Analyzer הנייד מבוססת עכבה בזמן אמת ככלי להתוות מסלולים מולקולריים מעורבים ברעילות העצבית וneuroprotection בקו תאים עצבי

המטרה הכוללת של הליך זה היא להשתמש בטכניקה מבוססת עכבה כדי לעקוב אחר הגנת הציטו בזמן אמת של קו תאים עצבי כדי לתאר את המעורבות של מסלולי שליח שני בתהליך ההגנה. זה מושג על ידי תרבית ראשונה של קו תאים עצביים בתנאי שגשוג במנתח תאים בזמן אמת מבוסס עכבה. בשלב השני, פוטנציאלית רלוונטית.

מסלולי שליח שני מעוכבים פרמקולוגית לפני שהם מכניסים את קו התאים לטיפולים נוירו-פרוטקטיביים. לאחר מכן, עוקבים אחר הסטטוס של קו התאים העצביים באמצעות מנתח תאים בזמן אמת בתנאי הניסוי השונים. בסופו של דבר, ניתן להשתמש בניתוח סטטיסטי כדי להעריך את המעורבות בזמן אמת של מסלולי שליח שני בהגנת הציטו של תאי העצב

היתרון העיקרי של טכניקה זו על פני שיטות קיימות כמו מבחני נוירוטוקסיות בנקודות קצה, הוא שהיא מאפשרת להעריך את הגנת טיטו ורעילות טיטו בשורות תאים עצביים בזמן אמת ובתנאים ללא תווית. שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלות מהירות בתחום הנוירוביולוגיה המולקולרית על ידי תרומה להערכת תפוקה גבוהה יותר של תרכובות נוירו-פרוטקטיביות פוטנציאליות במבחנה, ועל ידי מתן תובנה לגבי המנגנונים המולקולריים המעורבים בהגנה עצבית. לדוגמה, כאן, משתמשים בתאי S-K-N-S-H אנושיים עם PBS ואז מנסחים את התאים למשך חמש דקות ב-37 מעלות צלזיוס.

הסר את הטריפסין על ידי צנטריפוגה ולאחר מכן השהה מחדש את התאים ב -10 מיליליטר של מדיום התפשטות. לאחר ספירת התאים מדללים את התאים לשלושה פעמים 10 עד חמישית תאים לריכוז מיליליטר עם מדיום התפשטות רב יותר, ואז מאזנים כל באר של EPL 96 עם 100 מיקרוליטר של מדיום התפשטות במכסה המנוע של תרבית רקמה בטמפרטורת החדר. לאחר 30 דקות, הכנס את ה-EPL 96 לתחנת מנתח תאים בזמן אמת בחממת פחמן דו חמצני ב-37 מעלות צלזיוס והפעל את תוכנת מנתח התאים בזמן אמת.

לאחר מכן, בדף הפריסה, בחר את הבארות המתאימות לניסוי והזן את מספר התא של סוג התא ואת השמות והריכוזים של התרכובות הכימיות המעניינות בתיבות העריכה בדף תוכנת לוח הזמנים כאשר שלב ראשון מוגדר מראש. למדידת הרקע, בחר הוסף שלב והגדר את שלב שני למדידת אינדקס התא כל 15 דקות למשך 96 שעות. לאחר מכן לחץ על התחל כדי להתחיל את השלב הראשון ולמדוד את עכבת הרקע של המדיה.

כעת הסר את ה- EPL והוסף 100 מיקרוליטר של תרחיף תאי הנוירובלסטומה. לכל באר ניסוי סובבו בעדינות את ה-EPL 96 כדי לצפות את הבארות באופן שווה, ולאחר מכן דגרו את הצלחת בטמפרטורת החדר במכסה המנוע של תרבית הרקמה כדי לאפשר לתאים להתיישב לאחר חצי שעה, טענו את ה-EPL 96 בחזרה לתחנת מנתח התאים בזמן אמת והתחילו את השלב השני. כדי לנטר את ערכי אינדקס התאים לאורך הניסוי, הצג את עקומות התאים בדף העלילה ואת נתוני אינדקס התאים הגולמיים בדף אינדקס התאים 24 שעות.

לאחר ציפוי התאים, השהה את הניסוי והסר את הצלחת מתחנת מנתח התאים בזמן אמת. הוצא מיקרוליטר אחד של המעכבים המדוללים הטריים המעניינים לכל באר ולאחר מכן לאחר טעינה מחדש של ה- EPL 96 המשך את מדידות אינדקס התאים הניסיוני לאחר 30 דקות, השהה שוב את הניסוי והסר במהירות אך בזהירות את מדיום הריבוי מכל באר תוך הכוונת קצה הפיפטה לפינת הבאר כדי למנוע הפרעה לשכבת התא הדביקה. לאחר מכן הוסף מיד 200 מיקרוליטר של מדיום חסך בסרום לכל באר, מיקרוליטר אחד של תרכובות נוירו-פרוטקטיביות מדוללות טריות מעניינות, ומיקרוליטר אחד של מעכבי מסלול השליח השני המעניינים לבארות המתאימות.

לאחר מכן המשך במדידות אינדקס התאים כל 15 דקות למשך 96 שעות כפי שהוגדר קודם לכן כדי לנתח את הנתונים, כעת בחר את אינדקס התאים המנורמל ופונקציות הזמן המנורמל בדף העלילה כדי לנרמל את אינדקס התאים לנקודת הזמן האחרונה לפני השינויים בתרבית התאים. כדי להפחית את השונות בין הניסויים. סמן את הבארות בדף העלילה עבור תנאי הניסוי המעניינים ולחץ על הוסף כדי להתוות את עקומות אינדקס התאים המנורמלות.

לאחר מכן ייצא את נתוני הניסוי עבור כל נקודות הזמן של אינדקס התאים מדף תוכנת אינדקס התאים לקובץ גיליון אלקטרוני לניתוח סטטיסטי של ההבדלים בערכי אינדקס התאים בתנאי הטיפול השונים בנקודות זמן ספציפיות. בחר את ערכי אינדקס התאים בנקודות הזמן המתאימות להם בקובץ הגיליון האלקטרוני המיוצא. לבסוף, נתח את ערכי אינדקס התאים עבור נקודות הזמן שנבחרו עם ניתוח שונות חד כיווני או דו-כיווני, ואחריו מבחן פוסט הוק באמצעות תוכנה סטטיסטית גירויים נוירוטוקסיים לתאים מובילים לירידה בערכי אינדקס התא כאן עלייה באינדקס התא כאשר תאי S-K-N-S-H גדלים במדיום התפשטות וירידה באינדקס התא ואחריה התייצבות ברמות התחתונות החדשות לאחר מכן החלפת התאים למדיום חסך בסרום מוצגים בגרפים אלה.

ניתן לראות את ההשפעה הנוירו-פרוטקטיבית של שני אגוניסטים של קולטן סרוטונין שני חמישה מיקרומולריים, DOI ו-20 מיקרו-מולרי IDE שנוספו כאשר התאים הוזנו במחסור בסרום, ניתן להבחין במדיום. שאלה חשובה במחקרי הגנה עצבית היא האם השפעה על התפשטות התאים תורמת להשפעה המורכבת הנצפית על הישרדות התא. בגרף זה, מוצג היעדר ההשפעה של טיפול DOI של חמישה מיקרו-מולרים על התפשטות תאי SKNS, מה שמצביע על כך שההתפשטות אינה תורמת לאפקט הנוירו-פרוטקטיבי שנצפה.

בגרף אחרון זה, ניתן לראות את השפעת הטיפול ב-10 מיקרומולר של מעכב שלושת הקינאז הראשוניים של פוספטידיל LY 2 9 4 0 0 2 על הישרדות התאים וההשפעה הנוירו-פרוטקטיבית של DOI על תאי SK NSH חסרי סרום. LY 2 9 4 0 0 2 מנע את ההשפעה הנוירו-פרוטקטיבית של DOI בשלב החסך בסרום, אך גם הראה השפעה רעילה משלו. לאחר צפייה בסרטון זה, אתה אמור להבין היטב כיצד לעקוב אחר הגנת CTO בקו תאים עצבי באמצעות מנתח תאים בזמן אמת, ולתחם את המעורבות של מסלולי שליח שני בהגנה.