הדמיה בזמן אמת של תאי תאי צומת האנדותל במהלך נויטרופילים גלגול תחת פיזיולוגית זרימה

המטרה הכוללת של הליך זה היא לעקוב אחר התפלגות הצומת האנדוגנית, טרין ו-PCAM אחת במהלך נדידת האנדותל הטרנס-אנדותל של לויקוציטים בתנאי זרימה פיזיולוגיים. זה מושג על ידי בידוד לויקוציטים פולימורפו-גרעיניים או PMNs מהדם המלא של מתנדבים בריאים באמצעות שיפוע פרוקו. השלב השני הוא הוספת נוגדנים עם תווית פלואורסצנטית לתא אנדותל וריד טבורי אנושי מגורה TNF אלפא חד-שכבתי שתורבת בשקופיות זרימה 30 דקות לפני תחילת ניסוי הזרימה.

זה יאפשר הדמיה של דינמיקת הצומת של תאי אנדותל במהלך גלגול נויטרופילים בתנאי זרימה פיזיולוגיים. לאחר מכן, שקופית הזרימה המכילה את תאי האנדותל של וריד הטבור האנושי המגורה TNF אלפא מחוברת למערכת הזרימה ומונחת על שלב המיקרוסקופ. המשאבה תמשוך את מאגר הזרימה מהמאגר דרך תא הזרימה לתוך המזרק.

השלב האחרון הוא הזרקת ה-PMNs לאט למערכת הזרימה דרך יציאת ההזרקה. בסופו של דבר, ה-PMNs מוצגים באמצעות מיקרוסקופ סריקת לייזר קונפוקלי. לאחר מספר דקות מופיעים לויקוציטים, נדבקים ומתמרים.

ניתן לעצור את הניסוי בכל רגע רצוי. היתרון העיקרי של טכניקה זו על פני שיטות קיימות אחרות כמו מבחני גלגול סטטי, הוא שבעזרת טכניקה זו ניתן לחקור הידבקות וגלגול בחיים האמיתיים בתנאי זרימה פיזיולוגיים. זה יעזור לנו להבין מדוע לויקוציטים בוחרים בשורש אחד על פני השני, כך PGA לעומת נדידה טרנס-תאית.

אנו עושים זאת על ידי הדמיה של צמתים של תאי התא עם נוגדנים המסומנים פלואורסצנטית. תאי האנדותל של וריד הטבור האנושי או HU X לניסוי זה מתורבתים על פי הוראות היצרן על כלים מצופים פיברונקטין באמצעות מדיה בתוספת גידול אנדותל. בינוני. תרבית התאים משמשת בין ארבעה לשמונה מעברים כאשר התאים מגיעים ל-80 עד 90% מפגש שוטפים אותם בזהירות עם PBS בטמפרטורת החדר ב-pH 7.4 ואז טריפסין הוא התאים לאחר טריפסין וצנטריפוגה.

אנו משהים ב-800,000 תאים למיליליטר באמצעות מדיה. הניסוי משתמש בתאי זרימה שצופו בפיברונקטין בצלחת היום הקודם. 80,000 תאים בכל תעלה בודדת של תאי הזרימה המקודדים של הפיברונקטין ופיפטה בעדינות את תרחיף התאים למעלה ולמטה למשך הלילה באינקובטור בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס ו-5% פחמן דו חמצני למחרת.

רענן את המדיה בשקופית תא הזרימה על ידי הטיה עדינה של השקופית בזווית של 45 מעלות. מומלץ להסיר את המדיה רק במאגרים ולא בתעלה עצמה. הסרת המדיה בתעלות עלולה לגרום לאובדן תאי אנדותל ולמוות עקב כוח הגרירה של המדיה הנגרם על ידי פיפטינג.

בדוק לפי מיקרוסקופ ניגודיות פאזה אם תאי האנדותל יצרו חד-שכבה. אם התאים אינם 100% קולואנטים, החלף את המדיה פעמיים ביום עד שהם מגיעים למפגש של 100%. לאחר שהתאים הגיעו לשטף של 100%, מעוררים את התאים במדיה המכילה את המתווך הדלקתי.

TNF אלפא מגרה uix בן לילה עם TNF alpha מביא לפנוטיפ דלקתי של האנדותל IE ויסות מוגבר של מולקולות הידבקות תאים כגון ICAM one ו-VA M1. לפני בידוד לויקוציטים פולימורפו-גרעיניים או PMNs. הכן מאגר זרימה לשטיפת PMNs מבודדים ולשימוש בבדיקת זרימה ל-100 מיליליטר של תמיסת מלאי שהוכנה בעבר. ב-100 מיקרוליטר של סידן כלורי מולארי טרי, 2.5 מיליליטר אלבומין אנושי מריכוז מלאי של 200 גרם לליטר ו-0.1 גרם גלוקוז.

סנן את מאגר הזרימה באמצעות מסנן 0.45 מיקרון. תמיסת 10% טריסודיום ציטראט או TNC ב-PBS ב-pH 7.4 מוכנה גם לפני בידוד PMNs. PMNs יבודדו מ-20 מיליליטר של דם מלא שנאסף בנתרן הפרין ממתנדב בריא.

ראשית יש לדלל את כל הדם אחד לאחד עם 10% PBST NNC בשפופרת של 15 מיליליטר. לאחר מכן, השתמש בילד פיפטה בהגדרה האיטית ביותר כדי לפיפטה בזהירות 20 מיליליטר של דם מדולל בזהירות על 12.5 מיליליטר של תמיסה קולואידית לכל קו-במים בצפיפות של 1.130 גרם למיליליטר בשפופרת חדשה של 50 מיליליטר. יש להטות את הצינור המכיל לכל קול בזווית של 45 מעלות במהלך הוספת הדם.

הנח בזהירות את הצינורות בצנטריפוגה וסובב בטמפרטורת החדר למשך 20 דקות ב-800 Gs בתאוצה נמוכה וכאשר הבלמים מושבתים בסיום הצנטריפוגה. הסר את כל הנוזל ומלא כל צינור במאגר ליזיס אריתרוציטים קר כקרח כדי להניח את האריתרוציטים. השאירו את הצינורות על קרח, ומדי פעם הפכו אותם עד שהמתלים הופכים לצנטריפוגה אדומה כהה ב-500 GS למשך חמש דקות בארבע מעלות צלזיוס כשהבלמים מופעלים.

חלק הגלולה שנוצר מכיל את ה-PMNs יחד עם האריתרוציטים, הסר את הסופרנטנט ושטוף את הגלולה פעמיים בקרח. מאגר ליזיס קר ב-500 גרם למשך חמש דקות בארבע מעלות צלזיוס. לאחר הסרת הסופרנטנט מהכביסה השנייה, השעו מחדש את הגלולה עם מאגר זרימה בטמפרטורת החדר וקבעו את ריכוז ה-PMNs באמצעות מונה תאים אוטומטי.

לבסוף, השעו את ה-PMNs במאגר הזרימה באחת מ-10 לששת התאים למיליליטר ושמרו בטמפרטורת החדר כדי לסמן את ה-VA cadherin הצומת האנדותלי ו-PCAM אחד. הוסף את נוגדן ה-pcam LOR 6 47 בדילול של 1 עד 100 ואת נוגדן FE cadherin ZI הבלתי תלוי בסידן בדילול של 1 עד 50 לתרבית VE, מדיום בתא הזרימה ודגירה ב-37 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות. כדי להכין את ה-PMNs לבדיקה, הכניסו אותם לאמבט מים למשך 15 דקות בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס לפני הזרקתם למערכת הזרימה.

חבר צינורות לתא זרימה ריק ומלא במאגר זרימה חם כדי למנוע היווצרות בועות אוויר. בעת הגדרת מערכת הזרימה. באמצעות צינורות סיליקון, חבר צד אחד של תא הזרימה הריק למערכת זרימת משאבת המזרק המכילה מזרק של 20 מיליליטר.

הנח את תא הזרימה על במת המיקרוסקופ. הבדיקה תבוצע באמצעות מיקרוסקופ סריקת לייזר קונפוקלי המצויד באובייקט שמן 63x ותא אקלים מוגדר על 37 מעלות צלזיוס ו-5% פחמן דו חמצני. חבר את הצד השני של תא הזרימה הריק לבקבוק המאגר המלא במאגר זרימה של 37 מעלות צלזיוס והפעל את משאבת המזרק על מנת למלא את כל הצינורות במאגר זרימה, המשאבה תמשוך את מאגר הזרימה מהמאגר דרך תא הזרימה לתוך המזרק.

צינור זה מכיל גם יציאת הזרקת פיתוי מוטבעת, המאפשרת להזריק PMNs עם מחט לניסוי ריצה מבלי לעצור את הזרימה וליצור בועות אוויר. לאחר מכן, החלף את תא הזרימה הריק בתא הזרימה המכיל TNF אלפא שטופל ב-VE צבט את הצינורות לפני ניתוקו וחיבורם מחדש לתא המכיל את VE.To הימנע מבועות אוויר במערכת, זה קריטי לצבוט ולהדק את הצינורות. בעת חיבור השקופית המכילה את התאים.

הנח את תא הזרימה על במת המיקרוסקופ, התאם את מהירות הזרימה לסנטימטר אגורה אחד בריבוע בהתאם למהירות הזרימה הפיזיולוגית בפוסט נימי, שהיא אחד עד חמישה סעודות לסנטימטר רבוע ניגודיות הפרעות דיפרנציאליות או DIC fite LOR 6 47. בו-זמנית באמצעות מזרק מיליליטר אחד, הזריק את ה-PMN לאט למערכת הזרימה דרך יציאת הזרקת הפיתוי המוטבעת. לאחר מספר דקות מופיעים לויקוציטים, נדבקים ומתמירים עוצרים את הניסוי בכל רגע רצוי.

על ידי ניתוק הצינור מתא הזרימה והזרמת קיבוע aff לתוך תא הזרימה, נמדדה ההתנגדות של חד-שכבות אנדותל כדי לבדוק אם הנוגדנים מפריעים לתפקוד המחסום של האנדותל. לא נצפה שינוי בעמידות כאשר ה-VE יכול היה לשמוע שיבוט נוגדן 55 7 H אחד או שבקרת האיזוטיפ נוספה לתאים. לעומת זאת, הנוגדן חוסם השמיעה של בקלה VE CL 75 הפחית את ההתנגדות באופן דרמטי.

ניתוח RAP לא גילה שינוי בהתאוששות הקרינה בנוכחות או היעדר נוגדן VE CADHERIN 55 7 H אחד, מה שמצביע על כך שהנוגדן לא שינה את הדינמיקה של VE cadherin, VE cadherin ו-pcam התפלגות אחת במהלך נדידת אנדותל טרנס נויטרופילים או TEM בזמן אמת. הפאנל העליון מציג נויטרופיל מתואר בלבן נצמד לאנדותל וחוצה את צומת התא לתא מבלי לפגוע בהתפלגות הקוהרנטית של VE ו-PCAM אחד. במהלך דיאפדזיס, ניתן להבחין בפיזור מקומי של קוהרנטי VE ו-P chem כאשר נויטרופיל בולט דרך התא לצמתים של תאים המתוארים בלבן הוא נויטרופיל על גבי האנדותל.

המתאר הצהוב מראה קרום נויטרופילי שכבר נמצא מתחת לאנדותל. לאחר השלמת הדיאפדזיס, הצמתים נסגרים וקוהרנטיים ו-pcam אחד מועברים לאתרי הדיאפדזיס. גבולות הנויטרופיל הנודד מתוארים בצהוב.

לאחר הליך זה, ניתן לבצע נדידת אנדותל טרנס לויקוציטים על מנת לענות על שאלות נוספות כגון האם לויקוציטים חוצים את האנדותל באמצעות הבאגה או השורש הטרנס-תאי.