מדריך ל בשנת vivo הקלטה חד-יחידה מקליפת המוח המעכבת interneurons המזוהות Optogenetically

המטרה הכוללת של הניסוי הבא היא להשיג הקלטות יחידה בודדת חוץ-תאיות באיכות גבוהה מתאי עצב בקליפת המוח בעכברים המבטאים שורש ערוץ שני. זה מושג על ידי קידום אלקטרודת הקלטה עם עכבה גבוהה דרך הרקמה כדי לזהות בין נוירונים מתגובות זינוק לפולסים של אור כחול. האות החשמלי מנוטר לשינויים המצביעים על קצב ההתקדמות המתאים והסבירות להשיג הקלטה יציבה ומבודדת היטב.

אם לא ניתן להשיג בידוד טוב של יחידה אחת או להיפך, לעתים רחוקות נתקלים בנוירונים המגיבים לאור, החלף את אלקטרודת ההקלטה. התוצאות מראות כי אמינות האור מעוררת תגובות מזיהוי אופטי לתאי עצב ואת יחס האות לרעש האופייני המתקבל באסטרטגיה זו. גישת גירוי הצילום היא דרך נגישה וזולה להתמקד בסוגי תאים המזוהים גנטית באמצעות מגבר חוץ-תאי סטנדרטי ואור כחול.

זוהי האסטרטגיה שלנו לסרסור נוירונים פנימיים ספציפיים בקליפת המוח השמיעתית המרדימה, אך הנקודות הכלליות יותר חלות על אזורים אחרים בקליפת המוח מאשר סוגי תאים דלילים כדי להתחיל בהליך זה. לאחר שהחיה הורדמה עם קוקטייל קטמין מיין באמצעות הזרקה תוך-צפקית, הנח אותו בסטריאוטקסי או במנגנון אחיזת ראש אחר, וודא שהגולגולת מאובטחת היטב. זה חיוני לשמירה על הקלטות יציבות של תא בודד.

לאחר מכן, יש למרוח משחת עיניים על העיניים כדי למנוע יובש ולשמור על טמפרטורת הגוף של בעל החיים על 37 מעלות צלזיוס כדי לבצע ניקוז חזה CI ליציבות הקלטה נוספת, להסיר רקמה מהגולגולת האחורית עם להב אזמל כדי לחשוף את מגנה עצם החזה של CI. לאחר מכן עשה חתך קטן בדורה עם קצה הלהב כדי לנקז את נוזל עמוד השדרה המוחי. כעת באמצעות האזמל, בצע כריתת גולגולת קטנה מעל אזור קליפת המוח המעניין.

לאחר מכן, הסר את הדורה ואז כסה את קליפת המוח החשופה בשכבת הארוס החם. שמור על האגרוס לח במי מלח. הכן אלקטרודה למעמד לשונות.

הדביקו את האלקטרודה לצינור נימי זכוכית בעזרת דבק סופר ומאיץ. לאחר מכן הוסף צינורות לכווץ חום לאחיזה. לאחר מכן, הרכיב את האלקטרודה על מניפולטור מיקרום ממונע או הידראולי והגדר אותה לנסוע אורתוגונלית למשטח קליפת המוח.

החלק חוט הארקה מתחת לעור כנגד הגולגולת. הימנע ממגע עם השרירים בצד הראש ובחלק האחורי של הצוואר מכיוון שהם עלולים ליצור חפצים גרפיים של מיו. האות החשמלי מוגבר באמצעות מגבר חוץ-תאי המתאים להקלטת יחידה אחת, רצוי מצויד במצב בדיקת עכבה.

פעילות הזינוק המתמשכת מנוטרת באמצעות שני אוסצילוסקופים וסט רמקולים מופעלים. כעת קדם את האלקטרודה דרך האגרוס ובדוק את העכבה שלה כדי לוודא שהיא נמצאת בטווח של שבעה עד 14 מגה אוהם. כאשר הקצה פורץ את פני השטח של קליפת המוח אפס מיקום זה על מניפולטור המיקרום.

כדי להעריך בצורה הטובה ביותר את עומק ההקלטה, ודא חזותית שקצה האלקטרודה יוצא מהמשטח הקורטיקלי בעומק של אפס. כאשר מושכים את האלקטרודה בסוף חדירה בקליפת המוח השמיעתית כדי להבטיח שנקודת ההגדרה הזו של אפס תואמת את רמת קליפת המוח, עוקב אחר פוטנציאל השדה המעורר גירוי. תוך כדי קידום האלקטרודה דרך כמה מאות המיקרומטרים הראשונים של הרקמה, ודא שהקוטביות של פוטנציאל השדה המקומי מתהפכת סביב עומק של 100 מיקרומטר.

לאחר מכן, הרכיב סיב אופטי המחובר למקור אור כחול על מיקרו מניפולטור ידני. לווסת את תפוקת מקור האור עם יחידת הבקרה המסוגלת לספק רכבת דופק TTL ברוחב ומשך זמן מוגדרים. לאחר מכן עקוב אחר האות בשני האוסילוסקופים.

מדוד את עוצמת האור הכוללת בקצה הסיב האופטי באמצעות מד כוח. השתמש בערך זה כדי לחשב את הקרינה על ידי חלוקתה בשטח החתך של ליבת הסיבים. התחל עם הערך בטווח של 10 עד 15 מיליוואט למילימטרים רבועים.

באמצעות המיקרוסקופ מקם את קצה הסיב קרוב ככל האפשר לפני השטח של הארוס. מרכז את הקרן במקום שבו האלקטרודה תיכנס לרקמה. כעת בדוק אם יש חפצי אור עם האלקטרודה בארוס.

לספק מאמץ דופק. הסר את כל חפצי האור החולפים על ידי מיקום מחדש של הסיב האופטי ביחס לאלקטרודה כדי לשנות את זווית האור הפוגע. אם החפצים נמשכים, נסה להפחית את עוצמת האור.

לאחר מכן, קדם את האלקטרודה באיטיות דרך המוח בקצב של כמיקרומטר אחד לשנייה. השתמש באוסילוסקופ אחד כדי לעקוב אחר הפעילות השוטפת של האלקטרודה. השתמש בשני להפעלת פולסי הלייזר.

הקשיבו ל-hash הקלוש של הקוצים המעוררים אור על צג השמע, מה שמצביע על כך שהאלקטרודה מתקרבת לתא חיובי של ערוץ. לאחר מכן האטו את קצב ההתקדמות ברגע שהאור מתעורר. קוצים גדולים מספיק כדי להיות מופעלים בנפרד על האוסילוסקופ.

התחילו לעשות זאת. התאם קנה מידה על הציר האופקי כדי לראות את הצורה המדויקת של צורת הגל של הספייק. בשלב זה, הפסק לקדם את האלקטרודה והמתן עד שהיא תתייצב ברקמה.

זה קריטי להקלטה יציבה. לאחר מספר דקות, אם יחס האות לרעש לא השתפר, התקדם חמישה מיקרומטרים נוספים והמתן. שוב, חזור על תהליך זה עד שניתן יהיה ללכוד באופן אמין את השיא או השפל של פוטנציאל פעולה עם סף מתח.

ממוקם הרבה מעל רצפת הרעש בזמן ההקלטה. עקוב אחר הפעילות השוטפת באוסילוסקופ הראשון. במקביל, שימו לב לגודל ולצורה של קוצים באמצעות האוסילוסקופ השני ושימו לב לאיכות הצליל שלהם ברמקול.

הקשיבו בתשומת לב לשינויים פתאומיים, המצביעים על כך שהתא מתקרב מדי לאלקטרודה או מתרחק. אם הדוקרנים הופכים גדולים ומעוותים, משוך את האלקטרודה. אם הם הולכים וקטנים, קדם את האלקטרודה.

זז לאט בשני צעדים של מיקרומטר כדי לאשר את איכות הדוקרנים. הניחו את כל צורת הגל של הספייק על פני טווח רחב של ערכי סף. יש לראות רק צורת דוקרן עקבית אחת בגובה אחיד.

רוב התאים החיוביים ל-PV יכולים להחזיק מעמד בירי למשך שנייה שלמה. אם האות מזוהם בקוצים מנוירון שכן, קדם את האלקטרודה וחפש תא חדש בכל חדירה, הורד את האלקטרודה דרך כל עומק קליפת המוח. אם לא נתקלים בנוירונים המגיבים לאור לאחר חדירות רבות או להיפך, ההקלטות מזוהמות באופן שגרתי בקוצים מערוץ סמוך, תאים שליליים של אופסין, נסה אלקטרודה חדשה.

איור זה מציג הקלטות לדוגמה משלושה סוגים של תאי עצב בין-עצביים שזוהו אופטית. תאים מגיבים לרכבת דופק החיפוש בפרץ אמין של קוצים. מוצגים כאן קוצים של 100 קו tr וצורת הגל האינטרפולטיבית הממוצעת.

עלילות סגל אלה מראות את התזמון העקבי של עליות קלות מעוררות אור. השהיית הספייק הראשונה עבור דגימת כוח. נוירונים בין-נוירונים חיוביים של וולין מוצגים כאן.

גישת גירוי הצילום היא פשוטה מאוד מבחינה רעיונית, אך היא יכולה להיות מאתגרת באופן מפתיע ותשואה נמוכה. בפועל. אלקטרודות טלאי זכוכית מוטות מאוד לכיוון נוירונים פרה-מתכתיים, כך שלא מקבלים נוירונים פנימיים לעתים קרובות.

מצד שני, עם טטרו, אתה מקבל הרבה תאי עצב בין-עצביים המגיבים לאור, אבל הקוצים קטנים ויש הרבה צורות גל חופפות, כך שקשה מאוד למיין באופן אמין ליחידות בודדות. אנו מנסים להשיג זאת בדרכים רבות ושונות, ועבור נוירונים פנימיים, מצאנו שהאלקטרודות החדות הללו של 10 עד 14 מגה-אלקטרודות השיגו את האיזון הנכון מבחינת רדיוס ההאזנה, שחייב להיות גדול מספיק כדי לזהות אור של קוצים מעץ אלון מרחוק, אך מוגבל מספיק כדי להשיג בידוד טוב של יחידה אחת. אבל יש בזה קצת וודו.

אם אתה לא יכול להשיג את זה, אתה תחסוך לעצמך הרבה זמן רק על ידי נטישת האלקטרודה הזו ומעבר להבא עד שתמצא אחת שעובדת.