Analyzer הנייד מבוססת עכבה בזמן אמת ככלי להתוות מסלולים מולקולריים מעורבים ברעילות העצבית וneuroprotection בקו תאים עצבי
9 באוגוסט 2014
מבחני נוירוטוקסיות משופרים במבחנה יסייעו בזיהוי תרכובות נוירו-פרוטקטיביות חדשות. התועלת של מנתח תאים מבוסס עכבה בזמן אמת לקביעת ציטוטוקסיות והגנה ציטולוגית בקווי תאים עצביים ולתיחום המעורבות של מסלולי שליח שני, ובכך להשיג תובנה במנגנון ההגנה העצבית.
המטרה הכללית של פרוצדורה זו היא להשתמש בטכניקה מבוססת עכבה (impedance) כדי לעקוב בזמן אמת אחר הגנה תאית (cytoprotection) של שורת תאי עצבים, במטרה להגדיר את המעורבות של מסלולי שליחים שניים בתהליך ההגנה. דבר זה מושג תחילה על ידי גידול של שורת תאי עצבים בתנאים של התרבות בתוך מנתח תאים בזמן אמת המבוסס על עכבה. בשלב השני, רלוונטיים פוטנציאליים.
מסלולי שליחים שניים מעוכבים באופן פרמקולוגי לפני חשיפת שורת התאים לטיפולים נוירו-פרוטקטיביים. לאחר מכן, מעקבים אחר מצבה של שורת התאים העצביים באמצעות מנתח תאים בזמן אמת תחת התנאים הניסיוניים השונים. לבסוף, ניתן להשתמש בניתוח סטטיסטי כדי להעריך את המעורבות בזמן אמת של מסלולי השליחים השניים בהגנה התאית (cytoprotection) של התאים העצביים.
היתרון המרכזי של טכניקה זו על פני שיטות קיימות, כגון בדיקות נוירו-רעילות של נקודת סיום (endpoint neurotoxicity assays), הוא שהיא מאפשרת להעריך הגנה ורעילות של Tito בתאי קווי עצביים בזמן אמת ובתנאים נטולי סימון (label free). שיטה זו יכולה לסייע במתן מענה מהיר לשאלות בתחום הנוירוביולוגיה המולקולרית, על ידי תרומה להערכה בקיבולת גבוהה יותר (high throughput) של תרכובות נוירו-פרוטקטיביות פוטנציאליות in vitro, ועל ידי אספקת תובנות לגבי המנגנונים המולקולריים המעורבים בנוירו-פרוטקציה. התחל בשטיפה של שכבת קו תאים עצביים נצמדים. לדוגמה, כאן נעשה שימוש בתאי נוירובלסטומה אנושיים S-K-N-S-H עם PBS, ולאחר מכן בצע עיכול של התאים באמצעות טריפסין למשך חמש דקות ב-37 °C.
הסר את ה-trypsin באמצעות סנטריפוגציה ולאחר מכן השהה מחדש את התאים ב-10 milliliters של מצע פרליפרציה. לאחר ספירת התאים, דלל אותם לריכוז של 3 × 10⁵ תאים למיליליטר באמצעות מצע פרליפרציה נוסף, ולאחר מכן שווה את כל באערי ה-EPL 96 עם 100 microliters של מצע פרליפרציה במנדף לתרבית רקמות בטמפרטורת החדר. לאחר 30 דקות, הכנס את ה-EPL 96 לתחנת ניתוח תאים בזמן אמת בתוך אינקובטור פחמן דו-חמצני ב-37 °C והפעל את התוכנה של מנתח התאים בזמן אמת.
לאחר מכן, בעמוד הפריסה (layout page), בחרו את הבארות המתאימות לניסוי והזינו לתיבות העריכה בעמוד תוכנת התזמון את סוג התאים, מספר התאים, ואת השמות והריכוזים של התרכובות הכימיות הרלוונטיות, שכן שלב ראשון מוגדר מראש. עבור מדידת הרקע, בחרו ב"הוסף שלב" (add a step) והגדירו את שלב שני כך שימדוד את מדד התאים (cell index) מדי 15 דקות למשך 96 שעות. לאחר מכן, לחצו על "התחל" (start) כדי להפעיל את שלב ראשון ולמדוד את עכבת הרקע (background impedance) של המצע.
כעת הסירו את ה-EPL והוסיפו 100 µL של תרחיף תאי הנוירובלסטומה. בכל באער ניסויי, סובבו בעדינות את ה-EPL 96 כדי לצפות את הבאערים באופן אחיד, ולאחר מכן הדגירו את הפלטה בטמפרטורת החדר בתוך מ㠃 תרביות הרקמה כדי לאפשר לתאים לשקוע. לאחר חצי שעה, החזירו את ה-EPL 96 לתחנת מנתח התאים בזמן אמת והתחילו בשלב השני. כדי לנטר את ערכי מדד התאים לאורך הניסוי, צפו בעקומות התאים בדף הגרף ובנתוני מדד התאים הגולמיים בדף מדד התאים למשך 24 שעות.
לאחר זריעת התאים, השהו את הניסוי והוציאו את הפלטה מתחנת anlyzer התאים בזמן אמת. טפטפו מיקרוליטר אחד של המעכבים המדוללים הטריים הרלוונטיים לתוך כל באר, ולאחר טעינה מחדש של ה-EPL 96, חיזרו למדידות מדד התאים (cell index) הניסוייות לאחר 30 דקות. השהו שוב את הניסוי והסירו במהירות אך בזהירות את מצע השגשוג מכל באר, תוך הנחת קצה טיפ הפ pipette לפינת הבאר כדי למנוע פגיעה בשכבת התאים הדבקים. לאחר מכן, הוסיפו מיד 200 מיקרוליטר של מצע המחסיר סרום לכל באר, מיקרוליטר אחד של התרכובות הנוירופרוטקטיביות המדוללות הטריים הרלוונטיות, ומיקרוליטר אחד של מעכבי נתיבי השליח השני הרלוונטיים לבארים המתאימות.
לאחר מכן, המשיכו במדידות של מדד התא (cell index) בכל 15 דקות למשך 96 שעות כפי שהוגדר קודם לכן. כדי לנתח את הנתונים, בחרו כעת בדף הגרף בפונקציות של מדד תא מנורמל (normalized cell index) וזמן מנורמל (normalized time), כדי לנרמל את מדד התא לנקודת הזמן האחרונה לפני ביצוע השינויים בתרבית התאים, ובכך לצמצם את השונות בין הניסויים. סמנו בדף הגרף את הבארים המתאימים לתנאי הניסוי הרצויים ולחצו על "הוסף" (add) כדי להציג את עקומות מדד התא המנורמלות.
לאחר מכן, ייצאו את הנתונים הניסויים עבור כל נקודות הזמן של מדד התאים (cell index) מדף תוכנת מדד התאים לקובץ גיליון אלקטרוני, לצורך ניתוח סטטיסטי של ההבדלים בערכי מדד התאים תחת תנאי טיפול שונים בנקודות זמן ספציפיות. בחרו את ערכי מדד התאים בנקודות הזמן המתאימות בתוך קובץ הגיליון שהוצא. לבסוף, נתחו את ערכי מדד התאים עבור נקודות הזמן שנבחרו באמצעות ניתוח שונות (ANOVA) חד-כיווני או דו-כיווני, ולאחריו מבחן post hoc באמצעות תוכנה סטטיסטית. גירויים נוירוטוקסיים לתאים מובילים לירידה בערכי מדד התאים; כאן מוצגים בגרפים אלה עלייה במדד התאים כאשר תאי S-K-N-S-H גדלים במדיום פרוליפרציה, וירידה במדד התאים ואחריה התייצבות ברמות נמוכות חדשות לאחר העברת התאים למדיום של הרעבת סרום (serum deprivation medium).
ניתן להבחין בהשפעה הנוירופרוטקטיבית של שני אגוניסטים של קולטן סרוטונין 2a, DOI בריכוז 5 µM ו-IDE בריכוז 20 µM, שהוספו כאשר התאים הותאנו במצע עם חסך בסרום. שאלה חשובה במחקרי נוירופרוטקציה היא האם השפעה על התרבות התאים תורמת להשפעה הנצפית של התרכובת על הישרדות התאים. בגרף זה מוצג היעדר השפעה של טיפול ב-DOI בריכוז 5 µM על התרבות תאי SKNS, דבר המצביע על כך שהתרבות התאים אינה תורמת להשפעה הנוירופרוטקטיבית הנצפית.
בגרף סופי זה, ניתן להבחין בהשפעת הטיפול ב-10 micromolar של מעכב הפוספטידיל אינוזיטול 3-קינאז LY 2 9 4 0 0 2 על הישרדות תאים ובהשפעה הנוירופרוטקטיבית של DOI על תאי SK NSH בשקיעת סרום. LY 2 9 4 0 0 2 מנע את ההשפעה הנוירופרוטקטיבית של DOI במהלך שלב שקיעת הסרום, אך הפגין גם השפעה רעילה משלו. לאחר צפייה בסרטון זה, תהיה לכם הבנה טובה כיצד לעקוב אחר הגנה של CTO בשורת תאי עצבים באמצעות אנלייזר תאים בזמן אמת, וכיצד לאפיין את מעורבותם של מסלולי שליחים שניים בתהליך ההגנה.
צפו בתמליל המלא וקבלו גישה לאלפי סרטונים מדעיים
סקירה כללית
מחקר זה מציג טכניקה מבוססת עכבה (impedance) לניטור בזמן אמת של הגנה תאית (cytoprotection) בקווי תאים עצביים. מטרתו היא להבהיר את תפקידן של מסלולי שליחים שניים בהגנה עצבית באמצעות עיכוב פרמקולוגי וטיפולים נוירופרוטקטיביים.
מרכיבי מפתח במחקר
תחום המדע
- מדעי המוח
- ביולוגיה של התא
- נוירופרוטקציה
רקע
- בדיקות נוירו-טוקסיות הן חיוניות לזיהוי תרכובים נוירו-פרוטקטיביים.
- ניטור בזמן אמת יכול לספק תובנות לגבי ציטוטקסיות וציטופרוטקציה.
- מסלולי שליחים שניים חשובים בתהליך הנוירו-פרוטקטיבי.
- טכניקות מבוססות עכבה מאפשרות מעקב רציף אחר בריאות התאים.
מטרת המחקר
- שימוש במנתח תאים מבוסס עכבה (impedance) לניטור בזמן אמת.
- בחינת מעורבותם של מסלולי שליחים שניים (second messenger pathways) בנוירופרוטקציה.
- הערכת ההשפעות של עיכוב פרמקולוגי על קווי תאים עצביים.
שיטות שנעשה בהן שימוש
- גידול של שורות תאים עצביים בתנאים פרוליפרטיביים.
- עיכוב פרמקולוגי של מסלולי שליחים שניים.
- יישום של טיפולים נוירו-פרוטקטיביים.
- ניתוח בזמן אמת של מצב התאים באמצעות אנלייזר מבוסס עכבה (impedance).
תוצאות עיקריות
- ניטור בזמן אמת עוקב ביעילות אחר הגנה על תאים (cytoprotection) בתאי עצבים.
- ניתוח סטטיסטי חושף את תפקידן של מסלולי שליחים שניים.
- התערבויות פרמקולוגיות עשויות לשנות תוצאות של הגנה עצבית.
- השיטה מספקת פלטפורמה חסונה להערכת נוירוטוקסיות.
מסקנות
- טכניקות מבוססות עכבה (Impedance) הן בעלות ערך רב למחקר של נוירופרוטקציה.
- הבנת מסלולי שליחים שניים עשויה להוביל לאסטרטגיות טיפוליות חדשות.
- גישה זו משפרת את הזיהוי של תרכובות נוירופרוקטיביות.
שאלות נפוצות
רלוונטיות תעשייתית למנהלים
ניתוח מבוסס עכבה (impedance) בזמן אמת מאפשר ניטור רציף וללא סימון (label-free) של השפעות נוירופרוטקטיביות ונוירוטוקסיות בקווי תאים עצביים, ובכך נותן מענה למגבלה מרכזית של בדיקות נקודת-סוף (endpoint assays). גישה זו תומכת בהפחתת סיכונים מכניסטיים על ידי קישור השפעות של תרכובות למעורבות של מסלולי שליחים שניים, ובכך משפרת את רמת הביטחון החזויה בבחירה מוקדמת של מועמדים לנוירופרוטקציה. השיטה מחזקת את הרצף התרגומי (translational continuity) באמצעות אספקת נתונים קינטיים וספציפיים למסלול, המנחים החלטות של המשך או עצירה (go/no-go) בתהליך תיקוף מטרות למחלות נוירודגנרטיביות.
יישומים אסטרטגיים במחקר ופיתוח בביופארמה
גילוי מוקדם ותיקוף מטרה
- ערך מדעי: מאפשר בחינה של היפותזות טיפוליות על ידי קישור השפעות נוירופרוטקטיביות למסלולי שליחים שניים ספציפיים באמצעות עיכוב פרמקולוגי.
- ערך תפעולי: מספק קריאות כמותיות של מדד תאים (Cell Index) בזמן אמת, המבהירות את תרומתם של מסלולים ללא צורך בסימון או בקיבוע סופי.
- ערך ניבוי: תומך במיון תיקי פיתוח על ידי הבחנה בין נוירופרוטקציה שאינה תלויה בשגשוג לבין גורמים מטעים ציטוטוקסיים או מיטוגניים.
סריקה ופיתוח בדיקות
- ערך מדעי: מייצר פרופילים קינטיים מנורמלים המבחינים בין תגובות נוירופרוטקטיביות חולפות לתגובות מתמשכות בריכוזים שונים של התרכובת.
- ערך תפעולי: סטנדרטיזציה של תנאי הבדיקה באמצעות E-Plates ומדידות עכבה אוטומטיות במרווחי זמן של 15 דקות לאורך 96 שעות.
- ערך חיזוי: מאפשר סריקה בהספק גבוה של תרכובות נוירופרוטקטיביות עם בקרות מובנות להרעבה מסרום (serum deprivation) וטיפול משולב במעכבים.
מחקר תרגומי ופרה-קליני
- ערך מדעי: תואם מערכות רלוונטיות למחלה על ידי מידול סטרס המושרה על ידי חסר בסרום בתאי נוירובלסטומה אנושיים SK-N-SH.
- ערך תפעולי: מאפשר מעבר חלק משלב הגילוי לוולידציה פרה-קלינית על ידי שימור הקשרי היצמדות ואיתאות טבעיים.
- ערך ניבוי: מפחית סיכונים בשלבי ההתקדמות על ידי אישור השאלה האם ההשפעות שנצפו נובעות מציטופרוטקציה אמיתית או משינויים ארטיפקטואליים בריבוי התאים.
שילוב תהליכי עבודה וצנרת עיבוד (Pipeline)
השיטה משתלבת בתהליכי עבודה של גילוי מוקדם על ידי מיקום של פרופיל עכבה (impedance profiling) בין אישור פגיעות ראשוניות (primary hit confirmation) לבין אופטימיזציה של מובילים (lead optimization), במיוחד עבור מטרות המערבות נוירופרוטקציה המתווכת על ידי GPCR.
- ביולוגיה של גילוי: תומך בבדיקת היפותזות לגבי יעילות של אגוניסטים ל-5-HT2A וניתוח של מסלולים רכיבים באמצעות עיכוב על ידי LY294002.
- סינון: מספק מוכנות של הבדיקה באמצעות נרמול ניתן לשחזור של Cell Index לבסיסי נתונים שלפני הטיפול.
- אנליטיקה: מאפשר השוואה סטטיסטית של יעילות נוירופרוטקטיבית באמצעות נתוני נקודות זמן מנורמלים ו-ANOVA עם בדיקת post hoc.
- מחקר תרגומי: מקשר להתאמת סממנים ביולוגיים על ידי מעקב אחר השפעות עיכוב ספציפיות למסלול על עקומות ציטופרוטקציה.
- שימוש חוזר ארגוני: משמש כפלטפורמה רב-פעמית לכל קמפיין סינון של תרכובות נוירופרוטקטיביות או נוירוטוקסיות הדורשות קינטיקה בזמן אמת.
השפעה תפעולית ועסקית
- ערך מדעי: מגביר את הביטחון בתיקוף המטרה על ידי הפחתת הסיכון הנובע מעמימות מכניסטית במסלולי נוירופרוטקציה.
- ערך תפעולי: מבטיח הדירות באמצעות בקרות סביבתיות אוטומטיות וחשיפת עכבה (impedance) ללא סימון.
- ערך אסטרטגי: משפר את יעילות ההון על ידי צמצום התקדמויות שגויות באמצעות זיהוי מוקדם של השפעות התלויות במסלול.
- השפעה על הפורטפוליו: מאפשר תיעודוף של תרכובות מותאם סיכון, המבוסס על עמידות cytoprotection בזמן אמת ובהירות המכניזם.
שיקולי יישום
- דורש מומחיות בתרביות תאים עצביים ובהפעלה של אנליזר מבוסס עכבה (impedance).
- תלוי בזמינות של E-Plate ובגישה לתחנת אנליזה של תאים בזמן אמת.
- מחייב סטנדרטיזציה בין-צוותית של פרוטוקולי נורמליזציה ותוכניות לניתוח סטטיסטי.
- כולל שיקולי התאמה בעת הרחבה לנוירונים ראשוניים או לקווי תאים עצביים חלופיים.
- מוגבל למודלים של תאים נצמדים; תרביות שאינן נצמדות או תרביות בסספנסיה דורשות פלטפורמות חלופיות.
