דוגמנות אסטרוציטומה פתוגנזה במבחנה ו בVivo שימוש בקליפת מוח האסטרוציטים או בתאי גזע עצביים מעכברים מותנים, מהונדסים גנטי

המטרה הכוללת של הניסוי הבא היא ליצור מודלים מהונדסים גנטית של אסטרוציטומה מסוגי תאים מוגדרים לאפיון פנוטיפי במבחנה וב-vivo. זה מושג על ידי קצירת תאים ראשוניים מסוג בר מעכברים מהונדסים גנטית מותנים שאינם מבטאים Cree לתרבית חוץ גופית. בשלב השני, התאים הראשוניים נגועים בווקטור אדנו-ויראלי המקודד רקומבינציה של Cree כדי לגרום לרקומבינציה גנטית של אללי F flox במבחנה.

לאחר מכן, התאים המשולבים עוברים תרבית סדרתית לאפיון הפנוטיפי שלהם. בסופו של דבר, האם המוטציות המוגדרות מקדמות אגנזה של גליו בסוגי תאים עצביים ספציפיים נקבעת על ידי אפיון של פנוטיפים רלוונטיים גידוליים במבחנה וב-vivo. שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלות נוירו-אונקולוגיות מרכזיות כגון מהן ההשלכות הפנוטיפיות של מוטציות הקשורות לאסטרוציטומה?

ההשלכות של טכניקה זו משתרעות על פיתוח תרופות פרה-קליניות לאסטרוציטומות, מכיוון שניתן להשתמש בתאים המוגדרים גנטית הללו במבחנה וב-vivo, בעכברים סינטגנטיים בעלי יכולת חיסונית. הדגמה חזותית של שיטה זו היא קריטית מכיוון ששלבי קצירת התאים וההזרקה האורתוטופית קשים מבחינה טכנית ודורשים זיהוי מדויק של מבנים אנטומיים. מי שידגים את ההליך יהיה ריאן בש, טכנאי מהמעבדה שלי לקצור את רקמת המוח.

התחל בשימוש במספריים מעוקרים של אתנול כדי לבצע חתך סגיטלי בעור מעל הגולגולת של עכבר בן יום עד שלושה שעבר המתת חסד, מהונדס גנטית מחוט השדרה לאף. לאחר מכן, בצע חתך בגולגולת לאורך התפר הסגיטלי, החל מחוט השדרה ומשתרע על פני נורות הריח. לאחר מכן השתמש במלקחיים מעוקלים כדי לקלף בעדינות כל המיספרה של הגולגולת הרחק מהמוח באמצעות מיקרו מלקחיים ישרים.

לאחר מכן, צבטו בעדינות את החלק הגבי של כל המיספרה בקליפת המוח תוך הקפדה להימנע מהמוח הקטן ופקעת הריח והניחו את רקמת המוח בצלחת תרבית רקמה המכילה H-B-S-S-N. תחת מיקרוסקופ מנתח, השתמש בשני זוגות מיקרו מלקחיים כדי להסיר בעדינות את קרומי המוח מכל חצי כדור קליפת המוח ולהניח את צלחת תרבית הרקמה בחזרה על הקרח כדי להומוגניזציה של רקמת המוח. ראשית, השתמש בסכין גילוח נקי כדי לחתוך סוף סוף את חצאי קליפת המוח.

לאחר מכן העבירו את הצלחת למכסה המנוע של תרבית רקמות והעבירו את חלקי הרקמה לצינור חרוטי סטרילי של 15 מיליליטר. שוטפים את הצלחת במיליליטר HBSS קר כקרח ומעבירים את הכביסה גם לצינור. לאחר הסרת ה-HBSS העודף בשני מיליליטר של טמפרטורת החדר, טריפ עם EDTA לצינור וקשר את שברי הרקמה עוד יותר על ידי פיפטה למעלה ולמטה כ-10 פעמים עם פיפטה של מיליליטר אחד.

דגרו את תרחיף התאים בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך 15 עד 20 דקות. ערבב בזהירות את תמיסת התא על ידי היפוך כל חמש דקות לאחר הדגירה, ערבב שלושה מיליליטר של מדיה שלמה לתוך תרחיף התא כדי לעכב את הטריפסין על ידי פיפטינג למעלה ולמטה 10 פעמים כפי שהודגם זה עתה. לאחר מכן סובבו כלפי מטה את האסטרוציטים המנותקים.

הסר בזהירות את החטף בעזרת פיפטה של מיליליטר אחד והשהה מחדש את הגלולה בארבעה מיליליטר של 37 מעלות צלזיוס. מדיה מלאה. לאחר מכן העבירו את תרחיף האסטרוציטים לבקבוק תרבית רקמה עליון T 75, ושמרו על האסטרוציטים בקליפת המוח ב-37 מעלות צלזיוס ב-5% פחמן דו חמצני כ-16 שעות לאחר הקציר.

שוטפים את הבקבוק בארבעה מיליליטר של 37 מעלות צלזיוס HBSS. לאחר מכן הוסיפו ארבעה מיליליטר של מדיה שלמה ושמרו על האסטרוציטים בקליפת המוח ב-37 מעלות צלזיוס ב-5% פחמן דו חמצני. כאשר התרבית מגיעה לכ-95% מפגש, יש לנער את התרבית למשך הלילה ב-37 מעלות צלזיוס ב-5% פחמן דו חמצני.

לאחר מכן הסר את המדיה המכילה את התאים המנותקים ושטוף את הצלחת בארבעה מיליליטר נוספים של 37 מעלות צלזיוס HBSS. לאחר מכן הוסיפו ארבעה מיליליטר של מדיה שלמה טרייה ודגרו שוב על התאים 24 שעות לאחר העשרת התרבית לאסטרוציטים בקליפת המוח. רענן את התרבות עם שני מיליליטר של מדיה שלמה.

לאחר מכן דגרו על התאים עם מיליליטר אחד של מדיה שלמה המכילה מיקרוליטר אחד של לפחות 10 פעמים 10 מה-10 pfu למיליליטר של אדנו-וירוס מעניין ב-32 מעלות צלזיוס ב-5% פחמן דו חמצני בחמש. זיהום Gfab CRE גורם ליתרון שגשוג באסטרוציטים משולבים של gfab ומגדיל את טוהר האסטרוציטים מ-59% ליותר מ-90% לאחר חמישה עד תשעה מעברים בתרבית. לאחר שש שעות, הסר את המדיה המכילה את הנגיף ודגר מחדש את התרבית במדיה טרייה ושלמה.

לאחר שהאסטרוציטים בקליפת המוח נקצרים בכ-90% מפגש ומספר התאים המתאים מושעים מחדש בקור קרח 5% מתיל צלולוז. הנח מזרק זכוכית של 250 מיקרוליטר למתקן אנטיגן חוזר, ולאחר מכן חבר מחט קהה בגודל 18 למזרק. השתמש במחט 18 כדי לשאוב את האסטרוציטים בקליפת המוח לתוך המזרק ולהסיר בועות אוויר.

לאחר מכן השליכו את המחט בגודל 18 והתאימו מחט בגודל 27 על המזרק. לחצו על הכפתור במתקן האנטיגן עד שהנוזל ייפלט מהמחט החדשה כדי להשתיל את האסטרוציטים. לאחר מכן, אבטח בעל חיים בעל יכולת חיסונית בן שלושה עד שישה חודשים בתוך מסגרת סטריאוטקסית ובצע חתך מעל התפר הסגיטלי באורך של כ-0.5 סנטימטרים בין האוזניים לעיניים.

אתר את הצומת של התפרים העטרתיים והסגיטליים או ה-BRE MA, כמו גם את הצטלבות הכבש בתפרים סגיטליים או בלמבדה. לאחר שווידאתם שה-BMA והלמבדה נמצאים באותו מישור אופקי, חברו את המזרק ואת מתקן האנטיגן החוזר למסגרת הסטריאוטקסית מעל ראש החיה, והביאו את קצה המחט למגע עם ה-BGMA. הרם מעט את המחט מעל פני הגולגולת והזיז שני מילימטרים לרוחב ומילימטר אחד רוסטרל מה-BGMA.

לאחר מכן הורד את המחט בזהירות דרך הגולגולת ליעדה. ארבעה מילימטרים גחוניים מהברג MA והפעל את מתקן האנטיגן החוזר. פעם אחת להזריק חמישה מיקרוליטרים של תרחיף התאים.

השאירו את המחט במקומה למשך שתי דקות כדי לאפשר ללחץ התוך גולגולתי להתאזן ולאחר מכן משכו את המחט לאט במשך תקופה של 30 שניות באמצעות החלפת כותנה כדי להפעיל לחץ על כל דימום שעלול להתרחש. לבסוף, השתמש בדבק רקמות כדי להעריך את קצוות הפצע ולסגור את החתך, ולאחר מכן הנח את החיה בכלוב נקי וחם כדי להתאושש. Xenografts של קווי תאים אנושיים מבוססים דורשים מארחים חסרי חיסון ובאופן כללי לא לסכם את ההיסטופתולוגיה של אסטרוציטומה אנושית.

לדוגמה, קסנוגרפטים אורתוטופיים U 87 MG יוצרים גידולים מוגבלים שאינם פולשים למוח תקין. לעומת זאת, הזרקת אסטרוציטים אפסיים מסוג T RRP למוחם של עכברים סינגניים בעלי יכולת חיסונית מניבה גידולים המסכמים את המאפיינים ההיסטולוגיים של עמיתיהם האנושיים, במיוחד פלישה לרקמת מוח תקינה. כדי לנטר את צמיחת האלוגרפט האפס של TRP, עכברים הוקרבו כל חמישה ימים לאחר הזרקת התאים, ועומס הגידול נקבע על ידי כימות אזור הגידול בקטעי מוח מוכתמים h ו-e.

אזור הגידול נקבע כגדל באופן אקספוננציאלי עם הזמן, והזרקה אורתוטופית של פי 10 עד חמישית מהאסטרוציטים TP nll למוח הנמען הובילה לתחלואה נוירולוגית. עם הישרדות חציונית של 22 יום. הדמיה אורכית in vivo שימשה להגדרת קינטיקה של צמיחת גידול.

לכן, בניסוי זה, אסטרוציטים עונשיים TR והונדסו לבטא לוציפראז הוזרקו למוחם של סינגניים בעלי יכולת חיסונית. חברי המלטה וצמיחת הגידול נקבעו על ידי הדמיה ביולומינסנציה סדרתית. עלייה של פי 15 בביולומינסנציה נצפתה במשך תקופה של 16 ימים.

בעקבות הליך זה, ניתן לבצע בדיקות תרופות במבחנה וב-in vivo כדי לקבוע את היעילות ולבדוק שילובי תרופות חדשים. לאחר צפייה בסרטון זה, אתה אמור להבין היטב כיצד לקצור אסטרוציטים בקליפת המוח מעכברים מהונדסים גנטית מותנים, כיצד לגרום לרקומבינציה גנטית במבחנה, וכיצד לדגמן גידול באמצעות השתלות אורתוטופיות בעכברים בעלי יכולת חיסונית.