3D Orbital מעקב במיקרוסקופ שני פוטונים השתנה: בקשה למעקב של תאיים שלפוחית

המטרה הכוללת של הליך זה היא להמחיש כיצד לעקוב אחר אברונים הנעים במהירות כגון ליזוזומים הנעים בתלת מימד בתוך תא חי. זה מושג על ידי צביעה ראשונה של הליזוזומים והמיקרו-צינורות באמצעות צבעים מסחריים ספציפיים בתוך תאים חיים מתורבתים. השלב השני הוא להשתמש במיקרוסקופ סריקת לייזר ולהשתמש בשיטת המעקב המסלולי כדי לעקוב אחר תנועת הליזוזום במהירות גבוהה, גודל המסלול ופרמטרים אחרים, כגון תגובת התדר של המערכת נבחרים לאחר מכן לביצוע ניסויי מעקב.

בסופו של דבר, התוצאות מראות כי ניתן לעקוב אחר ליזוזומים הנעים במהירות בתלת מימד ולזהות אינטראקציות עם אברונים מוכתמים פלואורסצנטיים אחרים שנתקלים בהם לאורך מסלול הלייזר במהלך המעקב. היתרונות העיקריים של שיטת המעקב התלת-ממדי על פני שיטות קיימות אחרות, המבוססות, למשל, על אסטיגמטס, הוא ששיטת המעקב התלת-ממדית מאפשרת לנו לעקוב אחר טווח גדול מאוד של הדמנציה. שיטה זו יכולה לעזור לשאול שאלת מפתח בתחום הובלת השלפוחית, כגון כיצד שלפוחיות נעות לאורך צינורות מיקרו

אם כי ניתן להשתמש בשיטה זו כדי לחקור דינמיקה אנדוזומלית. ניתן להשתמש בו גם במערכות אחרות שבהן ניתן לתייג באופן פלואורסצנטי חלקיקים מבודדים כגון ננו-חלקיקים, קולטני ממברנה, קומפלקסים גרעיניים מצטברים או מיקומים גנטיים תאי שחלה של אוגר סיני או תאי CH K אחד כמתואר בפרוטוקול הטקסט. לאחר קצירת התאים, הניחו אותם בקוטר 14 מילימטר.

באר מיקרו בעובי פני השטח של 0.16 מילימטר תאי זרע לצפיפות אופטימלית להדמיה של כ-60 עד 70% Co fluency תאים מדגרים בן לילה ב-37 מעלות צלזיוס 5% CO2 למחרת, שוטפים את התאים שלוש פעמים בתמיסת מלח חוצצת של האנק או H-B-S-S-S-H-B-S-S משמשים להסרת תאים מתים או פסולת מצלחת התרבית ולהכנת התאים לשלב הצביעה. לאחר מכן דגרו את התאים בתמיסת HBSS המכילה ריכוז סופי של 50 גשש ליו מולארי ו-150 אנו טוחנת של גשש טובולין ירוק למשך שעה בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס לאחר הדגירה. שטפו את התאים שלוש פעמים ב-HBSS כדי להסיר כל צבע לא קשור.

הוסף מצע גידול DMEM טרי לפני הדמיית התאים. המיקרוסקופ למעקב אחר חלקיקים המתואר בפרוטוקול הווידאו מורכב על מסגרת של מיקרוסקופ הפוך זמין מסחרית. מקור אור עירור לייזר פמטו-שנייה זיקית קוהרנטית אולטרה שני טיטניום ספיר משמש עם פלט מתכוונן טווח אורכי גל בין 690 ננומטר ל-1040 ננומטר

ודא שקרן הלייזר מיושרת ביציאה האחורית של המיקרוסקופ. באמצעות מראות מצופות אינפרא אדום, קרן הלייזר מוחלשת באמצעות לוחית חצי גל מסתובבת המונחת מול מקטב קלציט, מחלישה את הקרן כך שההספק הממוצע בדגימה הוא בין 0.5 לשני מילי-וואט. אסוף את האור הקרינה מהדגימה על ידי הצבת מטרת מים עם צמצם מספרי גבוה לתוך נתיב האור.

לאחר מכן, הנח את הדגימה על במה ממונעת והתאם את התנועה העדינה של מטרת המיקרוסקופ. שימוש בבקר פיזו אובייקטיבי. בחר קוביית מסנן פלואורסצנטי בהתאם לאורכי גל הפליטה הרצויים בתצורת ערוץ אחד או שניים.

השתמש במסננים שעברו פס פליטה. כדי לבחור עוד יותר את הטווח הספקטרלי של הקרינה הנפלטת, כוון את האור מקוביית המסנן לצינורות מכפיל צילום שבהם האות מוגבר ומובחן, ונשלח לכרטיס רכישת נתוני פלט קלט דיגיטלי כדי לדמות את התאים, למקם אותם על הבמה ולהתמקד באמצעות תאורת אור משודרת. עבור להדמיית סריקת רסטר כדי לזהות את התאים ששילבו את הצבע, וכדי לדמיין את המיקרו-צינורות הבסיסיים, זהה את האזור הראשוני שבו קיימת תנועת השלפוחית.

לאחר זיהוי שלפוחית מבודדת, הגדר את הפרמטרים למעקב מסלולי. ראשית, בחר את רדיוס המסלול כדי להגדיר את גודל הסריקה המעגלית בהתאם לגודל החלקיק שאחריו עוקבים. עבור פולט נקודתי, הגדר את רדיוס המסלול שווה למותניים של פונקציית התפשטות הנקודה או PSF של קרן העירור.

למקסם את הרגישות והתגובה. הגדר את המרחק הצירי כדי להגדיר את המרחק בין שני המסלולים המבוצעים כדי למקם את מיקום החלקיקים לאורך הכיוון הצירי. הגדר את המרחק הצירי ל-1.5 עד פי שלושה מפסולת ה-PSF.

הגדר את זמן השהות בהתאם לבהירות החלקיק, כדי להגדיר את הזמן המושקע בכל נקודה במסלול, אשר יקבע גם את קצב הלבנת הצילום. השתמש בזמן שהייה בין 10 ל-100 מיקרו-שניות. הגדר את מספר הנקודות בכל מסלול ל-64 או 128 כדי להניב תקופות מסלול בסדר גודל של ארבע עד 32 אלפיות השנייה, ולספק רזולוציה זמנית גבוהה לקביעת מיקום החלקיק.

שנה את אות היסט ה-DC שנשלח למראות על מנת למרכז את האלומה על החלקיק דרך ממשק המשתמש הגרפי באמצעות בחירת סמן בתמונה הסרוקה. התחל לעקוב על ידי החלפת מצב המיקרוסקופ מהדמיית רסטר לסריקת מסלול. הפעל את המשוב ואיסוף הנתונים לניתוח מסלול.

השתמש בתוכנה כדי להציג את הקרינה שנאספה בכל נקודה לאורך המסלול ובכל נקודת זמן בצורה של שטיח עוצמה. העוצמה שנאספה לאורך השטיח מספקת מידע על האינטראקציה של החלקיק עם עצמים בהירים אחרים. הצג הן את מידע המסלול והן את עוצמת הקרינה שנאספה מצינור מכפיל הצילום לאורך זמן בצורה של סדרות זמן.

השתמש בייצוג סדרות הזמן ובמידע על שטיח העוצמה כדי לבחור רק אזור עניין במסלול. לאחר מכן הצג הקרנה דו-ממדית של החלק הנבחר של מסלול החלקיקים. בחר את הפקדים המתאימים כדי לצבוע את המסלול בהתאם לעוצמת הקרינה של החלקיקים.

בחרו באפשרות להציג את מסלול החלקיקים בתלת-ממד ולקודד אותו בצבע בהתאם לעוצמת הקרינה. סובב את המסלול בתלת-ממד באמצעות הפקדים כדי להמחיש את התכונות של תנועת הליזוזום לאורך המיקרו-צינורית. באמצעות צביעת צבע ירוק פלואורסצנטי של הליזוזומים ושל המיקרו-צינורות, ניתן לדמות את התנועה המהירה של השלפוחיות לאורך המיקרו-צינוריות באמצעות מיקרוסקופ סריקת לייזר דו-פוטוני.

עם זאת, להדמיית סריקת רסטר אין את הרזולוציה הזמנית הדרושה כדי לעקוב במדויק אחר תנועת האנדוזומים המהירים יותר אם נעשה שימוש במעקב מסלולי. במקום זאת, הנתונים מראים כי ניתן להשיג מסלולי תזוזה x, y, Z ברזולוציה זמנית של 32 אלפיות השנייה. במסלולי תזוזה לעומת זמן אלה, ניתוח השטיח מציג את העוצמה שנרשמה לאורך כל מסלול.

עם הזמן, מסלול העוצמה מספק מידע על הסביבה הפלואורסצנטית של החלקיק. האזור המקופסא מתאים לחלק של המסלול בין שתי קפיצות. כתמים בהירים מחוץ לאזור הקופסה תואמים לאינטראקציות של החלקיק עם עצמים בהירים אחרים וקשורים לקפיצות במסלול כאשר המסלולים מתרכזים מחדש במקור הפלואורסצנטי הבהיר ביותר.

במהלך המעקב ניתן לרשום את העוצמה המשולבת של הקרינה הנפלטת. המסלול התלת-ממדי המשוחזר מציג תנועה מכוונת כפי שניתן לצפות משלפוחית הנעה על רשת המיקרו-צינוריות. בנוסף, ניתן לתאם את המסלול התלת-ממדי ל-RAs או לתמונת סריקה של האזור שמסביב.

זה מאשר את תנועת החלקיק לאורך הכיוון של צרור מיקרו צינוריות. לאחר שליטה, ניתן לבצע טכניקה זו תוך מספר שעות אם היא מתפקדת כראוי תוך כדי ניסיון. נוהל זה חשוב לזכור להשתמש ברמת הספק לייזר שאינה מזיקה לדגימה שלך בזמן השימוש בציטוט פוטוני כפי שמוצג בפרוטוקול זה, רמות הספק כשני מילי-וולט לאחר המטרות צריכות להישמר.

לאחר צפייה בסרטון זה, אתם אמורים להבין היטב כיצד להגדיר ניסוי בשיטת המעקב המסלולי התלת-ממדי, המאפשרת לעקוב אחר עצמים בטווח Z גדול מאוד.