נוהל נפח קטן לריכוז נגיפי ממים
3 בפברואר 2015
פותחה גישה לזיהוי תנאי ריכוז נגיפי אופטימליים עבור דגימות מים בנפח קטן באמצעות קוצים של אדנו-וירוס אנושי. הטכניקות המתוארות כאן משמשות לזיהוי פרמטרי ריכוז עבור מטרות נגיפיות אחרות, ומיושמות על ניסויים בריכוז נגיפי בקנה מידה גדול.
המטרה הכללית של הניסוי הבא היא למטב את השחזור של נגיפים ממים באמצעות טכניקה בקנה מידה קטן שתוכננה במקור כדי למטב ריכוזים של נגיפים. נמצא כי מסנן תאית זכוכית הוא המסנן האלקטרופוזיטי הטוב ביותר לריכוז adenovirus ממים. עבור האלוציה המשנית, טכניקת ריכוז משנית באמצעות celite הוכחה כטובה ביותר לאלוציית adenovirus מפני השטחי המסנן. הטכניקה שהתקבלה משחזרת את הכמות הגבוהה ביותר של adenovirus ממי ברז, בהתבסס על אחוזי השחזור הגבוהים ביותר שנצפו מבין כל השילובים שנבחנו של מסננים ואלוציות.
היתרון המרכזי של טכניקה זו על פני שיטות קיימות, כגון ריכוז של נפחים גדולים, הוא שהיא משתמשת בנפחי דגימה קטנים יותר, מה שמאפשר להעריך מספר רב של משתני ריכוז במהירות ובקלות.
בעת ההכנה לפרוטוקול זה, יש להכין מראש את כל התמיסות הדרושות, כולל תמיסת הויראלי שהסננה דרך פילטר של 0.22 micron בריכוז של 10 עד 100,000 MPN למילליליטר.
התחילו במדידה של ליטר של מי ברז סטריליים. העבירו אותם לכוס כימיאית בנפח של שני ליטר עם מגנט ערבוב. תוך כדי ערבוב המים, הוסיפו 0.7 גרם של sodium thiosulfate והמתינו להמסה מלאה. לאחר מכן, כווןו את ה-pH לטווח שבין 7 ל-7.5 על ידי הוספה של תמיסות מרוכזות של חומצה או בסיס בריכוז one molar בטיפות. בשלב הבא, זרקו את המים בנגיף. הוסיפו מיליליטר מלא של תמיסת הנגיף שהוכנה. כסו את הבקרה בעטיפה סטרילית והניחו לנגיף להתערבב במים למשך 10 דקות.
בינתיים, הכינו את מסנן המילוپور (Millipore). ראשית, הוציאו אותו מאריזתו, וודאו שהוא מותאם במיגון הדוק בין הכלי העליון למסך התחתון. לאחר מכן, בדקו שחומר השעם שבמסנן מתאים באופן הדוק לשפת בקבוק עם זרוע צד (sidearm flask) בנפח של one liter. כעת הסירו את הכלי העליון של המסנן ובעזרת פינצטה, הניחו דיסק סינון אלקטרופוזיטיבי בקוטר 47 millimeter בצורה מדויקת על מסך הסינון. לאחר מכן, חברו מחדש את הכלי ונעלו אותו במקומו באמצעות סיבוב נגד כיוון השעון.
מדוד 100 milliliters של מי ברז עם תוספת (spiked) באמצעות משורה סטרילית. לאחר מכן, העבר את המים למעטפת המסנן שהוכנה על מבחנה בנפח שני ליטר. הדיסקה החיובית-חשמלית במסנן עשויה להיות זכוכית-צלולוז מקפלת או סיב זכוכית ננו-אלומינה. ניתן להשתמש בואקום עדין כדי להעביר את שאריות המים דרך המסנן.
כעת, העבירו את בית המסנן לבקבוק עם זרוע צד בנפח 250 milliliter. מדדו 100 milliliters של תמצית בקר ושפכו אותה באיטיות על המסנן. אפשרו לתמצית לעבור באיטיות והשתמשו בואקום עדין כדי לשאוב את השאריות.
לאחר מכן, המשיכו עם אחת משתי האפשרויות לריכוז משני.
כדי לרכז את הווירוס באמצעות celite, העבירו את תכולת הבקבוק בנפח 250 milliliter, המכילה את הווירוס, אל מעמדו של מערבל מגנטי. בעזרת מוט ערבוב, צרו מערבולת קטנה. לאחר מכן, הוסיפו 0.1 grams של אבקת celite ל-100 milliliters של תמצית בקר. המתינו לפיזור ה-celite והכינו את הפתרון לכיוון ה-ph. באמצעות הוספה טיפית של חומצה כלורית 0.1 molar, הנמיכו את ה-pH ל-4.0.
לאחר מכן, יש להניח לתמיסה להתערבב במשך 10 דקות. תוך כדי הערבוב, חברו את מסנן הקדם בנפח 47 מיליליטר לבקרה של שני ליטר. כעת, שפכו 100 מיליליטר מתערובת תמצית הבקר-celite דרך מסנן הקדם. ניתן להשתמש בואקום קל כדי להשלים את התהליך.
כעת הצמד תסבוב מתכת לקצה פיית בית המסנן. לתסבוב חבר מבחנת איסוף סטרילית מפּוליפרופילן בנפח 15 milliliters ולאחר מכן הרכב מחדש את המסנן על הבקבוק.
כעת אלוטו את הווירוס מחלקיקי ה-Celite בחמישה מיליליטר של 1X PBS ב-pH 9. אפשרו למרבית ה-PBS לטפטף לתוך מבחנה של 15 מיליליטר באמצעות כבידה, ושאבו את השאריות בעזרת ואקום קל. כדי לרכז את הווירוס באמצעות פלוקולציה אורגנית, העבירו את תכולת הבקראק של 250 מיליליטר המכילה את הווירוס למערך ערבוב מגנטי. בעזרת מוט ערבוב, צרו מערבולת קטנה. התאימו את ה-pH של התמיסה ל-3.5 באמצעות הוספה טיפית של חומצה כלורית בריכוז 1M. לאחר מכן, השאירו את התערובת לערבוב למשך חצי שעה. בהמשך, העבירו את התמיסה למבחנה צנטריפוגית קונית סטרילית של 250 מיליליטר. צנטריפוגו את התמיסה ב-2,500 g למשך 15 דקות בטמפרטורה של 4°C. לאחר הצנטריפוגה, היזהרו לא להפר את המשקע בעת הטיפול במבחנות. שפכו בזהירות את העילאי וסספנדו מחדש את המשקע בחמישה מיליליטר של PBS ב-pH 9. ודאו שהמשקע מומס. לאחר מכן, צנטריפוגו את הסספנדציה ב-4,000 g למשך 10 דקות בטמפרטורה של 4°C. כעת אספו את העילאי המכיל את הווירוס המרוכז. ניתן להשליך את המשקע.
במהלך אופטימיזציה של פרוטוקול זה, הושוו שלושה סוגי celite. celite גס יותר הוביל להשבה נמוכה יותר הן של ADV 40 והן של ADV 41.
בדיקת אלוציית המסנן בוצעה ב-pH שבין 7.5 ל-12 כדי לקבוע איזה ערך יהיה היעיל ביותר לאיסוף חלקיקי ADV מהמסננים. ההשבה הגבוהה ביותר התקבלה ממסנן זכוכית-צלולוז בשילוב עם תמצית בקר ב-pH 10 ועם celite. התוצאה הייתה זהה עבור ADV 40 ו-ADV 41.
תמצית בקר ב-pH 10 הוכחה כעדיפה על פני פלוקולציה אורגנית.
השיטה המותאמת הושוותה להוספה של 25% טריפסין ולהשלמה של תמצית הבקר ב-0.1% נתרשן פוליפוספט. אף אחד מהטיפולים לא שיפר באופן מובהק את השחזור של ADV.
לאחר השליטה בטכניקה, ניתן לבצע אותה בתוך 45 דקות אם היא מבוצעת כראוי.
צפו בתמליל המלא וקבלו גישה לאלפי סרטונים מדעיים
סקירה כללית
מחקר זה מציג שיטה לאופטימיזציה של התאוששות נגיפים מדגימות מים בנפח קטן, תוך התמקדות ספציפית ב-human adenovirus. הגישה עושה שימוש במסנן תאית זכוכית ובטכניקת ריכוז משנית כדי להעלות את שיעורי ההתאוששות.
מרכיבי מפתח של המחקר
תחום המדע
- וירולוגיה
- מדעי הסביבה
- איכות מים
רקע
- ריכוז נגיפים מדגימות מים הוא קריטי לניטור סביבתי.
- שיטות קיימות דורשות לרוב נפחי דגימה גדולים, דבר המגביל את יעילותן.
- אופטימיזציה של טכניקות התאוששות יכולה לשפר את הגילוי והניתוח של פתוגנים נגיפיים.
- אדנווירוס אנושי משמש כמודל לבדיקת שיטות ריכוז.
מטרת המחקר
- פיתוח טכניקה לזיהוי תנאי ריכוז ויראליים אופטימליים.
- הערכת שילובים שונים של מסננים ואלוציה לשחזור של adenovirus.
- מתן אפשרות להערכה מהירה של משתני ריכוז באמצעות נפחי דגימה קטנים.
שיטות שנעשה בהן שימוש
- שימוש במסנן תאית זכוכית לריכוז אדנווירוס.
- יישום של טכניקת ריכוז משנית מסוג sea light לאלוציה.
- השוואה בין שילובים שונים של מסננים ואלוציה.
- הערכת שיעורי התשואה מדגימות מי ברז.
תוצאות עיקריות
- מסנן התאית מזכוכית הראה את שיעורי ההשחזור הגבוהים ביותר עבור adenovirus.
- טכניקת הריכוז המשנית sea light אלוטה את הווירוס ביעילות.
- נפחי דגימה קטנים אפשרו הערכה מהירה של פרמטרי ריכוז מרובים.
- השיטה הניבה תוצאות טובות יותר מאשר טכניקות מסורתיות לריכוז נפחים גדולים.
מסקנות
- טכניקה זו מספקת אמצעי יעיל יותר להשגת וירוסים מדגימות מים.
- היא מאפשרת בדיקה מהירה של תנאי ריכוז שונים.
- ניתן להתאים את הגישה למטרות ויראליות אחרות מעבר ל-adenovirus.
שאלות נפוצות
רלוונטיות לתעשייה
אופטימיזציה של השבת נגיפים מדגימות מים בנפח קטן מאפשרת סריקה מהירה של פרמטרי ריכוז, ובכך תומכת בפיתוח בדיקות בשלבים מוקדמים עבור וירולוגיה סביבתית. השיטה מספקת גישה ניתנת להרחבה וכלכלית להערכת שילובים של מסננים ואלוציה, ובכך מפחיתה את הוצאות המשאבים בזרימות עבודה של זיהוי פתוגנים בשלב הפרה-קליני. באמצעות זיהוי התנאים האופטימליים לריכוז adenovirus, הטכניקה משפרת את הביטחון החזוי ביישומי זיהוי במורד התהליך.
יישומים אסטרטגיים במחקר ופיתוח בביופארמה
גילוי מוקדם ותיקוף מטרה
- ערך מדעי: מאפשר בדיקה של יעילות השחזור הנגיפי על פני סוגי מסננים ותנאי אלוטציה שונים, כדי לתמוך בתיקוף היעד בזיהוי פתוגנים סביבתיים.
- ערך תפעולי: משתמש בנפחי דגימה קטנים (1-10 L המדמים 100 mL) לבדיקה מהירה של משתנים מרובים, ובכך מאיץ את יצירת ההשערות לאופטימיזציה של ריכוז נגיפים.
סריקה ופיתוח בדיקות
- ערך מדעי: מייצר נתוני התאוששות כמותיים (אחוז התאוששות של AdV40 ו-AdV41) במטרה לספק מידע לסטנדרטיזציה של הבדיקה ולשחזוריות בפלטפורמות לגילוי נגיפים.
- ערך תפעולי: מכין מערכות ביולוגיות עוברות תיקוף (נגיף מרוכז בנפח של 5-30 mL) ליישומים המשכיים כגון בדיקות זיהומיות או ניתוח גנומי.
- ערך אסטרטגי: תומך במוכנות לסריקה על ידי מתן אפשרות להשוואה מהירה בין מסננים אלקטרופוזיטיביים (זכוכית/צלולוז לעומת ננו-אלומינה/זכוכית) ובין טכניקות ריכוז משניות (celite לעומת פלוקולציה אורגנית).
מחקר תרגומי ופרה-קליני
- ערך מדעי: משתמש באדנו-וירוס אנושי כמודל רלוונטי למחלה להערכת ביצועי שיטות ריכוז, ובכך תומך בפיתוח ביומרקרים תרגומיים עבור פתוגנים המועברים במים.
- ערך תפעולי: מספק רציפות משלב הגילוי ועד לאישוש פרה-קליני על ידי אספקת וירוס מרוכז המתאים לאפיון נוסף.
- ערך אסטרטגי: מסייע בקבלת החלטות קידום מותאמות סיכונים על ידי זיהוי שילובי סינון-אלוציה בעלי שיעור שחזור גבוה (מסנן תאית זכוכית עם תמצית בקר ב-pH 10 ו-sea light).
שילוב תהליכי עבודה וצנרת עיבוד
השיטה משתלבת ברצף הגילוי, החל מבדיקת השערות ראשונית ועד לזיהוי מובילים בגילוי פתוגנים סביבתיים, ומאפשרת חזרה מהירה על משתני ריכוז לפני המעבר לנפחים גדולים יותר.
- ביולוגיה של הגילוי: תומכת בבדיקת השערות לגבי משתני סינון ואלוציה כדי להבהיר את מנגנוני שחרור הנגיפים ממשטחים ולמקסם את יעילות השחזור.
- סקרינג: מספקת ריכוזי נגיפים מוכנים לבדיקה (5-30 mL) עם פלטים כמותיים (אחוז שחזור) להשוואת תנאים בין סוגי מסננים שונים ותוספי אלוציה.
- אנליטיקה: מאפשרת מדידה של משתנים תלויים (שחזור נגיפים באמצעות qPCR או זיהומיות) כדי להעריך סטטיסטית את השפעתם של משתנים בלתי תלויים (סוג המסנן, pH של האלוציה, גודל חלקיקי celite).
- מחקר תרגומי: מקשר להמשכיות פרה-קלינית על ידי אספקת adenoviruus מרוכז המתאים לאימות במערכי תרביות תאים או במודלים של בעלי חיים.
- שימוש חוזר ארגוני: מקריבה יכולת ניתנת לשימוש חוזר לאופטימיזציה של ריכוז נגיפים עבור יעדים ויראליים מרובים מעבר ל-adenovirus, ובכך מפחיתה פיתוח שיטות כפול.
השפעה תפעולית וארגונית
- ערך מדעי: מגביר את הביטחון החזוי בשיטות לשחזור נגיפים על ידי הפחתת עמימות מכניסטית באמצעות הערכה שיטית של פרמטרי סינון ואלוציה.
- ערך תפעולי: משפר את הסטנדרטיזציה והשחזוריות באמצעות שלבים מוגדרים (אלואציה עם תמצית בקר, ריכוז משני באמצעות sea light, התאמת pH ל-4.0) ונקודות סיום כמותיות (אחוזי שחזור של AdV40 ו-AdV41).
- ערך אסטרטגי: משפר החלטות של "המשך/עצור" (go/no-go) בפיתוח בדיקות לגילוי פתוגנים על ידי זיהוי תנאים אופטימליים (מסנן תאית זכוכית, תמצית בקר ב-pH 10, sea light) עם השחזור הגבוה ביותר שנצפה.
- השפעה על הפורטפוליו: תומך בתיעדוף מותאם סיכונים של שיטות ריכוז עבור תוכניות ניטור סביבתי, ובכך מפחית כשלים בשלבים מאוחרים בזרימות עבודה של זיהוי פתוגנים.
שיקולי יישום
- נדרשת מומחיות בוירולוגיה, בטכניקות סינון ובטיפול מדויק בנוזלים לצורך הוספה של נגיפים (virus spiking), הרכבת מסננים ושלבי צנטריפוגה.
- התהליך תלוי במיכשור הכולל מערכות סינון בוואקום, פלטות ערבוב, מדי pH, צנטריפוגות (מסוגלות להגיע ל-2,500 G ו-4,000 G), וכן צינורות סטריליים ומבחנות איסוף.
- נדרשת סטנדרטיזציה בין צוותים בהכנת התמיסות (תמצית בקר, celite, HCl, PBS) ובבקרות סביבתיות (צנטריפוגה ב-4°C, תנאים סטריליים) כדי להבטיח הדירות.
- השיטה דורשת שיקולי התאמה כאשר היא מיושמת על סוגי נגיפים שונים או מטריצות מים שונות, שכן יעילות השחזור עשויה להשתנות בהתאם למאפייני הנגיף (למשל, סרוטיפ של adenovirus) ולהרכב הדגימה (מי ברז לעומת מקורות סביבתיים).
- מגבלות מעשיות כוללות את הצורך בטכניקה אספטית במהלך הטיפול בנגיפים, ואפשרות לשונות בביצועי המסננים בין מנות שונות (lot-to-lot), מה שעלול להשפיע על עקביות האלוציה.
