Name: קופסית Serotyping של Streptococcus pneumoniae על ידי לאטקס התלכדות (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-09-25T00:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 11 s
Description: למד שיטת סרוטיפינג ל-Streptococcus pneumoniae באמצעות לאטקס התלכדות. טכניקה זו מאפשרת זיהוי מהיר ופשוט של זנים פנאומוקוקליים במעבדות אבחון קליניות.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

עבודה זו הייתה חלק מפרויקט PneuCarriage, שמומן על ידי קרן ביל ומלינדה גייטס בתרומת תוכנית התמיכה בתשתיות תפעוליות של ממשלת ויקטוריה.

.1 הכנת ריאגנטים לאטקס בבית <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכנת שנאגרו מלוח גליצין (GBS) <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 1.5 גליצין גרם, נתרן כלורי 11.7 גרם ושל מים מזוקקים 100 מ&quot;ל לכוס זכוכית 200 מ&quot;ל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מערבבים להמסה באמצעות stirrer מגנטי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העבר את התערובת ל500 מ&quot;ל מדידת צילינדר ולהוסיף מים מזוקקים כדי להפוך כולל של 200 מ&quot;ל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מעבירים את הפתרון בחזרה לכוס 200 מ&quot;ל, לבדוק את רמת החומציות ולהתאים ל8.2 עם הידרוקסיד 5 M נתרן. הערה: הידרוקסיד הנתרן הוא מאכל, ללבוש ציוד מגן אישי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> סנן לעקר את הפתרון באמצעות 0.22 מיקרומטר מסננים וכמה 60 מ&quot;ל מזרקים לתוך בקבוק זכוכית מ&quot;ל preautoclaved בורג כתרים 250. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחסן ב RT. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכנה של GBS עם 0.2% אלבומין בסרום שור <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוספת 0.2 גרם של אלבומין בסרום שור אבקה (BSA) ושל GBS 100 מ&quot;ל לכוס זכוכית 200 מ&quot;ל ולערבב לפזר באמצעות stirrer מגנטי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מסנןלעקר את הפתרון באמצעות 0.22 מיקרומטר מסננים באמצעות מספר מזרקים 60 מ&quot;ל לבקבוק זכוכית כתרים מ&quot;ל preautoclaved בורג 250. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חנות ב 4 ° C.. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכנה מגיב לאטקס <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לייבל 2 מ&quot;ל עגול צינור microfuge תחתון. הערה: סיבוב צינורות תחתון משמשות כדי למזער יישוב חלקיקים אשר עשוי להשפיע קובץ מצורף נוגדן. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעזרת פיפטה P1000 עם טיפים סטרילי להוסיף 975 μl של GBS לתוך צינור microfuge, ולאחר מכן להוסיף 25 μl של antiserum דלקת ריאות המתאים עבור מגיב הלטקס שמכין (כלומר, בריכה, קבוצה, סוג או גורם). הפוך חמש פעמים כדי לערבב. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מדולל חלקיקי לטקס פוליסטירן 01:10 ידי הוספת 120 μl של חלקיקי לטקס ל1,080 μl של תמיסת מלח פיסיולוגי סטרילי. הערה: זה יכול להתבצע בכמויות גדולות יותר, אבל צריך להיעשות טרי בכל פעם ריאגנטים הלטקס מיוצרים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוספת 1,000 μl של ההשעיה 01:10 לטקס (מוכנה בשלב 1.3.3) ל1,השעיה 000 μl 01:40 antiserum (מוכן בשלב 1.3.2). הפוך חמש פעמים כדי לערבב. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לדגור על 37 ° C על גלגל מסתובב לאט (לדוגמא, 4 סל&quot;ד גלגל בקוטר 38.5 סנטימטר) עבור שעה 2. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צנטריפוגה ל15 דקות ב 1,100 x גרם. בטל supernatant ועדינות resuspend גלולה ב2 מ&quot;ל של תמיסת מלח סטרילית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צנטריפוגה ל15 דקות ב 1,100 x גרם. בטל supernatant ולהוסיף 1 מ&quot;ל של GBS ובעדינות resuspend גלולה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פיפטה ההשעיה הלטקס לתוך 5 מ&quot;ל שכותרתו בורג כתרים צינור. הוסף 1 מ&quot;ל נוסף של GBS. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 2 מ&quot;ל של GBS מכיל 0.2 BSA% (w / v) (pH 8.2) (מוכן בשלב 1.2). הוסף 40 μl של 10% (w / v) פתרון של אזיד הנתרן כחומר משמר. הערה: יזיד הנתרן הוא מסוכן אם בשאיפה, והוא גירוי עור ועיניים. רצוי לרכוש פתרון 10% מוכנים ולא צורת האבקה, כמו זה ממזער את הסיכון של חשיפת משאיפת. ציוד מגן אישי (כולל כפפותמשקפי סנסציה ד) צריכים להיות משוחק בעת הטיפול מגיב זה. עיין בגיליון נתוני בטיחות של חומרים לפרטים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ריאגנטים לטקס חנות ב 4 ° C. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכנה של מגיב לטקס ביקורת שלילית <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לייבל 2 מ&quot;ל עגול צינור microfuge תחתון. הערה: סיבוב צינורות תחתון משמשות כדי למזער יישוב חלקיקים אשר עשוי להשפיע קובץ מצורף נוגדן. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעזרת פיפטה P1000 עם טיפים סטרילי להוסיף 975 μl של GBS לתוך צינור microfuge, ולאחר מכן להוסיף 25 μl antiserum ארנב הרגיל. הפוך חמש פעמים כדי לערבב. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> המשך כמו בשלבי 1.3.3 ל1.3.10 לעיל </li></ol></li></ol> .2 בקרת איכות (QC) של ריאגנטים לאטקס <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להביא מגיב לטקס לRT. מייד לפני השימוש, לערבב בעדינות מגיב לטקס על ידי היפוך הצינור מספר פעמים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בדוק מגיב לautoagglutination ידי pipetting 15 μl לשקופית מיקרוסקופ זכוכית והמשך כבצעדים 4.7 ו4.8 להלן. לא צריך להיות שוםgglutination של חלקיקי הלטקס. מגיב אמורה להופיע לבן וחלק. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בדוק את המגיב נגד פנל של בידודי דלקת ריאות מעבר נמוך. השתמש בתרבויות טריות גדלו מוכנות כמו בשלב 3 הפנל של בידודים צריך לכלול נגזרות של סרוטיפ &#39;היעד&#39; (סרוטיפ הספציפי למגיב נבדק) וזנים אל &#39;אינו יעד &quot;(נגזרות של סרוטיפים אחרים שלא צריך בדרך כלל לעבור מגיב עם המגיב). כולל בודד לפחות אחד מכל סוג סרוטיפ יעד ולא יעד עבור כל מגיב לטקס עובר QC. אם יש רק אחד יעד או serotype אינו היעד, בדיקת שני בידודים שונים של סרוטיפ המסוים. הערה: פנל הבדיקה צריך לכלול מספר בידודים של כל serotype, שחלקם נדירים במחלה פולשנית ו / או אוספי תרבות סוג. עדיף לכלול כמה מרכבה מבודדת, כפי שהם לעתים קרובות יותר תובעניים לסרוטיפ (מידע לא מוצג), ובכך בודקים את o הקיבולת נוספתf ריאגנטים ולהבטיח כי חומרים כימיים עשויים מסוגלים serotyping שני פולשנית וכרכרה מבודדת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להמשיך בבדיקות של חומרים כימיים לטקס עם יעד ודלקת ריאות שאינם יעד מבודד לפי השיטה המתוארת בשלבי 3 ו -4 להלן. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ריאגנטים בקרת איכות בזמן ייצור ולאחר מכן לפחות אחת לשנה לאחר מכן. הערה: אם מגיב לא עובר QC, אצווה חייב להיות מושלך והכנה חדשה שנעשתה. במקרה של כישלון QC חוזר אנו ממליצים על חומרים כימיים שמיוצרים תוך שימוש בשיטות החלופיות שמתוארות בOrtika et al. 2013 8 ובדיון שלהלן. </li></ol> .3 הכנת תרבויות דלקת ריאות לSerotyping <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> באמצעות לולאת סטרילי לבחור מושבה אחת של דלקת הריאות לבודד ופס זה החוצה אל אגר דם לא סלקטיבי מוצק, כך שהבידוד העיקרי מכסה כשליש ממשטח הצלחת. Streak למושבות אחת. הערה: לוחות שהוכנו מסוס defibrinated או דם כבשים מתאימים; אבל צלחות דם מוכנות עם דם אדם או דם של בעלי החיים citrated אינן. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה O הצלחת / N על 37 מעלות צלזיוס באווירה של 5% CO 2. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שים לב לצמיחה על הצלחת לטוהר ולהעריך שיש צמיחה מספיק לserotyping. הערה: תרבות טהורה של בודד דלקת הריאות נדרשת לserotyping. מהניסיון, ומחוברות, או בסמוך מחוברות הצמיחה שלנו מכסה כשליש ממשטח הצלחת הוא בדרך כלל מספיק על מנת להשלים serotyping. כתרבויות דלקת ריאות עלולות להיות מועדות לautolysis, תרבויות מוכנות לserotyping צריכה להיבדק בתוך 24 שעות של תת תרבות. אל תיקח את צלחת התרבות מחוץ לחממה יותר מ 15 עד 20 דקות לפני serotyping מתחיל. </li></ol> .4 Serotyping אטקס התלכדות ניצוח <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את כל חומרים כימיים הלטקס ממקרר ולאפשר להם לחמם לRT למשך כimately 30 דקות. מייד לפני השימוש, בעדינות להפוך את הצינורות כדי לערבב את חומרים כימיים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תווית שקופיות מיקרוסקופ. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הנח 15 μl של מגיב לטקס שליטה שלילי לשקופית מיקרוסקופ. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> באמצעות μl 1 לולאה חד פעמית סטרילי לקחת תנופה של תרבות דלקת הריאות, כך שהלולאה היא כמחצית מלאה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעדינות למרוח הבידוד על פני השטח של השקופיות קרובות לירידה של מגיב לטקס ביקורת שלילי. הבידוד צריך להיות גלוי בשקופית הזכוכית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> במהירות וביסודיות לערבב הבידוד למגיב לטקס שליטה השלילי באמצעות הלולאה. ודא כי הירידה אינה מתפשטת עוד יותר מאשר הגודל ההתחלתי שלה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להרים את השקופית, מחזיקים אותו בשני הקצוות. רוק השקופיות קדימה ואחורה דקות 1. תשמור על עצמך כדי לשמור על הנוזל נע באיטיות, ולהבטיח שהגודל של הירידה לא להגדיל. הערה: לחלופין להשתמש בכיסא נדנדה צלחת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שים לב להתלכדות מקרוסקופית (כלומר, על ידיבעין בלתי מזוינת) וסליקה של ההשעיה על רקע שחור. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אם מגיב לטקס ביקורת השלילי לא מראה התלכדות או סליקה להמשיך בדיקות התרבות, החלפת חומרים כימיים לטקס מבחן למגיב לטקס שליטה השלילי בצעדי 4.1-4.8 לעיל. לולאה טרי יש להשתמש בכל פעם. להמשיך בבדיקות של חומרים כימיים לטקס מתחילים עם הבריכות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בדוק כל אחד מהחומרים הכימיים &#39;הבריכה&#39; לטקס ברציפות עד בדיקה חיובית מתקבלת. הערה:. סדר הבדיקה של הבריכות ניתן לעשות זאת ב&#39;סיבובים &#39;כדי לשקף את השכיחות המקומית של זנים אל מסוימים (למשל, על ידי בדיקת שלוש בריכות ככל הנראה בשקופית הראשונה אם תגובה חיובית ולא התקבל, לאחר מכן מבחן הבא שלוש הסיכוי הטוב ביותר של הבריכות שנותרו בשקופית השנייה, וכן הלאה עד שתגובה חיובית מתקבלת). הדבר מבטיח כי קפסיד הנפוצים ביותר נבדקים ראשון, צמצום הזמן וריאגנטים צורך. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl">באמצעות המקש של יצרן antisera לקבוע איזה פרט antisera מיוצג בבריכה החיובית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בחן כל אחת מהקבוצות או הסוגים הכלולים בבריכה החיובית בנפרד כדי לקבוע את &quot;הקבוצה&quot; או &quot;סוג&quot; כמו בשלבים 4.1-4.8 לעיל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לקבוע את התוצאה על ידי התייחסות למפתח של יצרן antisera. אם &#39;סוג&#39; נקבע (לדוגמא, סרוטיפ 5), אז אין בדיקות נוספות נחוצה ותוצאה זה נרשמה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אם &quot;קבוצה&quot; נקבעה (לדוגמא, קבוצה 19), ולאחר מכן עיין במפתח היצרנים כדי לקבוע את הגורמים להיבדק. המשך בדיקות עם חומרים כימיים &quot;גורם&quot; לטקס האישיים ולקבוע את סרוטיפ הסופי (למשל, 19B סרוטיפ). </li></ol>

<ol><li>Rudan, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epidemiology+and+etiology+of+childhood+pneumonia+in+2010%3A+estimates+of+incidence%2C+severe+morbidity%2C+mortality%2C+underlying+risk+factors+and+causative+pathogens+for+192+countries%5BTitle%5D)+AND+%22J+Glob+Health%22%5BJournal%5D)">Epidemiology and etiology of childhood pneumonia in 2010: estimates of incidence, severe morbidity, mortality, underlying risk factors and causative pathogens for 192 countries.</a> J Glob Health. 3 (10401), (2013).</li>
<li>O'Brien, K. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Burden+of+disease+caused+by+Streptococcus+pneumoniae+in+children+younger+than+5+years%3A+global+estimates%5BTitle%5D)+AND+%22Lancet%22%5BJournal%5D)">Burden of disease caused by Streptococcus pneumoniae in children younger than 5 years: global estimates.</a> Lancet. 374, 893-902 (2009).</li>
<li>Henrichsen, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Six+newly+recognized+types+of+Streptococcus+pneumoniae%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Six newly recognized types of Streptococcus pneumoniae.</a> J Clin Microbiol. 33, 2759-2762 (1995).</li>
<li>Hausdorff, W. P., Bryant, J., Paradiso, P. R., Siber, G. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Which+pneumococcal+serogroups+cause+the+most+invasive+disease%3A+implications+for+conjugate+vaccine+formulation+and+use%2C+part+I%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Infect+Dis%22%5BJournal%5D)">Which pneumococcal serogroups cause the most invasive disease: implications for conjugate vaccine formulation and use, part I.</a> Clin Infect Dis. 30, 100-121 (2000).</li>
<li>Mulholland, K., Satzke, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Serotype+replacement+after+pneumococcal+vaccination%5BTitle%5D)+AND+%22Lancet%22%5BJournal%5D)">Serotype replacement after pneumococcal vaccination.</a> Lancet. 379, 1388-1389 (2012).</li>
<li>Weinberger, D. M., Malley, R., Lipsitch, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Serotype+replacement+in+disease+after+pneumococcal+vaccination%5BTitle%5D)+AND+%22Lancet%22%5BJournal%5D)">Serotype replacement in disease after pneumococcal vaccination.</a> Lancet. 378, 1962-1973 (2011).</li>
<li>Satzke, C., et al. Standard method for detecting upper respiratory carriage of Streptococcus pneumoniae: Updated recommendations from the World Health Organization Pneumococcal Carriage Working Group. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aSatzke%2C+C+%22Vaccine%22">Vaccine</a>. , (2013).</li>
<li>Ortika, B. D., Habib, M., Dunne, E. M., Porter, B. D., Satzke, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Production+of+latex+agglutination+reagents+for+pneumococcal+serotyping%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Res+Notes%22%5BJournal%5D)">Production of latex agglutination reagents for pneumococcal serotyping.</a> BMC Res Notes. 6 (49), (2013).</li>
<li>Adegbola, R. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Serotype+and+antimicrobial+susceptibility+patterns+of+isolates+of+Streptococcus+pneumoniae+causing+invasive+disease+in+The+Gambia+1996-2003%5BTitle%5D)+AND+%22Trop+Med+Int+Health%22%5BJournal%5D)">Serotype and antimicrobial susceptibility patterns of isolates of Streptococcus pneumoniae causing invasive disease in The Gambia 1996-2003.</a> Trop Med Int Health. 11, 1128-1135 (2006).</li>
<li>Slotved, H. C., Kaltoft, M., Skovsted, I. C., Kerrn, M. B., Espersen, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Simple%2C+rapid+latex+agglutination+test+for+serotyping+of+pneumococci+%28Pneumotest-Latex%29%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Simple, rapid latex agglutination test for serotyping of pneumococci (Pneumotest-Latex).</a> J Clin Microbiol. 42, 2518-2522 (2004).</li>
<li>Turner, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improved+detection+of+nasopharyngeal+cocolonization+by+multiple+pneumococcal+serotypes+by+use+of+latex+agglutination+or+molecular+serotyping+by+microarray%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Improved detection of nasopharyngeal cocolonization by multiple pneumococcal serotypes by use of latex agglutination or molecular serotyping by microarray.</a> J Clin Microbiol. 49, 1784-1789 (2011).</li>
<li>Mudany, M. A., Kikuchi, K., Totsuka, K., Uchiyama, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+a+new+serotyping+kit+for+Streptococcus+pneumoniae%5BTitle%5D)+AND+%22J+Med+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Evaluation of a new serotyping kit for Streptococcus pneumoniae.</a> J Med Microbiol. 52, 975-980 (2003).</li>
<li>Lalitha, M. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Serotyping+of+Streptococcus+pneumoniae+by+agglutination+assays%3A+a+cost-effective+technique+for+developing+countries%5BTitle%5D)+AND+%22Bull+World+Health+Organ%22%5BJournal%5D)">Serotyping of Streptococcus pneumoniae by agglutination assays: a cost-effective technique for developing countries.</a> Bull World Health Organ. 74, 387-390 (1996).</li>
<li>Shutt, C. K., Samore, M., Carroll, K. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+the+Denka+Seiken+slide+agglutination+method+to+the+quellung+test+for+serogrouping+of+Streptococcus+pneumoniae+isolates%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Comparison of the Denka Seiken slide agglutination method to the quellung test for serogrouping of Streptococcus pneumoniae isolates.</a> J Clin Microbiol. 42, 1274-1276 (2004).</li>
<li>Gella, F., Serra, J., Gener, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Latex+agglutination+procedures+in+immunodiagnosis%5BTitle%5D)+AND+%22Pure+Appl+Chem%22%5BJournal%5D)">Latex agglutination procedures in immunodiagnosis.</a> Pure Appl Chem. 63, 1131-1134 (1991).</li>
<li>Pneumococcus Key to S. pneumoniae types and pneumococcal diagnostic antisera. SSI Diagnostica. , Available from: 
 <a target="_blank" href="http://www.ssi.dk/ssidiagnostica">http://www.ssi.dk/ssidiagnostica</a> (2013).</li>
<li>Habib, M., Porter, B. D., Satzke, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Capsular+serotyping+of+Streptococcus+pneumoniae+using+the+Quellung+reaction%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Capsular serotyping of Streptococcus pneumoniae using the Quellung reaction.</a> J. Vis. Exp. (84), (2014).</li>
<li>Arai, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+antiserum-coated+latex+particles+for+serotyping+Streptococcus+pneumoniae%5BTitle%5D)+AND+%22Microbiol+Immunol%22%5BJournal%5D)">Use of antiserum-coated latex particles for serotyping Streptococcus pneumoniae.</a> Microbiol Immunol. 45, 159-162 (2001).</li>
<li>Lafong, A. C., Crothers, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Simple+latex+agglutination+method+for+typing+pneumococci%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Pathol%22%5BJournal%5D)">Simple latex agglutination method for typing pneumococci.</a> J Clin Pathol. 41, 230-231 (1988).</li>
<li>Ortega-Vinuesa, J. L., Bastos-Gonzalez, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+review+of+factors+affecting+the+performances+of+latex+agglutination+tests%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biomater+Sci+Polym+Ed%22%5BJournal%5D)">A review of factors affecting the performances of latex agglutination tests.</a> J Biomater Sci Polym Ed. 12, 379-408 (2001).</li>
<li>Yap, K. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+a+slide+latex+agglutination+test+for+rotavirus+antigen+detection%5BTitle%5D)+AND+%22Malays+J+Pathol%22%5BJournal%5D)">Development of a slide latex agglutination test for rotavirus antigen detection.</a> Malays J Pathol. 16, 49-56 (1994).</li>
<li>Severin, W. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Latex+agglutination+in+the+diagnosis+of+meningococcal+meningitis%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Pathol%22%5BJournal%5D)">Latex agglutination in the diagnosis of meningococcal meningitis.</a> J Clin Pathol. 25, 1079-1082 (1972).</li>
</ol>

למחברים אין מה לחשוף.

התלכדות לטקס היא שיטה פשוטה, מהירה וזולה לserotyping דלקת ריאות. ריאגנטים התלכדות לטקס דלקת ריאות מסחריים זמינים, אבל הם כרגע לא מבדילים כל דלקת הריאות הידועות קפסיד 10,12. עם זאת, ניתן לייצר חומרים כימיים התלכדות לטקס בקלות בתוך הבית באמצעות antisera נרכש הועלה נגד אנטיגנים קופסית דלקת ריאות ספציפיות. בשיטה המתוארת כאן, נוגדנים באופן פסיבי קשורים לחלקיקי לטקס כדי להפוך את קבוצה של חומרים כימיים התלכדות לטקס. תגובת לטקס חיובית מתרחשת כאשר נוגדנים ספציפיים קשורים לחלקיקי הלטקס לצרף לאנטיגנים בכמוסת פוליסכריד של דלקת הריאות לבודד 18,19. חלקיקי הלטקס צמודים לנוגדנים לאפשר תגובת הנוגדן אנטיגן הספציפית להיות דמיינו ללא הגדלה. התלכדות לטקס היא שיטה מתאימה למעבדות תפוקה גבוההגם ד להגדרות משאבים לעניים. יתרונות עיקריים של שיטת התלכדות הלטקס הם שאין צורך בציוד מיוחד כדי לבצע את הבדיקה, יש לי ריאגנטים חיי מדף של לפחות 2 שנים, כאשר הם מאוחסנים על 4 מעלות צלזיוס 8, ושזה לא יקר, פשוט ומהיר לביצוע. Serotyping בודד דלקת ריאות על ידי התלכדות לטקס לוקח כ 10 דקות, וניתן לבדוק עד ארבעה חומרים כימיים לטקס במקביל בשקופית אחת. יתר על כן, אם השכיחות של זנים אל ידועה בהגדרה אפידמיולוגיים הרלוונטית, בדיקה יכולה להתבצע בסבבים החלו בבריכות המכילות את הזנים אל הנפוצים ביותר בדומה למבחן Quellung 17. גישה זו מצמצמת את מספר הבדיקות הדרושות כדי לקבוע את סרוטיפ. השיטה היא גם מאוד לשחזור בין מפעילים שונים (מידע לא מוצג). חסרון של serotyping התלכדות לטקס הוא שייצור חומרים כימיים הוא לצרוך זמן, לוקח כ 4 שעות; למרות ריאד מרובהבקלות יכול להיות מיוצר NTS במקביל. יתר על כן, כמה אנטיגנים משותפים לזנים אל דלקת ריאות שונים, וכתוצאה מכך לתגובות צולבות עם כמה antisera (למשל, סרוטיפ 29, 42 וקבוצת 35). עם זאת, תגובות הצולבות אלה גם מתאפיינים בעת שימוש antisera המסחרי (שהוא בדרך כלל preabsorbed להסיר את הנוגדנים מגיבים צולבים בעייתיים יותר) ושולחנות תגובה נוספים מסופקות על ידי היצרן כדי להבדיל בי סרוטיפ הוא הווה. ריאגנטים לאטקס יכול גם לחצות יגיבו אם הנוגדנים אינם מיושרים כהלכה על חלקיקי הלטקס; אלה מתגלים ככישלונות QC. מניסיוננו, QC הקפדני הוא מרכזי להצלחתה של שיטה זו, גם כאשר antisera זמין מסחרי המשמשים לייצור. QC לוקח כ 15 דקות לכל מגיב והוא מסתמך על סט של QC המתאים המבודד כפי שתואר לעיל. השיטה המתוארת כאן תוצאות בריאגנטים שנותנים wi גם תגובה חיוביתדק תקופת המבחן. מניסיוננו, תוצאות חיוביות שגויות הן נדירות בפועל (מידע לא מוצג). תגובות שליליות כוזבות מדי פעם הם נצפו; בדרך כלל אלה מתייחסים לבעיות ידועות עם antiserum מסוים (לדוגמא, serogroup 6 מבודדים עשויים שלא להגיב בB antiserum בריכה), או למטה רגולציה של ביטוי כמוסה ידי הבודד. השימוש בalgrorithm serotyping מסופק על ידי היצרן הוא גם חשוב, כמו ברוב המקרים תגובה חיובית או שלילית כוזבת תוביל לתוצאה &quot;סוף עיוור&quot;. במקרים אלה, וכאשר התגובות הן קשות לפרש, אנו ממליצים לחזור על בדיקה ו / או בדיקה על ידי שיטה חלופית כגון תגובת Quellung. פתרון בעיות מסוימים נדרשת מעת לעת כדי להפוך את חומרים כימיים לטקס משביע רצון. בשיטה המתוארת כאן, הנוגדן מחובר לחלקיקי לטקס באמצעות ספיחה פסיבית 15,19, כך משתנה קריטי הוא הריכוז של נוגדנים המשמש, שקובע עד כמהפני השטח של חלקיקי הלטקס מכוסה והיישור הבא של האתרים הפעילים נוגדן 15,20. כתוצאה מכך, אם נוגדן מספיק או עודף מחובר לחלקיקי הלטקס, תגובות נוגדן אנטיגן לא תהיינה אופטימליות, וריאגנטים בלתי מספקים עלולים להיווצר 15,20,21. כטיטר נוגדנים להשתנות בין המון השונים של antisera, קבוצה סטנדרטית של דילולים לא יכולה לייצר חומרים כימיים כי ביצועים טובים 8. נקודת התחלה שימושית היא להשתמש בדילול 01:40 של antiserum, ואם זה לא מוצלח, לדלל את antiserum נוסף. מניסיוננו זה בדרך כלל פותר את הבעיה 8. במספר קטן של מקרי ריאגנטים עשויים להראות התלכדות חלשה שאינו מלווה בסליקה של ההשעיה כאשר נבדקו עם היעד מבודד. במקרים אלה דילול antiserum אינו משפר את האיכות של המגיב, אבל בדרך כלל ניתן לייצר חומרים כימיים משביעות רצון על ידי השמטת צנטריפוגה ולשטוף צעדים 8,22 </sup&gt;. חלקיקי לטקס נוגדן מצופה נמצאים בשימוש נפוץ במיקרוביולוגיה אבחונים לגילוי, זיהוי או serotyping של חיידקים רבים ושונים 15,20. ככזה, השיטה המתוארת כאן עשויה להיות מתאימה להכנת ריאגנטים לטקס למטרות אחרות, antisera המתאים ובלבד זמין ונהלי QC נאותים יאומצו.

Streptococcus pneumoniae (pneumococcus) הוא אחד גורמים עיקריים לתחלואה ותמותה בילדים מתחת לגיל חמש שנים ברחבי העולם, במיוחד בהגדרות משאבים לעניים 1,2. טווחי מחלה דלקת ריאות מפני זיהומים מקומיים לסכנת חיים בתנאים כגון דלקת ריאות, אלח דם ודלקת קרום מוח 1,2. יותר מ 90 קפסיד של pneumococci זוהו על בסיס הבדלים בפוליסכריד קופסית 3. חיסונים הנוכחיים למקד את פוליסכריד קופסית ולספק הגנה מפני הזנים אל העיקריים בגרימת מחלה פולשנית 4. Serotyping דלקת ריאות מבודדות הוא חשוב להערכת ההשפעה של חיסון על כרכרה ומחלה, כמו גם מתן מידע אפידמיולוגיים רחב יותר 5,6. השיטה הנוכחית &quot;תקן זהב&quot; לserotyping דלקת ריאות היא מבחן Quellung, אבל זה זמן רב ודורשת מיומנות מסוימת לperform 7. התלכדות לטקס היא שיטת serotyping חלופה המומלצת על ידי ארגון הבריאות העולמית 7. התלכדות לטקס היא מהירה וקלה לביצוע, והוא מועסק במעבדות רבות בעולם 8-11. חשוב לציין, התלכדות הלטקס הוכיחה דיוק דומה למבחן Quellung לserotyping דלקת הריאות 10,12-14. בסך הכל, שיטה זו היא אידיאלית עבור הגדרות משאבים לעניים, כמו גם מעבדות תפוקה גבוהה. ריאגנטים התלכדות לטקס (&#39;ריאגנטים לטקס&#39;) נוצרים על ידי ההתקשרות של נוגדנים לחלקיקי לטקס 15. בתגובה חיובית, חלקיקים אלה שכותרת agglutinate בנוכחות של אנטיגן הספציפי. ריאגנטים לטקס מסחריים זמינים לטווח מוגבל של סרוטיפים. ניתן גם מגיבים מוכנים לטקס בבית באמצעות מסחרי antisera זמין 10. תערובות של antisera (&quot;בריכות&quot;), כמו גם antisera הספציפי לים דלקת ריאותerogroups (למשל, קבוצה 19), זנים אל פרט (למשל, סרוטיפ 5), ולאנטיגנים ספציפיים (&#39;גורמים&#39;, למשל., 19c גורם הכרת 19A סרוטיפ) להגדרה נוספת קפסיד בתוך קבוצות זמינות 16. כתב יד זה מתאר את השלבים העיקריים בייצור של חומרים כימיים לטקס באמצעות קובץ מצורף פסיבי של antisera זמין המסחרית לחלקיקי לטקס. היבטי בקרת איכות (QC) של שיטה זו מתוארים, ופרוטוקול לשימוש בחומרים כימי לטקס לserotyping דלקת ריאות כלול.

<table><tbody><tr><td>מיקרו-חלקיקים המבוססים על פוליסטירן, 800 ננומטר</td><td>סיגמא</td><td>65984-10 מ"ל-F</td><td>או נפחים אחרים לפי הצורך</td></tr><tr>נוגדנים<td>רגילים בסרום ארנב</td><td>אוסטרליה&nbsp;</td><td>NRS-1 מ"ל</td><td>או נפחים אחרים לפי הצורך, הביאו ל-RT לפני השימוש</td></tr><tr><td>פנאומוקוק (נויפלד) אנטיסרה,</td><td>SSI Diagnostica</td><td>שונים</td>: <td>הביאו ל-RT לפני השימוש <a href="http://www.ssi.dk/ssidiagnostica">http://www.ssi.dk/ssidiagnostica</a></td></tr><tr><td>Sterile Bovine Albumin&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>A-4503</td><td>יש להביא ל-rRT לפני השימוש</td></tr><tr><td>תמיסת נתרן אזיד 10% (v/v)&nbsp;</td><td>VWR International</td><td>ROAC3902/100 מ"ל</td><td>זהירות: מסוכן בשאיפה; מגרה עור ועיניים</td></tr><tr><td>צינורות Eppendorf Safe-Lock, 2 מ"ל</td><td>Eppendorf</td><td>0030 120.094</td><td>תחתית עגולה</td></tr><tr><td>נתרן כלורי</td><td>Merck</td><td>10241.AP</td><td></td></tr><tr><td>לולאות חיסון חד פעמיות מכוילות 1 ומיקרו; l</td><td>קופן</td><td>CD175SO1</td><td></td></tr><tr><td>זכוכית שקופיות מיקרוסקופ 76 מ"מ x 26 מ"מ</td><td>תרמו פישר סיינטיפיק</td><td>LBS 2950RC</td><td></td></tr><tr><td>5 M NaOH</td><td>BDH</td><td>10252</td><td>זהירות: קורוזיבי מאוד</td></tr><tr><td>גליצין</td><td>Merck</td><td>10119.05</td><td></td></tr><tr><td>צלחות אגר דם סוס (HBA)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>PP2001</td><td>הביאו ל-RT לפני השימוש <a href="http://www.thermofisher.com.au/">http://www.thermofisher.com.au</a></td></tr><tr><td>גלגל מסתובב</td><td>Wyble Engineering Development Corporation</td><td></td><td></td></tr><tr><td>פוליסטירן צינור מכסה בורג תחתון שטוח, 5 מ"ל</td><td>Technoplas</td><td>S5016SU</td><td></td></tr><tr><td>מזרקים 60 מ"ל ללא מחטים</td> יחידת מסנן מזרק <td>Terumo</td><td>SS-60L</td><td></td></tr><tr><td>Millex-GP, 0.22 ומיקרו; m</td><td>Merck Millipore</td><td>SLGP033RS</td><td></td></tr><tr><td>חוברת על Neufeld antisera</td><td>Statens Serum Institut</td><td></td><td>מפתח לקביעת סרוטיפים <a href="http://www.ssi.dk/ssidiagnostica">http://www.ssi.dk/ssidiagnostica</a></td></tr><tr><td>מפתח לסרום גורם פנאומוקוק</td><td>Statens Serum Institut</td><td>18058</td><td>לקביעת סרוטיפ בתוך קבוצות <a href="http://www.ssi.dk/ssidiagnostica">http://www.ssi.dk/ssidiagnostica</a></td></tr><tr><td>*מקורות חלופיים זמינים עבור רוב החומרים</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

קופסית serotyping של<em&gt; streptococcus pneumoniae</em&gt; על ידי לאטקס התלכדות

Capsular Serotyping of Streptococcus pneumoniae by Latex Agglutination

ריאגנטים לאגלוטינציה של לטקס נמצאים בשימוש נרחב באבחון, זיהוי וסרוטייפ מיקרוביאלי. סטרפטוקוקוס דלקת ריאותe (הפנאומוקוק) הוא גורם עיקרי לתחלואה ותמותה ברחבי העולם. החיסונים הנוכחיים מכוונים לקפסולה הפנאומוקוקית, וישנם למעלה מ-90 סרוטיפים קפסולריים. לכן סרוטיפינג של מבודדי פנאומוקוק חשוב להערכת ההשפעה של תוכניות חיסון ולמטרות אפידמיולוגיות. ארגון הבריאות העולמי המליץ על אגלוטינציה של לטקס כשיטה חלופית לבדיקת Quellung 'תקן הזהב' לסרוטייפ פנאומוקוק. אגלוטינציה של לטקס היא שיטה פשוטה יחסית, מהירה וזולה; ולכן מתאים לסביבות דלות משאבים כמו גם למעבדות עם עומסי עבודה בנפח גבוה. ניתן להכין ריאגנטים לאגלוטינציה של לטקס בתוך הבית תוך שימוש בנוגדנים ממקור מסחרי המחוברים באופן פסיבי לחלקיקי לטקס. כתב יד זה מתאר שיטת ייצור ובקרת איכות של ריאגנטים לאגלוטינציה לטקס, ומפרט גישת בדיקה רציפה שהיא חסכונית בזמן ובעלות. 
שיטת ייצור ובקרת איכות זו עשויה להתאים גם למטרות בדיקה אחרות.

תגובת לטקס חיובית מתרחשת כאשר נוגדנים מסוג ספציפי שצורפו לחלקיקי הלטקס נקשר לכמוסה של pneumococcus, והתלכדות של חלקיקי הנוגדן שכותרתו מתפתחת 15. איור 1 א מציג תגובה חיובית המתאפיינת בהתלכדות וסליקה גלויות של הרקע השעיה. תגובה שלילית מאופיינת בהשעיה מגיב התלכדות לטקס שנותרה חלק ולבן (איור 1). ריאגנטים מותאמים כך שתגובה חיובית יש לשים לב לפני סוף המרווח דק &#39;פעם אחת (בדרך כלל להבחין בכ 20 שניות). אנחנו לא ממליצים לקרוא את תגובות אחרי פרק זמן 1 דקות. לעתים רחוקות, תגובות להציג התלכדות חלשה מסביב לקצה של הירידה שאינו מלווה על ידי ניקוי של ההשעיה הרקע, או להופיע &quot;סיבי&quot; ללא סליקת רקע (מידע לא מוצג). אלה הם רוב כמו<html> תגובות שליליות ly. במקרים כאלה, אנו ממליצים retesting ו / או חקירה נוספת בשיטה אחרת serotyping (לדוגמא תגובת Quellung 17). <img alt="איור 1" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51747/51747fig1highres.jpg" width="500" /> 1 תגובות איור חיוביות ושליליות התלכדות לטקס. תכשירים מדלקת ריאות לבודד מעורבים עם מגיב התלכדות הלטקס מראה תגובה חיובית () או תגובה שלילית (B). התלכדות מלווה בסליקה של הרקע נראית בתגובה החיובית () .There אין התלכדות גלויה עם מגיב לטקס ביקורת השלילי או בתגובה שלילית בדיקה (B). תמונות 8 בשימוש באישור.&quot;Target =&quot; _blank &quot;&gt; לוחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

בדיקות התלכדות לטקס היא שיטה פשוטה, מהירה וזולה לserotyping Streptococcus pneumoniae, וגם כבר מיושמות באופן נרחב במיקרוביולוגיה אבחון. כתב יד זה מתאר את הייצור של חומרים כימיים התלכדות לטקס, נהלי בקרת איכות ובבית היישום של טכניקה זו לserotyping דלקת ריאות.

קופסית Serotyping של<em&gt; Streptococcus pneumoniae</em&gt; על ידי לאטקס התלכדות

Latex agglutination reagents are widely used in microbial diagnosis, identification and serotyping. Streptococcus pneumoniae (the pneumococcus) is a major ...

המטרה הכללית של פרוצדורה זו היא לבצע סרטיפוס (serotyping) של בידודים של streptococcus pneumoniae באמצעות אנטיסרא המחוברים לחלקיקי לטקס. השלב הראשון בסרטיפוס של בידוד פנומוקוקי הוא לבחון אותו מול ריאגנט לטקס המשמש כביקורת שלילית. השלב השני של הפרוצדורה הוא לבחון את הבידוד הפנומוקוקי עם ריאגנטים של מאגרי לטקס (latex pool reagents) עד להשגת תגובה חיובית.השלב השלישי הוא לבחון את הבידוד מול הקבוצות והסוגים הנמצאים במאגר החיובי, תוך שימוש במפתח יצרן האנטיסרום כדי לבחור את הריאגנטים המתאימים לבדיקה. השלב האחרון הוא בדיקת הבידוד עם כל ריאגנטי הלטקס של הגורמים הנדרשים, ולאחר מכן פרשנות של התוצאות באמצעות מפתח יצרן האנטיסרום כדי לקבוע את הסרוטיפ הסופי. היתרון המרכזי של טכניקה זו על פני שיטות אחרות, כמו בדיקת ה-que, הוא שאינה דורשת שימוש במיקרוסקופ והיא פשוטה ומהירה יחסית לביצוע.בלינדה, עוזרת מחקר מהמעבדה שלנו, תדגים את ההליך הזה. ראשית, סמנו מבחנת מיקרו-צנטריפוגה בנפח 2 mL. בחרו במבחנה בעלת תחתית עגולה כדי לסייע במניעת שקיעת חלקיקים במהלך שלב חיבור הנוגדנים.בעזרת פפית של 1000 µL, הוסף 975 µL של תמיסת מלחים מתוספת גליצין (glycine buffered saline) למבחנה. לאחר מכן, הוסף 25 µL מהאנטיסרום הפנומוקוקלי הדרוש להכנת ריאגנט הלטקס. הפוך את המבחנה חמש פעמים כדי לערבב; לאחר מכן, דלל 120 µL של חלקיקי לטקס פוליסטירן ב-1080 µL של תמיסת מלח פיזיולוגית סטרילית.הפוך את המבחנה חמש פעמים כדי לערבב. פפטי 1000 µL של תרחיף הלטקס לתוך 1000 µL של תמיסת anitserum. הפוך חמש פעמים כדי לערבב, ולאחר מכן העבר לאינקובטור בטמפרטורה של 37 °C והנח על גלגל סיבוב איטי. הנח לתערובת להתרגול למשך שעתיים. לאחר האינקובציה, סבב את החלקיקים ב-1,100 ×g למשך 15 דקות.הסרו את הנוזל העליון באמצעות פיפטה של 1000 µL. השליכו את הנוזל העליון והשעיקו שוב את המשקע בשני מיליליטר של תמיסת סליין סטרילית. כעת סובבו שוב את התערובת בצנטריפוגה, השליכו את הנוזל העליון והשעיקו את המשקע השטוף במיליליטר אחד של תמיסת סליין עם בופר גליצין.העבירו את התרחיף לשפופרת עם מכסה הברגה בנפח חמישה מיליליטר והוסיפו מיליליטר אחד נוסף של glycine buffered saline. כעת הוסיפו שני מיליליטר של glycine buffered saline עם 0.2%BSA. לאחר מכן הוסיפו 40 µL של 10%sodium azide.כחומר משמר, הקפידו לפעול לפי גיליון נתוני החומר. אמצעי בטיחות בעת שימוש ב-sodium azide. לאחר מכן, עיינו במפתח של יצרן הנוגדן כדי לקבוע את בידודי בקרת האיכות המתאימים לבדיקה מול הרכיב.לאחר מכן, בחנו את הרכיב באמצעות בידודים אלו של סרוטיפים המשמשים כביקורות חיוביות ושליליות. בדיקת בקרת איכות היא חשובה מאוד. תהליך זה מבטיח שהופק רכיב המגיב בצורה נכונה, ומהווה שלב בקרה חיוני. שמרו את הרכיבים שעברו את בקרת האיכות בטמפרטורה של 4 °C.התחילו בהכנת התרביות. בעזרת לולאה סטרילית, בחרו מושבה בודדת וזהמו שליש מתוך צלחת אגר דם לא סלקטיבית. לאחר מכן, בצעו ריסוס בצלחת כדי לקבל מושבות בודדות.דגרו את המצע למשך לילה בטמפרטורה של 37 °C באטמוספירה של 5% carbon dioxide. למחרת, לפני תחילת ה-SYP, הוציאו את ריאגנטי הלטקס מהמקרר והמתינו שיגיעו לטמפרטורת החדר.הוצא את הפלטה מהאינקובטור. התרבית חייבת להיות טהורה והצמיחה חייבת להיות קונפלואנטית או כמעט קונפלואנטית. מעל לשליש מהפלטה, הפוך את ריאגנט הלטקס של הבקרה השלילית מספר פעמים.הסיר 15 µL והעבר בעזרת פיפטה לעשייה של סמיכה (slide) למסרט השדה המסומנת. לאחר מכן, באמצעות לולאה סטרילית של 1 µL, בצע דגימה מהתרבית עד שמרכז הלולאה יהיה מלא למחציתו בקירוב. מרח בעדינות את תוכן הלולאה על הסמיכה, בסמוך לטיפה של ריאגנט בקרת השלילה.האינוקולום צריך להיות גלוי על הזכוכית. לאחר מכן, בעזרת הלולאה, ערבבו את האינוקולום לתוך טיפת ריאגנט הלטקס. השתדלו לא להפרוס את הטיפה על פני השקופית.הרימו את שני קצות השקופית ונעו אותה בעדינות קדימה ואחורה. שמרו על סירקולציה איטית של הנוזל ונסו למנוע מהטיפה להתפשט על פני השקופית. המשיכו להניע את השקופית במשך דקה אחת ולאחר מכן קראו את התוצאה.התוצאות נראות בצבע אדום על רקע כהה. טיפת ריאגנט השליטה השלילית צריכה להישאר ללא שינוי, ללא הגלוטינציה או התבהרות. לאחר שנקבע כי אין תגובה עם ריאגנט השליטה השלילית, יש להתחיל בבדיקת כל אחד מריאגנטי הלטקס של המאגר עד לקבלת תגובה חיובית.השתמש באותו הליך ובלופ סטרילי חדש עבור כל ריאגנט. בדרך כלל נבדקים שלושה מאגרי דגימות (pools) על כל סרטית. נערה את הסרטית במשך דקה אחת לפני הערכת התגובה.תגובת לטקס חיובית מתרחשת כאשר נוגדנים ספציפיים הקשורים לחלקיקי הלטקס נקשרים לקפסולה של הפנומוקוק (pneumococcus), ובעקבות זאת נוצרת גושים (אגלוטינציה) של חלקיקים מסומנים. תהליך זה מלווה בדרך כלל בהבהרה מסוימת של תרחיף הרקע. תגובה שלילית מאופיינת בכך שתרחיף ריאגנט הלטקס נשאר חלק ולבן, ללא גושים או הבהרה.מדי פעם, חלק מהתגובות השליליות המשוערות מראות agglutination חלשה יותר סביב שולי הטיפה, ללא התבהרות של תסחין הרקע. תגובות שליליות משוערות אחרות נראות צמיגיות ללא התבהרות של הרקע בשני המקרים דו-משמעיים אלו. יש לחזור על הבדיקה או לנסות שיטת stereotyping שונה.לאחר קבלת תגובה חיובית, השתמש במפתח היצרן כדי לקבוע אילו קבוצות או סוגים נמצאים בתערובת הנילוח (pool) זו. לאחר מכן, בדוק את הקבוצות או הסוגים המרכיבים נילוח זה מול הבידוד עד לצפייה בתגובה חיובית. אם זוהה סוג מסוים, אין צורך בבדיקות נוספות.עם זאת, אם זוהתה קבוצה, יש להשתמש במפתח של היצרן כדי לגלות אילו גורמים יש לבחון לצורך זיהוי הסרוטיפ. כאשר תוצאות בדיקת הגורמים נקבעות, יש שוב להסתמך על המפתח כדי לקבוע את הסרוטיפ הסופי. לאחר רכישת מיומנות, ניתן להשתמש בטכניקה פשוטה וזולה זו לצורך סרוטיפ.בידוד של חיידק פנומוקוקי לוקח 10 דקות במידה והתהליך מבוצע נכון. אנו מבצעים כעת הליך זה. חשוב לזכור להשתמש בלולאות סטריליות טריות ובקלפיות פיפטה עבור כל אחת מהבדיקות, כדי למנוע זיהום צולב של הבדיקות או של הריאגנטים.לאחר צפייה בסרטון זה, תגבשו הבנה טובה לגבי אופן ההכנה והשימוש בריאגנטי לטקס לטיפוס (stereotyping) של pneumococcus.

capsular-serotyping-of-streptococcus-pneumoniae-by-latex-agglutination

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

אימונולוגיה וזיהומים

שיטה יעילה כדי להעריך את פני חשיפה של חלבונים leptospiral מתואר. השיטה היא תוכננה במיוחד כדי למנוע שיבוש של הממברנה החיצונית של התאים leptospiral שביר. טכניקה זו דורשת עבודה של בקרות שלילי מספר להעריך את היושרה של הממברנה החיצונית הספציפיות של תגובת הנוגדנים.

חיסונית פלואורסצנציה Assay של משטח חשוף חלבונים Leptospiral

החלקיקים פיתחה לאחרונה רומן התלכדות (רש"פ) assay ניצול קולטן מולקולה וירוס איפשר זיהוי מהיר וקל של poliovirus (PV). במאמר זה, אנו נראה את הליך assay הרשות לצורך זיהוי PV.

התלכדות חלקיקים שיטת זיהוי poliovirus

סרטון זה מדגים בדיקת היצמדות אופסונו-לבחינת האינטראקציה בין חיידקים שעברו אופסונציה לבין תאי מערכת החיסון. חיידקים המסומנים בפלואורסצנטית, מטופלים בסרום בדיקה המכיל נוגדנים נגד קפסולות, מודגרים עם מקרופאגים. לאחר צביעת המקרופאגים בפלואורסצנטיות, החיידקים המחוברים על פני המקרופאגים נצפים תחת מיקרוסקופ לצורך הדמיה.

בדיקת היצמדות אופסונו-להערכת האופסוניזציה של חיידקים עטופים על ידי נוגדנים נגד קפסולות

מרכבת pneumococcal אנושית ניסויית מציעה מודל טבעי של קרון ומודל פוטנציאל לשימוש בפיתוח חיסון. טכניקה זו היא יקרה עדיין מורכבת וכרוכה בסיכון קליני על ידי החדרת הפתוגן לאדם. פתחנו פרוטוקול מפורט.

תובלת pneumococcal אנוש ניסויית

תגובת Quellung היא טכניקת תקן זהב עבור serotyping Streptococcus pneumoniae. טכניקה זו מנצלת מיקרוסקופ ונסיובי pneumococcal הספציפי ומשמשת בדרך כלל התייחסות ומעבדות מחקר ברחבי העולם.

קופסית Serotyping של<em&gt; Streptococcus pneumoniae</em&gt; שימוש תגובת Quellung

Streptococcus pneumoniae יוצר נגעים מיקרוסקופיים נפרדים שאינם מוגלתיים בלב. מתואר הפרוטוקול למודל עכברי של היווצרות מיקרו-נגעים לבביים. ניתנת הדרכה על הדמיית מיקרו-נגעים באמצעות מיקרוסקופיה, הבחנה בין מיקרו-נגעים מוקדמים ומאוחרים, ושיטות לאיתור שיפוץ לב בלבבות של בעלי חיים מחלימים.

ויזואליזציה של<em&gt; Streptococcus pneumoniae</em&gt; בתוך Microlesions הלב וRemodeling לב לאחר

שיטת ההרג הזה opsonophagocytic משמש כדי להשוות את היכולת של תאים חיסוניים phagocytic להגיב ולהרוג חיידקים בהתבסס על טיפולים שונים ו/או תנאים. באופן קלאסי, assay הזה משמש תקן זהב להערכת אפקטור פונקציות של נוגדנים שהועלו נגד חיידק בשם opsonin.

Opsonophagocytic הריגה הנועד להעריך תגובות אימונולוגי נגד פתוגנים חיידקיים

הרחבת קוד גנטי מוחלת על הקדמה של חומצת אמינו לא טבעית הנושאת קבוצה פונקציונלית ביורטוגונלית על חלבון נשא באתר מוגדר. הפונקציה biorthogonal משמש עוד יותר עבור צימוד סלקטיבי האתר של אנטיגן פחמימות כדי לספק חיסון גליקוקוג'וג'וגייט הומוגני.

גליקוקוג'גייט הומוגני המיוצר על ידי התאגדות חומצת אמינו לא טבעית משולבת וכימיה לחץ למטרות חיסון

כאן אנו מתארים זן סרוטיפ 1 של S. pneumoniae serotype 1 519/43 שניתן להנדס גנטית באמצעות יכולתו לרכוש באופן טבעי DNA ופלסמיד מתאבד. כהוכחה עקרונית נוצרה מוטציה איזוגנית בגן הפנאומוליזין (ply).

בניית מוטנטים בסרוטיפ 1 סטרפטוקוקוס דלקת ריאות זן 519/43

בזיהום Mycoplasma pneumoniae, בדיקות סרולוגיות יכולות להניב תוצאות טובות, אך עם ספציפיות נמוכה בגלל תגובה צולבת אימונולוגית. ה- ELISA ללכידת אנטיגן פנימית, המתוארת במאמר זה, מבטיחה ספציפיות גבוהה של מינים והוכחה כבדיקת סינון אמינה לאבחון מדויק של M. pneumoniae.

בדיקת חיסון הקשורה לאנזים לכידת אנטיגן לזיהוי ספציפי של דלקת ריאות מיקופלסמה

מערכת ניתוח זרימה פלואורסצנטית דו-ערוצית בעלת שלושה ערוצים שימשה לפיתוח מערכת חיסון מרובת חרוזים המבצעת בו זמנית דגימות סרום עבור IgG ו- IgM שהופקו כנגד אנטיגנים מרובים של מיני בורליה שונים הגורמים לבורליוזיס ליים באירופה ובצפון אמריקה.

זיהוי סימולטני של סוגי נוגדנים שונים בבדיקה סרולוגית מרובת משתתפים

למד שיטת סרוטיפינג ל-Streptococcus pneumoniae באמצעות לאטקס התלכדות. טכניקה זו מאפשרת זיהוי מהיר ופשוט של זנים פנאומוקוקליים במעבדות אבחון קליניות.

קופסית Serotyping של

גלה סרטונים נוספים