Name: 3D Orbital מעקב במיקרוסקופ שני פוטונים השתנה: בקשה למעקב של תאיים שלפוחית (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-10-01T13:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 28 s
Description: למדו מעקב תלת-ממדי של ליזוזומים בתאים חיים באמצעות מיקרוסקופ שני פוטונים משופר. שיטת המעקב המסלולי מאפשרת תצפית במהירות גבוהה על תנועת אברונים ואינטראקציות שלהם.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

פרויקט זה נתמך על ידי מענקים NIH NIGMS 8P41 GM103540-28 ו-P50-GM076516

הכנת .1 לדוגמא <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שמור על תאי CHOK1 בצלוחיות תרבית רקמה באמצעות DMEM בתוספת 10% בסרום שור העובר ו100 IU / מ&quot;ל ​​של פניצילין 50 מיקרוגרם / מ&quot;ל ​​של סטרפטומיצין. דגירה התאים בחממה humidified 5% CO 2 על 37 מעלות צלזיוס. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קציר ולאחר מכן תאי צלחת CHOK1 על מיקרו היטב בקוטר 14 מ&quot;מ בעובי של 0.16 מ&quot;מ משטח. תאי זרע לצפיפות אופטימלית להדמיה, סביב confluency 60-70%. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה תאי הלילה בשעה 37 ° C, 5% CO 2. שוטף את התאים שלוש פעמים בHBSS (האנק נאגר מלוח פתרון), ודגירת תאים בתמיסה המכילה 50 ננומטר של Lysotracker DND26 הירוק ו150 ננומטר של ירוק גשש טובולין. דגירה תאים לשעה 1 ב37 מעלות צלזיוס. שלב אופציונאלי: לפני הדגירה, לבצע כתם נוסף עם צבע המיטוכונדריה צביעת מטריצה ​​(25 ננומטר). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שוטף את התאים שלוש פעמים בHBSS כדי להסיר כל צבע מאוגד. הוסף בינוני צמיחת DMEM טרי לפני מתאר לעצמיing התאים. </li></ol> 2 תצורות מיקרוסקופ מיקרוסקופ למעקב אחר החלקיקים המתוארים בפרוטוקול הווידאו מורכב על המסגרת של מיקרוסקופ זמין מסחרי הפוך (איור 4). מודולים עם זאת מסחריים למעקב אחר חלקיקים מסלולית 3D זמינים כעת. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש השני קוהרנטית Chameleon-Ultra Ti: femtosecond מקור אור עירור לייזר Sa, עם טווח אורכי גל פלט מתכונן בין 690 ננומטר ננומטר-1,040. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ודא שקרן הלייזר מיושרת ביציאה האחורית של מיקרוסקופ באמצעות מראות מצופה IR. קרן הלייזר מוחלשת באמצעות צלחת חצי גל מסתובבת ואחריו מקטב ליניארי קלציט. להחליש את הקרן, כך שההספק הממוצע במדגם הוא בין mW 0.5 ו2. הערה: קרן הלייזר באה לידי ביטוי על ידי זוג מראות ומונעות גלונומטר מנוע המאפשרות שליטה על המיקום והמסלול של הקרן הממוקדת במטוס המדגם. בתצורה אופיינית קרן לייזר collimated יציאה של מראות גלונומטר מורחבת (10X) עוברת דרך הרחבה קרן, לפני שנכנסת לחלק האחורי של מטרת מיקרוסקופ לאחר ההשתקפות במראה dichroic קצר לעבור. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאסוף את אור פלואורסצנטי מהמדגם על ידי הצבת מטרה מספרית מים גבוהות צמצם (60X, NA 1.2) לתוך נתיב האור. בחר קוביית מסנן הקרינה על פי אורכי גל הפליטה הרצויים בכל תצורת ערוץ אחד או שתיים. מעסיק מסנני bandpass הפליטה כדי לבחור את טווח הספקטרום של הקרינה הנפלטת נוסף. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים את המדגם על במה ממונעת, ולהתאים את התנועה העדינה של מטרת מיקרוסקופ באמצעות piezo-בקר אובייקטיבי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לכוון את האור מקוביית המסנן לתוך צינורות מכפיל שבו האות מופלה ונשלחו לכרטיס רכישת נתונים I / O דיגיטלי. הערה: מחשב שנוצר צורות גל הם הפלט האנלוגי של I / O הכרטיס והם provided לסורקים לשלוט אלקטרוניקה. קלט ספירת פוטון מהמכפיל ואות הפלט לסורקים נמדד ונשלט באמצעות כרטיס קלט / פלט על ידי המעבדה לתוכנת Dynamics הקרינה SimFCS. </li></ol> .3 הדמיה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מקם את התאים על הבמה ולהתמקד באמצעות תאורת אור מועברת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לעבור להדמית סריקת סריקה לזהות את התאים ששלבו את הצבע וכדי להמחיש את microtubules הבסיסי. זהה את האזור הראשוני שבו תנועת שלפוחית ​​היא הווה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ברגע ששלפוחית ​​בודדת מזוהה, להגדיר את הפרמטרים למעקב ההקפה הבאים: <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בחר את הרדיוס של המסלול כדי להגדיר את הגודל של הסריקה המעגלית בהתאם לגודל של החלקיקים במעקב. לפולט נקודה, להגדיר את הרדיוס של המסלול שווה למותנים של פונקצית מורחים פוינט (כוחות הביטחון הפלסטיניים) של קורה העירור על מנת למקסם את הרגישות ותגובה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הגדר את צירילהרחיק כדי להגדיר את המרחק בין שני המסלולים המבוצעים בתרגום עמדת החלקיקים לאורך הכיוון הצירי. הגדר את המרחק הצירי ל1.5-3 פעמים המותניים כוחות הביטחון הפלסטיניים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הגדר את הזמן להתעכב בהתאם לבהירות של החלקיקים כדי להגדיר את המשך הזמן על כל נקודה של המסלול, שגם יקבע את שיעור הלבנת תמונה. השתמש להתעכב זמן בין 10-100 μsec. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הגדר את מספר נקודות בכל מסלול ל64 או 128 להניב תקופות מסלול בצו של 4-32 אלפיות שני ולספק רזולוציה גבוהה זמנית לקביעת עמדת החלקיקים. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשנות את DC אות לקזז נשלחה למראות כדי למרכז את הקרן על החלקיק דרך ממשק המשתמש הגרפי באמצעות בחירת סמן בדימוי שנסרק סריקה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להתחיל לעקוב אחר על ידי מעבר למצב מיקרוסקופ מסריקת הדמיה לסריקה מסלולית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפעל את אוסף המשוב ונתונים. </li></ol> .4 Trajectניתוח אורים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש בתוכנה כדי להציג את הקרינה שנאסף בכל נקודה לאורך המסלול ובכל נקודה בצורה של &quot;שטיח עוצמה &#39;זמן. העצמה שנאסף לאורך השטיח מספקת מידע על האינטראקציה של החלקיקים עם אובייקטים בהירים אחרים. להשתמש בתוכנה כדי להציג את שני מידע המסלול (כלומר עקירת DC לאורך הזמן של x, y וסורקים של -piezo z), כמו גם את עוצמת הקרינה שנאספו מהצינור מכפיל לאורך זמן בצורת סדרת זמן של. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש בייצוג סדרת הזמן ומידע &#39;שטיח עוצמה&#39; כדי לבחור רק אזור של עניין במסלול. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להשתמש בתוכנה כדי להציג הקרנת 2D של החלק הנבחר של מסלול החלקיק. בחר את הפקדים המתאימים לצבע קוד המסלול בהתאם לעוצמת הקרינה של חלקיקים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בחר את האפשרות להציג pמסלול מאמר ב3D, וצבע קוד אותו בהתאם לעוצמת הקרינה. סובב את המסלול ב3D באמצעות הפקדים כדי להמחיש את התכונות של תנועת הליזוזום לאורך microtubule. </li></ol>

<ol><li>So, P. T., Dong, C. Y., Masters, B. R., Berland, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two+photon+excitation+fluorescence+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Biomed+Eng%22%5BJournal%5D)">Two photon excitation fluorescence microscopy.</a> Annu Rev Biomed Eng. 2, 399-429 (2000).</li>
<li>Dupont, A., Lamb, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nanoscale+three+dimensional+single+particle+tracking%5BTitle%5D)+AND+%22Nanoscale%22%5BJournal%5D)">Nanoscale three dimensional single particle tracking.</a> Nanoscale. 3, 4532-4541 (2011).</li>
<li>Estrada, L. C., Gratton, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((3D+nanometer+images+of+biological+fibers+by+directed+motion+of+gold+nanoparticles%5BTitle%5D)+AND+%22Nano+Lett%22%5BJournal%5D)">3D nanometer images of biological fibers by directed motion of gold nanoparticles.</a> Nano Lett. 11, 4656-4660 (2011).</li>
<li>Kis-Petikova, K., Gratton, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distance+measurement+by+circular+scanning+of+the+excitation+beam+in+the+two+photon+microscope%5BTitle%5D)+AND+%22Microscopy+Research+and+Technique%22%5BJournal%5D)">Distance measurement by circular scanning of the excitation beam in the two photon microscope.</a> Microscopy Research and Technique. 63, 34-49 (2004).</li>
<li>Levi, V., Ruan, Q., Gratton, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((3+D+particle+tracking+in+a+two+photon+microscope+application+to+the+study+of+molecular+dynamics+in+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys+J%22%5BJournal%5D)">3 D particle tracking in a two photon microscope application to the study of molecular dynamics in cells.</a> Biophys J. 88, 2919-2928 (2005).</li>
<li>Lund, F. W., Wustner, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+comparison+of+single+particle+tracking+and+temporal+image+correlation+spectroscopy+for+quantitative+analysis+of+endosome+motility%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Microscopy%22%5BJournal%5D)">A comparison of single particle tracking and temporal image correlation spectroscopy for quantitative analysis of endosome motility.</a> Journal of Microscopy. 252, 169-188 (2013).</li>
<li>Nath, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spreading+of+Neurodegenerative+Pathology+via+Neuron+to+Neuron+Transmission+of+beta+Amyloid%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Spreading of Neurodegenerative Pathology via Neuron to Neuron Transmission of beta Amyloid.</a> Journal of Neuroscience. 32, 8767-8777 (2012).</li>
<li>Balint, S., Vilanova, I. V., Alvarez, A. S., Lakadamyali, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Correlative+live+cell+and+superresolution+microscopy+reveals+cargo+transport+dynamics+at+microtubule+intersections%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Correlative live cell and superresolution microscopy reveals cargo transport dynamics at microtubule intersections.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110, 3375-3380 (2013).</li>
<li>Huotari, J., Helenius, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endosome+maturation%5BTitle%5D)+AND+%22Embo+Journal%22%5BJournal%5D)">Endosome maturation.</a> Embo Journal. 30, 3481-3500 (2011).</li>
<li>Ragan, T., So, P. T., Kwon, H. S., Gratton, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((3D+particle+tracking+on+the+two+photon+microscope%5BTitle%5D)+AND+%22Multiphoton+Microscopy+in+the+Biomedical+Sciences%22%5BJournal%5D)">3D particle tracking on the two photon microscope.</a> Multiphoton Microscopy in the Biomedical Sciences. 2, 247-258 (2001).</li>
<li>Konig, K., So, P. T. C., Mantulin, W. W., Gratton, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cellular+response+to+near-infrared+femtosecond+laser+pulses+in+two+photon+microscopes%5BTitle%5D)+AND+%22Optics+Letters%22%5BJournal%5D)">Cellular response to near-infrared femtosecond laser pulses in two photon microscopes.</a> Optics Letters. 22, 135-136 (1997).</li>
<li>Caviston, J. P., Holzbaur, E. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microtubule+motors+at+the+intersection+of+trafficking+and+transport%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Microtubule motors at the intersection of trafficking and transport.</a> Trends Cell Biol. 16, 530-537 (2006).</li>
<li>Cardarelli, F., Lanzano, L., Gratton, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Capturing+directed+molecular+motion+in+the+nuclear+pore+complex+of+live+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Capturing directed molecular motion in the nuclear pore complex of live cells.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109, 9863-9868 (2012).</li>
</ol>

למחברים אין מה לחשוף.

למרות ההתקדמות העצומה בטכניקות הקרינה מיקרוסקופיה וinstrumentations בשנים האחרונות, להשגת מסלולים של חלקיקי ניאון בשלושה ממדים עם רזולוציה גבוהה זמנית נשאר אתגר בתחום. אם רזולוציה גבוהה זמנית הושגה חלקיקי מעקב בשני ממדים, הרחבה לכיוון הצירי בדרך כלל מביאה לירידה דרסטית בתגובת התדר של המערכת 10. בסרטון-פרוטוקול זה אנו מתמקדים ביישום ההפגנתי של מעקב חלקיקים בודדים בשלושה ממדים בתוך תא חי עם רזולוציה גבוה...

מספר גדול של גישות פותחו עד כה כדי לעקוב אחר חלקיקי ניאון בשלושה ממדים באמצעות מיקרוסקופ. רוב הגישות מסתמכות על השימוש במצלמות מהירות, מתאימות באופן אידיאלי למעקב בשני ממדים, בשילוב בדרך כלל עם שינויים מותאמים אישית של אופטיקה הפליטה של ​​מיקרוסקופ כדי להשיג מעקב בכיוון הצירי. מיקרוסקופי סריקת לייזר (או confocal או שני פוטונים) כמקובל יכול לעקוב אחר חלקיקי ניאון על ידי ביצוע רצף של z-ערימות זמן, למרות שתהליך זה הוא בדרך כלל זמן רב, ומניב רזולוציה זמן סבירה (10 Hz) רק אם במעקב החלקיקים הוא המשיך במרכז אזור הדמיה סריקה קטן על ידי מנגנון משוב פעיל 2. הרעיון של נעילה לחלקיקים הוא הבסיס של שיטת המעקב מסלולית. במקום סריקה לסרוק מסלול מעגלי מתבצע סביב חלקיקי הניאון. עוצמת הקרינה לאורךהמסלול בדיוק מתאים את עמדת חלקיקי 4. העמדה המקומית של החלקיקים לאחר מכן ניתן להשתמש כדי להניע סורקי מיקרוסקופ ומחדש מרכז המסלול בעמדת החלקיקים. סורקי גלונומטר של המיקרוסקופ מונעים על ידי מתח אנלוגי. רכיב AC של מתח זה מאפשר לבצע מסלול עם קרן הלייזר הממוקדת, כלומר סינוס וקוסינוס גל פנה למראות X וסריקת Y יאפשר ביצוע מסלול מעגלי. DC לקזז של האות מקל לשנות את מיקומו של מרכז המסלול. ברגע שתקופת מסלול נקבעה ואת צורת הגל לאות AC מוגדרת, מערכת המשוב צריכה לעדכן את רכיב DC רק של האות. תוכנה מסוגלת לקרוא את אות הניאון שנאסף מהגלאים נדרשה לשלוט הסורקים וגלאים, כדי לחשב את המיקום של החלקיק ולעדכן את DC אתנקבע. למשוב מוצלח הדמיה בחירה זהירה של הפרמטרים המסלול (גודל ועיתוי) דרוש ופרמטרים אלה צריכים להיות מותאמים המבוססים על המאפיינים של חלקיקי הניאון שיש צורך לעקוב אחר. היסודות הפיזיים ומתמטיים של הטכניקה תוארו ב4,5 העבר עבור שני יישומי 2D and 3D. בפרוטוקול זה אנו מתארים בקצרה את רכיבי החומרה המרכזיים של ההתקנה, ובפירוט רב יותר נדרשים הבחירה של הפרמטרים והכנת המדגם לניסוי טיפוסי מאפשר לנו הבא לעקירתם של הליזוזום ברזולוציה גבוהה זמנית בתוך תא חי.

<table><tbody><tr><td>Lysotracker DND 26</td><td>Life Technologies</td><td>L-7526</td><td></td></tr><tr><td>Tubuline tracker Green</td><td>Life Technologies</td><td>T34075</td><td></td></tr><tr><td>Mitotracker RED</td><td>Life Technologies</td><td>M7512</td><td></td></tr><tr><td>מלון קוהרנטי- אולטרה II</td><td>TI קוהרנטי</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Glan Taylor Calcite Polarizer</td><td>Melles Griot</td><td>03PTA001</td><td></td></tr><tr><td>מראה גלוונומטר-מנוע</td><td>Cambridge Technologies</td><td>M 6350</td><td></td></tr><tr><td>מראה דיכרואית</td><td>Chroma Technologies</td><td>700 DCSPXR</td><td></td></tr><tr><td>שלב ממונע</td><td>ASI</td><td>MS2000</td><td></td></tr><tr><td>Piezo&nbsp;</td><td>PI</td><td>P721-LLQ</td><td></td></tr><tr><td>צינור מכפיל צילום</td><td>Hamamatsu</td><td>H7422P-40</td><td></td></tr><tr><td>כרטיס רכישת נתונים</td><td>IO tech</td><td>PCI 1128-4000</td><td></td></tr><tr><td>תוכנת הדמיה</td><td>LFD</td><td>Global לתמונות-SimFCS</td><td></td></tr></tbody></table>

3d orbital מעקב במיקרוסקופ שני פוטונים השתנה: בקשה למעקב של תאיים שלפוחית

3D Orbital Tracking in a Modified Two-photon Microscope: An Application to the Tracking of Intracellular Vesicles

מטרת פרוטוקול וידאו זה היא לדון כיצד לבצע ולנתח ניסוי מסלולית ניאון תלת ממדי מעקב אחר חלקיקים באמצעות מיקרוסקופ שני פוטונים שונה 1. בניגוד לגישות קונבנציונליות (סריקה סריקה או שדה רחב המבוסס על ערימה של מסגרות), המעקב מסלולית 3D מאפשר למקם ופעל עם מרחבית גבוהה (10 דיוק ננומטר) ורזולוציה של זמן (תגובת תדר 50 הרץ) עקירת 3D של חלקיקי ניאון נעו על אורך קשקשים של מאות מיקרונים 2. השיטה מבוססת על אלגוריתם משוב ששולט בחומרה של מיקרוסקופ סריקת לייזר שני פוטונים על מנת לבצע מסלול מעגלי מסביב לאובייקט להיות במעקב: מנגנון המשוב ישמור את אובייקט הניאון במרכז על ידי שליטה על התזוזה של קרן הסריקה 3-5. כדי להדגים את היתרונות של טכניקה זו, אנחנו אחרי אברון זז מהר, הליזוזום, בתוך אלתא iving 6,7. תאים היו מצופים על פי פרוטוקולים סטנדרטיים, ומוכתם באמצעות צבע מסחרי הליזוזום. אנו דנים בקצרה את תצורת החומרה ובפירוט רב יותר את תוכנת שליטה, לבצע ניסוי מעקב מסלולית 3D בתוך תאי חיים. אנו דנים בפירוט הפרמטרים הנדרשים על מנת לשלוט במיקרוסקופ הסריקה ולאפשר התנועה של האלומה במסלול סגור סביב החלקיקים. אנו מסיקים על ידי המדגימים כיצד שיטה זו ניתן להשתמש ביעילות כדי לעקוב אחר התנועה מהירה של הליזוזום שכותרתו לאורך microtubules ב3D בתוך תא חי. יזוזומים יכולים לנוע במהירויות בטווח של 0.4-0.5 מיקרומטר / sec, בדרך כלל מוצגות תנועה בבימויו לאורך רשת microtubule 8.

על פי פרוטוקול זה מעקב אחר חלקיקים מהירים 3D יחיד יכול להתבצע בתוך תאי חיים באמצעות מיקרוסקופ שני פוטונים שונה כדי לעקוב אחר התזוזה של יזוזומים שכותרתו fluorescently. הניסוי בוצע מתחקה אחרים הליזוזום מבודד נע בתוך התא לאחר תהליך התבגרות endosome 9. יזוזומים היו מוכתמים באמצעות צבע ירוק ניאון ונרגש ב930 ננומטר ניצול עירור 2 פוטונים. הנתונים שלנו מראים שזה אפשרי להשיג x, y, z מסלולי תזוזה עם רזולוציה זמנית של 32 אלפיות שניים (איור 1 א). ניתוח השט...

בפרוטוקול וידאו זה אנו עוקבים - במהירות גבוהה ובתלת מימד - אחר ליזוזומים בעלי תווית פלואורסצנטית בתוך תאים חיים, תוך שימוש בשיטת המעקב המסלולי במיקרוסקופ דו-פוטוני שונה.

3D Orbital מעקב במיקרוסקופ שני פוטונים השתנה: בקשה למעקב של תאיים שלפוחית

The objective of this video protocol is to discuss how to perform and analyze a three-dimensional fluorescent orbital particle tracking experiment using a ...

המטרה הכוללת של הליך זה היא להמחיש כיצד לעקוב אחר אברונים הנעים במהירות כגון ליזוזומים הנעים בתלת מימד בתוך תא חי. זה מושג על ידי צביעה ראשונה של הליזוזומים והמיקרו-צינורות באמצעות צבעים מסחריים ספציפיים בתוך תאים חיים מתורבתים. השלב השני הוא להשתמש במיקרוסקופ סריקת לייזר ולהשתמש בשיטת המעקב המסלולי כדי לעקוב אחר תנועת הליזוזום במהירות גבוהה, גודל המסלול ופרמטרים אחרים, כגון תגובת התדר של המערכת נבחרים לאחר מכן לביצוע ניסויי מעקב.בסופו של דבר, התוצאות מראות כי ניתן לעקוב אחר ליזוזומים הנעים במהירות בתלת מימד ולזהות אינטראקציות עם אברונים מוכתמים פלואורסצנטיים אחרים שנתקלים בהם לאורך מסלול הלייזר במהלך המעקב. היתרונות העיקריים של שיטת המעקב התלת-ממדי על פני שיטות קיימות אחרות, המבוססות, למשל, על אסטיגמטס, הוא ששיטת המעקב התלת-ממדית מאפשרת לנו לעקוב אחר טווח גדול מאוד של הדמנציה. שיטה זו יכולה לעזור לשאול שאלת מפתח בתחום הובלת השלפוחית, כגון כיצד שלפוחיות נעות לאורך צינורות מיקרו.אם כי ניתן להשתמש בשיטה זו כדי לחקור דינמיקה אנדוזומלית. ניתן להשתמש בו גם במערכות אחרות שבהן ניתן לתייג באופן פלואורסצנטי חלקיקים מבודדים כגון ננו-חלקיקים, קולטני ממברנה, קומפלקסים גרעיניים מצטברים או מיקומים גנטיים תאי שחלה של אוגר סיני או תאי CH K אחד כמתואר בפרוטוקול הטקסט. לאחר קצירת התאים, הניחו אותם בקוטר 14 מילימטר.באר מיקרו בעובי פני השטח של 0.16 מילימטר תאי זרע לצפיפות אופטימלית להדמיה של כ-60 עד 70% Co fluency תאים מדגרים בן לילה ב-37 מעלות צלזיוס 5% CO2 למחרת, שוטפים את התאים שלוש פעמים בתמיסת מלח חוצצת של האנק או H-B-S-S-S-H-B-S-S משמשים להסרת תאים מתים או פסולת מצלחת התרבית ולהכנת התאים לשלב הצביעה. לאחר מכן דגרו את התאים בתמיסת HBSS המכילה ריכוז סופי של 50 גשש ליו מולארי ו-150 אנו טוחנת של גשש טובולין ירוק למשך שעה בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס לאחר הדגירה. שטפו את התאים שלוש פעמים ב-HBSS כדי להסיר כל צבע לא קשור.הוסף מצע גידול DMEM טרי לפני הדמיית התאים. המיקרוסקופ למעקב אחר חלקיקים המתואר בפרוטוקול הווידאו מורכב על מסגרת של מיקרוסקופ הפוך זמין מסחרית. מקור אור עירור לייזר פמטו-שנייה זיקית קוהרנטית אולטרה שני טיטניום ספיר משמש עם פלט מתכוונן טווח אורכי גל בין 690 ננומטר ל-1040 ננומטר.ודא שקרן הלייזר מיושרת ביציאה האחורית של המיקרוסקופ. באמצעות מראות מצופות אינפרא אדום, קרן הלייזר מוחלשת באמצעות לוחית חצי גל מסתובבת המונחת מול מקטב קלציט, מחלישה את הקרן כך שההספק הממוצע בדגימה הוא בין 0.5 לשני מילי-וואט. אסוף את האור הקרינה מהדגימה על ידי הצבת מטרת מים עם צמצם מספרי גבוה לתוך נתיב האור.לאחר מכן, הנח את הדגימה על במה ממונעת והתאם את התנועה העדינה של מטרת המיקרוסקופ. שימוש בבקר פיזו אובייקטיבי. בחר קוביית מסנן פלואורסצנטי בהתאם לאורכי גל הפליטה הרצויים בתצורת ערוץ אחד או שניים.השתמש במסננים שעברו פס פליטה. כדי לבחור עוד יותר את הטווח הספקטרלי של הקרינה הנפלטת, כוון את האור מקוביית המסנן לצינורות מכפיל צילום שבהם האות מוגבר ומובחן, ונשלח לכרטיס רכישת נתוני פלט קלט דיגיטלי כדי לדמות את התאים, למקם אותם על הבמה ולהתמקד באמצעות תאורת אור משודרת. עבור להדמיית סריקת רסטר כדי לזהות את התאים ששילבו את הצבע, וכדי לדמיין את המיקרו-צינורות הבסיסיים, זהה את האזור הראשוני שבו קיימת תנועת השלפוחית.לאחר זיהוי שלפוחית מבודדת, הגדר את הפרמטרים למעקב מסלולי. ראשית, בחר את רדיוס המסלול כדי להגדיר את גודל הסריקה המעגלית בהתאם לגודל החלקיק שאחריו עוקבים. עבור פולט נקודתי, הגדר את רדיוס המסלול שווה למותניים של פונקציית התפשטות הנקודה או PSF של קרן העירור.למקסם את הרגישות והתגובה. הגדר את המרחק הצירי כדי להגדיר את המרחק בין שני המסלולים המבוצעים כדי למקם את מיקום החלקיקים לאורך הכיוון הצירי. הגדר את המרחק הצירי ל-1.5 עד פי שלושה מפסולת ה-PSF.הגדר את זמן השהות בהתאם לבהירות החלקיק, כדי להגדיר את הזמן המושקע בכל נקודה במסלול, אשר יקבע גם את קצב הלבנת הצילום. השתמש בזמן שהייה בין 10 ל-100 מיקרו-שניות. הגדר את מספר הנקודות בכל מסלול ל-64 או 128 כדי להניב תקופות מסלול בסדר גודל של ארבע עד 32 אלפיות השנייה, ולספק רזולוציה זמנית גבוהה לקביעת מיקום החלקיק.שנה את אות היסט ה-DC שנשלח למראות על מנת למרכז את האלומה על החלקיק דרך ממשק המשתמש הגרפי באמצעות בחירת סמן בתמונה הסרוקה. התחל לעקוב על ידי החלפת מצב המיקרוסקופ מהדמיית רסטר לסריקת מסלול. הפעל את המשוב ואיסוף הנתונים לניתוח מסלול.השתמש בתוכנה כדי להציג את הקרינה שנאספה בכל נקודה לאורך המסלול ובכל נקודת זמן בצורה של שטיח עוצמה. העוצמה שנאספה לאורך השטיח מספקת מידע על האינטראקציה של החלקיק עם עצמים בהירים אחרים. הצג הן את מידע המסלול והן את עוצמת הקרינה שנאספה מצינור מכפיל הצילום לאורך זמן בצורה של סדרות זמן.השתמש בייצוג סדרות הזמן ובמידע על שטיח העוצמה כדי לבחור רק אזור עניין במסלול. לאחר מכן הצג הקרנה דו-ממדית של החלק הנבחר של מסלול החלקיקים. בחר את הפקדים המתאימים כדי לצבוע את המסלול בהתאם לעוצמת הקרינה של החלקיקים.בחרו באפשרות להציג את מסלול החלקיקים בתלת-ממד ולקודד אותו בצבע בהתאם לעוצמת הקרינה. סובב את המסלול בתלת-ממד באמצעות הפקדים כדי להמחיש את התכונות של תנועת הליזוזום לאורך המיקרו-צינורית. באמצעות צביעת צבע ירוק פלואורסצנטי של הליזוזומים ושל המיקרו-צינורות, ניתן לדמות את התנועה המהירה של השלפוחיות לאורך המיקרו-צינוריות באמצעות מיקרוסקופ סריקת לייזר דו-פוטוני.עם זאת, להדמיית סריקת רסטר אין את הרזולוציה הזמנית הדרושה כדי לעקוב במדויק אחר תנועת האנדוזומים המהירים יותר אם נעשה שימוש במעקב מסלולי. במקום זאת, הנתונים מראים כי ניתן להשיג מסלולי תזוזה x, y, Z ברזולוציה זמנית של 32 אלפיות השנייה. במסלולי תזוזה לעומת זמן אלה, ניתוח השטיח מציג את העוצמה שנרשמה לאורך כל מסלול.עם הזמן, מסלול העוצמה מספק מידע על הסביבה הפלואורסצנטית של החלקיק. האזור המקופסא מתאים לחלק של המסלול בין שתי קפיצות. כתמים בהירים מחוץ לאזור הקופסה תואמים לאינטראקציות של החלקיק עם עצמים בהירים אחרים וקשורים לקפיצות במסלול כאשר המסלולים מתרכזים מחדש במקור הפלואורסצנטי הבהיר ביותר.במהלך המעקב ניתן לרשום את העוצמה המשולבת של הקרינה הנפלטת. המסלול התלת-ממדי המשוחזר מציג תנועה מכוונת כפי שניתן לצפות משלפוחית הנעה על רשת המיקרו-צינוריות. בנוסף, ניתן לתאם את המסלול התלת-ממדי ל-RAs או לתמונת סריקה של האזור שמסביב.זה מאשר את תנועת החלקיק לאורך הכיוון של צרור מיקרו צינוריות. לאחר שליטה, ניתן לבצע טכניקה זו תוך מספר שעות אם היא מתפקדת כראוי תוך כדי ניסיון. נוהל זה חשוב לזכור להשתמש ברמת הספק לייזר שאינה מזיקה לדגימה שלך בזמן השימוש בציטוט פוטוני כפי שמוצג בפרוטוקול זה, רמות הספק כשני מילי-וולט לאחר המטרות צריכות להישמר.לאחר צפייה בסרטון זה, אתם אמורים להבין היטב כיצד להגדיר ניסוי בשיטת המעקב המסלולי התלת-ממדי, המאפשרת לעקוב אחר עצמים בטווח Z גדול מאוד.

3d-orbital-tracking-modified-two-photon-microscope-an-application-to

Research

JoVE Journal

Bioengineering

הנדסה ביולוגית

סרטון זה מדגים כיצד שלפוחיות עצביות מסומנות בחלבונים פלואורסצנטיים ספציפיים כדי לדמיין את תנועתן. ראשית, פלסמיד המקודד לחלבון פלואורסצנטי מודגר עם סוכן טרנספקציה ולאחר מכן מוכנס לתרבית של נוירונים. לאחר מכן, תמונות של הנוירונים נרכשות ומנותחות כדי לעקוב אחר תנועת השלפוחיות.

הדמיה של תנועתיות שלפוחית בתאי עצב באמצעות הדמיה פלואורסצנטית

הדמיה ארבעה ממדים (4D) מנוצל כדי ללמוד את ההתנהגות ואינטראקציות בין שני סוגים של endosomes בחיים מסוף עצב חוליות. תנועה של המבנים הקטנים האלה מתאפיינת בשלושה ממדים, המאפשרת אישור של אירועים כגון היתוך endosome וexocytosis.

ויזואליזציה של Endosome Dynamics בחי מסוף עצב עם דימות פלואורסצנטי ארבעה ממדים

החקירה של סחר קרום הוא חיוני להבנת תפקודים נוירונים. כאן, אנו מציגים שיטה לכימות תנועתיות שלפוחית ​​נוירונים. זוהי שיטה נוחה שניתן להתאים את כימות של סחר קרום במערכת העצבים.

כימות של Endosome ו Lysosome Motilities ב נוירונים תרבותיים באמצעות בדיקות פלואורסצנטי

פרוטוקול זה פרטים הקמה ותפעול של מיקרוסקופ מעקב בזמן אמת 3D חלקיק יחיד מסוגל מעקב הננומטרי פלורסנט רגשים במהירויות גבוהות המפזרת, המחירים ספירה נמוכה פוטון.

פרוטוקול לצורך מעקב בזמן אמת 3D חלקיק יחיד

כאן אנחנו מדגימים כיצד מולקולה בודדת לוקליזציה מופעל צילום מיקרוסקופ יכול להתבצע על הטרמינל עצבים מוטוריים של חיים דרוזופילה melanogaster השלישי instar זחל.

אין ויוו מעקב אחר בתחנת האוטובוסים Presynaptic עצבים מוטוריים דרוזופילה מולקולה בודדת

פרוטוקול זה מתאר את הניתוח של מסומן בתוך התאים התאיים בתוך שמרים באמצעות מרובת צבעים 4d (זמן הפקיעה 3d) קונפוקלית מיקרוסקופ. הפרמטרים הדמיה נבחרים כדי ללכוד אותות הולמים תוך הגבלת photodamage. תוספים מותאמים אישית של ImageJ מאפשרים מבנים עם תוויות למעקב וניתוח כימות.

4D מיקרוסקופ של שמרים

3D מיקרוסקופ לוקליזציה יחיד מולקולה מנוצל כדי לחקור את המיקומים מרחבי ומסלולי תנועה של חלבונים המסומנים באנרגיה בתאי בקטריאלי חיים. פרוטוקול ניתוח הנתונים הניסיוני והמידע המתואר להלן קובע את ההתנהגויות התפוצזות הנפוצות של חלבונים ציטוסולמים בהתבסס על מסלולים בעלי מולקולה בודדת.

מיקרוסקופ מעקב חד-מולקולה-כלי לקביעת המדינות התפוצבניות של מולקולות ציטוסולג

ניתוח תזוזה ריבועית ממוצעת (iMSD) שמקורו בהדמיה מיושם על מקרופינוזומים כדי להדגיש את האופי הפנימי שלהם המתפתח בזמן במונחים של תכונות מבניות ודינמיות. לאחר מכן משווים את המקרופינוזומים לגרגירי הפרשת האינסולין (ISGs) כהתייחסות למבנים תת-תאיים בעלי תכונות מבניות/דינמיות ממוצעות של אינווריאנטים בזמן.

בדיקת תכונות מבניות ודינמיות של ננו-מבנים תת-תאיים של סחר בבני אדם על-ידי ספקטרוסקופיית תנודות מרחביות-טמפורליות

בעובר דרוזופילה המוקדם, אברונים רבים הם תנועתיים. באופן עקרוני, ניתן לדמות אותם בשידור חי באמצעות בדיקות פלואורסצנטיות ספציפיות, אך קליפת הביצית מונעת יישום ישיר על העובר. פרוטוקול זה מתאר כיצד להציג בדיקות כאלה באמצעות מיקרו-איניג'קציה, ולאחר מכן לנתח תנועת אברונים בתפזורת באמצעות ולוסימטריה של תמונת חלקיקים.

הדמיה של סחר תלוי-שלד ציטוסקלטון של אברונים המכילים שומנים בעוברי דרוזופילה

מאמר זה מספק תיאור מפורט כיצד ליצור דגימות למעקב אחר חלבון יחיד בשכבות דו-שכביות ליפידיות הנתמכות על ידי מוצקים. הוא גם מסביר מיקרוסקופ פלואורסצנציה פשוט עם רגישות למולקולה בודדת וקצב פריימים מהיר. לבסוף, אנו מתארים את ההליך להפקת מסלולי חלבון יחיד.

מעקב אחר חלבונים בודדים בדו-שכבתיות של ליפידים באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי

למדו מעקב תלת-ממדי של ליזוזומים בתאים חיים באמצעות מיקרוסקופ שני פוטונים משופר. שיטת המעקב המסלולי מאפשרת תצפית במהירות גבוהה על תנועת אברונים ואינטראקציות שלהם.

3D Orbital מעקב במיקרוסקופ שני פוטונים השתנה: בקשה למעקב של תאיים שלפוחית

גלה סרטונים נוספים