הקלטות ארוכות טווח בו זמנית בשני שלבים עצביים עיבוד במתנהגים דבורי דבש
July 21st, 2014
הקלטות ארוכות טווח תאיים בו זמנית משני neuropiles המוח שונה או שני קטעים אנטומיים שונים הוקמו בדבורי דבש. הקלטות אלה מאפשרות החקירה של היבטים זמניים של עיבוד עצבי על פני אזורים שונים במוח בנוירון הבודד, כמו גם ברמת ההרכב בבעלי חיים מתנהגים.
המטרה הכוללת של הליך זה היא לחקור ציפוי ריח ויצירת זיכרון באמצעות גישה ארוכת טווח לשני שלבי עיבוד עצביים עצמאיים בתוך דבורי דבש מתנהגות. זה מושג על ידי הרכבה ראשונה של אלקטרודות רב-ערוציות בעלות נמוכה מחוטי מיקרו נחושת מבודדים ומחזיקים בהתאמה אישית. השלב הבא הוא להכין דבורת דבש חיה על ידי הסרת חלק מקפסולת הראש שלה כדי להכניס שתי אלקטרודות שטופלו בצבע פלואורסצנטי למוח החשוף.
השלב השלישי הוא להקליט משתי גלולות נוירולוגיות עצמאיות או מסלולים במסלול הריח, תוך גירוי עם ריחות פרחים ופרומונים. מאוחר יותר, לאחר ניתוח המוח, מוזרק עוקב פלואורסצנטי אחר לאונה של האנטנה כדי למלא מחדש את נוירוני המטרה. המסלולים הממולאים מחדש ומעקב האלקטרודות מוצגים לאחר מכן כדי לייצר שחזור תלת מימדי של הארכיטקטורה העצבית.
בסופו של דבר, ניתן להבין טוב יותר את הקשרים בציפוי הריח בין שתי אוכלוסיות הנוירונים ברמות עיבוד שונות כמו אונת האנטנה וגוף הפטרייה באמצעות הטכניקות האלה. אז היתרונות העיקריים של הטכניקה הזו של השיטות הקיימות הם שהאלקטרודות הרב-ערוציות שלנו קטנות מאוד וניתן להשתמש בהן בשילוב, כלומר אנו יכולים להקליט בו זמנית באזורים שונים במוח לאחר העיגון. החוטים הגמישים מאפשרים זיכרון יציב למשך מספר שעות בבעלי חיים מתנהגים.
שיטה זו יכולה לסייע לענות על שאלות מפתח בתחום הנוירופתולוגיה, כגון הבנת האופן שבו בעלי חיים מקבלים, תופסים ולבסוף מחשבים מפעלי זאבים בחיים מסביבתם. טכניקת הקלטה כפולה זו יכולה לספק תובנה לגבי המנגנון הבסיסי של קידוד ריח ורשתות עצביות באופן כללי. ניתן ליישם אותו גם על אורגניזמים מודלים אחרים בחסרי חוליות או חיבה ונוירוביולוגיה.
באופן כללי, אנשים חדשים בשיטה זו יתקשו מכיוון שנדרש אימון רב כדי לזהות נוירונים של דבורת דבש באמצעות ציוני דרך מורפולוגיים בלבד כמו האונה הפנימית או האונה האנכית של גוף הפטרייה. עבור פרוטוקול זה, בנה מתאם אלקטרודה שיתאים ללוח ממשק אלקטרודה סטנדרטי. ראשית הלחמו שלוש חתיכות קצרות של חוטים מבודדים למחבר 18 פינים.
לאחר מכן חותכים חתיכת צלחת פרספקס ומכניסים חריץ רדוד לאורך הצד הארוך ביותר. לאחר מכן, הברג זיזי הלחמה לתוך צלחת הפרספקס והדבק את הצלחת על החלק העליון של המחבר. לאחר מכן חבר את הבסיס לזיזים באמצעות שלושת החוטים הקצרים.
לאחר מכן, מקם נימי זכוכית לתוך החריץ של צלחת הפרספקס. הנימים צריכים להיות מסוגלים להחליק ולהיות מאובטחים על ידי בורג בעזרת סיכה זעירה, הרחיבו את נימי הזכוכית כלפי חוץ כחמישה מילימטרים. הנימים והסיכה ישמשו לתמיכה וייצוב של חוטי המיקרו של האלקטרודות.
לאחר מכן, מקם שלושה מיקרו-חוטים. בעזרת סרט דבק לגישה טובה יותר, ניתן להסיר את נימי הזכוכית באמצעות דבק מחט הלחמה 12 וולט. החוטים יחד עם שעוות שיניים LMP אינם מדביקים את השליש האחרון של החוטים.
כעת חבר את מכלול חוטי המיקרו הרב-ערוצי הזה למתאם האלקטרודה. מקם את נימי הזכוכית המורחבים במקביל לחוטי המיקרו. אבטח את החיבור הזה עם שעווה דנטלית לאורך נימי הזכוכית החופפים והסיכה הדקה.
לאחר מכן חתוך את חוטי האלקטרודה והשאיר שניים עד שלושה סנטימטרים המשתרעים מהסיכה הדקה ושניים עד שלושה סנטימטרים המשתרעים מקצה האלקטרודה. לאחר מכן, אבטח את הנימים לתוך מתאם האלקטרודה והשתמש בבורג כדי לייצב את הכל במקום. ב-360 מעלות צלזיוס.
הלחמו את קצות החוטים בניצב לזיזים. לאחר מכן בדוק שיש מגע חשמלי חזק מספיק על ידי בדיקה שהעכבה שלהם היא כ -300 קילו אוהם בקילוהרץ אחד. כעת חבר את התעלות של מתאם האלקטרודה השני לאלקטרודה הראשית והלחם את אלקטרודות הייחוס והשריר לבסיס האלקטרודות הראשיות.
לבסוף, התקן את האלקטרודה הראשית ללוח הממשק של שלב הראש. תקן את האלקטרודה השנייה במתאם נפרד לאחר השגת דבורי הדבש מצננים אחת על קרח עד שהיא משותקת. לאחר מכן, תקן את הדבורה במחזיק פרספקס רגיל כשהראש חשוף.
מרחו שעווה דנטלית מחוממת על בסיס העיניים ועל הצומת בין הראש לבית החזה, ובכך אבטחו את הראש. המשך להשתמש בשעווה כדי לשתק את עין הנוף של האנטנות על קפסולת הראש. הימנע ממריחת שעווה על הפגל, שצריך להצביע קדימה.
ה-Pro Bois צריך להיות חופשי מפגיעה. בדוק שהוא יכול לזוז. כעת גלח את קפסולת הראש כדי לשפר את הנגישות.
לאחר מכן האכילו את הדבורה בכל 30% הסוכרוז שהיא תצרוך. זה מבטיח הכנה טובה, כדאיות ולחות רקמות. כעת באמצעות אזמל מיקרו, חתוך אנכית לאורך גבול העין ואופקית מעל בסיסי האנטנה.
המשך לחתוך מתחת לעין תא ה-O והסר את הציפורן הרופפת. יש להזיז את בלוטות הלוע ההיפו-לוע הצידה, וכך גם קנה הנשימה. זה יפנה את הדרך להכנסת האלקטרודה.
התחל בהכנסת אלקטרודת הייחוס, חוט כסף 35 מיקרון. ראשית, בצע חתך קטן בעין המורכבת המקבילה. ואז תחוב את האלקטרודה דרכה.
לאחר מכן, הכנס את החוט השני לאזור הקרנת השריר מתחת לעין תא ה-O הרוחבית. כדי לדמיין מאוחר יותר את מיקומי האלקטרודות, טבלו את האלקטרודות בתמיסה של 0.5 אשלגן כלורי מולרי, ו-5% Alexa Hydrocyte 4 88 למשך שלוש דקות. לאחר מכן, באמצעות מניפולטורים זעירים ממקמים את שתי האלקטרודות לתוך המוח.
התמצאו על ידי זיהוי אונת האנטנה והאונה האנכית של גוף הפטרייה. כאן אלקטרודה אחת נמצאת במערכת אונת האנטנה הרוחבית בעומק 180 מיקרון והשנייה במערכת אונת האנטנה המדיאלית. הוכנס בעומק של כ -300 מיקרון.
השלם את מיקומי האלקטרודות על ידי עיגון באמצעות שני רכיבים. סיליקון מכסה את כל החלל שמעל המוח, מה שימנע גם את התייבשות הרקמות. לאחר מכן המשך בביצוע הקלטות כדי לחלץ את פעילות היחידה מהאות המוקלט החוץ-תאי.
השתמש בתוכנת מיון ספייק זמינה. השתמש בתעלות האלקטרודות המובחנות. החל טכניקות התאמת תבניות בו-זמנית על כל שלושת ערוצי האלקטרודות כדי לזהות שילובי צורות גל שונים המהווים אירועי ספייק בודדים.
ולבסוף, בקרה על הפרדה נכונה של יחידות. שימוש בניתוח רכיבים עקרוני על אירועי הספייק הבודד של שלושת ערוצי האלקטרודות המובחנים שתועדו. לאחר ביצוע ההקלטות, הסר בזהירות את הסיליקון והאלקטרודות מהדבורה.
לאחר מכן, שטפו את המוח בתמיסת צלצול דבורים והסירו את הבלוטות וקנה הנשימה. לאחר מכן באמצעות מיקרו פיפטה להזריק לאונה האנטנה, 5% מיקרו אודם מומס באשלגן אצטט טוחנת אחת. זה יספק תווית אנטרוגרדית למסלולי האונה.
מכאן והלאה, בצע את כל הצעדים בחושך מקסימלי. שטפו את המוח עם צלצולי דבורים שוב, שלוש פעמים, והניחו לצבע לדגור במשך 30 עד 45 דקות. משתקים את הדבורה על ידי קירורה במקרר.
לאחר מכן בודד את המוח. קבע את המוח ב-4%Para aldehyde ב-0.1 PBS מולארי למשך הלילה בארבע מעלות צלזיוס ועם תסיסה עדינה. עקוב אחר זה עם פרוטוקולים סטנדרטיים להתייבשות וניקוי לאחר מילוי חוזר של נוירוני הקרנה באונה האנטנה עם עוקב מיקרו אודם, תצוגת הקרנה של נוירונים אלה הורכבה מפרוסות אורטו לאורך ציר Z.
צבע Alexa Hydrocyte 4 88 על שתי האלקטרודות מראה את החדרתן באונה האנטנה המדיאלית ובנתיב אונת האנטנה הרוחבית. שחזור תלת מימדי של תאי המטרה המוכתמים ואתרי החדרת האלקטרודות שימש ליצירת סכמטי של שני המסלולים הנמתחים של אונות האנטנה, הקלטה בו זמנית משתי דרכי אונות האנטנה תוך גירוי הדבורה בריכוזי ריח שונים שימשה לחקירת עיבוד זמני. הפעילות הוערכה בשלבי העיבוד הבאים.
נוירוני הקרנת אונת האנטנה וניתוח מרכיבי העיקרון של הנוירונים החיצוניים של וקטורי האוכלוסייה מדגימים כי הריח בנוירוני ההקרנה היה ממושך והחזיק מעמד מעבר לגירוי. לעומת זאת, באוכלוסיית הנוירונים החיצוניים, היו מיוצגים רק סוגי ריח וריח כבוי. אז בצפייה בפעילות עם הזמן, אוכלוסיית הנוירונים החיצוניים מימין מראה פעילות הפרדת ריח מעט לפני שאוכלוסיית נוירוני ההקרנה מתחילה לפתח את הפעילות המושרה על ידי ריח.
גירוי ריח מסומן באפור. לאחר השליטה, לוקח בערך 30 דקות לבנות אלקטרודה. הכנת הדבורה והחדרת האלקטרודות לאזורי המטרה יכולה להיעשות בעוד חצי שעה אם היא מבוצעת כראוי.
בזמן ניסיון הליך זה, חשוב לזכור שכל שלב דורש הרבה תרגול וסבלנות עד ששולטים בו. היזהר במיוחד בעת הרמת חוטי האלקטרודה לנקודות החיבור שלהם והקלטת מהישג המוח הרצוי. נדרש ידע מוצק באנטומיה של מוח דבורת הדבש לאחר התפתחותו.
טכניקה זו אפשרה לחוקרים בתחום הנוירופתולוגיה וחוש הריח של חרקים לחקור את הקשרים הזמניים המדויקים בין פעילותם של מסלולים עצביים שונים ומרכזי מוח בדבורי דבש מתנהגות. לאחר צפייה בסרטון זה, אתם אמורים להבין היטב כיצד לבנות ולהשתמש באלקטרודות מיקרו-חוטים רב-ערוציות כדי להקליט בו-זמנית משני אזורי מוח ודבורי דבש מתנהגות. אתה אמור גם להיות מסוגל לדמיין את המיקומים המדויקים של אלקטרודות ההקלטה שלך.
סקירה כללית
המחקר הזה מציג שיטה להקלטות אקסטרא-סלולריות סימולטניות לטווח ארוך מתוך שני נוירופילים מוחיים שונים בדבורים. הטכניקה מאפשרת חקירה של עיבוד עצבי על פני אזורי מוח מובחנים הן ברמת נוירון בודד והן ברמת הרכבה בחיות מתנהגות.
מרכיבי מחקר מרכזיים
תחום המדע
- נוירו-מדע
- אלקטרופיזיולוגיה
- ביולוגיה התנהגותית
רקע
- הבנת העיבוד החוש הריח בדבורים היא חיונית לתובנות על היווצרות זיכרון.
- שיטות קודמות חסרו את היכולת להקלטות סימולטניות מאזורי מוח מרובים.
- דבורים משמשות כאורגניזם מודל לחקר רשתות עצביות מורכבות.
- חקירת מנגנוני קידוד ריח יכולה לשפר את הבנתנו את העיבוד החושי.
מטרת המחקר
- לחקור את קידוד הריח והיווצרות הזיכרון בדבורים.
- לפתח טכניקה להקלטות סימולטניות משלבי עיבוד עצבי שונים.
- להבין את היחסים בקידוד הריח בין אוכלוסיות נוירונים.
שיטות ששימשו
- הרכבת אלקטרודות רב-ערוציות בעלות עלות נמוכה מחוטי נחושת מבודדים.
- הכנת הדבורים להכנסת אלקטרודה על ידי הסרת חלק מקפסולת הראש.
- הקלטת פעילות עצבית תוך גירוי בריחות פרחוניים ופרומונים.
- ויזואליזציה של הארכיטקטורה העצבית באמצעות מעקבים פלואורסצנטיים ושחזור תלת-ממדי.
תוצאות עיקריות
- הקלטות סימולטניות מוצלחות מן האנטנה הלובית ומגוף הפטרייה.
- הבנה משופרת של מנגנוני קידוד הריח בדבורים.
- הוכחת יציבות של אלקטרודות רב-ערוציות להקלטות ממושכות.
- הבנה של הרשתות העצביות המעורבות בעיבוד החוש הריח.
מסקנות
- טכניקה זו מאפשרת הבנה עמוקה יותר של אופן עיבוד המידע החוש הריח אצל דבורים.
- ניתן להתאים אותה לשימוש באורגניזמים מודל אחרים בנוירוביולוגיה.
- יישומים עתידיים עשויים לטפל בשאלות מפתח בנוירופתולוגיה ובעיבוד חושי.
שאלות נפוצות
Executive Industry Relevance
This method enables simultaneous long-term extracellular recordings from two distinct neuronal processing stages in behaving honeybees, providing a unique capability to investigate temporal dynamics in olfactory processing pathways. By capturing multi-unit activity from both the antennal lobe and mushroom body—or parallel tracts connecting them—researchers can de-risk mechanistic hypotheses about sensory integration and memory formation. The approach supports predictive confidence in target validation by revealing how odor-evoked signals propagate across brain regions over time, informing translational models of neural circuit function.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses by tracking odor-evoked activity across sequential neuropils to clarify pathway-specific contributions to behavior.
- Operational Value: Provides stable, multi-channel recordings over many hours, reducing variability in longitudinal target engagement studies.
- Predictive Value: Supports mechanistic de-risking by distinguishing sustained versus transient neuronal responses, informing target selectivity and functional relevance.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Generates quantifiable, time-resolved neurophysiological outputs that can serve as biomarkers for compound effects on olfactory processing.
- Operational Value: Uses differentially amplified micro-wire electrodes to minimize noise and verify signal origin, enhancing assay reproducibility.
- Scalability: Electrode assembly from insulated copper wires allows low-cost, replicable preparation for multi-condition screening.
Translational & Preclinical Research
- Translational Continuity: Links early sensory processing in the antennal lobe to higher-order integration in the mushroom body, modeling perceptual-to-memory transformation.
- Predictive Confidence: Reveals temporal dissociation in odor responses between neuron populations, supporting biomarker alignment for cognitive or sensory-modulating compounds.
- Disease-Relevant System: Offers a genetically tractable invertebrate model to study conserved principles of sensory gating and adaptive filtering.
Pipeline & Workflow Integration
The technique fits within the discovery continuum by enabling hypothesis-driven interrogation of neural circuit dynamics, supporting lead identification through functional readouts of target engagement, and informing preclinical decisions via mechanistic de-risking of sensory processing pathways.
- Discovery Biology: Supports pathway clarification by comparing activity in antennal lobe (early processing) and mushroom body (integration center) during odor stimulation.
- Screening: Delivers reproducible, multi-unit extracellular recordings that allow comparison of compound effects across independent neuronal tracts.
- Analytics: Employs spike sorting, template matching, and principal component analysis to resolve single-spike events and population-level dynamics.
- Translational Research: Connects immediate odor responses to longer-term neuronal plasticity, relevant for modeling learning and memory processes.
- Enterprise Reuse: Electrode design is adaptable across model organisms and brain regions, promoting platform-level standardization.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Reduces mechanistic ambiguity by revealing how odor identity and timing are represented across sequential processing stages.
- Operational Value: Electrode flexibility enables stable recordings in behaving animals for hours to days, improving data yield and reducing attrition.
- Strategic Value: Informs go/no-go decisions by providing direct evidence of target modulation in vivo, decreasing reliance on surrogate endpoints.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of compounds based on their effects on temporal coding fidelity in sensory pathways.
Implementation Considerations
- Requires expertise in honeybee brain anatomy and microsurgical techniques for head capsule preparation and electrode targeting.
- Depends on micro-manipulation tools, fluorescent tracers, and spike sorting software for signal validation and 3D reconstruction.
- Necessitates standardization across teams for electrode impedance testing (~300 kΩ at 1 kHz) and reference electrode placement.
- Adaptation to other model systems requires adjustment of electrode size, insertion depth, and brain stabilization methods.
- Practical limitations include the need for extensive training to identify neuronal tracts via anatomical landmarks and the invasiveness of chronic implantation.
