בימוי דופאמין Neuron בידול מתאי גזע pluripotent האדם
15 בספטמבר 2014
אנחנו, בהתבסס על ידע מביולוגיה התפתחותית ומחקר שפורסם, פיתחנו פרוטוקול אופטימלי ליצירת נוירונים דופמינרגיים A9 במוח התיכון הן מתאי גזע עובריים אנושיים והן מתאי גזע פלוריפוטנטיים מושרים אנושיים, שיהיו שימושיים למידול מחלות וטיפול בהחלפת תאים למחלת פרקינסון.
המטרה הכוללת של פרוצדורה זו היא להשראת בידול יעיל מאוד של נוירונים דופמינרגיים in vitro. דבר זה מושג תחילה על ידי הכנת תרבית היצמדות של תאים בודדים של תאי גזע פלוריפוטנטיים אנושיים.
בשלב השני, מתווך תרבית התאים מוחלף בתווך השראה לנוירונים כדי להשריץ תאי מקור של ה-floorplate. לאחר מכן, הנוירונים הדופמינרגיים גודלים בתווך הבשלה. ולבסוף, תאי מקור של נוירונים דופמינרגיים בתרבית של תאים בודדים גודלים על פלטות מצופות poly L ornithine ו-fibronectin, בתווך הבשלה למשך 30 ימים.
בסופו של דבר, ניתן להשתמש במיקרוסקופיה אימונופלואורסצנטית כדי להעריך את הביטוי של סממנים חשובים של נוירונים דופמינרגיים. לטכניקה זו יתרון רב יותר על פני הפרוטוקול הקיים של נוירוספרות על נוירו-חומצה. היא יכולה להפיק אוכלוסייה עצבית כפולה הומוגנית יותר ביעילות גבוהה יותר.
ארבעה ימים לאחר ההעברה, שאבו את המצע מתרביות התאים. נתקו את התאים באמצעות 1 ml של Accutane לכל באר והדגירו אותם בטמפרטורה של 37 °C למשך חמש דקות. במהלך ההדגרה, הוסיפו 1 ml של ג'לטין לכל באר בלוח של שש בארות, ולאחר מכן הכניסו את הלוח יחד עם לוחות מצופים ב-matrigel שהוכנו זה עתה למדגרה.
כאשר התאים הופכים לחצי-צפים, העבירו אותם הלוך ושוב בעזרת פ pipette מספר פעמים כדי ליצור תגסוסיה של תאים בודדים. לאחר מכן, העבירו את התאים למבחנה של 15 millilitre וסבבו אותם בצנטריפוגה למשך שלוש דקות. ב-258 Gs ובטמפרטורת החדר, השביו את המשקע בכמות המתאימה של מצע גידול לתאי גזע פלוריפוטנטיים אנושיים מועשר בסרום והוסיפו thi vivin לריכוז סופי של two millimolars.
בשלב הבא, דגרו את התאים בצלחות המצופות ג'לטין ביחס של אחד לאחד בטמפרטורה של 37 °C למשך 30 דקות. כדי להסיר את תאי המזין (meth feeders), העבירו את התאים למבחנה חדשה בנפח של 15 ml. דללו אותם במדיום לתאי גזע פלוריפוטנטיים אנושיים, מועשר בסרום, וספרו אותם לאחר סבב ספינטרניזציה נוסף; השביו את התאים במדיום MT.SR one עם thias Ivan לריכוז של 180,000 תאים ל-ml.
לאחר מכן, שאבו את ה-matrigel מהפלטות המצופות והעבירו שתי מיליליטר של תאים לכל באר. 48 שעות. לאחר זריעה חוזרת של התאים לפלטות ה-matrigel.
שאבו את המצע מכל באער ושטפו את התאים פעם אחת ב-PBS. לאחר מכן, הוסיפו לתאים שני מיליליטר של מצע דיפרנציאציה KSR המועשר ב-SB 4 31, 50 42 ו-L DN 1 9 3 1 8 9, והחליפו את המצע מדי יום מיום D zero עד יום D 20 כפי שמתואר בטבלה. ביום 20, שאבו את מצע הדיפרנציאציה ונתקו את התאים באמצעות מיליליטר אחד של acutus בטמפרטורה של 37 degrees Celsius לכל באער, למשך חמש דקות ב-37 degrees Celsius. במהלך הדגירה, חממו בתוך האינקובטור פלטות poly L orine laminin fibronectin.
לאחר ההחייאה (Resus), תלה את התאים שהופרדו לתיתה של תאים בודדים, ודלל את התאים במצע neuro basal. לאחר ספירה, סובב את התאים בצנטריפוגה ושחזר את המשקע במצע התמיינות B 27 בריכוז של 1 million cells per milliliter. לאחר מכן, שאב את הפיברונקטין מלוחיות ה-polyol orine laminin fibronectin.
שטוף אותם פעמיים ב-PBS והעבר 400 microliters של תאים לכל באר. לבסוף, החלף את המצע לאחר 24 השעות הראשונות, ולאחר מכן בכל יום שני עד לסיום הניסוי, כדי להסיר תאים מתים שאינם צמודים. כפי שמוצג בתמונות אלו, תרביות של תאי גזע פלוריפוטנטיים אנושיים שהועברו מחדש כתאים בודדים יתרחבו כצברים במהלך 48 השעות הראשונות של הגזירה (differentiation), ויגיעו לכ-70% confluence.
לאחר ההבדלה, התאים מגיעים לקונפלואנציה מלאה תוך שלושה עד ארבעה ימים בלבד. עד היום ה-20, התאים המובדלים נצמדים וגדלים כצבירים קטנים. במהלך חמשת הימים הבאים, מופיעים בתוך הצבירים אקסונים ונוריטים אינטנסיביים הרבה יותר ושלמים מבחינה מורפולוגית, היוצרים מספר חיבורים בין הצבירים.
לאחר 11 ימים של דיפרנציאציה, ניתן להמיר תאי גזע פלוריפוטנטיים אנושיים ביעילות לתאי קדם של לוח הרצפה (floor plate). כפי שמוצג בתמונות אלו, כמעט כל התאים מביעים את סממני התאים של תאי קדם של לוח הרצפה nestin ו-fox A2, ומעל ל-90% מהתאים מביעים Corin, OTX2 ו-LMX1A. לאחר דיפרנציאציה נוספת, תאי הקדם של לוח הרצפה מתמיינים לנוירונים דופמינרגיים המבטאים TUJ1 ו-TH. נוירונים דופמינרגיים אלו הם בעלי זהות מסוג A9, שכן הם מביעים Girk2 ושליליים ל-calbindin. ניסויי צביעה אימונוהיסטוכימית מדגימים גם כי אין נוכחות של אסטרוציטים GFAP ומספר מועט מאוד של נוירונים GABAergic, מה שמעיד על כך שהדיפרנציאציה היא ספציפית בלבד לשושלת הנוירונים הדופמינרגיים.
במהלך בדיקת פרוטוקול זה, חשוב לשמור על עקביות בתרבית התאים היומיומית ולוודא שהתווך הומס טרי עם הרכיבים הנכונים.
צפו בתמליל המלא וקבלו גישה לאלפי סרטונים מדעיים
סקירה כללית
מאמר זה מציג פרוטוקול מותאם עבור ייצור נוירונים דופמינרגיים של אזור A9 במוארך המוח מתאי גזע עובריים אנושיים ומתאי גזע פלוריפוטנטיים מושריים. התקדמות זו היא משמעותית עבור מידול של מחלת פרקינסון ובחינת טיפולים להחלפת תאים.
מרכיבי מפתח של המחקר
תחום המדע
- מדעי המוח
- ביולוגיה של תאי גזע
- רפואה רגנרטיבית
רקע
- נוירונים דופמינרגיים חיוניים לבקרה מוטורית.
- מחלת הפרקינסון מאופיינת בניוון של נוירונים אלו.
- הטיפולים הנוכחיים מוגבלים, מה שיוצר צורך בגישות חדשות.
- תאי גזע מהווים מקור פוטנציאלי להחלפת נוירונים.
מטרת המחקר
- פיתוח שיטה מהימנה להגבהה של תאי גזע לנוירונים דופמינרגיים.
- שיפור היעילות של ייצור נוירונים מתאי גזע פלוריפוטנטיים.
- אספקת כלי למחקר של מחלת פרקינסון in vitro.
שיטות שנעשה בהן שימוש
- הכנה של תרבית הידבקות של תאים בודדים של תאי גזע פלוריפוטנטיים אנושיים.
- מעבר למצע השראה של נוירונים כדי לעודד היווצרות של תאי פרוגניטור של רצפת המוח (floorplate).
- גידול של נוירונים דופמינרגיים במצע הבשלה.
- תרבית סופית של פרוגניטורים של נוירונים דופמינרגיים כתאים בודדים על פלטות ייעודיות למשך 30 ימים.
תוצאות עיקריות
- בידול מוצלח של תאי גזע פלוריפוטנטיים אנושיים לנוירונים דופמינרגיים.
- יעילות גבוהה ביצירת נוירונים דופמינרגיים מסוג A9 במערכת המוח האמצעית.
- יישומים פוטנציאליים במידול מחלות ובטיפול בהחלפת תאים.
- ניתן להתאים את הפרוטוקול לצרכי מחקר שונים.
מסקנות
- הפרוטוקול שפותח מהווה התקדמות משמעותית למחקר במדעי המוח.
- הוא מספק בסיס למחקרים עתידיים על מחלת הפרקינסון.
- מחקר נוסף עשוי לשפר אסטרטגיות טיפוליות המשתמשות בנוירונים אלו.
שאלות נפוצות
רלוונטיות תעשייתית למסמך סיכום
דיפרנציאציה מכוונת של תאי גזע פלוריפוטנטיים אנושיים לנוירונים דופמינרגיים מסוג A9 נותנת מענה לצורך קריטי במודלים תאיים רלוונטיים למחלה במחקרי מחלת הפרקינסון. פרוטוקול זה מאפשר יצירה ניתנת לשחזור ובקנה מידה רחב של אוכלוסיות נוירונים הומוגניות, ובכך תומך הן במחקרים מכניסטיים והן בסריקת תרופות פרה-קלינית. גישה זו מגבירה את הביטחון החזוי בנקודות של תיקוף המטרה ובשלבי המעבר התרגומיים המוקדמים בpipeline של מחלות ניו روندגנרטיביות.
יישומים אסטרטגיים במו"פ של ביו-פארמה
גילוי מוקדם ותיקוף מטרה
- מאפשר בחינה של מסלולים ספציפיים לנוירונים דופמינרגיים המעורבים במחלת פרקינסון.
- תומך בתיקוף פונקציונלי של מטרות באמצעות יצירת נוירונים אנושיים ספציפיים לשושלת תאים.
- מסייע בהפחתת סיכונים מכניסטיים באמצעות דיפרנציאציה מבוקרת ואישור שושלת מבוסס סממנים.
- מספק פלטפורמה לחקירה מונחית-השערות של מנגנוני מחלה.
סריקה ופיתוח בדיקות
- מספק אוכלוסיות נוירונים סטנדרטיות והומוגניות לצורך פיתוח בדיקות הניתנות לשחזור.
- מאפשר הערכה כמותית של ביטוי סממנים נוירונליים לצורך תיקוף הבדיקה.
- תומך בסריקה בעלת תוכן גבוה (high-content screening) ובהערכת תרכובות בתאים אנושיים הרלוונטיים למחלה.
- משפר את יכולת ההרחבה (scalability) ואת השימוש החוזר בפלטפורמה עבור קמפיינים של סריקה למחלות ניווניות של מערכת העצבים.
מחקר תרגומי וטרום-קלני
- מתאים מידול מחלות in vitro לפנוטיפים של נוירונים דופמינרגיים בעלי רלוונטיות אנושית.
- מאפשר רציפות משלב הגילוי ועד לאישור פרה-קליני באמצעות iPSCs המופקים מחולים.
- תומך בקבלת החלטות על קידום מותאם-סיכון באמצעות אספקת תוצאי קריאה תאיים ניבויים.
- מקל על חקר ביומרקרים תרגומיים בהקשר תאי מבוקר.
שילוב תהליכי עבודה וצינור עיבוד
פרוטוקול דיפרנציאציה זה משתלב ברצף השלב שבין הגילוי לשלב הפרה-קליני, ומאפשר תיקוף מטרות בשלב מוקדם, פיתוח בדיקות ומחקר תרגומי עבור הפרעות ניוורו-דגנרטיביות.
- ביולוגיה של הגילוי: מספק מערכת חזקה לבדיקת היפותזות ולהבהרת מסלולים בביולוגיה של נוירונים דופמינרגים.
- סריקה: מספק נוירונים הניתנים לשחזור ומאומתים באמצעות סמנים לסריקה כמותית של תרכובות.
- אנליטיקה: מאפשר כימות של סמנים ספציפיים לשושלת המבוסס על אימונופלואורסצנציה לצורך ניתוח השוואתי.
- מחקר תרגומי: מגשר בין מידול מחלות in vitro למערכות תאיות שמקורן בחולה עבור מחקרים פרה-קליניים.
- שימוש חוזר ארגוני: מבסס תהליך עבודה הדיפרנציאלי הניתן לשימוש חוזר, הניתן להתאמה למקורות תאי גזע ומודלים של מחלות מרובים.
השפעה תפעולית וארגונית
- ערך מדעי: מגביר את הביטחון החזוי ומפחית עמימות מכניסטית במחקר של מחלות נוירודגנרטיביות.
- ערך תפעולי: סטנדרטיזציה של דיפרנציאציה של נוירונים לצורך הדירות וסקליביליות בין צוותי מו"פ.
- ערך אסטרטגי: משפר את איכות קבלת ההחלטות לגבי המשך תהליך (go/no-go) ואת היעילות ההונית בתיקי פיתוח בשלבים מוקדמים של מדעי העצבים.
- השפעה על תיק הפיתוח: מאפשר תיעדוף מותאם סיכון של מטרות והיפותזות טיפוליות בקווי הפיתוח למחלת פרקינסון.
שיקולי יישום
- דורש מומחיות בתרבית תאי גזע פלוריפוטנטיים אנושיים ובהבדלה נוירונית.
- דורש גישה לריאגנטים ייעודיים לתרבית תאים, פלטות מצופות ומיקרוסקופיית אימונופלואורסצנציה.
- מחייב סטנדרטיזציה קפדנית בין צוותים להכנת מדיה ולפרוטוקולים של טיפול בתאים.
- ניתן להתאמה למקורות hESC ו-hiPSC, כולל שורות תאים המופקות ממטופלים לצורך מידול מחלות.
- תלוי בתנאי תרבית תאים עקביים ובריאגנטים תחת בקרת איכות לצורך שחזור התוצאות.
