Name: נוהל נפח קטן לריכוז נגיפי ממים (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-02-03T13:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 28 s
Description: למד שיטה לריכוז נגיפי אדנובירוס ממי ברז באמצעות מסנן זכוכית תאית וטכניקת ריכוז משני Sea Light. השיטה מאפשרת הערכה מהירה של משתני ריכוז בנפחים קטנים ומשפרת את שיעורי השחזור לעומת שיטות מסורתיות.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

אנו רוצים להודות לד"ר ניקולס ג' אשבולט ולד"ר ג' שי פוט על סקירת כתב היד.

1. הכנת כלי הזכוכית ומרכבי סינון <ol style="margin-left: 40px;;text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אלא אם צוין אחרת, לעקר את כל כלי הזכוכית, המארזים ופתרונות הסינון ב 121 מעלות צלזיוס במשך 15 דקות. כדי להבטיח סטריליות, לכסות את כל הפתחים או משטחים חשופים או עם רדיד אלומיניום או נייר מובטח קלטת לפני העיקור. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להרכיב מנגנון סינון על ידי הצמדת בית מסנן (קוטר 47 מ&quot;מ) לארלנמייר זרוע צד L 1. לאסוף מסננים הנדרשים: מסנני דיסק electropositive / אלקטרו-47 מ&quot;מ קוטר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן תמצית 1 L של 1.5% בשר בקר (flocculating; מייצר חלקיקי floc כאשר pH של תמיסה הוא הוריד ל -3.5, או שאינו flocculating; שלא מצטבר ב- pH 3.5), עם 0.05 מ &#39;גליצין, על ידי המסת 15 גרם של תמצית בשר בקר ב 1 ליטר של מים deionized והוספת 3.75 גליצין g. הערה: תמציות בשר בקר ללא flocculating תדרוש תוספת של celite לפני ריכוז שלישוני. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להוסיף polyph נתרן תוסף elutionosphate לתמצית בשר בקר בריכוז 0.1%. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף פתרון חומצה הידרוכלורית M 1, טיפה חכמה, לערבוב תמצית בשר בקר, פתרון pH לpH הרצוי. תמצית בשר בקר החיטוי במשך 15-30 דקות ב 121 מעלות צלזיוס. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> למדוד 0.1 גרם של קנס, בינוני, או celite חלקיקים הגדול (לשימוש עם תמצית בשר בקר שאינו flocculating בלבד). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן ואקום / יניקה על ידי הצמדת צינור תואם לבקבוק בצד זרוע Erlenmeyer ולשקע ואקום. </li></ol> 2. הכנת הפתרונות ומניות וירוס <ol style="margin-left: 40px;;text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן L 1 של 1 M HCl. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן L 1 של 1 M NaOH. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן פתרון PBS 1x (137 מ&quot;מ NaCl, 2.7 מ&quot;מ KCl, 1.47 מ&quot;מ K 2 PO 4, ו -4.3 מ&quot;מ לאא 2 PO 4). <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> התאם את ה- pH של 1x PBS ל 9.0 באמצעות 1 M NaOH. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן ולדלל מניות וירוס עד 10 4 5 -10 מספר הסביר ביותר (MPN) מיליליטר -1 ידי ערבוב 1 מיליליטר של מניית וירוס עם 9 מיליליטר של PBS (pH7), כפי שתואר לעיל 8,13. חנות ב -80 ° C בaliquots 1 מיליליטר. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לעקר מניות וירוס על ידי סינון מזרק (0.22 מיקרומטר גודל נקבובית) להסרת מזהמים פוטנציאליים. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Dechlorinated ברז <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מדד 1 ליטר של מים ברז סטרילי באמצעות סטרילי סיים גליל ויוצקים לתוך מבחנה המכילה 2 ליטר בר מערבבים מגנטי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להוסיף 0.7 גרם של נתרן תיוסולפט ומערבבים עד שגרגרים לפזר. התאם את ה- pH של מים ברז ל7-7.5 במידת הצורך באמצעות 1 M HCl או 1 פתרון M NaOH. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ספייק וירוס הפשרה (1 מיליליטר) ולהוסיף נפח שלם של ספייק לי 1 ליטר של מים ברז סטרילי dechlorinated. מערבבים במשך 10 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן ריק שיטה (מי ברז dechlorinated ללא אדנווירוס) עם כל ניסוי ותהליך באופן זהה למדגם ממוסמר. </li></ol></li></ol> 3. הכנת מכשירי סינון Millipore <ol style="margin-left: 40px;;text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר כיסוי סטרילי מעל בית מסנן. ודאהתאמה נכונה בין בית המסנן קערה עליונה ומסך מסנן נמוך כדי למנוע דליפה מדגם במהלך סינון. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר כיסוי סטרילי מבקבוק 1 ליטר Erlenmeyer. ודא שהפקק של יחידת המסנן מתאים בנוחות בפתח העליון של ארלנמייר, יצירת חותם טוב. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר קערה העליונה של יחידת מסנן מהמסך מסנן נמוך, ולמקם את מסנן electropositive דיסק 47 מ&quot;מ ישר מעל מסך עם מלקחיים סטרילית. צרף קערת בית מסנן למסך תחתון וננעלו במקומו על ידי סיבוב נגד כיוון השעון. </li></ol> 4. סינון מי ברז (ריכוז ראשי) <ol style="margin-left: 40px;;text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מדוד של וירוס 100 מיליליטר זינק ברז מים באמצעות סטרילי סיים גליל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> יוצקים של וירוס 100 מיליליטר זינק ברז מים לבית מסנן המכיל גם 47 מ&quot;מ זכוכית קפלים / מסנן תאית או מסנן סיבי דיסק ננו-אלומינה / זכוכית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מאפשר למים לעבור באיטיות דרך מסנן. החל ואקום עדין להסרת שאריות שנותרו oמים ברז ו ממשטח מסנן. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אם באמצעות טיפול טריפסין, להוסיף 5 מיליליטר של טריפסין 0.25% לסינון שטח ודגירה של 5 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף טריפסין ממשטח מסנן באמצעות 50 מיליליטר של מים סטריליים deionized. </li></ol> 5. Elution וירוס ממסנן <ol style="margin-left: 40px;;text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר בית מסנן מבקבוק 2 ליטר Erlenmeyer, והנח על בקבוק 250 מיליליטר בצד זרוע. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מדוד של תמצית בשר בקר 100 מיליליטר באמצעות סיים גליל. לאט לאט לשפוך של תמצית בשר בקר 100 מיליליטר לבית מסנן. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאפשר לתמצית בשר בקר לשפוך דרך מסנן, לכידת תמצית בשר בקר ב( 250 מיליליטר) בקבוק קטן Erlenmeyer. החל ואקום למשוך באמצעות תמצית בשר בקר שייר ממסנן. </li></ol> 6. ריכוז משני Celite <ol style="margin-left: 40px;;text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צלוחיות העברה המכילות וירוסי eluted לצלחת ומערבבים. להוסיף בר סטרילי מגנטי מערבבים ומניחים על צלחת ומערבבים, ערבוב כדי ליצור מערבולת קלה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להוסיף 0.1 גרם של celiteאבקה לתמצית בשר בקר 100 מיליליטר ולאפשר celite להתפזר. הנח בדיקה pH סטרילי לתוך תמצית בשר בקר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להוסיף טיפה חכמה 1 M HCl לתמצית בשר בקר להשיג pH 4.0. לאפשר לערבב לאט במשך 10 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים 47 מ&quot;מ מראש מסנן על בית מסנן (כפי שתואר לעיל) באמצעות בקבוק 2 ליטר Erlenmeyer. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> יוצקים 100 מיליליטר תמצית בשר בקר / תערובת celite מעל לפני מסנן. לאפשר לתמצית בשר בקר לשפוך דרך. החל ואקום קל למשוך דרך לחלץ בשר שייר ממסנן. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הנח קליפ צינור מתכת בסוף זרבובית בית המסנן. צרף צינור איסוף פוליפרופילן סטרילי 15 מיליליטר לקליפ צינור מתכת. הנח בית מסנן בחזרה לארלנמייר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 5 מיליליטר של חיץ 1x PBS, pH 9.0 מעל celite נאסף על קדם-מסנן. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאפשר PBS לטפטף דרך קדם-מסנן. החל ואקום קל למשוך דרך PBS שייר ל -15 מיליליטר צינור איסוף. </li></ol> ריכוז משני הפתתה אורגנית 7. <ol style="margin-left: 40px;;text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl">העבר את הכוסות המכילות את נגיף eluted לצלחת ומערבבים. להוסיף בר ומערבב מגנטי סטרילי של תמצית בשר בקר 100 מיליליטר ומערבבים כדי ליצור מערבולת קלה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הנח בדיקה pH סטרילי לתוך תמצית בשר בקר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 1 טיפת M HCl חכמה תמצית בשר בקר ולהתאים את ה- pH 3.5. לערבב למשך 30 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> יוצקים את eluate לתוך 250 מיליליטר צינורות חרוטי צנטריפוגה ו צנטריפוגות ב 2500 XG במשך 15 דקות ב 4 מעלות צלזיוס. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> יוצקים את טיפול לקיחת supernatant לא לא לשבש את גלולה. Resuspend גלולה ב 5 מיליליטר של 1x PBS, pH 9. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צנטריפוגה ההשעיה ב 4000 XG במשך 10 דקות ב 4 מעלות צלזיוס. יוצקים את supernatant וזורקים את הכדור. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> התאם את ה- pH ל7-7.5, מסנן לעקר באמצעות מסנן מזרק 0.22 מיקרומטר והקפאה ב -80 מעלות צלזיוס. </li></ol> 8. ויראלי חומצות גרעין Extraction <ol style="margin-left: 40px;;text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחלץ חומצות גרעין נגיפיות באמצעות ערכה מסחרית מתאימה בהתאם להוראות יצרן. </li></ol> &lt;class = &quot;jove_title&quot; p&gt; 9. עו&quot;ד 40/41 qPCR <ol style="margin-left: 40px;;text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש בצבעי יסוד ובדיקות, כמו גם תערובת תגובה ופרופילי רכיבה תרמית כפי שפורסם 8,13. הערה: מגבלה משוערת של גילוי עבור assay היא כ 5 יחידות qPCR לכל תגובה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוספת מרכיבי תערובות ההגברה PCR בריכוזים כדלקמן: 10 מ&quot;מ טריס (pH 8.3), 50 מ&quot;מ KCl, 4.5 מ&quot;מ MgCl 2, 10 מ&quot;מ dNTPs, 10 מיקרומטר פריימרים ובדיקת 1 מיקרומטר ו 0.5 μl של פולימראז כך שכמויות סופיות של 45 ניתן להוסיף μl למספר מתאים של בארות בצלחת תגובת 96-גם PCR. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עומס 45 μl של תערובת ההגברה PCR היטב כל אחד המתאים של 96-היטב, תגובה מהירה צלחת PCR. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 5 μl של DNA שחולץ מדגם לבארות מתאימות של צלחת PCR. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כיסוי צלחת עם כיסוי עמיד חותם חום, לסובב את הצלחת לעבור כל טיפות לתחתית בארות צלחת PCR. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מחזורי הגברה PCR קבעו כfollOWS: 95 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות, ואחרי 40 מחזורים של 95 מעלות צלזיוס למשך 15 שניות ו 60 מעלות צלזיוס במשך 1 דקות. </li></ol> 10. ניתוח נתונים <ol style="margin-left: 40px;;text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ניתוח מדידות בשלושה עותקים של דילולים פי 5 הסידוריים של הדגימות פורש 1: 5 ל -1: טווח 625 דילול כדי לקבוע את המספר הסביר ביותר (MPN) של החלקיקים הנגיפיים, כפי שתואר בעבר 8,13. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לנתח דילולים פי 5 סידוריים של קוצים ניסיוניים אדנווירוס פורש 1: 5 ל -1: מגוון 15625 דילול כדי לקבוע את המספר הסביר ביותר (MPN) של החלקיקים הנגיפיים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שימוש במחשבון EPA MPN (http://www.epa.gov/nerlcwww/online.html), להתאים את המחשבון לחשבון לסוג של דילול (1: 5 או 1:10), מספר דילולים ביצע, ומספר לשכפל דגימות סדרת דילול ב. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בצע כניסה 10 טרנספורמציה של הנתונים, ואחריו נרמול ליחידת הנפח (מיליליטר לדוגמא, 1, 100 מיליליטר, וכו &#39; </em&gt;). לחשב החלמה לניסוי נתון על ידי חלוקת מספר החלקיקים נגיפיים נוכחים במדגם מתרכז עם מספר החלקיקים הנגיפיים נוכחים בקוצים ניסיוניים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להעריך את ההשפעה של המשתנים הניסיוניים השונים (למשל, סוגים שונים celite, טווחי pH, סוגים שונים של מסנן וטכניקות ריכוז משניים שונות) על החלמה עו&quot;ד על ידי ביצוע בדיקות סטטיסטיות פרמטרית או אי-פרמטרית (למשל, מבחן t מזווג, אחד או שתיים -way ANOVA) בהתאם להתפלגות של הנתונים ועיצוב ניסיוני. </li></ol>

<ol><li>Sinclair, R. G., Jones, E. L., Gerba, C. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Viruses+in+recreational+water-borne+disease+outbreaks%3A+a+review%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Applied+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Viruses in recreational water-borne disease outbreaks: a review.</a> Journal of Applied Microbiology. 107, 1769-1780 (2009).</li>
<li>WHO. Guidelines for Safe Recreational Water Environments. , World Health Organization. Geneva. (2003).</li>
<li>Westrell, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Norovirus+outbreaks+linked+to+oyster+consumption+in+the+United+Kingdom%5BTitle%5D)+AND+%22Euro+Surveillance+%3A+Bulletin+Europeen+Sur+les+Maladies+Transmissibles+%3D+European+Communicable+Disease+Bulletin%22%5BJournal%5D)">Norovirus outbreaks linked to oyster consumption in the United Kingdom.</a> Euro Surveillance : Bulletin Europeen Sur les Maladies Transmissibles = European Communicable Disease Bulletin. 15, Norway, France, Sweden and Denmark. (2010).</li>
<li>Wong, K., Fong, T. T., Bibby, K., Molina, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Application+of+enteric+viruses+for+fecal+pollution+source+tracking+in+environmental+waters%5BTitle%5D)+AND+%22Environment+International%22%5BJournal%5D)">Application of enteric viruses for fecal pollution source tracking in environmental waters.</a> Environment International. 45, 151-164 (2012).</li>
<li>Cashdollar, J. L., Wymer, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Methods+for+primary+concentration+of+viruses+from+water+samples%3A+a+review+and+meta-analysis+of+recent+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Applied+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Methods for primary concentration of viruses from water samples: a review and meta-analysis of recent studies.</a> Journal of Applied Microbiology. 115, 1-11 (2013).</li>
<li>Ikner, L. A., Soto-Beltran, M., Bright, K. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((New+method+using+a+positively+charged+microporous+filter+and+ultrafiltration+for+concentration+of+viruses+from+tap+water%5BTitle%5D)+AND+%22Applied+and+Environmental+Microbiology%22%5BJournal%5D)">New method using a positively charged microporous filter and ultrafiltration for concentration of viruses from tap water.</a> Applied and Environmental Microbiology. 77, 3500-3506 (2011).</li>
<li>Karim, M. R., Rhodes, E. R., Brinkman, N., Wymer, L., Fout, G. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((New+electropositive+filter+for+concentrating+enteroviruses+and+noroviruses+from+large+volumes+of+water%5BTitle%5D)+AND+%22Applied+and+Environmental+Microbiology%22%5BJournal%5D)">New electropositive filter for concentrating enteroviruses and noroviruses from large volumes of water.</a> Applied and Environmental Microbiology. 75, 2393-2399 (2009).</li>
<li>McMinn, B. R., Cashdollar, J. L., Grimm, A. C., Fout, G. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+the+celite+secondary+concentration+procedure+and+an+alternate+elution+buffer+for+the+recovery+of+enteric+adenoviruses+40+and+41%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Virological+Methods%22%5BJournal%5D)">Evaluation of the celite secondary concentration procedure and an alternate elution buffer for the recovery of enteric adenoviruses 40 and 41.</a> Journal of Virological Methods. 179, 423-428 (2012).</li>
<li>Katzenelson, E., Fattal, B., Hostovesky, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Organic+flocculation%3A+an+efficient+second-step+concentration+method+for+the+detection+of+viruses+in+tap+water%5BTitle%5D)+AND+%22Applied+and+Environmental+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Organic flocculation: an efficient second-step concentration method for the detection of viruses in tap water.</a> Applied and Environmental Microbiology. 32, 638-639 (1976).</li>
<li>Fout, G. S., Schaefer, F. W. 3rd, Messer, J. W., Dahling, D. R. ICR microbial laboratory manual. 178, US Environmental Protection Agency. Washington, D.C. (1996).</li>
<li>Calgua, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+and+application+of+a+one-step+low+cost+procedure+to+concentrate+viruses+from+seawater+samples%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Virological+Methods%22%5BJournal%5D)">Development and application of a one-step low cost procedure to concentrate viruses from seawater samples.</a> Journal of Virological Methods. 153, 79-83 (2008).</li>
<li>Calgua, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detection+and+quantification+of+classic+and+emerging+viruses+by+skimmed-milk+flocculation+and+PCR+in+river+water+from+two+geographical+areas%5BTitle%5D)+AND+%22Water+Research%22%5BJournal%5D)">Detection and quantification of classic and emerging viruses by skimmed-milk flocculation and PCR in river water from two geographical areas.</a> Water Research. 47, 2797-2810 (2013).</li>
<li>McMinn, B. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimization+of+adenovirus+40+and+41+recovery+from+tap+water+using+small+disk+filters%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Virological+Methods%22%5BJournal%5D)">Optimization of adenovirus 40 and 41 recovery from tap water using small disk filters.</a> Journal of Virological Methods. 193 (2), 284-290 (2013).</li>
<li>Brinkman, N. E., Haffler, T. D., Cashdollar, J. L., Rhodes, E. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+methods+using+celite+to+concentrate+norovirus%2C+adenovirus+and+enterovirus+from+wastewater%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Virological+Methods%22%5BJournal%5D)">Evaluation of methods using celite to concentrate norovirus, adenovirus and enterovirus from wastewater.</a> Journal of Virological Methods. 193, 140-146 (2013).</li>
<li>Albinsson, B., Kidd, A. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adenovirus+type+41+lacks+an+RGD+alpha%28v%29-integrin+binding+motif+on+the+penton+base+and+undergoes+delayed+uptake+in+A549+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Virus+Research%22%5BJournal%5D)">Adenovirus type 41 lacks an RGD alpha(v)-integrin binding motif on the penton base and undergoes delayed uptake in A549 cells.</a> Virus Research. 64, 125-136 (1999).</li>
<li>He, C., Lian, J. S., Jiang, Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electronic+structures+and+hydrogen+bond+network+of+high-density+and+very+high-density+amorphous+ices%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Physical+Chemistry.+B%22%5BJournal%5D)">Electronic structures and hydrogen bond network of high-density and very high-density amorphous ices.</a> The Journal of Physical Chemistry. B. 109, 19893-19896 (2005).</li>
<li>Sedmak, G., Bina, D., Macdonald, J., Couillard, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nine-year+study+of+the+occurrence+of+culturable+viruses+in+source+water+for+two+drinking+water+treatment+plants+and+the+influent+and+effluent+of+a+Wastewater+Treatment+Plant+in+Milwaukee%2C+Wisconsin%5BTitle%5D)+AND+%22%22%5BJournal%5D)">Nine-year study of the occurrence of culturable viruses in source water for two drinking water treatment plants and the influent and effluent of a Wastewater Treatment Plant in Milwaukee, Wisconsin.</a> 71, 1042-1050 (2005).</li>
<li>Soto-Beltran, M., Ikner, L. A., Bright, K. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effectiveness+of+poliovirus+concentration+and+recovery+from+treated+wastewater+by+two+electropositive+filter+methods%5BTitle%5D)+AND+%22Food+and+Environmental+Virology%22%5BJournal%5D)">Effectiveness of poliovirus concentration and recovery from treated wastewater by two electropositive filter methods.</a> Food and Environmental Virology. 5, 91-96 (2013).</li>
<li>Haramoto, E., Katayama, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Application+of+acidic+elution+to+virus+concentration+using+electropositive+filters%5BTitle%5D)+AND+%22Food+and+Environmental+Virology%22%5BJournal%5D)">Application of acidic elution to virus concentration using electropositive filters.</a> Food and Environmental Virology. 5, 77-80 (2013).</li>
<li>Lee, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+electropositive+filtration+for+recovering+norovirus+in+water%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Water+and+Health%22%5BJournal%5D)">Evaluation of electropositive filtration for recovering norovirus in water.</a> Journal of Water and Health. 9, 27-36 (2011).</li>
<li>Gibbons, C. D., Rodriguez, R. A., Tallon, L., Sobsey, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+positively+charged+alumina+nanofibre+cartridge+filters+for+the+primary+concentration+of+noroviruses%2C+adenoviruses+and+male-specific+coliphages+from+seawater%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Applied+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Evaluation of positively charged alumina nanofibre cartridge filters for the primary concentration of noroviruses, adenoviruses and male-specific coliphages from seawater.</a> Journal of Applied Microbiology. 109, 635-641 (2010).</li>
<li>Hill, V. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+a+rapid+method+for+simultaneous+recovery+of+diverse+microbes+in+drinking+water+by+ultrafiltration+with+sodium+polyphosphate+and+surfactants%5BTitle%5D)+AND+%22Applied+and+Environmental+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Development of a rapid method for simultaneous recovery of diverse microbes in drinking water by ultrafiltration with sodium polyphosphate and surfactants.</a> Applied and Environmental Microbiology. 71, 6878-6884 (2005).</li>
<li>Polaczyk, A. L., Roberts, J. M., Hill, V. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+1MDS+electropositive+microfilters+for+simultaneous+recovery+of+multiple+microbe+classes+from+tap+water%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Microbiological+Methods%22%5BJournal%5D)">Evaluation of 1MDS electropositive microfilters for simultaneous recovery of multiple microbe classes from tap water.</a> Journal of Microbiological Methods. 68, 260-266 (2007).</li>
<li>Rhodes, E. R., Hamilton, D. W., See, M. J., Wymer, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+hollow-fiber+ultrafiltration+primary+concentration+of+pathogens+and+secondary+concentration+of+viruses+from+water%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Virological+Methods%22%5BJournal%5D)">Evaluation of hollow-fiber ultrafiltration primary concentration of pathogens and secondary concentration of viruses from water.</a> Journal of Virological Methods. 176, 38-45 (2011).</li>
<li>Melnick, J. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Round+robin+investigation+of+methods+for+the+recovery+of+poliovirus+from+drinking+water%5BTitle%5D)+AND+%22Applied+and+Environmental+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Round robin investigation of methods for the recovery of poliovirus from drinking water.</a> Applied and Environmental Microbiology. 47, 144-150 (1984).</li>
<li>Schwab, K. J., De Leon, R., Sobsey, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Concentration+and+purification+of+beef+extract+mock+eluates+from+water+samples+for+the+detection+of+enteroviruses%2C+hepatitis+A+virus%2C+and+Norwalk+virus+by+reverse+transcription-PCR%5BTitle%5D)+AND+%22Applied+and+Environmental+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Concentration and purification of beef extract mock eluates from water samples for the detection of enteroviruses, hepatitis A virus, and Norwalk virus by reverse transcription-PCR.</a> Applied and Environmental Microbiology. 61, 531-537 (1995).</li>
</ol>

אין אינטרסים פיננסיים מתחרים. 
הדעות המובעות במאמר זה הן של המחברים ואינן משקפות בהכרח את העמדות או המדיניות של הסוכנות להגנת הסביבה האמריקאית. אזכור שמות מסחריים או מוצרים מסחריים אינו מהווה אישור או המלצה לשימוש.

מסנני electropositive שימושיים בריכוז וירוסים ממים; עם זאת מסננים אלה יכולים להיות שונים במבנה שלהם ובהרכב אשר בתורו יכול לשנות את האפקטיביות שלהם. ההרכבה בעיה זו, מבני קפסיד וחיובים משתנים בין זני וירוס הדורשים טכניקות ריכוז להיות מותאמות כדי להבטיח התאוששות אופטימלית 15. באמצעות שינויים פשוטים של טכניקות ריכוז הקיימות (למשל, מסנני electropositive, elution תמצית בשר בקר), ריכוז יעיל יותר של וירוסי היעד יכול להיות מושגת 16,17. <p class="jove_cont...

וירוסי enteric אדם הם סוכני סיבה חשובים של מחלות המועברות במי 1-3, אבל הם בדרך כלל נוכחים במספרים נמוכים במים המזוהמים סביבתיים, מה שהופך את איתורם קשה בלי ריכוז. נהלים המשמשים להתרכז וירוסים כוללים בדרך כלל שלב סינון, ואחריו elution מסנן, וריכוז המשני של eluate המסנן. הליך סינון נפוץ מסתמך על שימוש בממברנות טעונות כגון מסנני electropositive (נבדקו לאחרונה 4,5). מסננים אלה מסתמכים על לכידת וירוסים תלויים במים באמצעות אינטראקציות אלקטרוסטטיות בין משטח המסנן (מטען חשמלי חיובי) וחלקיקי נגיף ממוקדים (מטען שלילי). שני מסננים electropositive כי הם זמינים באופן מסחרי להסתמך על טכנולוגיה זו, מסנני זכוכית / תאית וננו-אלומינה / סיבי זכוכית. עלויות פילטר זכוכית / תאית הן עד 10 פעמים כי ננו-אלומינה / סיבי הזכוכית, המגבילות את השימוש בזכוכית / ceמסנני llulose לניטור וירוס שיגרתי. מחקרים שנעשו לאחרונה הגיעו למסקנה הבדלים הם נומינליים בין שני מסננים אלה בהתאוששות של enteroviruses מ6,7 מים הסביבה, המצדיקים את השימוש בחלופה זולה יותר מסנן. אפשרויות סינון נוספות כגון מסנני אלקטרו וזכוכית צמר נחקרו, לעומת זאת, הם גם דורשים הטיפול המקדים של מים מקור (מסנני אלקטרו) או אינם זמינים באופן מסחרי (מסנני זכוכית צמר). הפיתוח של נהלי ריכוז וירוס בעיקר התמקד אופטימיזציה טכניקות ריכוז עיקריות (מסננים) על מנת לשפר את ההחלמה וירוס ממים. עם זאת, הליכי ריכוז משניים, המקטין את הנפח של eluant בדרך כלל מL 1 למיליליטר כרכים, יכולים גם להיות השפעה משמעותית על החלמה וירוס 8. ריכוז המשני של וירוסי enteric בדרך כלל מסתמך על סוכן flocculating כגון סוגים מסוימים של תמצית בשר בקר (floccu האורגניlation) או הפתתה חלב דל שומן 9-12 להסיר חלקיקי נגיף ממשטחי מסנן. לאחרונה, עוד הליך ריכוז המשני באמצעות תמצית בשר יחד עם התוספת של celite (חלקיקים קטנים) הראה הבטחה לשחזור אדנווירוס, enterovirus, וnorovirus 8,13,14. עבודות ריכוז Celite תחת עקרונות דומים לזה של שיטת הפתתה האורגנית שבחלקיקי הווירוס לצרף ולמשתחררות מחלקיקים (floc או celite) על ידי שינוי pH של תמיסת ההשעיה. השוואות בין שתי טכניקות ריכוז המשניות אלה הוערכו בהתאוששות של אדנווירוס ממוסמר סוגים (עו&quot;ד) 40 ו -41 8. מחקר זה הגיע למסקנה כי שתי טכניקות הריכוז המשניות היו סטטיסטיים דומות בהתאוששות של אדנו-וירוסים. עם זאת, שיטת הפתתה האורגנית דורשת 30 דקות. דגירה ב- pH 3.5, ואילו טכניקת celite דורשת דגירה קצרה יותר (10 דקות) ב- pH 4.0. Flocculat האורגנייון מחייב גם שימוש בציוד יקר מעבדה (צנטריפוגות) כדי לאסוף חלקיקי floc במהלך ריכוז שלישוני, טכניקת celite בניגוד משתמשת בציוד בסיסי בלבד מעבדה (סינון ואקום) כדי להפריד בין חלקיקי celite מהשעיה. שילובים מסוימים של מסננים וטכניקות elution המשניות יכולים להשפיע גם על החלמה וירוס. מחקר אחד למסקנה כי שילובים מסוימים של (מסנני electropositive) ראשוניים ומשניות טכניקות ריכוז (celite או הפתתה אורגנית) היו השפעה משמעותית של התאוששות של אדנו-וירוס 13. ממצאים אלה מראים כי אופטימיזציה נדרשת על מנת להתאושש בצורה אופטימלית וירוס יעד ממטריצת מים שניתנו בעת השימוש בטכניקות אלה. אופטימיזציה היא זמן רב, חוקרים רבים תהליך מפרך באופן פעיל להימנע מאז משתנים רבים יוערכו (סוג המסנן / מותג, פתרון elution pH, celite / הפתתה אורגנית). לשם כך זהTudy, הליך פותח כדי לזהות תנאים אופטימליים לריכוז וירוס ממים באמצעות אדנווירוס אדם ממוסמר זני 40 ו 41. יש להניח, שכן כל סוג וירוס מציג מורפולוגיה קפסיד ייחודית ותשלום קפסיד ספציפי, פרוטוקולי ריכוז עשויים צריכים להיות מותאמים לכל וירוס היעד כדי להשיג התאוששות ויראלי אופטימלית. מחקר זה מספק גישה לעו&quot;ד 40 ו -41 על ידי ריכוז: 1) הערכת החלמה וירוס במים ברז באמצעות תקליטורי electropositive מסנן ואחריו 2) הערכה של שיטת הפתתה אורגנית הוקמה לעומת טכניקת celite כריכוז משנית, ו 3) הערכה מאגרי elution לריכוז שלישוני.

<table><tbody><tr><td>מלאי אדנו-וירוס 40 ATCC</td><td></td><td>VR-931</td><td></td></tr><tr><td>אדנו-וירוס 41 מלאי</td><td>ATCC</td><td>VR-930</td><td></td></tr><tr><td>נתרן תיוסולפט</td><td>פלוקה כימיקל ושות'</td><td>72051</td><td></td></tr><tr><td>Celites #577</td><td>Fluka כימיקלים ושות'</td><td>22142</td><td></td></tr><tr><td>NanoCeram 47 מ"מ</td><td>Argonide</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>1MDS 47 מ"מ</td><td>3M</td><td>6408502</td><td></td></tr><tr><td>AP-20 Prefilter 47 מ"מ</td><td>Millipore Corp.</td><td></td><td></td>AP2004700</tr><tr><td>גליצין&nbsp;</td><td>סיגמא</td><td>50046-1KG</td><td></td></tr><tr><td>נתרן פוליפוספט</td><td>אקרוס אורגני</td><td>390930010</td><td></td></tr><tr><td>טריפסין</td><td>גיבקו</td><td>25200</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>סיגמא</td><td>P5368</td><td></td></tr><tr><td>חומצה הידרוכלורית</td><td>פישר</td><td>A481-212</td><td></td></tr><tr><td>תמצית בקר BBL</td> BD <td>Biosciences</td><td>212303</td><td></td></tr><tr><td>תמצית בקר דיפקו</td><td>BD Biosciences</td><td>211520</td><td></td></tr><tr><td>ABI 7900 מערכת PCR בזמן אמת</td><td>ABI</td><td>N / A</td><td></td></tr><tr><td>דיור מסנן נירוסטה</td><td>Millipore Corp.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>XX2004720 ערכת מיצוי DNA בדם</td><td>Qiagen&nbsp;</td><td>51104</td><td></td></tr><tr>מחשבון <td></td><td></td><td>MPN EPA</td><td>http://www.epa.gov/nerlcwww/online.html</td></tr></tbody></table>

נוהל נפח קטן לריכוז נגיפי ממים

A Small Volume Procedure for Viral Concentration from Water

ריכוז בקנה מידה קטן של וירוסים (נפחי דגימה 1-10 ליטר, כאן מדומה עם דגימות מים של 100 מ"ל) הוא דרך יעילה וחסכונית לזהות פרמטרים אופטימליים לריכוז הנגיף. ניתן לרכז וירוסים ממים באמצעות סינון (אלקטרופוזיטיבי, אלקטרושלילי, צמר זכוכית או אי הכללת גודל), ולאחר מכן ריכוז משני עם תמצית בקר לשחרור וירוסים ממשטחי המסנן, ולבסוף ריכוז שלישוני וכתוצאה מכך תרכיז וירוסים בנפח 5-30 מ"ל. על מנת לזהות הליכי ריכוז אופטימליים, הוערכו שני מסננים אלקטרו-חיוביים שונים (מסנן זכוכית/תאית [1MDS] ומסנן ננו-אלומינה/זכוכית [NanoCeram]), כמו גם טכניקות ריכוז משניות שונות; טכניקת הסליט שבה הוערכו שלושה גדלים שונים של חלקיקי צלייט (עדינים, בינוניים וגדולים) ואחריה השוואה טכניקה זו לזו של שיטת הפלוקולציה האורגנית הממוסדת. תוספי פליטה שונים הוערכו גם ביכולתם לשפר את שחרור חלקיקי אדנו-וירוס (AdV) ממשטחי המסנן. צלייט חלקיקים עדינים החזיר רמות דומות של AdV40 ו-41 לזו של שיטת הפלוקולציה האורגנית המבוססת כאשר נוספו קוצים נגיפיים במהלך הריכוז המשני. מסנן הזכוכית/תאית החזיר רמות גבוהות יותר של שניהם, AdV40 ו-41, בהשוואה לזה של מסנן ננו-אלומינה/סיבי זכוכית. למרות שלא הייתה מובהקת סטטיסטית, תוספת של 0.1% נתרן פוליפוספט תמצית בקר מתוקנת eluant החזירה 10% יותר חלקיקי AdV בהשוואה לתמצית בקר לא מתוקנת.

<html> בחירת Celite שלושה סוגים שונים של celite נבדקו לפני הבחירה של גרסת הביצועים הטובה ביותר. Celites עם קנס לחלקיקים בגודל בינוני המיוצר על ההחלמה אדנווירוס הגבוהה ביותר. השימוש בcelites הגדול הביא להחלמה נמוכה יותר עבור שניהם AdV40 ו -41 (טווח של 32% -100%) (איור 1). החלמה הממוצעת של אדנווירוס 40 היו 144% ± 52% (קנס), 115% ± 28% (בינוני) ו- 82% ± 53% celites חלקיקים (גדולים) ולAdV41, 132% ± 39...

פותחה גישה לזיהוי תנאי ריכוז נגיפי אופטימליים עבור דגימות מים בנפח קטן באמצעות קוצים של אדנו-וירוס אנושי. הטכניקות המתוארות כאן משמשות לזיהוי פרמטרי ריכוז עבור מטרות נגיפיות אחרות, ומיושמות על ניסויים בריכוז נגיפי בקנה מידה גדול.

Small-scale concentration of viruses (sample volumes 1-10 L, here simulated with spiked 100 ml water samples) is an efficient, cost-effective way to ...

המטרה הכללית של הניסוי הבא היא למטב את השחזור של נגיפים ממים באמצעות טכניקה בקנה מידה קטן שתוכננה במקור כדי למטב ריכוזים של נגיפים. נמצא כי מסנן תאית זכוכית הוא המסנן האלקטרופוזיטי הטוב ביותר לריכוז adenovirus ממים. עבור האלוציה המשנית, טכניקת ריכוז משנית באמצעות celite הוכחה כטובה ביותר לאלוציית adenovirus מפני השטחי המסנן. הטכניקה שהתקבלה משחזרת את הכמות הגבוהה ביותר של adenovirus ממי ברז, בהתבסס על אחוזי השחזור הגבוהים ביותר שנצפו מבין כל השילובים שנבחנו של מסננים ואלוציות.היתרון המרכזי של טכניקה זו על פני שיטות קיימות, כגון ריכוז של נפחים גדולים, הוא שהיא משתמשת בנפחי דגימה קטנים יותר, מה שמאפשר להעריך מספר רב של משתני ריכוז במהירות ובקלות.בעת ההכנה לפרוטוקול זה, יש להכין מראש את כל התמיסות הדרושות, כולל תמיסת הויראלי שהסננה דרך פילטר של 0.22 micron בריכוז של 10 עד 100,000 MPN למילליליטר.התחילו במדידה של ליטר של מי ברז סטריליים. העבירו אותם לכוס כימיאית בנפח של שני ליטר עם מגנט ערבוב. תוך כדי ערבוב המים, הוסיפו 0.7 גרם של sodium thiosulfate והמתינו להמסה מלאה. לאחר מכן, כווןו את ה-pH לטווח שבין 7 ל-7.5 על ידי הוספה של תמיסות מרוכזות של חומצה או בסיס בריכוז one molar בטיפות. בשלב הבא, זרקו את המים בנגיף. הוסיפו מיליליטר מלא של תמיסת הנגיף שהוכנה. כסו את הבקרה בעטיפה סטרילית והניחו לנגיף להתערבב במים למשך 10 דקות.בינתיים, הכינו את מסנן המילוپور (Millipore). ראשית, הוציאו אותו מאריזתו, וודאו שהוא מותאם במיגון הדוק בין הכלי העליון למסך התחתון. לאחר מכן, בדקו שחומר השעם שבמסנן מתאים באופן הדוק לשפת בקבוק עם זרוע צד (sidearm flask) בנפח של one liter. כעת הסירו את הכלי העליון של המסנן ובעזרת פינצטה, הניחו דיסק סינון אלקטרופוזיטיבי בקוטר 47 millimeter בצורה מדויקת על מסך הסינון. לאחר מכן, חברו מחדש את הכלי ונעלו אותו במקומו באמצעות סיבוב נגד כיוון השעון.מדוד 100 milliliters של מי ברז עם תוספת (spiked) באמצעות משורה סטרילית. לאחר מכן, העבר את המים למעטפת המסנן שהוכנה על מבחנה בנפח שני ליטר. הדיסקה החיובית-חשמלית במסנן עשויה להיות זכוכית-צלולוז מקפלת או סיב זכוכית ננו-אלומינה. ניתן להשתמש בואקום עדין כדי להעביר את שאריות המים דרך המסנן.כעת, העבירו את בית המסנן לבקבוק עם זרוע צד בנפח 250 milliliter. מדדו 100 milliliters של תמצית בקר ושפכו אותה באיטיות על המסנן. אפשרו לתמצית לעבור באיטיות והשתמשו בואקום עדין כדי לשאוב את השאריות.לאחר מכן, המשיכו עם אחת משתי האפשרויות לריכוז משני.כדי לרכז את הווירוס באמצעות celite, העבירו את תכולת הבקבוק בנפח 250 milliliter, המכילה את הווירוס, אל מעמדו של מערבל מגנטי. בעזרת מוט ערבוב, צרו מערבולת קטנה. לאחר מכן, הוסיפו 0.1 grams של אבקת celite ל-100 milliliters של תמצית בקר. המתינו לפיזור ה-celite והכינו את הפתרון לכיוון ה-ph. באמצעות הוספה טיפית של חומצה כלורית 0.1 molar, הנמיכו את ה-pH ל-4.0.לאחר מכן, יש להניח לתמיסה להתערבב במשך 10 דקות. תוך כדי הערבוב, חברו את מסנן הקדם בנפח 47 מיליליטר לבקרה של שני ליטר. כעת, שפכו 100 מיליליטר מתערובת תמצית הבקר-celite דרך מסנן הקדם. ניתן להשתמש בואקום קל כדי להשלים את התהליך.כעת הצמד תסבוב מתכת לקצה פיית בית המסנן. לתסבוב חבר מבחנת איסוף סטרילית מפּוליפרופילן בנפח 15 milliliters ולאחר מכן הרכב מחדש את המסנן על הבקבוק.כעת אלוטו את הווירוס מחלקיקי ה-Celite בחמישה מיליליטר של 1X PBS ב-pH 9. אפשרו למרבית ה-PBS לטפטף לתוך מבחנה של 15 מיליליטר באמצעות כבידה, ושאבו את השאריות בעזרת ואקום קל. כדי לרכז את הווירוס באמצעות פלוקולציה אורגנית, העבירו את תכולת הבקראק של 250 מיליליטר המכילה את הווירוס למערך ערבוב מגנטי. בעזרת מוט ערבוב, צרו מערבולת קטנה. התאימו את ה-pH של התמיסה ל-3.5 באמצעות הוספה טיפית של חומצה כלורית בריכוז 1M. לאחר מכן, השאירו את התערובת לערבוב למשך חצי שעה. בהמשך, העבירו את התמיסה למבחנה צנטריפוגית קונית סטרילית של 250 מיליליטר. צנטריפוגו את התמיסה ב-2,500 g למשך 15 דקות בטמפרטורה של 4°C. לאחר הצנטריפוגה, היזהרו לא להפר את המשקע בעת הטיפול במבחנות. שפכו בזהירות את העילאי וסספנדו מחדש את המשקע בחמישה מיליליטר של PBS ב-pH 9. ודאו שהמשקע מומס. לאחר מכן, צנטריפוגו את הסספנדציה ב-4,000 g למשך 10 דקות בטמפרטורה של 4°C. כעת אספו את העילאי המכיל את הווירוס המרוכז. ניתן להשליך את המשקע.במהלך אופטימיזציה של פרוטוקול זה, הושוו שלושה סוגי celite. celite גס יותר הוביל להשבה נמוכה יותר הן של ADV 40 והן של ADV 41.בדיקת אלוציית המסנן בוצעה ב-pH שבין 7.5 ל-12 כדי לקבוע איזה ערך יהיה היעיל ביותר לאיסוף חלקיקי ADV מהמסננים. ההשבה הגבוהה ביותר התקבלה ממסנן זכוכית-צלולוז בשילוב עם תמצית בקר ב-pH 10 ועם celite. התוצאה הייתה זהה עבור ADV 40 ו-ADV 41.תמצית בקר ב-pH 10 הוכחה כעדיפה על פני פלוקולציה אורגנית.השיטה המותאמת הושוותה להוספה של 25% טריפסין ולהשלמה של תמצית הבקר ב-0.1% נתרשן פוליפוספט. אף אחד מהטיפולים לא שיפר באופן מובהק את השחזור של ADV.לאחר השליטה בטכניקה, ניתן לבצע אותה בתוך 45 דקות אם היא מבוצעת כראוי.

a-small-volume-procedure-for-viral-concentration-from-water

Research

JoVE Journal

Environment

סביבה

כדי להפוך את lentiviruses, וקטורים DNA הם transfected 293 לתוך תאים אנושיים. לאחר הקציר ריכוז supernatant, titer וירוס נקבעת על ידי ביטוי פלואורסצנציה עם cytometer זרימה.

Lentivirus הפקה

שיעור התחלופה של וירוסים במערכות ימיים מים מתוקים ניתן לאמוד על ידי ירידה וטכניקה הישנותם. הנתונים לאפשר לחוקרים להסיק ששיעורי התמותה וירוס בתיווך של חיידקים במערכות מים.

הערכת הפקה חליפין וירוס במערכות Aquatic

צמר זכוכית מסננים שימשו לרכז וירוסים waterborne על ידי מספר קבוצות מחקר ברחבי העולם. כאן אנו מצביעים על גישה פשוטה לבניית צמר זכוכית מסננים ולהפגין המסננים הם גם יעילים ריכוז waterborne ויראליים, גורמי מחלה חיידקיים protozoan.

צמר זכוכית מסננים וירוסים waterborne ריכוז פתוגנים zoonotic חקלאיים

Source: Nguyen, H., et al. Growth, Purification, and Titration of Oncolytic Herpes Simplex Virus. J. Vis. Exp. (2021)This video demonstrates the purification of an oncolytic virus from infected mammalian cell cultures using nuclease treatment, sequential centrifugation, membrane filtration, and sucrose cushion centrifugation.

 Oncolytic Virus Purification from Infected Mammalian Cells 

Source: Fout, G. S., Cashdollar, J. L. EPA Method 1615. Measurement of Enterovirus and Norovirus Occurrence in Water by Culture and RT-qPCR. II. Total Culturable Virus Assay. J. Vis. Exp. (2016)This video demonstrates the use of a total culturable virus assay to quantify infectious viruses in water samples. It outlines host cell inoculation, observation of cytopathic effect, and statistical quantification of infectious virus concentration.

Quantifying Infectious Viruses in Water Samples Using an In Vitro Total Culturable Virus Assay

שיטת EPA 1615 משתמשת במסנן אלקטרו-פוזיטיבי כדי לרכז אנטרו-וירוסים ונורו-וירוסים במי הסביבה ובמי השתייה. כתב יד זה מתאר את הליך איסוף הדגימות לניתוחי שיטה 1615.

EPA שיטת המדידה של 1615. Enterovirus ומופע norovirus במים על ידי תרבות וRT-qPCR. I. איסוף דגימות וירוסים

כאן, אנו מציגים פרוטוקול מקיף להערכת זמינות החומרים המזינים האורגניים והאנאורגניים ואת השפע והמבנה של קהילות מיקרוביאליות וויראליות בסביבות ימיות מרוחקות.

להתיר את השחקנים הנעלמת באוקיינוס ​​- מדריך שדה לכימיה מים והימי מיקרוביולוגיה

כאן אנו מציגים נוהל למדידת סך כל הנגיפים הניתנים לתרבית באמצעות קו תאי הכליה של הקוף הירוק של באפלו. הנוהל מספק כלי סטנדרטי למדידת הופעת נגיפים זיהומיים במי הסביבה ובמי השתייה.

מדידת שיטת EPA 1615. של enterovirus ואת מופע norovirus במים על ידי תרבות RT-qPCR. II. Assay וירוס culturable סה&quot;כ

כאן אנו מציגים את VirWaTest, המהווה שיטה פשוטה, במחיר סביר ונייד לריכוז ואיתור של וירוסים מדגימות המים בנקודת השימוש.

וירוטסט, נקודת שימוש לאיתור וירוסים בדגימות מים

ריכוז הנגיף מדגימות מים ושפכים סביבתיים הוא משימה מאתגרת, המתבצעת בעיקר לזיהוי וכימות נגיפים. בעוד מספר שיטות ריכוז וירוסים פותחו ונבדקו, אנו מדגימים כאן את היעילות של ultrafiltration ו flocculation חלב דל שומן עבור וירוסים RNA עם סוגי דגימה שונים.

ריכוז חלקיקי הנגיף מדגימות מים ושפכים סביבתיים באמצעות חלב דל שומן ואולטרה-סינון

וירוס הקשור באדנו מיוצר בתרבית תאי השעיה ומטוהר על ידי צנטריפוגה הדרגתית בצפיפות יודיקסנול כפולה. צעדים כלולים כדי להגדיל את התפוקה הכוללת של הנגיף, להקטין את הסיכון של משקעים וירוס, ועוד לרכז את המוצר הסופי של הנגיף. הטיטרים הסופיים הצפויים להגיע ל-1012 חלקיקים נגיפיים / מ"ל ומתאימים לשימוש פרה-קליני in vivo .

תרבית תרחיף ייצור וטיהור של וירוס הקשור לאדנו על ידי צנטריפוגת שיפוע צפיפות יודיקסנול עבור יישומי in vivo

למד שיטה לריכוז נגיפי אדנובירוס ממי ברז באמצעות מסנן זכוכית תאית וטכניקת ריכוז משני Sea Light. השיטה מאפשרת הערכה מהירה של משתני ריכוז בנפחים קטנים ומשפרת את שיעורי השחזור לעומת שיטות מסורתיות.

נוהל נפח קטן לריכוז נגיפי ממים

גלה סרטונים נוספים