Name: הדמיה חיה של דרוזופילה הזחל Neuroblasts (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-07-07T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 50 s
Description: למד הדמיה חיה של חלוקות אסימטריות בתאי גזע עצביים בזחלי Drosophila melanogaster. שיטה זו מאפשרת תצפית ישירה בהתפתחות מערכת העצבים המרכזית ומנגנוני התמיינות תאית.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

עבודה זו נתמכה על ידי חטיבת מחקר של שבירת קירות במכונים הלאומיים לבריאות / NHLBI (1ZIAHL006126) וLenfant ביו פוסט דוקטורט מלגה הוענקו לDAL.

<ol><li>Truman, J. W., Bate, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spatial+and+temporal+patterns+of+neurogenesis+in+the+central+nervous+system+of+Drosophila+melanogaster%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Spatial and temporal patterns of neurogenesis in the central nervous system of Drosophila melanogaster.</a> Developmental Biology. 125, 145-157 (1988).</li>
<li>Doe, C. Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+markers+for+identified+neuroblasts+and+ganglion+mother+cells+in+the+Drosophila+central+nervous+system%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Molecular markers for identified neuroblasts and ganglion mother cells in the Drosophila central nervous system.</a> Development. 116, 855-863 (1992).</li>
<li>Lerit, D. A., Smyth, J. T., Rusan, N. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Organelle+asymmetry+for+proper+fitness%2C+function%2C+and+fate%5BTitle%5D)+AND+%22Chromosome+research%22%5BJournal%5D)">Organelle asymmetry for proper fitness, function, and fate.</a> Chromosome research. 21, 271-286 (2013).</li>
<li>Bello, B. C., Izergina, N., Caussinus, E., Reichert, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Amplification+of+neural+stem+cell+proliferation+by+intermediate+progenitor+cells+in+Drosophila+brain+development%5BTitle%5D)+AND+%22Neural+development%22%5BJournal%5D)">Amplification of neural stem cell proliferation by intermediate progenitor cells in Drosophila brain development.</a> Neural development. 3, 5 (2008).</li>
<li>Bowman, S. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+tumor+suppressors+Brat+and+Numb+regulate+transit-amplifying+neuroblast+lineages+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Cell%22%5BJournal%5D)">The tumor suppressors Brat and Numb regulate transit-amplifying neuroblast lineages in Drosophila.</a> Developmental Cell. 14, 535-546 (2008).</li>
<li>Boone, J. Q., Doe, C. Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+Drosophila+type+II+neuroblast+lineages+containing+transit+amplifying+ganglion+mother+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Neurobiol%22%5BJournal%5D)">Identification of Drosophila type II neuroblast lineages containing transit amplifying ganglion mother cells.</a> Dev Neurobiol. 68, 1185-1195 (2008).</li>
<li>Homem, C. C., Knoblich, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Drosophila+neuroblasts%3A+a+model+for+stem+cell+biology%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Drosophila neuroblasts: a model for stem cell biology.</a> Development. 139, 4297-4310 (2012).</li>
<li>Savoian, M. S., Rieder, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitosis+in+primary+cultures+of+Drosophila+melanogaster+larval+neuroblasts%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Science%22%5BJournal%5D)">Mitosis in primary cultures of Drosophila melanogaster larval neuroblasts.</a> Journal of Cell Science. 115, 3061-3072 (2002).</li>
<li>Fleming, S. L., Rieder, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Flattening+Drosophila+cells+for+high-resolution+light+microscopic+studies+of+mitosis+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Motil+Cytoskeleton%22%5BJournal%5D)">Flattening Drosophila cells for high-resolution light microscopic studies of mitosis in vitro.</a> Cell Motil Cytoskeleton. 56, 141-146 (2003).</li>
<li>Buffin, E., Lefebvre, C., Huang, J., Gagou, M. E., Karess, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recruitment+of+Mad2+to+the+kinetochore+requires+the+Rod%2FZw10+complex%5BTitle%5D)+AND+%22Current+biology%22%5BJournal%5D)">Recruitment of Mad2 to the kinetochore requires the Rod/Zw10 complex.</a> Current biology. 15, 856-861 (2005).</li>
<li>Basto, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Flies+without+centrioles%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Flies without centrioles.</a> Cell. 125, 1375-1386 (2006).</li>
<li>Lucas, E. P., Raff, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Maintaining+the+proper+connection+between+the+centrioles+and+the+pericentriolar+matrix+requires+Drosophila+centrosomin%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Maintaining the proper connection between the centrioles and the pericentriolar matrix requires Drosophila centrosomin.</a> J. Cell Biol. 178, 725-732 (2007).</li>
<li>Basto, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Centrosome+amplification+can+initiate+tumorigenesis+in+flies%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Centrosome amplification can initiate tumorigenesis in flies.</a> Cell. 133, 1032-1042 (2008).</li>
<li>Conduit, P. T., Raff, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cnn+dynamics+drive+centrosome+size+asymmetry+to+ensure+daughter+centriole+retention+in+Drosophila+neuroblasts%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Biol%22%5BJournal%5D)">Cnn dynamics drive centrosome size asymmetry to ensure daughter centriole retention in Drosophila neuroblasts.</a> Curr. Biol. 20, 2187-2192 (2010).</li>
<li>Forer, A., Pickett-Heaps, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cytochalasin+D+and+latrunculin+affect+chromosome+behaviour+during+meiosis+in+crane-fly+spermatocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Chromosome+research%22%5BJournal%5D)">Cytochalasin D and latrunculin affect chromosome behaviour during meiosis in crane-fly spermatocytes.</a> Chromosome research. 6, 533-549 (1998).</li>
<li>Rebollo, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functionally+unequal+centrosomes+drive+spindle+orientation+in+asymmetrically+dividing+Drosophila+neural+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Cell%22%5BJournal%5D)">Functionally unequal centrosomes drive spindle orientation in asymmetrically dividing Drosophila neural stem cells.</a> Dev. Cell. 12, 467-474 (2007).</li>
<li>Januschke, J., Llamazares, S., Reina, J., Gonzalez, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Drosophila+neuroblasts+retain+the+daughter+centrosome%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Commun%22%5BJournal%5D)">Drosophila neuroblasts retain the daughter centrosome.</a> Nat. Commun. 2, 243 (2011).</li>
<li>Januschke, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Centrobin+controls+mother-daughter+centriole+asymmetry+in+Drosophila+neuroblasts%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Centrobin controls mother-daughter centriole asymmetry in Drosophila neuroblasts.</a> Nat Cell Biol. 15, 241-248 (2013).</li>
<li>Homem, C. C., Reichardt, I., Berger, C., Lendl, T., Knoblich, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-Term+Live+Cell+Imaging+and+Automated+4D+Analysis+of+Drosophila+Neuroblast+Lineages%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Long-Term Live Cell Imaging and Automated 4D Analysis of Drosophila Neuroblast Lineages.</a> PLoS One. 8, (2013).</li>
<li>Neumuller, R. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome-wide+analysis+of+self-renewal+in+Drosophila+neural+stem+cells+by+transgenic+RNAi%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Genome-wide analysis of self-renewal in Drosophila neural stem cells by transgenic RNAi.</a> Cell Stem Cell. 8, 580-593 (2011).</li>
<li>Brand, A. H., Perrimon, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeted+gene+expression+as+a+means+of+altering+cell+fates+and+generating+dominant+phenotypes%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Targeted gene expression as a means of altering cell fates and generating dominant phenotypes.</a> Development. 118, 401-415 (1993).</li>
<li>Siegrist, S. E., Doe, C. Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extrinsic+cues+orient+the+cell+division+axis+in+Drosophila+embryonic+neuroblasts%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Extrinsic cues orient the cell division axis in Drosophila embryonic neuroblasts.</a> Development. 133, 529-536 (2006).</li>
<li>Broadus, J., Doe, C. Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extrinsic+cues%2C+intrinsic+cues+and+microfilaments+regulate+asymmetric+protein+localization+in+Drosophila+neuroblasts%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Biol%22%5BJournal%5D)">Extrinsic cues, intrinsic cues and microfilaments regulate asymmetric protein localization in Drosophila neuroblasts.</a> Curr. Biol. 7, 827-835 (1997).</li>
<li>Siller, K. H., Serr, M., Steward, R., Hays, T. S., Doe, C. Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Live+imaging+of+Drosophila+brain+neuroblasts+reveals+a+role+for+Lis1%2Fdynactin+in+spindle+assembly+and+mitotic+checkpoint+control%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+biology+of+the+cell%22%5BJournal%5D)">Live imaging of Drosophila brain neuroblasts reveals a role for Lis1/dynactin in spindle assembly and mitotic checkpoint control.</a> Molecular biology of the cell. 16, 5127-5140 (2005).</li>
<li>Britton, J. S., Edgar, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Environmental+control+of+the+cell+cycle+in+Drosophila%3A+nutrition+activates+mitotic+and+endoreplicative+cells+by+distinct+mechanisms%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Environmental control of the cell cycle in Drosophila: nutrition activates mitotic and endoreplicative cells by distinct mechanisms.</a> Development. 125, 2149-2158 (1998).</li>
<li>Siller, K. H., Doe, C. Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lis1%2Fdynactin+regulates+metaphase+spindle+orientation+in+Drosophila+neuroblasts%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Lis1/dynactin regulates metaphase spindle orientation in Drosophila neuroblasts.</a> Developmental Biology. 319, 1-9 (2008).</li>
<li>Cabernard, C., Doe, C. Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Apical%2Fbasal+spindle+orientation+is+required+for+neuroblast+homeostasis+and+neuronal+differentiation+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Cell%22%5BJournal%5D)">Apical/basal spindle orientation is required for neuroblast homeostasis and neuronal differentiation in Drosophila.</a> Dev. Cell. 17, 134-141 (2009).</li>
<li>Januschke, J., Gonzalez, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+interphase+microtubule+aster+is+a+determinant+of+asymmetric+division+orientation+in+Drosophila+neuroblasts%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">The interphase microtubule aster is a determinant of asymmetric division orientation in Drosophila neuroblasts.</a> J. Cell Biol. 188, 693-706 (2010).</li>
<li>Cabernard, C., Doe, C. Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Live+imaging+of+neuroblast+lineages+within+intact+larval+brains+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harb+Protoc%22%5BJournal%5D)">Live imaging of neuroblast lineages within intact larval brains in Drosophila.</a> Cold Spring Harb Protoc. 2013, 970-977 (2013).</li>
<li>Rusan, N. M., Akong, K., Peifer, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Putting+the+model+to+the+test%3A+are+APC+proteins+essential+for+neuronal+polarity%2C+axon+outgrowth%2C+and+axon+targeting%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Putting the model to the test: are APC proteins essential for neuronal polarity, axon outgrowth, and axon targeting.</a> J. Cell Biol. 183, 203-212 (2008).</li>
<li>Lerit, D. A., Rusan, N. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PLP+inhibits+the+activity+of+interphase+centrosomes+to+ensure+their+proper+segregation+in+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">PLP inhibits the activity of interphase centrosomes to ensure their proper segregation in stem cells.</a> J. Cell Biol. 202, 1013-1022 (2013).</li>
<li>Morris, L. X., Spradling, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-term+live+imaging+provides+new+insight+into+stem+cell+regulation+and+germline-soma+coordination+in+the+Drosophila+ovary%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Long-term live imaging provides new insight into stem cell regulation and germline-soma coordination in the Drosophila ovary.</a> Development. 138, 2207-2215 (2011).</li>
<li>Prasad, M., Jang, A. C., Starz-Gaiano, M., Melani, M., Montell, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+protocol+for+culturing+Drosophila+melanogaster+stage+9+egg+chambers+for+live+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Protoc%22%5BJournal%5D)">A protocol for culturing Drosophila melanogaster stage 9 egg chambers for live imaging.</a> Nat. Protoc. 2, 2467-2473 (2007).</li>
<li>Rusan, N. M., Peifer, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+role+for+a+novel+centrosome+cycle+in+asymmetric+cell+division%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">A role for a novel centrosome cycle in asymmetric cell division.</a> J. Cell Biol. 177, 13-20 (2007).</li>
<li>Martinez-Campos, M., Basto, R., Baker, J., Kernan, M., Raff, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Drosophila+pericentrin-like+protein+is+essential+for+cilia%2Fflagella+function%2C+but+appears+to+be+dispensable+for+mitosis%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">The Drosophila pericentrin-like protein is essential for cilia/flagella function, but appears to be dispensable for mitosis.</a> J. Cell Biol. 165, 673-683 (2004).</li>
<li>Dix, C. I., Raff, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Drosophila+Spd-2+recruits+PCM+to+the+sperm+centriole%2C+but+is+dispensable+for+centriole+duplication%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Biol%22%5BJournal%5D)">Drosophila Spd-2 recruits PCM to the sperm centriole, but is dispensable for centriole duplication.</a> Curr. Biol. 17, 1759-1764 (2007).</li>
<li>Moutinho-Santos, T., Sampaio, P., Amorim, I., Costa, M., Sunkel, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+localisation+of+the+mitotic+POLO+kinase+shows+a+highly+dynamic+association+with+the+mitotic+apparatus+during+early+embryogenesis+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Biol.+Cell%22%5BJournal%5D)">In vivo localisation of the mitotic POLO kinase shows a highly dynamic association with the mitotic apparatus during early embryogenesis in Drosophila.</a> Biol. Cell. 91, 585-596 (1999).</li>
<li>Megraw, T. L., Kilaru, S., Turner, F. R., Kaufman, T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+centrosome+is+a+dynamic+structure+that+ejects+PCM+flares%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell+Sci%22%5BJournal%5D)">The centrosome is a dynamic structure that ejects PCM flares.</a> J. Cell Sci. 115, 4707-4718 (2002).</li>
</ol>

יש המחברים אין לחשוף.

הדמיה תא חי היא גישה לא יסולא בפז לשמש כדי לחקור את המנגנונים המווסתים ACD של תאי גזע, ההתמיינות של שושלות תאים, והמורפוגנזה של רקמות מורכבות. למרות שקבוצות המחקר היסטורית השתמשו במגוון של טכניקות כדי להמחיש NB ACD, הגישות הללו ניתן לקבץ בדרך כלל לשתי קטגוריות שבעיקר שונה ביחס לשאלה האם רקמת המוח נותרה בשלמותה או מנותק. הדמיה ניתקה יש NBS היתרונות שלה. עבור אחד, ניתק NBS הם קלים יותר לתמונה משום שהם קלים במיוחד ל...

תאי גזע לשמור על איזון של בידול והתחדשות עצמית כדי ליצור גיוון סלולארי במהלך התפתחות מוקדמת והחלפת תאים פגועים ברקמות בוגרות. רגולציה של הומאוסטזיס זה מונעת גם האובדן והתרחבות יתר של אוכלוסיית תאי גזע, אשר יכול לגרום לניוון רקמה מזיק או היווצרות גידול. Neuroblasts (NBS) הם תאי הגזע העצביים למדו נרחב של מערכת דרוזופילה עצבים המרכזית (איור 1 א), כי הטופס הראשון בשלבים עובריים 1, 2. NBS לעבור סיבובים חוזרים ונשנים של חלוקת תא לא סימטרית (ACD) כדי לייצר שני תאים נגזר על איפה ואיפה: בתאי גזע עצמי חידוש ותא מבדל. ACD מונחה על ידי centrosomes, האברונים שאינם קרומיים המשמשים כמרכזי microtubule-המארגן של רוב התאים 3. במהלך מיטוזה, centrosomes NB לארגן ולכוון את ציר mitotic דו קוטבי יחד קוטב apical-הבזלייםציר ity. על המחשוף של NB החלוקה, גורמי פסגת גורל המציינים את גורל תאי גזע, וגורמי גורל בסיסיים המציינים בידול, הם הפרדה לתאי בת לא שווים. במוח המרכזי הזחל, שני סוגים של NBS עשויים להיות מכובדים על ידי מספרם, מיקום, ביטוי גורם שעתוק, ושושלת תא (איור 1 א) 4-6. הקלד אני NBS הם הנפוץ ביותר, ועל 90 שלהם לאכלס את הצדדים הקדמי והאחוריים של כל אונה אופטית של המוח 7. NBS אלה מבטאים גורם שעתוק Asense (ASE), והם מחלקים את אופייני לNB עצמי חידוש אחד ותא אחד קטן יותר גנגליון אמא (GMC; איור 1). כל GMC עובר חטיבת מסוף יחידה ליצירת שני תאי עצב או גליה (איור 1). לעומת זאת, NBS שמונה סוג II המאכלסים את הצד האחורי של כל אונה אופטית חסר הבעת ASE 5. הם עוברים ACDכדי לייצר NB עצמי חידוש אחד ואב אחד ביניים עצביים (INP). INP, בתורו, מחלק סימטרי שלושה עד חמש פעמים. כל אחת מתוצאות הענפים אלה בהתחדשות של INP והייצור של GMC אחת 4. באופן קולקטיבי, זהות NB הספציפית והצו הזמני של לידת GMC מולידים את הגיוון העצבי המדהים של מערכת העצבים המרכזית למבוגר. הבנת הביולוגיה של התא שבבסיס NB ACD שופרה בהרבה באמצעות השימוש בטכניקות הדמיה תא חיות. פרוטוקולים שפורסמו בשימוש על ידי חוקרים לNBS חי התמונה משתנים במידה רבה. בסך הכל, עם זאת, שיטות אלו עשויות להיות מקובצים לשתי קטגוריות כלליות מאופיינות האם מוח הזחל נותר בשלמותה או באופן מכאני ניתק. לשניהם יש טכניקות יתרונות ברורים וחסרונות בהתאם ליישום של החוקר. דיווחים מוקדמים חושפים divi תא NB החיהוא קונה כרוך במידה מסוימת של ניתוק הידני של מוח הזחל. פירוט פרוטוקולים אלה מריחת 8 או 9 מתגרה מלבד המוח כדי לגדול תרבויות עיקריות לטווח הקצר של NBS על coverslips זכוכית. כדי לשפר את ההדמיה, NBS העגול בדרך כלל שטוח על coverslips עם שתי שקופיות זכוכית 8 או רפידות agarose 9. למרות שתאים שטוחים השתפרו אופטיקה, טכניקות אלה לעתים קרובות להוביל לפגמים המיטוטי NB, כוללים רגרסיה של תלם המחשוף וחוסר היכולת לחלק יותר מפעם אחת. לכן, פרוטוקולים שכוללים גם ניתוק ידני ועיוות פיזית של רקמת מוח הזחל בדרך כלל מתאימים רק לטווח קצר מאוד (כלומר., מחזור תא אחד או פחות) יישומים. כמו כן, חצי מעיכה או השטחת מוח שלם בין שקופיות זכוכית coverslips לחלוטין מגבילה את הזמן אפשר לבלות הדמיה דגימה שניתנה לכ 30 דקות תקופת 10. למרות ההגבלה, thi זההגישה של נוצלה בהצלחת 11-14. מאמצים אחרונים לחית תמונה ניתקו מגבלת NBS עיוות פיזית של התאים המבודדים. טכניקות אלה הן שימושיות במיוחד עבור יישומים בהם יש צורך לקיים בתרביות תאים למחזורי חלוקת תא מרובים. לדוגמא, תאים מפוזרים ממוחם ניתק באופן ידני עשויים להיות מוטבעים באופן חלקי בקריש עשוי מהתערובת של פיברינוגן וטרומבין 15 להדמיה לטווח ארוך 16. לחלופין, מוח explanted עשוי להיות ראשון מבחינה כימית ניתק עם collagenase האנזים, ליד שיבש באופן ידני על ידי מעבר חוזר ונשנה באמצעות pipet קצה, ומצופה לאחר מכן במנות-ליזין המצופה פולי-L זכוכית תחתונה 17, 18. ציפוי כלים מזכוכית עם או פיברינוגן או פולי-L-ליזין מקדם את הקובץ המצורף וקל התפשטות של תאים עגולים, להביא אותם קרוב לcoverslip אפשרי ללא עיוות פיזית גדולה. בadditiב, שיטות אלה כרוכים culturing NBS במדיום שניתן להחליף בקלות לניסויי הפרעות תרופתיים 18. בסך הכל, באופן ישיר ציפוי התפזר NBS משפר אופטיקה הדמיה מבלי להקריב את יכולות הדמיה לטווח ארוך. לאחרונה, פרוטוקול המתאר את culturing לטווח הארוך של NBS ניתק כבר פורט 19. עם זאת, גישה זו אינה נטולת מגבלות. יש כמה אזהרות להדמית NBS ניתק בשידור חי. בתחום של תאים מפוזרים, למשל, קשה לזהות שושלות NB ספציפיות שמאורגנות במרחב במוח שלם 1. כמו כן, הבחנה סוג I לעומת סוג השני NBS בתוך רקמה ניתקת היא גם מאתגרת ללא הביטוי של קליעים נותבים שושלת או transgenes תת סוג ספציפי, כגון worniu-GAL4, asense-GAL80 20. למרות transgenes אלה הם די שימושיים עבור יישומים מסוימים, הם מגבילים את החוקרים ללשעבר transgenes אלהלחץ תחת שליטתו של האלמנט משפר כטב&quot;מ 21 ודורשים תוכניות גנטיות מורכבות יותר. מחקרים הנוגעים לפיתוח המרחבי או זמני של NBS, אם כן, דורשים בתחום ההדמיה vivo בהקשר של רקמה שלמה. יתר על כן, מחקרים של NBS העוברי ניתק מצביעים על כך שהמגע הפיזי של תאים סמוכים הוא קריטי עבור לוקליזציה ביניים של קוטביות מפתח גורמי 22, 23. מחקרים אלה מראים NBS המבודד לחלוטין כבר לא לשמור על ציר ציר mitotic בלתי משתנה. במקום זאת, תאים אלה להציג ציר ציר אקראי יותר וזוויות רחבים של הפרדה בין ניצני GMC הרצופים, אולי בשל אובדן מיצוב centrosome פסגת 22. למרות שהקשר בין NBS הזחל ותאי השכנים שלהם לא נחקר בהרחבה, זה שווה בהתחשב בכך שmicroenvironment תאי גזע הזחל עשוי פוגע בקוטביות תא או אחרתהתנהגויות. כדי לשמור על ההקשר הפיזיולוגי של NBS זחל, אנו התמונה ACD מהמוח כולו. בהתחשב במגבלות המבניות הקשורים NBS הדמיה ניתקה, המעבדה ועוד הקימו פרוטוקולים לסיבובים רצופים תמונה של NB ACD מהמוח של זחל כולו. טכניקות למוח בשלמות תמונה לעתים קרובות להחליף את המשטח הנוקשה של זכוכית בצד אחד של חדר התרבות עם קרום גמיש כדי למנוע עיוות רקמה או נזק ולאפשר חילוף גזים. חלק מהשיטות כרוכות בהרכבת מוח explanted בתערובת של מדיום חרקים culturing, סרום, וחומצה אסקורבית עם גופי השומן מבודדים מעשרה זחלים 24. גופי השומן המבודדים מתווספים בגלל שהם מפרישים mitogen ידוע לעורר חלוקת תא NB 25. פרוטוקול זה שומר על שלמות הרקמה במשך 3 שעות, והוא, אם כן, ניתן להדמיה לטווח ארוך 24, 26-28. לאחרונה, פרוטוקול המתאר את לוןהדמיה גרם לטווח של מוח של זחל בשלמותה בנוכחות חומצה אסקורבית, סרום, וגופי שומן שפורטה 29. חשוב לציין, כי הרקמה לא נחשפה ולא משותק, גישה זו היא פחות שימושית עבור יישומים בהם בינוני culturing הוא החליף (למשל, מחקרים בסמים, immunodepletion, וכו &#39;.). המעבדה שלנו יש לפשט את כל הכנת הר מוחות זחל חיים להדמיה לטווח ארוך 30, ביום 31. היתרון העיקרי לפרוטוקול שלנו על פני אחרים הוא בפשטותו: התצפיות שלנו מצביעות גם בסרום, חומצה אסקורבית, אינסולין, ולא גופי שומן הם תוספים נחוצים כדי סיבובים רצופים תמונה של NB ACD. למרות שתוספים, כגון אינסולין, היו שימושיים עבור ההדמיה הממושכת של חלוקות תא גזע 32 ונדידת תאים קולקטיבית בשחלות דרוזופילה 33, הם נראים מיותרים לNB ACD, כמדיום ההדמיה שלנו מורכב מתערובת פשוטה של STAndard הבינוני culturing תא חרקים בתוספת האנטיביוטיקה antimycotic על מנת למנוע זיהום. באמצעות השימוש בכלי תרבות שימוש חוזרים גז חדיר או זכוכית תחתונה, היינו מסוגל לקיים כמה סבבים של ACDs NB רצוף. דגימות explanted אותו יכול בקלות לשמש לimmunofluorescence והליכים אחרים עם רקמה קבועה. בפרוטוקול זה, אנו מפרטים את הנתיחה של מוח של זחל בשלמותה, כמו גם ההכנה של מוח לניתוח גם בשידור חי וקבוע.

<table><tbody><tr><td>צלחת תרבית רקמות Lumox 50 x 12 מ"מ</td><td>Sarstedt</td><td>94.6077.410</td><td>צלחת תרבית רב פעמית עם בסיס סרט חדיר גז ושקוף אופטית.</td></tr><tr><td>S2 בינוני</td><td>Invitrogen</td> של שניידר <td>21720-024</td><td></td></tr><tr><td>Gibco Antibiotic-Antimycotic (100x)</td><td>Invitrogen</td><td>15240-062</td><td>תוסף המכיל פניצילין (10,000 U/ml), סטרפטומיצין (10,000 &#956; גרם/מ"ל), ואמפוטריצין B (25 &#956; גרם/מ"ל) שמוסיפים למדיית S2 של שניידר כדי למנוע זיהום חיידקי ופטרייתי.&nbsp;</td></tr><tr><td>כיסויי זכוכית, #1.5 22 x 22 מ"מ</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-541-B</td><td></td></tr><tr><td>שמן הלוקרביון 700</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H8898</td><td>שמן אינרטי בעל צמיגות גבוהה, שקוף וחסר צבע.</td></tr><tr><td>זוג מחזיקי סיכות מצופים ניקל, באורך 17 ס"מ</td><td>Fine Science Tools</td><td>26018-17</td><td></td></tr><tr><td>זוג דומונט #5 מלקחיים</td><td>Fine Science</td><td>Tools 11252-20</td><td></td></tr><tr><td>חיתוך מחט/בדיקה עם ידית פלסטיק</td><td>פישר סיינטיפיק</td><td>08-965-A</td><td></td></tr><tr><td>מסנן מזרק, 0.22 & #956; m גודל נקבוביות</td><td>מזרק Fisher Scientific</td><td>09-719A</td><td></td></tr><tr><td>, 5 מ"ל</td><td>BD Biosciences</td><td>309646</td><td></td></tr><tr><td>פיפטה להעברת פלסטיק</td><td>Fisher Scientific</td><td>S30467-1</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldehyde, 32%</td> EM <td>Electron Microscopy Sciences</td><td>15714</td><td>זהירות: פורמלדהיד רעיל; יש לטפל בו במכסה אדים. פעל לפי הנחיות MSDS לטיפול בטוח.</td></tr><tr><td>DAPI (4',6-diamidino-2-phenylindole, dihydrochloride)</td><td>Invitrogen</td><td>D1306</td><td>צבע המסמן DNA ומעורר על ידי אור UV.</td></tr></tbody></table>

הדמיה חיה של<em&gt; דרוזופילה</em&gt; הזחל neuroblasts

Live Imaging of Drosophila Larval Neuroblasts

תאי גזע מתחלקים סימטרי כדי ליצור שני תאי צאצאים עם פוטנציאל לא שוויוני גורל: תאי גזע עצמי חידוש ותא מבדל. בהתחשב את הרלוונטיות שלהם לפיתוח ומחלה, הבנת המנגנונים השולטים בחלוקת תא גזע סימטרי הייתה אזור חזק של מחקר. כי הם גנטי צייתנים ולעבור סיבובים רצופים של חלוקת תא בערך פעם בכל שעה, בתאי הגזע של מערכת העצבים המרכזית דרוזופילה, או neuroblasts, הם מודלים חיוניים לחקר חלוקת תא גזע. אודות 100 תאי גזע עצביים נמצאים סמוך לפני השטח של כל אחת משתי אונות מוח הזחל, מה שהופך את מערכת מודל זה שימושי במיוחד עבור מחקרי מיקרוסקופיה ההדמיה לחיות. בעבודה זו, נסקור מספר גישות בשימוש נרחב כדי להמחיש חלוקות תא גזע, ואנו פונים את היתרונות וחסרונות של אלה טכניקות שמעסיקות ניתקו לעומת רקמות מוח שלמות יחסית. אנחנו גם פירוט simplifפרוטוקול מטען המשמש לexplant מוח כולו מזחלים שלישיים instar הדמיה תא חי ויישומי ניתוח קבועים.

הדמיה חיה כבר הובהרה מספר המנגנונים המווסתים NB ACD. לפני רכישת תמונה, יש צורך לקבוע את תנאי הדמיה אופטימליים. זה הכרחי כדי לאזן את שיעור לכידת המסגרת עם משך ההדמיה תא חי. לניתוח הסלולר בסדר, למשל, הגדיל את זמן וייתכן שתהיה הצורך ברזולוציה אופטית. כאשר חזותי מחזור אחד NB תא (איור 4 א), הקצב שבו תמונות שנתפסו ניתן להגדיל ללא החדרת נזקי. בדרך כלל, אירועי חלוקת תא יחיד עשויים להיות במעקב בכ 10-30 מרווחי זמן שניות. אחת דרכים להגדיל את הרזולוציה הזמנית מבלי לפגוע ברקמו...

פרוטוקול זה מפרט שיטה יעילה המשמשת לביצוע הדמיה תא חי בהקשר של מוח זחל בשלמותה. גישות הדמיה תא חי הן לא יסולא בפז לחקר חלוקות תא גזע עצביים סימטריות כמו גם תהליכים עצביים והתפתחותיות אחרים, לחשוף באופן עקבי מנגנונים שהתעלמו בעבר.

הדמיה חיה של<em&gt; דרוזופילה</em&gt; הזחל Neuroblasts

Stem cells divide asymmetrically to generate two progeny cells with unequal fate potential: a self-renewing stem cell and a differentiating cell. Given ...

המטרה הכוללת של פרוצדורה זו היא לפרט את הדיסקציה של מערכת העצבים המרכזית (CNS) השלמה מפגות של זבובים בשלב הלרבה של הגלגול השלישי (third Instar). זאת על מנת לחקור חלוקות אסימטריות של תאי גזע, דיפרנציאציה תאית ומורפוגנזה. דבר זה מושג תחילה על ידי הוצאת ה-CNS מגוף הלרבה באמצעות דיסקציה גסה.השלב השני הוא בידוד המוח השל מרקמות היקפיות באמצעות מיקרו-דיסקציה עדינה בעזרת כלים מותאמים אישית. לאחר מכן, המוחות הבריאים מועמדים לדימות תאים חיים או עוברים קיבוע כימי ואימונופלורסצנציה; לבסוף, נעשה שימוש במיקרוסקופיית קונפוקלית מסוג spinning disc כדי להציג את האירועים השולטים בחלוקת תאי גזע עצביים ולספק תובנה מכניסטית לגבי התפתחות ה-CNS. שיטה זו יכולה לסייע במתן מענה לשאלות מפתח בתחומי תאי הגזע, הסרטן וההתפתחות העצבית.על ידי תרומה להבנתנו לגבי האופן שבו מווסתת התרבות תאי גזע, אנו יודעים שחלוקת תאי גזע מסוג ABER קשורה לתומוריגנזה (יצירת גידולים) ולמיקרוצפליה, ומחקרי הדימוי שלנו חושפים את המנגנונים המווסתים חלוקות אלו של תאי גזע. הדגמה חזותית של שיטה זו היא קריטית מכיוון שהמיקרודיסקציה וההשמה של המוח הן קשות ללמידה שכן הן דורשות ידיים יציבות, סבלנות ותרגול. התחילו הליך זה על ידי הנחת שתי טיפות של מדיום דיסקציה חם על תגית זכוכית אחת, אחת עבור דיסקציה גסה והשנייה עבור דיסקציה עדינה.לאחר מכן, העבירו מס

live-imaging-of-drosophila-larval-neuroblasts

Research

JoVE Journal

Neuroscience

מדעי המוח

כאן אנו מתארים פרוטוקול לבחון את ההגירה של ותאי גלייה לתוך העין תסיסנית מתפתחות באמצעות ניתוח מיקרוסקופי לחיות יחד עם התאים GFP גליה מתויג.

הדמיה חיה של נדידת תאים גליה את הדיסק העין דמותי תסיסנית

Hemocytes תסיסנית לפזר מעל מכלול של העובר המתפתח. פרוטוקול זה מדגים כיצד הר התמונה באמצעות העברות אלה עוברים עם hemocytes שכותרתו fluorescently.

הדמיה חיה של תסיסנית melanogaster Hemocyte נדידות עובריים

כאן אנו מציגים פרוטוקול הרכבה...

הדמיה של זקופה תסיסנית עוברים

מקור: Hellerman, M. B., et al. Live-imaging of the Drosophila Pupal Eye. J. Vis. Exp. (2015)הסרטון מדגים טכניקת הדמיה חיה לחקר דפוסי עיניים בגולם Drosophila melanogaster. סמנים מתויגים בחלבון פלואורסצנטי ירוק (GFP) מאפשרים הדמיה של ארגון התאים והתמיינות במהלך היווצרות מבנה העין המתפתח.

הדמיה חיה של עין הגולם של דרוזופילה באמצעות מיקרוסקופיה פלואורסצנטית

כאן אנו מתארים שיטה יעילה ללימוד דינמיקה של פינוי תאים...

חי הדמיה של חיסול תאים אפופטוטיים במהלך<em&gt; דרוזופילה</em&gt; עובר

פרוטוקול זה מתאר כיצד תמונת חלוקת תאים בתוך רקמה בעוברי elegans Caenorhabditis. בעוד כמה פרוטוקולים מתארים כיצד חלוקת תאי תמונה בעובר המוקדם, פרוטוקול זה מתאר כיצד תמונת חלוקת תאים בתוך רקמה מתפתחת במהלך embryogenesis אמצע סוף.

חזותי neuroblast cytokinesis במהלך<em&gt; ג elegans</em&gt; עובר

פרוטוקול זה מציג שיטה יעילה להדמיה של נוירואפיתל עין גולם חי של דרוזופילה. שיטה זו מפצה על תנועת רקמות וטופולוגיה לא אחידה, משפרת את ההדמיה של גבולות התא באמצעות שימוש בחלבוני צומת מרובים המתויגים ב-GFP, ומשתמשת במתקן הדמיה המורכב בקלות.

Live-הדמיה של דרוזופילה גלמי עין

פרוטוקול זה מתאר שיטה מפורטת עבור תרבות הדמיה חיה vivo לשעבר לטווח ארוך של דיסק דמותי דרוזופילה. זה מדגים בידול קולטי אור וסיבוב ommatidial בתוך התקופה 10 שעות של הדמית חיה של דיסק העין. הפרוטוקול הוא פשוט ואינו דורש התקנה יקרה.

הדמיה לטווח ארוך בשידור חי של<em&gt; דרוזופילה</em&gt; דיסק העין

כאן, אנו מתארים את השיטה שאנו מועסקים התמונה המרצפת הדנדריטי מאוד בהכנה חיה של המוח הזחל Drosophila ילה , ואת הפרוטוקול שפיתחנו לכמת זמן קפיצה 3d מערכות הדמיה עבור הערכות כמותית של דנדט דינמיקה בפיתוח נוירונים.

זמן פקיעה הדמיה חיה הקוונפיקציה של הענף הדנדריטים המהירה בפיתוח של דרוזופילה נוירונים

כאן, אנו דנים בתהליך עבודה להכנה, ניתוח, הרכבה ותמונה של מוחות צמחים חיים מזחלי Drosophila melanogaster Third instar כדי לצפות בדינמיקה התאית והתת-תאית בתנאים פיזיולוגיים.

הדמיה של תאים חיים של Drosophila melanogaster מוח זחל כוכב שלישי

כאן, אנו מספקים פרוטוקול מפורט לביצוע הדמיה חיה של החלוקה הא-סימטרית של תאי גזע של קו הנבט (GSCs) בנישת השחלות של דרוזופילה. אנו משתמשים בקו טרנסגני המבטא בכל מקום היתוך חלבון פלואורסצנטי ירוק (GFP) של חלבון הספקטרוזום Par-1.

הדמיה חיה מורחבת של נישות תאי גזע נקבות Drosophila melanogaster

למד הדמיה חיה של חלוקות אסימטריות בתאי גזע עצביים בזחלי Drosophila melanogaster. שיטה זו מאפשרת תצפית ישירה בהתפתחות מערכת העצבים המרכזית ומנגנוני התמיינות תאית.

הדמיה חיה של

גלה סרטונים נוספים