בימוי דופאמין Neuron בידול מתאי גזע pluripotent האדם
15 בספטמבר 2014
אנחנו, בהתבסס על ידע מביולוגיה התפתחותית ומחקר שפורסם, פיתחנו פרוטוקול אופטימלי ליצירת נוירונים דופמינרגיים A9 במוח התיכון הן מתאי גזע עובריים אנושיים והן מתאי גזע פלוריפוטנטיים מושרים אנושיים, שיהיו שימושיים למידול מחלות וטיפול בהחלפת תאים למחלת פרקינסון.
המטרה הכוללת של הליך זה היא לגרום להתמיינות נוירונים דופמינרגיים יעילה ביותר. במבחנה. זה מושג על ידי הכנת תרבית הידבקות של תא בודד של תאי גזע פלוריפוטנטיים אנושיים.
בשלב השני, אמצעי תרבית התאים מועבר לאמצעי אינדוקציה של נוירונים כדי לגרום לאבות צלחת הרצפה. לאחר מכן, הנוירונים הדופמינרגיים מתורבתים באמצעי התבגרות. ולבסוף, אבות הנוירונים הדופמינרגיים של התא היחיד מתורבתים על לוחות פיברונקטין למינציה פולי L אורניתין, ואמצעי התבגרות למשך 30 יום.
בסופו של דבר, ניתן להשתמש במיקרוסקופיה אימונופלואורסצנטית כדי להעריך את הביטוי של סמני נוירונים דופמינרגיים חשובים. לטכניקה זו יש יתרון גדול יותר על פני התחום העצבי הקיים בפרוטוקול חומצה עצבית. זה יכול ליצור אוכלוסייה עצבית כפולה הומוגנית יותר עם יעילות גבוהה יותר.
ארבעה ימים לאחר המעבר שואבים את המדיום מתרביות התאים. נתק את התאים עם מיליליטר אחד של אקוטן לבאר ודגר אותם בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך חמש דקות. במהלך הדגירה, הוסיפו מיליליטר ג'לטין אחד לכל באר של צלחת שש בארות, ולאחר מכן הניחו את הצלחת יחד עם צלחות מצופות ג'ל מאטרי שהוכנו טרי לתוך החממה.
כאשר התאים הפכו צפים למחצה, פיפטה אותם למעלה ולמטה מספר פעמים כדי ליצור תרחיף תא בודד. לאחר מכן משוך את התאים לצינור של 15 מיליליטר וצנטריפוגה אותם למשך שלוש דקות. ב-258 גרם וטמפרטורת החדר, יש להשעות מחדש את הגלולה בכמות המתאימה של מדיום תרבית תאי גזע פלוריפוטנטיים אנושיים בתוספת סרום ולהוסיף את ה-vivin לריכוז סופי של שתי מילי-טוחנות.
לאחר מכן, דגרו את התאים בצלחות המצופות ג'לטין ביחס של אחד לאחד ב-37 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות. כדי להסיר את מזיני המת', העבירו את התאים לצינור חדש של 15 מיליליטר. לדלל אותם במדיום תאי גזע פלוריפוטנטי אנושי, בתוספת סרום, ולספור אותם לאחר סיבוב התאים שוב, להשעות מחדש את התאים במדיום אחד MT.SR עם תיאס איוון לריכוז של 180,000 תאים למיליליטר.
לאחר מכן שאפו את המטריג'ל מהצלחות המצופות והוציאו שני מיליליטר תאים לבאר. 48 שעות. לאחר ציפוי מחדש של התאים לצלחות המטריג'ל.
שואבים את המדיום מכל באר ושוטפים את התאים פעם אחת עם PBS. לאחר מכן הוסיפו שני מיליליטר של התמיינות KSR, מדיום בתוספת SB 4 31, 50 42 an L DN 1 9 3 1 8 9 לתאים המשנים את המדיום כל יום מ- D אפס ל- D 20 כפי שמתואר בתרשים ביום 20, שאפו את מדיום ההתמיינות ונתקו את התאים עם מיליליטר אחד של 37 מעלות צלזיוס אקוטוס לבאר ב -37 מעלות צלזיוס למשך חמש דקות. במהלך הדגירה, חממו צלחות פיברונקטין פולי L אורין למינין בחממה.
לאחר Resus, השעיית התאים המנותקים לתרחיף תא בודד, יש לדלל את התאים במדיה נוירו-בסיסית. לאחר הספירה, סובב את התאים והשהה מחדש את הגלולה ב-B 27, מדיום התמיינות בריכוז של מיליון תאים למיליליטר. לאחר מכן שאפו את הפיברונקטין מלוחות הפיברונקטין של פוליאול אורין למינין.
שוטפים אותם פעמיים עם PBS ומעבירים 400 מיקרוליטר תאים לכל אחד. ובכן, סוף סוף החליפו את המדיום לאחר 24 השעות הראשונות, ולאחר מכן כל יומיים עד לנקודת הסיום של הניסוי כדי להסיר תאים מתים לא מחוברים. כפי שמודגם בתמונות אלה, תרביות תאי גזע פלוריפוטנטיים אנושיים חד-תאיים מצופים יתרחבו כאשכולות במהלך 48 השעות הראשונות של ההתמיינות, ויגיעו לכ-70% מפגש.
לאחר ההתמיינות, התאים משיגים מפגש מלא תוך שלושה עד ארבעה ימים. ביום ה-20, התאים הממוינים מתחברים וגדלים כגושים קטנים. במהלך חמשת הימים הבאים, אקסונים ונויריטים הרבה יותר אינטנסיביים ושלמים מבחינה מורפולוגית מופיעים בתוך הגושים, ויוצרים קשרים מסוימים בין הגושים.
לאחר 11 ימים של התמיינות, ניתן להמיר ביעילות את תאי הגזע הפלוריפוטנטיים האנושיים למבשרי לוחות רצפה. כפי שמודגם בתמונות אלה, כמעט כל התאים מבטאים את מבשר לוחית הרצפה, סמני תאים מקננים ושועל A שניים ומעלה. 90% מהתאים מבטאים Corin O OTX two ו-LM X אחד A.לאחר התמיינות נוספת, תאי המבשר של לוחית הרצפה מתמחים בנוירונים דופמינרגיים המבטאים TUJ one ו-TH. נוירונים דופמינרגיים אלה הם בעלי זהות תשע מכיוון שהם מבטאים GK 2 והם שליליים עבור קלבינדין ניסויי צביעה חיסונית מדגימים גם כי אין אסטרוציטים של GFAP ומעט מאוד נוירונים GABAergic המצביעים על כך שההתמיינות היא ספציפית אך ורק לשושלת הנוירונים הדופמינרגיים.
בעת בדיקת הליך זה, חשוב לשמור על עקביות בתרבית התאים היומיומית ולוודא שהמדיום מוכן טרי עם המרכיבים הנכונים.
צפו בתמליל המלא וקבלו גישה לאלפי סרטונים מדעיים
סקירה כללית
מאמר זה מציג פרוטוקול מותאם עבור ייצור נוירונים דופמינרגיים של אזור A9 במוארך המוח מתאי גזע עובריים אנושיים ומתאי גזע פלוריפוטנטיים מושריים. התקדמות זו היא משמעותית עבור מידול של מחלת פרקינסון ובחינת טיפולים להחלפת תאים.
מרכיבי מפתח של המחקר
תחום המדע
- מדעי המוח
- ביולוגיה של תאי גזע
- רפואה רגנרטיבית
רקע
- נוירונים דופמינרגיים חיוניים לבקרה מוטורית.
- מחלת הפרקינסון מאופיינת בניוון של נוירונים אלו.
- הטיפולים הנוכחיים מוגבלים, מה שיוצר צורך בגישות חדשות.
- תאי גזע מהווים מקור פוטנציאלי להחלפת נוירונים.
מטרת המחקר
- פיתוח שיטה מהימנה להגבהה של תאי גזע לנוירונים דופמינרגיים.
- שיפור היעילות של ייצור נוירונים מתאי גזע פלוריפוטנטיים.
- אספקת כלי למחקר של מחלת פרקינסון in vitro.
שיטות שנעשה בהן שימוש
- הכנה של תרבית הידבקות של תאים בודדים של תאי גזע פלוריפוטנטיים אנושיים.
- מעבר למצע השראה של נוירונים כדי לעודד היווצרות של תאי פרוגניטור של רצפת המוח (floorplate).
- גידול של נוירונים דופמינרגיים במצע הבשלה.
- תרבית סופית של פרוגניטורים של נוירונים דופמינרגיים כתאים בודדים על פלטות ייעודיות למשך 30 ימים.
תוצאות עיקריות
- בידול מוצלח של תאי גזע פלוריפוטנטיים אנושיים לנוירונים דופמינרגיים.
- יעילות גבוהה ביצירת נוירונים דופמינרגיים מסוג A9 במערכת המוח האמצעית.
- יישומים פוטנציאליים במידול מחלות ובטיפול בהחלפת תאים.
- ניתן להתאים את הפרוטוקול לצרכי מחקר שונים.
מסקנות
- הפרוטוקול שפותח מהווה התקדמות משמעותית למחקר במדעי המוח.
- הוא מספק בסיס למחקרים עתידיים על מחלת הפרקינסון.
- מחקר נוסף עשוי לשפר אסטרטגיות טיפוליות המשתמשות בנוירונים אלו.
שאלות נפוצות
רלוונטיות תעשייתית למסמך סיכום
דיפרנציאציה מכוונת של תאי גזע פלוריפוטנטיים אנושיים לנוירונים דופמינרגיים מסוג A9 נותנת מענה לצורך קריטי במודלים תאיים רלוונטיים למחלה במחקרי מחלת הפרקינסון. פרוטוקול זה מאפשר יצירה ניתנת לשחזור ובקנה מידה רחב של אוכלוסיות נוירונים הומוגניות, ובכך תומך הן במחקרים מכניסטיים והן בסריקת תרופות פרה-קלינית. גישה זו מגבירה את הביטחון החזוי בנקודות של תיקוף המטרה ובשלבי המעבר התרגומיים המוקדמים בpipeline של מחלות ניו روندגנרטיביות.
יישומים אסטרטגיים במו"פ של ביו-פארמה
גילוי מוקדם ותיקוף מטרה
- מאפשר בחינה של מסלולים ספציפיים לנוירונים דופמינרגיים המעורבים במחלת פרקינסון.
- תומך בתיקוף פונקציונלי של מטרות באמצעות יצירת נוירונים אנושיים ספציפיים לשושלת תאים.
- מסייע בהפחתת סיכונים מכניסטיים באמצעות דיפרנציאציה מבוקרת ואישור שושלת מבוסס סממנים.
- מספק פלטפורמה לחקירה מונחית-השערות של מנגנוני מחלה.
סריקה ופיתוח בדיקות
- מספק אוכלוסיות נוירונים סטנדרטיות והומוגניות לצורך פיתוח בדיקות הניתנות לשחזור.
- מאפשר הערכה כמותית של ביטוי סממנים נוירונליים לצורך תיקוף הבדיקה.
- תומך בסריקה בעלת תוכן גבוה (high-content screening) ובהערכת תרכובות בתאים אנושיים הרלוונטיים למחלה.
- משפר את יכולת ההרחבה (scalability) ואת השימוש החוזר בפלטפורמה עבור קמפיינים של סריקה למחלות ניווניות של מערכת העצבים.
מחקר תרגומי וטרום-קלני
- מתאים מידול מחלות in vitro לפנוטיפים של נוירונים דופמינרגיים בעלי רלוונטיות אנושית.
- מאפשר רציפות משלב הגילוי ועד לאישור פרה-קליני באמצעות iPSCs המופקים מחולים.
- תומך בקבלת החלטות על קידום מותאם-סיכון באמצעות אספקת תוצאי קריאה תאיים ניבויים.
- מקל על חקר ביומרקרים תרגומיים בהקשר תאי מבוקר.
שילוב תהליכי עבודה וצינור עיבוד
פרוטוקול דיפרנציאציה זה משתלב ברצף השלב שבין הגילוי לשלב הפרה-קליני, ומאפשר תיקוף מטרות בשלב מוקדם, פיתוח בדיקות ומחקר תרגומי עבור הפרעות ניוורו-דגנרטיביות.
- ביולוגיה של הגילוי: מספק מערכת חזקה לבדיקת היפותזות ולהבהרת מסלולים בביולוגיה של נוירונים דופמינרגים.
- סריקה: מספק נוירונים הניתנים לשחזור ומאומתים באמצעות סמנים לסריקה כמותית של תרכובות.
- אנליטיקה: מאפשר כימות של סמנים ספציפיים לשושלת המבוסס על אימונופלואורסצנציה לצורך ניתוח השוואתי.
- מחקר תרגומי: מגשר בין מידול מחלות in vitro למערכות תאיות שמקורן בחולה עבור מחקרים פרה-קליניים.
- שימוש חוזר ארגוני: מבסס תהליך עבודה הדיפרנציאלי הניתן לשימוש חוזר, הניתן להתאמה למקורות תאי גזע ומודלים של מחלות מרובים.
השפעה תפעולית וארגונית
- ערך מדעי: מגביר את הביטחון החזוי ומפחית עמימות מכניסטית במחקר של מחלות נוירודגנרטיביות.
- ערך תפעולי: סטנדרטיזציה של דיפרנציאציה של נוירונים לצורך הדירות וסקליביליות בין צוותי מו"פ.
- ערך אסטרטגי: משפר את איכות קבלת ההחלטות לגבי המשך תהליך (go/no-go) ואת היעילות ההונית בתיקי פיתוח בשלבים מוקדמים של מדעי העצבים.
- השפעה על תיק הפיתוח: מאפשר תיעדוף מותאם סיכון של מטרות והיפותזות טיפוליות בקווי הפיתוח למחלת פרקינסון.
שיקולי יישום
- דורש מומחיות בתרבית תאי גזע פלוריפוטנטיים אנושיים ובהבדלה נוירונית.
- דורש גישה לריאגנטים ייעודיים לתרבית תאים, פלטות מצופות ומיקרוסקופיית אימונופלואורסצנציה.
- מחייב סטנדרטיזציה קפדנית בין צוותים להכנת מדיה ולפרוטוקולים של טיפול בתאים.
- ניתן להתאמה למקורות hESC ו-hiPSC, כולל שורות תאים המופקות ממטופלים לצורך מידול מחלות.
- תלוי בתנאי תרבית תאים עקביים ובריאגנטים תחת בקרת איכות לצורך שחזור התוצאות.
