הפקה ובידוד של אקסונים מסנסורי ביוכימית ניתוח באמצעות מסננים נקבוביים

מטרת הליך זה היא להשיג תכשירים אקסונליים טהורים המתאימים לבדיקה בטכניקות כימיות קונבנציונליות, ביוכימיות או אימונו-ציטו. זה מושג על ידי תרבית ראשונה של תאי גנגליון שורש גב עובריים על תוספות תרבית הנושאות מסנן ממברנה נקבובי כאשר נוירוני ה-DRG מרחיבים את האקסונים. חלק מהאקסונים גדלים דרך נקבוביות במסנן ונמשכים על פני השטח התחתונים שלו בעוד גופי התאים נשארים מבודדים על המשטח העליון לאחר המניפולציות הניסיוניות הרצויות, ההכנה האקסונלית מתקבלת על ידי הסרה פיזית של התאים בצד העליון של המסננים תוך שמירה על האקסונים שגדלו בצד התחתון.

בסופו של דבר, ניתן לשקר את האקסונים המבודדים לניתוחים ביוכימיים או לתקן אותם לבדיקה אימונוכימית על ידי הפקת דגימות אקסונליות טהורות המתאימות לניתוח בטכניקות ביוכימיות קונבנציונליות. הליך זה הוכיח את עצמו כשימושי מאוד לחקירת הפיזיולוגיה והפתופיזיולוגיה של אקסונים. כפי שתראה, הטכניקה פשוטה יחסית ליישום וניתנת להתאמה לסביבות ניסוי מסוימות.

אנו הולכים להדגים את השימוש בו בחקר מנגנוני ניוון אקסונלי יום לפני הציפוי. התחל בציפוי המסננים מתחת למכסה מנוע סטרילי לתרבית רקמות. מקום ראשון, מסנן 24 מילימטר מוסיף בצלחת קליטה של שש בארות.

לאחר מכן הוסיפו שני מיליליטר של מיליגרם אחד למיליליטר, פולי דה ליצין במים לתא התחתון ומיליליטר אחד למעלה, ודגרו את התוספות למשך שעה בטמפרטורת החדר. הבא שלה שואב את הפולי דה ליצין ומקפיד להסיר את שאריות הנוזל שנלכד ישירות מתחת למסנן. לאחר מכן יש לשטוף פעם אחת במים לאחר שאיבת המים, לסגור את המכסה ולהשאיר את הצלחות לייבוש במכסה המנוע למשך הלילה.

למחרת בבוקר מערבבים ומחממים תמיסת למינציה ומים בחום של 37 מעלות צלזיוס. דגרו את התוספות בתמיסת הלמינין למשך שעה בחממת תאים בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס באמצעות נפחים סטנדרטיים. לאחר השאיפה.

הלמינין מוסיף 0.1 מיליגרם למיליליטר, קולגן במים ודוגר במשך שעה בטמפרטורת החדר, ואז שואב את הקולגן ושוטף פעם אחת במים סטריליים. המסננים מוכנים כעת לקליטת מדיית תרבית והסבר DRG לאחר מכן, לאחר ניתוח ועריפת ראש של עובר עכבר E 13 כמתואר בפרוטוקול הטקסט. הניחו את העובר על צדו בצלחת פטרי מלאה במדיה L 15 תוך התבוננות במיקרוסקופ מנתח, בצעו חתך לאורך הצדדים הצדדיים כדי להשליך את החזה, גפי הבטן והזנב.

הנח את הגב המכיל את צד הגחון של עמוד השדרה כלפי מעלה והסר את כל איברי הקרביים בעזרת מספריים קפיציים קטנים. חשוף את כל חוט השדרה על ידי חיתוך עמוד השדרה מהצד הגחוני שלו לאורך קו האמצע. החזיקו את הפגר עם זוג אחד של מלקחיים מספר שלוש והשתמשו בזוג שני כדי להחזיק את חוט השדרה בהיבט הרוסטרלי ביותר שלו.

כעת, משוך לאט ובעדינות את החוט הרחק מחלל החוליות. כאשר ה-DRGs נחשפים, השתמש במלקחיים דקים במיוחד מספר חמש כדי לצבוט אותם מחוט השדרה. מניחים את ה-DRG המנותקים בתחתית הכלי בעזרת קצה פיפטה של 200 מיקרוליטר שנחתך להגדלה.

הפתיחה שלו. שאפו את ה-DRG שנאספו והניחו אותם בצינור על קרח. השלם את מדיית התא התחתון ב-15 ננוגרם למיליליטר של NGF תוך שמירה על התא העליון ללא NGF.

לאחר מכן, הוסף מדיית DRG מלאה ב-37 מעלות צלזיוס לתוספות המצופות באמצעות נפחים סטנדרטיים. לאחר מכן השתמשו בפיפטה של 1000 מיקרוליטר עם עיטור קצה כדי להגדיל את הפתח שלה. הגדר את הפיפטה על 800 מיקרוליטר.

לאחר מכן העבירו כ-200 מיקרוליטר של מדיה מהצד העליון של המסנן ל-DRG המכיל פיפטת צינור בנפח קטן למעלה ולמטה על מנת להחיות את ה-D RRG ששקעו לתחתית. לאחר השעיה מחדש שאפו את כל הנפח, כעת העבירו את ה-DRG למסנן על ידי טבילת קצה הפיפטה באמצע התוסף והוצאת ה-DRG. שמור על התרביות בחממת תאים ב-37 מעלות צלזיוס.

החלפת המדיה כל יומיים-שלושה כדי להחליף את המדיה. שאפו תחילה את התא העליון, ואחריו את התא התחתון. הוסף מדיה חדשה בנפחים סטנדרטיים החל מהתא התחתון כדי לחקור את ההשפעה של נסיגת הגורם הטרופי על האקסונים.

המתן יומיים כדי לאפשר הארכה אקסונלית. לאחר מכן, הסר את המדיה מהתאים העליונים והתחתונים. לאחר מכן כדי לבודד את כל מה שנותר או המיוצר באופן אנדוגני ו-GF להוסיף מדיה חסרת NGF ומכילה נוגדנים נגד NGF.

החזר את הלוחות לחממת התאים ב-37 מעלות צלזיוס כדי לאפשר לניוון המושרה על ידי נסיגת NGF להמשיך למשך הזמן הרצוי ללימוד בזמן הניוון הארי. השתמש במסננים המכילים DRG explan השמור ב-NGF במשך יומיים. השתמש במגרד תאים כדי לגרד DRG מהצד העליון של המסנן.

הקפידו על הסרה מוחלטת של גופי התאים העצביים על ידי הזזת המגרד קדימה ואחורה בכיווני x ו-y ובמעגלים. אשר את הצלחת הגירוד על ידי בדיקה שלא נשארים צמחי X מחוברים למסנן. לאחר מכן, השליכו את המדיה המכילה את הצמחים הצפים מהתא העליון והוסיפו מיליליטר אחד של מדיית DRG שלמה חמה מראש המכילה 10 ננוגרם למיליליטר ו-gf.

לאחר מכן החזר את הצלחת לחממת התאים ב-37 מעלות צלזיוס כדי לאפשר לניוון וולרי להמשיך למשך הזמן הרצוי כדי לחלץ חלבון מהדגימות האקסונליות. התחל במילוי צינורות איסוף של 1.5 מיליליטר ב-75 מיקרוליטר של מאגר דגימת עלי כבש והנח את הצינורות על קרח. שטפו את המסנן המכיל את ה-DRG ב-PBS וגרדו את הצד העליון של המסנן כמו קודם.

לאחר הוצאת התוספת מהצלחת, השתמש באפליקטור קצה כותנה כדי לנקות את הצד העליון של המסנן. לאחר מכן שאפו כל PBS נוסף מהצד העליון והתחתון. לאחר מכן, הניחו את התוספת הפוכה על ספסל והשתמשו באזמל חד כדי לחתוך את המסנן מהתוספת.

ואז החזק את המסנן בעזרת מלקחיים. מלמטה למעלה. השתמש במספריים כדי לבצע חתך מההיקף למרכז המסנן.

כעת הניחו את המסנן על גבי צינור האיסוף ובעזרת מלקחיים לחצו על מרכז המסנן במורד הצינור. תוך כדי כך, ייווצר משפך שידחוף את המסנן בצורת משפך לתחתית הצינור כך שהוא יהיה שקוע במאגר הדגימה של הלאלי. כעת השלם את מיצוי החלבון על ידי כיסוי הצינורות והנחתם במים רותחים למשך ארבע דקות.

הסר את המסנן באמצעות מלקחיים והנח אותו הפוך בחלק העליון של הצינור וצנטריפוגה אותו לזמן קצר. בסיום, השליכו את המסננים המיובשים לאימונופלואורסצנטיות. שוטפים את התוספות ב- PBS בשש צלחות באר.

לאחר מכן מקבעים את התוספות באלדהיד טרי של 4% פרפורמים ב- PBS למשך 10 דקות בטמפרטורת החדר על שייקר לאחר קיבוע, מגרדים ומנקים את הצד העליון של התוספות כדי להבטיח שרק אקסונים שגדלו אך ורק על המשטח התחתון של המסנן יוכתמו. לאחר מכן בצע אימונופלואורסצנציה סטנדרטית כמתואר בפרוטוקול הטקסט. לאחר השלמת כל הדגירות האימונופלואורסצנטיות.

שופכים את ה- PBS מהכביסה האחרונה. נקו את הצד העליון של המסנן בעזרת מוליך קצה כותנה ושאבו את כל הנוזלים שנותרו מהצד העליון והתחתון. הנח את התוספת הפוכה על הספסל והשתמש באזמל חד כדי לחתוך את המסנן מהתוספת.

ואז החזק את המסנן עם מלקחיים כלפי מטה. הניחו אותו על שקופית מיקרוסקופ. השתמש באמצעי הרכבה תואם פלורסנט כדי להניח החלקת כיסוי מעל המסנן ולתת למסנן להתייבש שטוח בחושך בארבע מעלות צלזיוס.

סיים על ידי בחינה ולכידת תמונות באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי. הציפוי הרציף של מסננים עם פוליליזין, למינין וקולגן מביא לצמחים שמגדלים אקסונים יותר ויותר ארוכים בהשוואה לאלה הגדלים עם פוליליזין בלבד או פוליליזין וקולגן תחת אותו מצע. תנאי ציפוי.

DRG Explan הנשמר על מסננים מראה צמיחה אקסונלית שופעת הרבה יותר מאשר צמחי X הגדלים על פלסטיק. התכשיר האקסונלי המתקבל לאחר גירוד הצד העליון של המסנן נטול גרעיני תאים המדגימים כי גופי התאים אינם נכללים מהצד התחתון של המסנן המוצג. להלן דוגמאות לאקסונים שמקורם בכ-17 אקספלן, שהשתרעו דרך נקבוביות המסנן כדי לצמוח בצד התחתון של מסנן 24 מילימטר.

כתמים חיסוניים של ליזטים שנאספו מצמרות המסננים לעומת התחתונים מדגימים כי היסטון H 3, סמן גרעיני, מוגבל לחלק העליון של המסנן. תכולת החלבון הכוללת נורמלה על פני הדגימות השונות. ניסויי החסך של NGF מודגמים בתמונות אלה בהגדלות שונות של תכשירים אקסונליים מאקספלן שנשמרו ב-NGF או שנמנעו מ-NGF במשך 12 או 36 שעות.

מחקרי הניוון האקסונלי של אריאן מוצגים בתמונות אלה של תכשירים אקסונליים מאקספלנטים שלמים או שלוש עד 7.5 שעות לאחר חתך, כמו במודלים אחרים של ניוון ולריאני. חמישה מילי-מולרי NAD פלוס מגן מפני ניוון המושרה על ידי חתך לאחר שליטה. טכניקה זו חזקה וקלה לשחזור.

זה מאפשר ייצור כמויות גדולות של תכשירים אקסונליים אמינים מאז שתואר לראשונה על ידי טוויסט ועמיתיו בשנת 2001. וריאציות של טכניקה זו שימשו כדי לחקור היבטים רבים של פיזיולוגיה של אקסונים ודנדריטים. עיין בציטוטים בפרוטוקול הטקסט כדי לגלות יישומים אחרים של טכניקה זו.