . למרות שכל המחקרים הללו הושגו hydroxylase טירוזין (TH) תאי -expressing עם כמה מאפיינים של תאי עצב DA, תהליך ההתמיינות כל הוא זמן רב ועבודה,בדרך כלל לא יעיל, ויותר מכך, זהות A9 של נוירונים אלה לא באו לידי ביטוי במרבית המחקרים מלבד אחד עם ביטוי אקטופי LMX1a 12. לאחרונה, צלחת רצפה חדשה (FP) פרוטוקול מבוסס פותחה 13-16, שבו מבשרי FP עם פוטנציאל נוירון DA נוצרו לראשונה על ידי הפעלה של הקיפוד הקולי ומסלולי Wnt הקנונית איתות בשלב המוקדם של בידול, ולאחר מכן תאי FP אלה שצוינו בהמשך לתאי עצב DA. למרות שפרוטוקול זה הוא יעיל יותר, יש עדיין כמה בעיות; למשל, תהליך ההתמיינות השלם לוקח זמן רב (לפחות 35 ימים), והוא תא המזין תלוי 15, או היא EB תלויה 16 או זהות A9 לא הפגינה 14. כאן, המבוססים על הידע מפיתוח in vivo עוברי תא עצב DA והתוצאות שפורסמו של חוקרים אחרים, יש לנו מותאם לתנאי התרבות לeffדור icient של נוירונים DA משני hESCs וhiPSCs. אנחנו שנוצרנו ראשון תאי מבשר FP על ידי הפעלה של האיתות של Wnt הקנונית עם המולקולה קטנה CHIR99021 וסוניק קיפוד איתות עם מולקולות קטנות SAG וpurmorphamine. תאי FP אלה מבטאים FOXA2, LMX1a, קורין, OTX2 וNestin. לאחר מכן, אנו שצוינו תאי FP אלה לתאי עצב DA עם גורמי צמיחה כולל BDNF, GDNF, וכו &#39;. נוירונים DA שנוצרו הם מסוג תא A9 כפי שהם חיוביים לGIRK2 תוך שלילי לCalbindin 17. פרוטוקול זה הוא תא מזין או עצמאי EB, יעיל ומאוד לשחזור. שימוש בפרוטוקול זה, אחד יכול להפיק תאי עצב DA בפחות מ -4 שבועות מhESCs או hiPSCs של אנשים רגילים למחקר השתלת תאים, או מhiPSCs של חולי פרקינסון לדוגמנות במבחנה של PD או בדיקת סוכנים טיפוליים פוטנציאליים עבור PD.

<table><tbody><tr><td>DMEM</td><td>Life Technologies</td><td>10569-010</td><td></td></tr><tr><td>FBS</td><td>Life Technologies</td><td>26140</td><td></td></tr><tr><td>פניצילין/אמפיצילין</td><td>Life Technologies</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>DMEM/F12</td><td>Life Technologies</td><td>10565-018</td><td></td></tr><tr><td>KSR</td><td>Life Technologies</td><td>10828-028</td><td></td></tr><tr><td>חיים של חומצות אמינו לא חיוניות</td><td> טכנולוגיות</td><td>11140-050</td><td></td></tr><tr><td>b-מרקפטואתנול</td><td>Millipore</td><td>ES-007-E</td><td></td></tr><tr><td>bFGF</td><td>מו"פ & D Systems</td><td>233-FB-025</td><td></td></tr><tr><td>mTesR1</td><td>STEMCELL Technologies</td><td>5850</td><td></td></tr><tr><td>Collagenase IV</td><td>Life Technologies</td><td>17104-019</td><td></td></tr><tr><td>ג'לטין</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>G9391</td><td></td></tr><tr><td>תוסף N2</td><td>Life Technologies</td><td>17502-048</td><td></td></tr><tr><td>תוסף B27</td><td>Life Technologies</td><td>17504-044</td><td></td></tr><tr><td>Neurobasal</td><td>Life Technologies</td><td>21103-049</td><td></td></tr><tr><td>Glutamax</td><td>Life Technologies</td><td>35050-061</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>Life Technologies</td><td>10010-023</td><td></td></tr><tr><td>גורם גדילה מופחת מטריג'ל</td><td>BD Biosciences</td><td>354230</td><td></td></tr><tr><td>Accutase</td><td>MP Biomedicals</td><td>1000449</td><td></td></tr><tr><td>Thiazovivin</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>sc-361380</td><td></td></tr><tr><td>SB431542</td><td>Tocris Bioscience</td><td>1614</td><td></td></tr><tr><td>LDN-193189</td><td>Stemgent</td><td>04-0074</td><td></td></tr><tr><td>SAG</td><td>EMD Millipore</td><td>566660-1MG</td><td></td></tr><tr><td>Purmorphamine</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>sc-202785</td><td></td></tr><tr><td>FGF8b</td><td>R& D Systems</td><td>423-F8-025</td><td></td></tr><tr><td>CHIR99021</td><td>Cellagen Technology</td><td>C2447-2s</td><td></td></tr><tr><td>BDNF</td><td>R& D Systems</td><td>248-BD-025</td><td></td></tr><tr><td>GDNF</td><td>מו"פ D Systems</td><td>212-GD-010</td><td></td></tr><tr><td>TGF-beta3</td><td>מו"פ D Systems</td><td>243-B3-002</td><td></td></tr><tr><td>חומצה אסקורבית</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A4034</td><td></td></tr><tr><td>cAMP</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D0627</td><td></td></tr><tr><td>עכבר אנטי אנושי נוגדן NESTIN</td><td>סנטה קרוז ביוטכנולוגיה</td><td>sc-23927</td><td>1/1,000 דילול</td></tr><tr><td>ארנב אנטי אנושי נוגדן OTX2</td><td>Millipore</td><td>AB9566</td><td>1/2,000 דילול</td></tr><tr><td>עז אנטי אנושי FOXA2 נוגדן</td><td>מו"פ D Systems</td><td>AF2400</td><td>1/200 דילול</td></tr><tr><td>ארנב אנטי אנושי LMX1a נוגדן</td><td>Millipore</td><td>AB10533</td><td>1/1,000 דילול</td></tr><tr><td>ארנב אנטי אנושי TH נוגדן</td><td>Pel Freez</td><td>P40101</td><td>1/500 דילול</td></tr><tr><td>עוף אנטי אנושי TH נוגדן</td><td>Millipore</td><td>AB9702</td><td>1/500 דילול</td></tr><tr><td>עכבר אנטי אנושי TUJ1 נוגדן</td><td>Covance</td><td>MMS-435P</td><td>1/,2000 דילול</td></tr><tr><td>ארנב אנטי אנושי GIRK2 נוגדן Abcam</td><td></td><td>ab30738</td><td>1/300 דילול</td></tr><tr><td>ארנב אנטי אנושי Calbindin נוגדן</td><td>Abcam</td><td>ab25085</td><td>1/400 דילול</td></tr><tr><td>צנטריפוגה</td><td>Eppendorf</td><td>5804</td><td></td></tr></tbody></table>

בימוי דופאמין neuron בידול מתאי גזע pluripotent האדם

Directed Dopaminergic Neuron Differentiation from Human Pluripotent Stem Cells

נוירונים דופמינרגיים (DA) בחומר השחור (הידוע גם בשם נוירונים A9 DA) הם סוג התא הספציפי שאבד במחלת פרקינסון (PD). יש עניין רב בהפקת נוירונים A9 DA מתאי גזע פלוריפוטנטיים אנושיים (hPSCs) לטיפול תחליפי תאים רגנרטיביים למחלת פרקינסון. במהלך ההתפתחות העצבית, נוירונים A9 DA מקורם במבשרי לוחית הרצפה (FP) הממוקמים בקו האמצע הגחוני של מערכת העצבים המרכזית. כאן, ביצענו אופטימיזציה של תנאי התרבית להתמיינות הדרגתית של hPSCs לנוירונים A9 DA, המחקה התפתחות נוירונים DA עובריים. בפרוטוקול שלנו, אנו מתארים תחילה את היצירה היעילה של תאי מבשר FP מ-hPSCs באמצעות שיטת מולקולה קטנה, ולאחר מכן ממירים את תאי ה-FP לתאי עצב A9 DA, שיכולים להישמר במבחנה במשך כמה חודשים. פרוטוקול יעיל, חוזר ונשלט זה עובד היטב בתאי גזע עובריים אנושיים (hESCs) ותאי גזע פלוריפוטנטיים מושרים אנושיים (hiPSCs) מאנשים נורמליים וחולי פרקינסון, בהם ניתן להפיק נוירונים A9 DA לביצוע מודלים של מחלות מבחנה ובדיקת תרופות וטיפול בהשתלת תאים in vivo למחלת פרקינסון.

סקירה כללית של פרוטוקול הבידול מוצגת באיור 1. היעילות של פרוטוקול הבידול מוצג כאן מסתמכת על מעמדם של התאים מתחילים. לכן, זה קריטי לוודא כי, ראשון מסיר את כל המושבות מובחנות לפני מתנער hPSCs לתוך תאים בודדים לבידול, ושנייה, אחד מכלה את רוב, אם לא כולם, תאים מזינים MEF ידי דוגרים התאים על צלחות מצופים ג&#39;לטין ל30 דקות, ושלישית, אחד לוחות התאים בודדים hPSC בצפיפות המתאימה לצלחת Matrigel. כפי שמודגם באיור 2, replated תאים בודדים hPSC ירחיבו כאשכולו...

אנחנו, בהתבסס על ידע מביולוגיה התפתחותית ומחקר שפורסם, פיתחנו פרוטוקול אופטימלי ליצירת נוירונים דופמינרגיים A9 במוח התיכון הן מתאי גזע עובריים אנושיים והן מתאי גזע פלוריפוטנטיים מושרים אנושיים, שיהיו שימושיים למידול מחלות וטיפול בהחלפת תאים למחלת פרקינסון.

בימוי דופאמין Neuron בידול מתאי גזע pluripotent האדם

Dopaminergic (DA) neurons in the substantia nigra pars compacta  (also known as A9 DA neurons) are the specific cell type that is lost in ...

המטרה הכוללת של פרוצדורה זו היא להשראת בידול יעיל מאוד של נוירונים דופמינרגיים in vitro. דבר זה מושג תחילה על ידי הכנת תרבית היצמדות של תאים בודדים של תאי גזע פלוריפוטנטיים אנושיים.בשלב השני, מתווך תרבית התאים מוחלף בתווך השראה לנוירונים כדי להשריץ תאי מקור של ה-floorplate. לאחר מכן, הנוירונים הדופמינרגיים גודלים בתווך הבשלה. ולבסוף, תאי מקור של נוירונים דופמינרגיים בתרבית של תאים בודדים גודלים על פלטות מצופות poly L ornithine ו-fibronectin, בתווך הבשלה למשך 30 ימים.בסופו של דבר, ניתן להשתמש במיקרוסקופיה אימונופלואורסצנטית כדי להעריך את הביטוי של סממנים חשובים של נוירונים דופמינרגיים. לטכניקה זו יתרון רב יותר על פני הפרוטוקול הקיים של נוירוספרות על נוירו-חומצה. היא יכולה להפיק אוכלוסייה עצבית כפולה הומוגנית יותר ביעילות גבוהה יותר.ארבעה ימים לאחר ההעברה, שאבו את המצע מתרביות התאים. נתקו את התאים באמצעות 1 ml של Accutane לכל באר והדגירו אותם בטמפרטורה של 37 °C למשך חמש דקות. במהלך ההדגרה, הוסיפו 1 ml של ג'לטין לכל באר בלוח של שש בארות, ולאחר מכן הכניסו את הלוח יחד עם לוחות מצופים ב-matrigel שהוכנו זה עתה למדגרה.כאשר התאים הופכים לחצי-צפים, העבירו אותם הלוך ושוב בעזרת פ pipette מספר פעמים כדי ליצור תגסוסיה של תאים בודדים. לאחר מכן, העבירו את התאים למבחנה של 15 millilitre וסבבו אותם בצנטריפוגה למשך שלוש דקות. ב-258 Gs ובטמפרטורת החדר, השביו את המשקע בכמות המתאימה של מצע גידול לתאי גזע פלוריפוטנטיים אנושיים מועשר בסרום והוסיפו thi vivin לריכוז סופי של two millimolars.בשלב הבא, דגרו את התאים בצלחות המצופות ג'לטין ביחס של אחד לאחד בטמפרטורה של 37 °C למשך 30 דקות. כדי להסיר את תאי המזין (meth feeders), העבירו את התאים למבחנה חדשה בנפח של 15 ml. דללו אותם במדיום לתאי גזע פלוריפוטנטיים אנושיים, מועשר בסרום, וספרו אותם לאחר סבב ספינטרניזציה נוסף; השביו את התאים במדיום MT.SR one עם thias Ivan לריכוז של 180,000 תאים ל-ml.לאחר מכן, שאבו את ה-matrigel מהפלטות המצופות והעבירו שתי מיליליטר של תאים לכל באר. 48 שעות. לאחר זריעה חוזרת של התאים לפלטות ה-matrigel.שאבו את המצע מכל באער ושטפו את התאים פעם אחת ב-PBS. לאחר מכן, הוסיפו לתאים שני מיליליטר של מצע דיפרנציאציה KSR המועשר ב-SB 4 31, 50 42 ו-L DN 1 9 3 1 8 9, והחליפו את המצע מדי יום מיום D zero עד יום D 20 כפי שמתואר בטבלה. ביום 20, שאבו את מצע הדיפרנציאציה ונתקו את התאים באמצעות מיליליטר אחד של acutus בטמפרטורה של 37 degrees Celsius לכל באער, למשך חמש דקות ב-37 degrees Celsius. במהלך הדגירה, חממו בתוך האינקובטור פלטות poly L orine laminin fibronectin.לאחר ההחייאה (Resus), תלה את התאים שהופרדו לתיתה של תאים בודדים, ודלל את התאים במצע neuro basal. לאחר ספירה, סובב את התאים בצנטריפוגה ושחזר את המשקע במצע התמיינות B 27 בריכוז של 1 million cells per milliliter. לאחר מכן, שאב את הפיברונקטין מלוחיות ה-polyol orine laminin fibronectin.שטוף אותם פעמיים ב-PBS והעבר 400 microliters של תאים לכל באר. לבסוף, החלף את המצע לאחר 24 השעות הראשונות, ולאחר מכן בכל יום שני עד לסיום הניסוי, כדי להסיר תאים מתים שאינם צמודים. כפי שמוצג בתמונות אלו, תרביות של תאי גזע פלוריפוטנטיים אנושיים שהועברו מחדש כתאים בודדים יתרחבו כצברים במהלך 48 השעות הראשונות של הגזירה (differentiation), ויגיעו לכ-70% confluence.לאחר ההבדלה, התאים מגיעים לקונפלואנציה מלאה תוך שלושה עד ארבעה ימים בלבד. עד היום ה-20, התאים המובדלים נצמדים וגדלים כצבירים קטנים. במהלך חמשת הימים הבאים, מופיעים בתוך הצבירים אקסונים ונוריטים אינטנסיביים הרבה יותר ושלמים מבחינה מורפולוגית, היוצרים מספר חיבורים בין הצבירים.לאחר 11 ימים של דיפרנציאציה, ניתן להמיר תאי גזע פלוריפוטנטיים אנושיים ביעילות לתאי קדם של לוח הרצפה (floor plate). כפי שמוצג בתמונות אלו, כמעט כל התאים מביעים את סממני התאים של תאי קדם של לוח הרצפה nestin ו-fox A2, ומעל ל-90% מהתאים מביעים Corin, OTX2 ו-LMX1A. לאחר דיפרנציאציה נוספת, תאי הקדם של לוח הרצפה מתמיינים לנוירונים דופמינרגיים המבטאים TUJ1 ו-TH. נוירונים דופמינרגיים אלו הם בעלי זהות מסוג A9, שכן הם מביעים Girk2 ושליליים ל-calbindin. ניסויי צביעה אימונוהיסטוכימית מדגימים גם כי אין נוכחות של אסטרוציטים GFAP ומספר מועט מאוד של נוירונים GABAergic, מה שמעיד על כך שהדיפרנציאציה היא ספציפית בלבד לשושלת הנוירונים הדופמינרגיים.במהלך בדיקת פרוטוקול זה, חשוב לשמור על עקביות בתרבית התאים היומיומית ולוודא שהתווך הומס טרי עם הרכיבים הנכונים.

directed-dopaminergic-neuron-differentiation-from-human-pluripotent

Research

JoVE Journal

Neuroscience

מדעי המוח

הקמנו פרוטוקול לזירוז של neuroblasts ישירה אנושי לתאי גזע עובריים pluripotent נשמר בתנאים מוגדרים עם מולקולות קטנות, המאפשרת גזירת אספקה ​​גדולה של אבות העצבית האנושית העצבית תא סוגים של פיתוח עבור מערכת העצבים המרכזית העצבית לתיקון.

גזירת יעיל של אבות עצב נוירונים האדם מן האדם תאים pluripotent גזע עובריים עם אינדוקציה מולקולה קטנה

פרוטוקולים להתמיינות עצבית של תאי גזע האנושי pluripotent (hPSCs) הם לעתים קרובות זמן רבים ודורשים מיומנויות סלולריות תרבות משמעותיות. הנה, יש לנו מותאם הליך בידול מולקולה מבוססת קטן לפורמט צלחת multititre, המאפשר לדור פשוט, מהיר ויעיל של תאי עצב אנושי באופן מבוקר.

דור מהיר ויעיל של נוירונים מתאי גזע pluripotent אדם בפורמט פלייט Multititre

סרטון זה מדגים את הדור של תאי אב עצביים מתאי גזע פלוריפוטנטיים אנושיים שאינם מהונדסים ומהונדסים. hPSCs מתמיינים לתאי אב עצביים באמצעות מדיום התמיינות עצבי. בעוד התמיינות מושרית בתאים שאינם טרנסגניים באמצעות מולקולות קטנות, hPSCs טרנסגניים מתמיינים על ידי הוספת אנטיביוטיקה המשרה את המקדם עבור גורם שעתוק ספציפי התמיינות עצבית.

התמיינות תאי גזע פלוריפוטנטיים אנושיים שאינם מהונדסים לתאי אב עצביים

סרטון זה מדגים את התהליך של גרימת תאי גזע פלוריפוטנטיים אנושיים להתמיין לנוירונים על ידי העברתם עם לנטי-וירוסים מהונדסים הנושאים גן גורם שעתוק נוירוגני תחת שליטה של אלמנט מגיב טטרציקלין, ולאחר מכן טיפול בנגזרת טטרציקלין ומדיום התבגרות.

התמיינות תאי גזע פלוריפוטנטית אנושית בתאי עצב באמצעות לנטי-וירוסים מהונדסים

סרטון זה מדגים את ההתמיינות של תאי גזע עובריים אנושיים (תאי גזע עובריים) לנוירונים דופמינרגיים, כדי לספק מודל לחקר מחלת פרקינסון. תאי גזע עובריים בתרבית בתווך אינדוקציה עצבי בצלחת מיקרו-באר כדי ליצור נוירוספרות תלת-ממדיות. לאחר מכן הם מתורבתים במדיום אינדוקציה עצבי כדי לקדם את ההתמיינות לנוירוני אב דופמינרגיים. ההבשלה הסופית של תאי העצב מתרחשת בהחדרת תרבית בתנאי ממשק אוויר-נוזל, וכתוצאה מכך אורגנואידים תלת-ממדיים המורכבים מנוירונים דופמינרגיים בוגרים.

יצירת אורגנואידים עצביים דופמינרגיים מתאי גזע עובריים אנושיים

הליך זה מניב נוירונים telencephalic על ידי עובר מחסומים שדומים לאלו שנצפו בהתפתחות האנושית. התאים מותרים באופן ספונטני כדי להבדיל, חשופים לגורמים שדוחפים אותם לכיוון השושלת העצבית, מבודדים, ומצופים על coverslips כדי לאפשר בידול מסוף והתבגרות.

המפרט של נוירונים glutamatergic Telencephalic מתאי גזע pluripotent אדם

אנו לשנות וליישם פרוטוקול שפורסם בעבר המתאר את הבידול מהירה, לשחזור, ויעיל של תאי גזע מושרים אנושיים (hiPSCs) לתוך נוירונים בקליפת המוח מעוררים 12. באופן ספציפי, השינוי שלנו מאפשר שליטה של ​​צפיפות תאים עצבית ושימוש על מערכים מיקרו-אלקטרודות למדוד תכונות אלקטרו ברמת הרשת.

בידול העצבי המהיר של גזע תאים המושרה pluripotent למדידת פעילות רשת על מערכי מייקרו-אלקטרודה

הפרוטוקול מציג את התיכנות מראש של תאים היקפיים דם מונפקוף כדי לגרום לתאי גזע עצביים על ידי זיהום וירוס סנדאי, הבידול של iNSCs לתוך הנוירונים הפראים, השתלת ה-DA מקדים לתוך מגירסה חד צדדית מחלת פרקינסון מודלים העכבר, והערכה של הבטיחות והיעילות של הקדם-הלאומית של התובע המחוזי עבור טיפול PD.

דור של תאי גזע עצביים מתוך היקפי תאים מונמונומנט ובידול לכיוון תא העצב הפראמינרגיים ללימודי השתלות

מוצג כאן הוא פרוטוקול עבור הדור של התרבות תא יחיד של תאי גזע האדם העובריים והבידול שלהם לתוך תאים מחולל קדמון. הפרוטוקול הוא פשוט, חסון, מדרגי, ומתאים לסינון סמים וליישומים רפואת התחדשות.

בידול עצבי יעיל באמצעות התרבות תא יחיד של תאי גזע האדם העובריים

בפרוטוקול זה, אנו מתארים אסטרטגיה יציבה, בידול יעיל מאוד עבור הדור של נוירונים האוהדים הסימפתטית של האדם בתאי גזע בעלי עוצמה גבוהה. מודל זה יעשה הנוירונים זמינים לשימוש במחקרים של הפרעות אוטונומיות מרובות.

יעיל הבידול של הנוירונים האוהדים הסימפתטית באמצעות בתאי גזע האדם Pluriפוטנטי תחת ממזין-חינם ומוגדר כימית תנאים תרבות

אנו מראים את האוטומציה של תרבויות תאי גזע פלורופוטנטיים (hiPSC) הנגרמים על ידי בני אדם ובדיונים עצביים התואמים להדמיה וניתוח אוטומטיים.

ייצור אוטומטי של נוירונים קורטיים קורטיים ודופאמין נגזר תאי גזע המושרה על ידי תאי גזע אנושיים עם ניטור משולב של תאים חיים

למד פרוטוקול ממוקד ליצירת נוירונים דופמינרגיים ממקורות תאי גזע פלוריפוטנטיים אנושיים. השיטה מאפשרת מחקר מולקולרי של מחלת פרקינסון ופיתוח טיפולים תאיים חדשניים.

בימוי דופאמין Neuron בידול מתאי גזע pluripotent האדם

גלה סרטונים נוספים