הדמיה חיה של דרוזופילה הזחל Neuroblasts

המטרה הכוללת של הליך זה היא לפרט את הדיסקציה של מערכת העצבים המרכזית השלמה מזחלי Instar oph השלישי. על מנת לחקור חלוקות תאי גזע אסימטריות, התמיינות תאית ומורפוגנזה. זה מושג על ידי שתילה ראשונה של מערכת העצבים המרכזית מגוף הזחל על ידי דיסקציה גסה.

השלב השני הוא לבודד את המוח השלם מהרקמות ההיקפיות על ידי מיקרו-דיסקציה עדינה באמצעות כלים מותאמים אישית. לאחר מכן, המוחות הבריאים מותקנים להדמיית תאים חיים או נתונים לקיבוע כימי ואימונופלואורסצנטי, ובסופו של דבר נעשה שימוש במיקרוסקופיה קונפוקלית של דיסק מסתובב כדי להראות את האירועים השולטים בחלוקות תאי גזע עצביים ולספק תובנה מכניסטית להתפתחות מערכת העצבים המרכזית. שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלות מפתח בתחומי סרטן תאי הגזע והתפתחות עצבית.

על ידי תרומה להבנתנו כיצד מווסתת התפשטות תאי גזע, אנו יודעים שחלוקת תאי גזע ABER קשורה לגידול ומיקרוצפליה, ומחקרי ההדמיה שלנו חושפים את המנגנונים המווסתים את חלוקות תאי הגזע הללו. הדגמה חזותית של שיטה זו היא קריטית מכיוון שקשה ללמוד את המיקרו-דיסקציה והרכבה של המוח מכיוון שהם דורשים ידיים יציבות, סבלנות ותרגול. התחל הליך זה על ידי הנחת שתי טיפות של חומר ניתוח חם על שקופית זכוכית אחת, אחת לדיסקציה גסה והשנייה לדיסקציה עדינה.

לאחר מכן העבירו כמה זחלים לאחת מטיפות המדיה. לאחר מכן, העבירו את מגלשת הזכוכית עם הזחלים למיקרוסקופ מנתח. כעת התקרב לטיפה המכילה את הזחלים כך שהקצוות הקדמיים והאחוריים של הזחלים נראים לעין.

תפסו את האזור האמצעי של זחל בודד עם זוג מלקחיים ותפסו אזור אחר ממש לידו עם זוג מלקחיים שני. לאחר מכן קרעו את הזחלים לשניים. חזור על ההליכים עבור כל הזחלים על הכיסוי, החלק והשליך את החצאים האחוריים.

התקרב לזחל כך שהווים הקדמיים של הפה נראים בבירור. לאחר מכן, בצע חתך קטן או חריץ בצד הנגדי של ווי הפה הזחל בין רצועת CLE השלישית של בית החזה לראשונה בבטן. לאחר מכן, אחוז בווי הפה בעזרת המלקחיים.

יש לקלף בעדינות את הקוטיקולה בכיוון הקדמי לאחורי ולהמשיך עד לחשיפת מערכת העצבים המרכזית. לאחר מכן קרעו את הרקמות כדי לבודד את מערכת העצבים המרכזית משאר הזחלים. היזהר לא לפגוע במערכת העצבים המרכזית ולהשליך דגימות פגומות עם חוט עצב גחוני קרוע או אונות אופטיות מעוותות.

חזור על ההליכים עבור כל הזחלים על החלקת הכיסוי. לאחר מכן העבירו את הרקמה המושתלת הבריאה למדיום הנקי השני. זרוק על תלוש הכיסוי לדיסקציה עדינה.

השתמש בסיכות החיתוך כדי להסיר את הרקמות ההיקפיות מהמוח. החלק את האזמל בין המוח לרקמה הלא רצויה והצמד את רקמת החיבור לשקופית הזכוכית. השתמשו בוו כדי למשוך בעדינות את הרקמה הלא רצויה ובמקביל ללחוץ את האזמל על החלקת הכיסוי בתנועות נדנדה.

עבדו לאט ובכוונה כדי להסיר את כל הדיסקים מכל מוח. היזהר לא להפריע למורפולוגיה של המוח. למוח בריא יהיה חוט עצב גחוני שלם ואונות אופטיות עגולות סימטריות.

כעת הפוך צלחת תרבית חדירה לגז בגודל 50 מילימטר עם סרט שקוף הפונה כלפי מעלה, והניח טיפה קטנה של מדיום על מרכז המנה. לאחר מכן, השתמשו בוו כדי לגרוף את המוחות מתחת לאונות האופטיות ולהעביר אותם לטיפת המדיום על הצלחת בזה אחר זה. אסוף חמישה עד 10 מוחות בטיפת המדיום.

לאחר מכן דחף אותם לתחתית בזה אחר זה, מכיוון שרבים מהם יילכדו במניסקוס לאחר מכן. כוון את המוח כדי לאפשר לדמות את הנוירובלסט כדי לדמות את הנוירובלסט הגחוני הקדמי. מקם את המוחות כשחוט העצב הגחוני פונה כלפי מעלה, יישר את המוחות כך שכל מיתרי העצב הגחוניים מצביעים באותו כיוון בתוך מישור ה-XY.

השתמש במזרק או בפיפטה להעברת פלסטיק כדי להניח ארבע טיפות שמן פחמן הילה על הממברנה החדירה לגז. הנפח של כל טיפת שמן צריך להיות שווה ערך זה לזה ולטיפת המדיום. לאחר השלמתן, חמש הטיפות ידמו לחמשת ההיבטים בקוביות בסגנון מערבי.

לאחר מכן, הורד את החלקת הכיסוי על המכלול כך שהיא תפגע בכל חמש הטיפות בו זמנית. שמירה על לחץ אחיד על פני הדגימות מפחיתה את הסבירות שהן יופרעו. המתן כשלוש דקות.

כאשר השמן והמדיום מתפזרים תחת משקל הכיסוי מחליקים תחת טווח ניתוח. הורד את החלקת הכיסוי על פני המוח עוד יותר על ידי הסרת מדיה עודפת עם פתיל נייר טישו עד שהחלקת הכיסוי נוגעת, המוחות לא פתיל יתר על המידה מכיוון שהדבר יגרום לעיוות רקמות או פיצוץ מוחי כדי לדמות נוירובלסט גחוני קדמי. יש להזיז מעט את החלקת הכיסוי לכיוון קצות חוט העצב הגחוני.

זה גורם למוח להסתובב, מה שמביא את אונות המוח למגע ישיר עם החלקת הכיסוי כדי להקל על ההדמיה, ולאחר מכן אטום את החדר על ידי enc. הכיסוי מחליק עם כמות קטנה של שמן פחמן הילה. יש למזער עודפי שמן הנוטפים מהחלקת הכיסוי ולמחוק אותם עם טישו.

לפני ההדמיה. הוסף טיפה של שמן טבילה להחלקת הכיסוי ממש מעל המוחות המותקנים כדי לעזור למרכז את המטרה ישירות מעל הדגימה. מקם בעדינות את הדגימה המותקנת בחממת הבמה של 25 מעלות צלזיוס וכסה את החדר במכסה שלו.

לאחר מכן, אתר את הנוירובלסט המרכזי במוח באמצעות אור מועבר על ידי התמקדות בתאים העגולים הגדולים השוכנים באזורים המרכזיים והמדיאליים של האונות האופטיות. לאחר המקום, בצע חשיפות מהירות באמצעות הקונפוקלי כדי לקבוע את המיקום והעומק הנכונים של הנוירובלסט. הגבל את העומק ל -10 עד 15 מיקרומטר הראשונים.

התאם לפי הצורך וצלם תמונת בדיקה נוספת. כדי למנוע סחיפה צירית, השתמש בהתקן מיקוד אוטומטי רציף המשתמש בנורת LED אינפרא אדום או תקן ידנית את מישור המוקד. לאחר זיהוי נוירובלסט מעניין, בצע אופטימיזציה של כל הפרמטרים לפני ההדמיה.

כעת דמו את הנוירובלסט כולו על ידי איסוף 12 עד 14 תמונות במרווח של מיקרומטר אחד בציר Z. התאימו את רזולוציית הזמן כדי ללכוד מחזורי תאים בודדים או מרובים של אותו נוירובלסט. השתמש במרווחים של 10 עד 32 להדמיית מחזור תא בודד ובמרווחים של דקה עד שלוש דקות עבור מחזורי תאים מרובים.

לאחר מכן, ודא שהדגימה בריאה על ידי ניטור משך המיטוזה. אם המיטוזה נמשכת יותר מ-15 דקות, עברו למוח אחר. מוח בריא יראה נוירובלסטים רבים באותו שדה ראייה, שעוברים מספר סבבים של מיטוזה.

לאחר השלמת ההדמיה, פרק את תא הדגירה והשליך הכל מלבד כלי התרבות החדירים לגז. שוטפים את משטח צלחת התרבות באתנול 95% ומנגבים שמן עם טישו. חזור על ההליך פעמיים נוספות.

מוצגת כאן הדמיה חיה של חלוקות תאי גזע נוירובלסטים בתכשירים שלמים. אלו הן תמונות זמן-lapse של מחזור תא בודד מנוירובלסט המבטא GFP Mosin לניתוח תאים עדין, מחזור תא נוירובלסט יחיד מצולם במרווחי זמן של פחות מ-32. ואלה הן תמונות זמן-lapse של מחזורי חלוקת תאים עוקבים מנוירובלסט המבטא הן G-F-P-M-O והן סמן צנטרוזום המסומן ב-GFP.

לדמות מחזורי תאים נוירובלסטים מרובים. מוחות מצולמים בדרך כלל במרווחי זמן של דקה עד שלוש דקות לאורך תקופה של שעתיים עד שלוש. ההקרנות הקונפוקליות של תאי גזע קבועים מתכשירים ביתיים מוצגות כאן.

כדי לדמות את כל הנוירובלסטים הממוקמים בשתי האונות האופטיות, נעשה שימוש בהגדלה של פי 20. ניתוח זה שימושי במיוחד כדי לבחון את המורפולוגיה הכוללת של המוח ולכמת את מספרי הנוירובלסטים. ניתן לדמיין את רוב הנוירובלסטים מאונה אופטית בודדת בהגדלה של פי 40.

לניתוח סלולרי מפורט של כמה נוירובלסטים, יש להשתמש בהגדלה של פי 100. נוירובלסט מוטנטי זה מראה צנטרוזומים מרובים בכל קוטב ציר. בעת ניסיון הליך זה, חשוב לזכור להימנע מנזק לתמונה על ידי הגבלת כמות האור הפוגעת בדגימה.

טכניקה זו של הדמיית חלוקות נוירובלסטים חיות בתכשירים שלמים סללה את הדרך לחוקרים בתחום הביולוגיה של תאי גזע לחקור חלוקת תאים אסימטרית בהקשר החי של מוח הדרוזופילה המתפתח.