הקלטות ארוכות טווח בו זמנית בשני שלבים עצביים עיבוד במתנהגים דבורי דבש
21 ביולי 2014
הקלטות ארוכות טווח תאיים בו זמנית משני neuropiles המוח שונה או שני קטעים אנטומיים שונים הוקמו בדבורי דבש. הקלטות אלה מאפשרות החקירה של היבטים זמניים של עיבוד עצבי על פני אזורים שונים במוח בנוירון הבודד, כמו גם ברמת ההרכב בבעלי חיים מתנהגים.
המטרה הכוללת של הליך זה היא לחקור ציפוי ריח ויצירת זיכרון באמצעות גישה ארוכת טווח לשני שלבי עיבוד עצביים עצמאיים בתוך דבורי דבש מתנהגות. זה מושג על ידי הרכבה ראשונה של אלקטרודות רב-ערוציות בעלות נמוכה מחוטי מיקרו נחושת מבודדים ומחזיקים בהתאמה אישית. השלב הבא הוא להכין דבורת דבש חיה על ידי הסרת חלק מקפסולת הראש שלה כדי להכניס שתי אלקטרודות שטופלו בצבע פלואורסצנטי למוח החשוף.
השלב השלישי הוא להקליט משתי גלולות נוירולוגיות עצמאיות או מסלולים במסלול הריח, תוך גירוי עם ריחות פרחים ופרומונים. מאוחר יותר, לאחר ניתוח המוח, מוזרק עוקב פלואורסצנטי אחר לאונה של האנטנה כדי למלא מחדש את נוירוני המטרה. המסלולים הממולאים מחדש ומעקב האלקטרודות מוצגים לאחר מכן כדי לייצר שחזור תלת מימדי של הארכיטקטורה העצבית.
בסופו של דבר, ניתן להבין טוב יותר את הקשרים בציפוי הריח בין שתי אוכלוסיות הנוירונים ברמות עיבוד שונות כמו אונת האנטנה וגוף הפטרייה באמצעות הטכניקות האלה. אז היתרונות העיקריים של הטכניקה הזו של השיטות הקיימות הם שהאלקטרודות הרב-ערוציות שלנו קטנות מאוד וניתן להשתמש בהן בשילוב, כלומר אנו יכולים להקליט בו זמנית באזורים שונים במוח לאחר העיגון. החוטים הגמישים מאפשרים זיכרון יציב למשך מספר שעות בבעלי חיים מתנהגים.
שיטה זו יכולה לסייע לענות על שאלות מפתח בתחום הנוירופתולוגיה, כגון הבנת האופן שבו בעלי חיים מקבלים, תופסים ולבסוף מחשבים מפעלי זאבים בחיים מסביבתם. טכניקת הקלטה כפולה זו יכולה לספק תובנה לגבי המנגנון הבסיסי של קידוד ריח ורשתות עצביות באופן כללי. ניתן ליישם אותו גם על אורגניזמים מודלים אחרים בחסרי חוליות או חיבה ונוירוביולוגיה.
באופן כללי, אנשים חדשים בשיטה זו יתקשו מכיוון שנדרש אימון רב כדי לזהות נוירונים של דבורת דבש באמצעות ציוני דרך מורפולוגיים בלבד כמו האונה הפנימית או האונה האנכית של גוף הפטרייה. עבור פרוטוקול זה, בנה מתאם אלקטרודה שיתאים ללוח ממשק אלקטרודה סטנדרטי. ראשית הלחמו שלוש חתיכות קצרות של חוטים מבודדים למחבר 18 פינים.
לאחר מכן חותכים חתיכת צלחת פרספקס ומכניסים חריץ רדוד לאורך הצד הארוך ביותר. לאחר מכן, הברג זיזי הלחמה לתוך צלחת הפרספקס והדבק את הצלחת על החלק העליון של המחבר. לאחר מכן חבר את הבסיס לזיזים באמצעות שלושת החוטים הקצרים.
לאחר מכן, מקם נימי זכוכית לתוך החריץ של צלחת הפרספקס. הנימים צריכים להיות מסוגלים להחליק ולהיות מאובטחים על ידי בורג בעזרת סיכה זעירה, הרחיבו את נימי הזכוכית כלפי חוץ כחמישה מילימטרים. הנימים והסיכה ישמשו לתמיכה וייצוב של חוטי המיקרו של האלקטרודות.
לאחר מכן, מקם שלושה מיקרו-חוטים. בעזרת סרט דבק לגישה טובה יותר, ניתן להסיר את נימי הזכוכית באמצעות דבק מחט הלחמה 12 וולט. החוטים יחד עם שעוות שיניים LMP אינם מדביקים את השליש האחרון של החוטים.
כעת חבר את מכלול חוטי המיקרו הרב-ערוצי הזה למתאם האלקטרודה. מקם את נימי הזכוכית המורחבים במקביל לחוטי המיקרו. אבטח את החיבור הזה עם שעווה דנטלית לאורך נימי הזכוכית החופפים והסיכה הדקה.
לאחר מכן חתוך את חוטי האלקטרודה והשאיר שניים עד שלושה סנטימטרים המשתרעים מהסיכה הדקה ושניים עד שלושה סנטימטרים המשתרעים מקצה האלקטרודה. לאחר מכן, אבטח את הנימים לתוך מתאם האלקטרודה והשתמש בבורג כדי לייצב את הכל במקום. ב-360 מעלות צלזיוס.
הלחמו את קצות החוטים בניצב לזיזים. לאחר מכן בדוק שיש מגע חשמלי חזק מספיק על ידי בדיקה שהעכבה שלהם היא כ -300 קילו אוהם בקילוהרץ אחד. כעת חבר את התעלות של מתאם האלקטרודה השני לאלקטרודה הראשית והלחם את אלקטרודות הייחוס והשריר לבסיס האלקטרודות הראשיות.
לבסוף, התקן את האלקטרודה הראשית ללוח הממשק של שלב הראש. תקן את האלקטרודה השנייה במתאם נפרד לאחר השגת דבורי הדבש מצננים אחת על קרח עד שהיא משותקת. לאחר מכן, תקן את הדבורה במחזיק פרספקס רגיל כשהראש חשוף.
מרחו שעווה דנטלית מחוממת על בסיס העיניים ועל הצומת בין הראש לבית החזה, ובכך אבטחו את הראש. המשך להשתמש בשעווה כדי לשתק את עין הנוף של האנטנות על קפסולת הראש. הימנע ממריחת שעווה על הפגל, שצריך להצביע קדימה.
ה-Pro Bois צריך להיות חופשי מפגיעה. בדוק שהוא יכול לזוז. כעת גלח את קפסולת הראש כדי לשפר את הנגישות.
לאחר מכן האכילו את הדבורה בכל 30% הסוכרוז שהיא תצרוך. זה מבטיח הכנה טובה, כדאיות ולחות רקמות. כעת באמצעות אזמל מיקרו, חתוך אנכית לאורך גבול העין ואופקית מעל בסיסי האנטנה.
המשך לחתוך מתחת לעין תא ה-O והסר את הציפורן הרופפת. יש להזיז את בלוטות הלוע ההיפו-לוע הצידה, וכך גם קנה הנשימה. זה יפנה את הדרך להכנסת האלקטרודה.
התחל בהכנסת אלקטרודת הייחוס, חוט כסף 35 מיקרון. ראשית, בצע חתך קטן בעין המורכבת המקבילה. ואז תחוב את האלקטרודה דרכה.
לאחר מכן, הכנס את החוט השני לאזור הקרנת השריר מתחת לעין תא ה-O הרוחבית. כדי לדמיין מאוחר יותר את מיקומי האלקטרודות, טבלו את האלקטרודות בתמיסה של 0.5 אשלגן כלורי מולרי, ו-5% Alexa Hydrocyte 4 88 למשך שלוש דקות. לאחר מכן, באמצעות מניפולטורים זעירים ממקמים את שתי האלקטרודות לתוך המוח.
התמצאו על ידי זיהוי אונת האנטנה והאונה האנכית של גוף הפטרייה. כאן אלקטרודה אחת נמצאת במערכת אונת האנטנה הרוחבית בעומק 180 מיקרון והשנייה במערכת אונת האנטנה המדיאלית. הוכנס בעומק של כ -300 מיקרון.
השלם את מיקומי האלקטרודות על ידי עיגון באמצעות שני רכיבים. סיליקון מכסה את כל החלל שמעל המוח, מה שימנע גם את התייבשות הרקמות. לאחר מכן המשך בביצוע הקלטות כדי לחלץ את פעילות היחידה מהאות המוקלט החוץ-תאי.
השתמש בתוכנת מיון ספייק זמינה. השתמש בתעלות האלקטרודות המובחנות. החל טכניקות התאמת תבניות בו-זמנית על כל שלושת ערוצי האלקטרודות כדי לזהות שילובי צורות גל שונים המהווים אירועי ספייק בודדים.
ולבסוף, בקרה על הפרדה נכונה של יחידות. שימוש בניתוח רכיבים עקרוני על אירועי הספייק הבודד של שלושת ערוצי האלקטרודות המובחנים שתועדו. לאחר ביצוע ההקלטות, הסר בזהירות את הסיליקון והאלקטרודות מהדבורה.
לאחר מכן, שטפו את המוח בתמיסת צלצול דבורים והסירו את הבלוטות וקנה הנשימה. לאחר מכן באמצעות מיקרו פיפטה להזריק לאונה האנטנה, 5% מיקרו אודם מומס באשלגן אצטט טוחנת אחת. זה יספק תווית אנטרוגרדית למסלולי האונה.
מכאן והלאה, בצע את כל הצעדים בחושך מקסימלי. שטפו את המוח עם צלצולי דבורים שוב, שלוש פעמים, והניחו לצבע לדגור במשך 30 עד 45 דקות. משתקים את הדבורה על ידי קירורה במקרר.
לאחר מכן בודד את המוח. קבע את המוח ב-4%Para aldehyde ב-0.1 PBS מולארי למשך הלילה בארבע מעלות צלזיוס ועם תסיסה עדינה. עקוב אחר זה עם פרוטוקולים סטנדרטיים להתייבשות וניקוי לאחר מילוי חוזר של נוירוני הקרנה באונה האנטנה עם עוקב מיקרו אודם, תצוגת הקרנה של נוירונים אלה הורכבה מפרוסות אורטו לאורך ציר Z.
צבע Alexa Hydrocyte 4 88 על שתי האלקטרודות מראה את החדרתן באונה האנטנה המדיאלית ובנתיב אונת האנטנה הרוחבית. שחזור תלת מימדי של תאי המטרה המוכתמים ואתרי החדרת האלקטרודות שימש ליצירת סכמטי של שני המסלולים הנמתחים של אונות האנטנה, הקלטה בו זמנית משתי דרכי אונות האנטנה תוך גירוי הדבורה בריכוזי ריח שונים שימשה לחקירת עיבוד זמני. הפעילות הוערכה בשלבי העיבוד הבאים.
נוירוני הקרנת אונת האנטנה וניתוח מרכיבי העיקרון של הנוירונים החיצוניים של וקטורי האוכלוסייה מדגימים כי הריח בנוירוני ההקרנה היה ממושך והחזיק מעמד מעבר לגירוי. לעומת זאת, באוכלוסיית הנוירונים החיצוניים, היו מיוצגים רק סוגי ריח וריח כבוי. אז בצפייה בפעילות עם הזמן, אוכלוסיית הנוירונים החיצוניים מימין מראה פעילות הפרדת ריח מעט לפני שאוכלוסיית נוירוני ההקרנה מתחילה לפתח את הפעילות המושרה על ידי ריח.
גירוי ריח מסומן באפור. לאחר השליטה, לוקח בערך 30 דקות לבנות אלקטרודה. הכנת הדבורה והחדרת האלקטרודות לאזורי המטרה יכולה להיעשות בעוד חצי שעה אם היא מבוצעת כראוי.
בזמן ניסיון הליך זה, חשוב לזכור שכל שלב דורש הרבה תרגול וסבלנות עד ששולטים בו. היזהר במיוחד בעת הרמת חוטי האלקטרודה לנקודות החיבור שלהם והקלטת מהישג המוח הרצוי. נדרש ידע מוצק באנטומיה של מוח דבורת הדבש לאחר התפתחותו.
טכניקה זו אפשרה לחוקרים בתחום הנוירופתולוגיה וחוש הריח של חרקים לחקור את הקשרים הזמניים המדויקים בין פעילותם של מסלולים עצביים שונים ומרכזי מוח בדבורי דבש מתנהגות. לאחר צפייה בסרטון זה, אתם אמורים להבין היטב כיצד לבנות ולהשתמש באלקטרודות מיקרו-חוטים רב-ערוציות כדי להקליט בו-זמנית משני אזורי מוח ודבורי דבש מתנהגות. אתה אמור גם להיות מסוגל לדמיין את המיקומים המדויקים של אלקטרודות ההקלטה שלך.
סקירה כללית
מחקר זה מציג שיטה להקלטות חוץ-תאיות ארוכות טווח בו-זמנית משני נוירופילים שונים במוח של דבורי דבש. הטכניקה מאפשרת לחקור עיבוד נוירונלי באזורי מוח נפרדים, הן ברמת הנוירון הבודד והן ברמת האנסמבל, בבעלי חיים הפגלים התנהגות.
מרכיבי מפתח של המחקר
תחום המדע
- מדעי המוח
- אלקטרופיזיולוגיה
- ביולוגיה התנהגותית
רקע
- הבנת העיבוד הריחני בדבורים היא חיונית להשגת תובנות לגבי היווצרות זיכרון.
- שיטות קודמות היו חסרות את היכולת לביצוע הקלטות סימולטניות מאזורים מ複数の במוח.
- דבורים משמשות כארגון מודל לחקר רשתות עצביות מורכבות.
- חקירת מנגנוני קידוד ריח יכולה לשפר את הבנתנו לגבי עיבוד חושי.
מטרת המחקר
- לחקור קידוד ריח ויצירת זיכרון בדבורי דבש.
- לפתח טכניקה להקלטות סימולטניות משלבים שונים של עיבוד נוירונלי.
- להבין קשרי קידוד ריח בין אוכלוסיות של נוירונים.
שיטות שנעשה בהן שימוש
- הרכבת אלקטרודות רב-ערוציות בעלות עלות נמוכה מחוטי נחושת מיקרוסקופיים מבודדים.
- הכנת דבורי דבש להחדרת אלקטרודות על ידי הסרת חלק מקליפת הראש.
- הקלטת פעילות נוירונלית תוך גירוי בריחות פרחים ופרומונים.
- ויזואליזציה של ארכיטקטורה נוירונלית באמצעות סומני פלואורסצנציה ושחזור תלת-ממדי.
תוצאות עיקריות
- הקלטות סימולטניות מוצלחות מאונה האנטנה ומגוף הפטרייה (mushroom body).
- הבנה משופרת של מנגנוני קידוד ריחות בדבורי דבש.
- הוכחת יציבות של אלקטרודות רב-ערוציות להקלטות ממושכות.
- מתן תובנות לגבי הרשתות הנוירונליות המעורבות בעיבוד חוש הריח.
מסקנות
- טכניקה זו מאפשרת הבנה מעמיקה יותר של האופן שבו דבורי דבש מעבדות מידע אולפקטורי.
- ניתן להתאימה לשימוש באורגניזמי מודל אחרים בביולוגיה של מערכת העצבים.
- יישומים עתידיים עשויים להתמקד בשאלות מפתח בנושא נוירופתולוגיה ועיבוד חושי.
שאלות נפוצות
רלוונטיות תעשייתית להנהלה
שיטה זו מאפשרת הקלטות חוץ-תאיות ארוכות טווח בו-זמנית משני שלבי עיבוד עצביביים נפרדים בדבורי דבש הפועלות, ובכך מספקת יכולת ייחודית לחקור דינמיקה זמנית במסלולי עיבוד ריח. על ידי לכידת פעילות רב-יחידתית (multi-unit activity) הן מהאונה של המחוש (antennal lobe) והן מגוף הפטרייה (mushroom body) — או מהמסלולים המקבילים המחברים ביניהם — חוקרים יכולים להפחית סיכונים בהשערות מכניסטיות לגבי אינטגרציה חושית ויצירת זיכרון. גישה זו תומכת בביטחון חיזוי באימות מטרות, על ידי חשיפת האופן שבו אותות המעוררים על ידי ריח מתפשטים בין אזורי מוח לאורך זמן, ובכך מספקת מידע למודלים תרגומיים של תפקוד מעגלים עצביים.
יישומים אסטרטגיים במחקר ופיתוח בביופארמה
גילוי מוקדם ותיקוף מטרה
- ערך מדעי: מאפשר בחינה של היפותזות טיפוליות באמצעות מעקב אחר פעילות המעוררת על ידי ריח לאורך נוירופילים עוקבים, כדי להבהיר תרומה ספציפית של מסלולים להתנהגות.
- ערך תפעולי: מספק הקלטות רב-ערוציות יציבות לאורך שעות רבות, מה שמפחית את השונות במחקרי מעקב ארוכים אחר מעורבות של מטרות.
- ערך ניבוי: תומך בהפחתת סיכונים מכניסטיים על ידי הבחנה בין תגובות עצביות מתמשכות לעומת חולפות, ובכך מספק מידע על סלקטיביות המטרה והרלוונטיות התפקודית שלה.
סריקה ופיתוח בדיקה
- ערך מדעי: מייצר פלטים נוירופיזיולוגיים כמותיים ורזולוצייתיים בזמן, שיכולים לשמש כסמנים ביולוגיים להשפעות של תרכובות על עיבוד ריח.
- ערך תפעולי: משתמש באלקטרודות של מי-חוטים (micro-wire) המוגברים באופן דיפרנציאלי כדי למזער רעשים ולאמת את מקור האות, ובכך לשפר את השחזוריות של הבדיקה.
- סביליות: הרכבת אלקטרודות מחוטי נחושת מבודדים מאפשרת הכנה בעלות נמוכה וניתנת לשחזור לסריקת תנאים מרובים.
מחקר תרגומי ופרה-קליני
- רצף תרגומי: מקשר בין עיבוד חושי מוקדם באונה האנטנלית (antennal lobe) לאינטגרציה מסדר גבוהי יותר בגוף הפטרייה (mushroom body), תוך מידול של התמרה מתפיסה לזיכרון.
- ביטחון חזוי: חושף דיסוציאציה זמנית בתגובות לריחות בין אוכלוסיות נוירונים, דבר התומך בהתאמת סמנים ביולוגיים עבור תרכובות המשנות תפקוד קוגניטיבי או חושי.
- מערכת רלוונטית למחלות: מספק מודל חסר חוליות שניתן לשליטה גנטית לצורך חקר עקרונות שמורים של סינון חושי (sensory gating) וסינון אדפטיבי.
שילוב תהליכי עבודה וצנרת עיבוד
הטכניקה משתלבת ברצף הגילוי על ידי כך שהיא מאפשרת בחינה מונחית-השערה של דינמיקה של מעגלים עצביים, תומכת בזיהוי מובילים באמצעות קריאות פונקציונליות של מעורבות המטרה, ומספקת מידע להחלטות פרה-קליניות באמצעות הפחתת סיכונים מכניסטית של נתיבי עיבוד תחושתי.
- ביולוגיה של הגילוי: תומך בהבהרת מסלולים על ידי השוואה של הפעילות באונה של המחוש (עיבוד ראשוני) ובגוף הפטריה (מרכז אינטגרציה) במהלך גירוי ריח.
- סריקה: מספק הקלטות חוץ-תאיות רב-יחידות הניתנות לשחזור, המאפשרות השוואה של השפעות תרכובות על פני מסלולים עצביים בלתי תלויים.
- אנליטיקה: עושה שימוש במיון פולסים (spike sorting), התאמת תבניות וניתוח רכיבים ראשיים כדי להבחין באירועי פולס בודדים ובדינמיקה ברמת האוכלוסייה.
- מחקר תרגומי: מקשר בין תגובות ריח מיידיות לבין פלסטיות עצבית לטווח ארוך, דבר הרלוונטי למידול תהליכי למידה וזיכרון.
- שימוש חוזר ארגוני: תכנון האלקטרודות ניתן להתאמה לאורגניזמי מודל ולאזורי מוח שונים, ובכך מקדם סטנדרטיזציה ברמת הפלטפורמה.
השפעה תפעולית וארגונית
- ערך מדעי: מפחית עמימות מכניסטית על ידי חשיפת האופן שבו זהות הריח והתזמון מיוצגים לאורך שלבי עיבוד רצופים.
- ערך תפעולי: גמישות האלקטרודות מאפשרת הקלטות יציבות בבעלי חיים בעודם פועלים למשך שעות עד ימים, מה שמשפר את תפוקת הנתונים ומפחית את שיעור הנשירה.
- ערך אסטרטגי: מסייע בקבלת החלטות של go/no-go על ידי אספקת ראיות ישירות לוויסות המטרה in vivo, ובכך מפחית את ההסתמכות על נקודות סיום חלופיות.
- השפעה על הפורטפוליו: מאפשר תיעדוף של תרכובות מותאם סיכון, בהתבסס על השפעותיהן על דיוק הקידוד הזמני במסלולים תחושתיים.
שיקולי יישום
- דורש מומחיות באנטומיה של מוח דבורת הדבש ובטכניקות מיקרו-כירורגיות להכנת קפסולת הראש ולמיקוד האלקטרודות.
- תלוי בכלי מיקרו-מניפולציה, סומני פלואורסצנציה ותוכנה למיוןBספייקים (spike sorting) לצורך תיקוף האותים ושחזור תלת-ממדי.
- מחייב סטנדרטיזציה בין הצוותים לבדיקת עכבה של האלקטרודות (~300 kΩ ב-1 kHz) ולמיקום אלקטרודת הייחוס.
- התאמה למערכות מודל אחרות דורשת התאמה של גודל האלקטרודה, עומק ההחדרה ושיטות לייצוב המוח.
- מגבלות מעשיות כוללות את הצורך בהכשרה נרחבת לזיהוי מסלולים עצביים באמצעות נקודות ציון אנטומיות ואת הפולשניות של השתלה כרונית.
