Name: הפקה ובידוד של אקסונים מסנסורי ביוכימית ניתוח באמצעות מסננים נקבוביים (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-07-08T23:45:00.000+00:00
Duration: 12 min
Description: למדו שיטה לבידוד אקסונים טהורים מתרביות תאי גנגליון שורשי עמוד השדרה עובריים באמצעות מסננים נקבוביים. טכניקה זו מאפשרת ניתוח ביוכימי ואימונוציטוכימי של פיזיולוגיה אקסונלית ותהליכי ניוון עצבי.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

פרויקט זה נתמך על ידי MOP62827 מענקים מהמכונים הקנדיים לחקר הבריאות.

<ol><li>Conde, C., Caceres, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microtubule+assembly%2C+organization+and+dynamics+in+axons+and+dendrites%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Microtubule assembly, organization and dynamics in axons and dendrites.</a> Nat. Rev. Neurosci. 10, 319-332 (2009).</li>
<li>Rasband, M. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+axon+initial+segment+and+the+maintenance+of+neuronal+polarity%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">The axon initial segment and the maintenance of neuronal polarity.</a> Nat. Rev. Neurosci. 11, 552-562 (2010).</li>
<li>Lingor, P., Koch, J. C., Tonges, L., Bahr, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Axonal+degeneration+as+a+therapeutic+target+in+the+CNS%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Tissue+Res%22%5BJournal%5D)">Axonal degeneration as a therapeutic target in the CNS.</a> Cell Tissue Res. 349, 289-311 (2012).</li>
<li>Torre, E. R., Steward, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Demonstration+of+local+protein+synthesis+within+dendrites+using+a+new+cell+culture+system+that+permits+the+isolation+of+living+axons+and+dendrites+from+their+cell+bodies%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Demonstration of local protein synthesis within dendrites using a new cell culture system that permits the isolation of living axons and dendrites from their cell bodies.</a> J. Neurosci. 12, 762-772 (1992).</li>
<li>Zheng, J. Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+functional+role+for+intra-axonal+protein+synthesis+during+axonal+regeneration+from+adult+sensory+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">A functional role for intra-axonal protein synthesis during axonal regeneration from adult sensory neurons.</a> J. Neurosci. 21, 9291-9303 (2001).</li>
<li>Willis, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+transport+and+local+translation+of+cytoskeletal%2C+injury-response%2C+and+neurodegeneration+protein+mRNAs+in+axons%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Differential transport and local translation of cytoskeletal, injury-response, and neurodegeneration protein mRNAs in axons.</a> J. Neurosci. 25, 778-791 (2005).</li>
<li>Poon, M. M., Choi, S. H., Jamieson, C. A., Geschwind, D. H., Martin, K. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+process-localized+mRNAs+from+cultured+rodent+hippocampal+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Identification of process-localized mRNAs from cultured rodent hippocampal neurons.</a> J. Neurosci. 26, 13390-13399 (2006).</li>
<li>Schoenmann, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Axonal+degeneration+is+regulated+by+the+apoptotic+machinery+or+a+NAD%2B-sensitive+pathway+in+insects+and+mammals%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Axonal degeneration is regulated by the apoptotic machinery or a NAD+-sensitive pathway in insects and mammals.</a> J. Neurosci. 30, 6375-6386 (2010).</li>
<li>Unsain, N., Higgins, J. M., Parker, K. N., Johnstone, A. D., Barker, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((XIAP+regulates+caspase+activity+in+degenerating+axons%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Rep%22%5BJournal%5D)">XIAP regulates caspase activity in degenerating axons.</a> Cell Rep. 4, 751-763 (2013).</li>
<li>Ure, D. R., Campenot, R. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Retrograde+transport+and+steady-state+distribution+of+125I-nerve+growth+factor+in+rat+sympathetic+neurons+in+compartmented+cultures%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Retrograde transport and steady-state distribution of 125I-nerve growth factor in rat sympathetic neurons in compartmented cultures.</a> J. Neurosci. 17, 1282-1290 (1997).</li>
<li>Taylor, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Axonal+mRNA+in+uninjured+and+regenerating+cortical+mammalian+axons%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Axonal mRNA in uninjured and regenerating cortical mammalian axons.</a> J. Neurosci. 29, 4697-4707 (2009).</li>
<li>Minis, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Subcellular+transcriptomics-Dissection+of+the+mRNA+composition+in+the+axonal+compartment+of+sensory+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Neurobiol%22%5BJournal%5D)">Subcellular transcriptomics-Dissection of the mRNA composition in the axonal compartment of sensory neurons.</a> Dev. Neurobiol. , (2013).</li>
<li>Niekerk, E. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sumoylation+in+axons+triggers+retrograde+transport+of+the+RNA-binding+protein+La%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.+S.+A%22%5BJournal%5D)">Sumoylation in axons triggers retrograde transport of the RNA-binding protein La.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 104, 12913-12918 (2007).</li>
<li>Huang, E. J., Reichardt, L. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neurotrophins%3A+roles+in+neuronal+development+and+function%5BTitle%5D)+AND+%22Annu.+Rev.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Neurotrophins: roles in neuronal development and function.</a> Annu. Rev. Neurosci. 24, 677-736 (2001).</li>
<li>Vargas, M. E., Barres, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Why+is+Wallerian+degeneration+in+the+CNS+so+slow%5BTitle%5D)+AND+%22Annu.+Rev.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Why is Wallerian degeneration in the CNS so slow.</a> Annu. Rev. Neurosci. 30, 153-179 (2007).</li>
<li>Waller, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Experiments+on+the+Section+of+the+Glossopharyngeal+and+Hypoglossal+Nerves+of+the+Frog%2C+and+Observations+of+the+Alterations+Produced+Thereby+in+the+Structure+of+Their+Primitive+Fibres%5BTitle%5D)+AND+%22Philosophical+Transactions+of+the+Royal+Society+of+London%22%5BJournal%5D)">Experiments on the Section of the Glossopharyngeal and Hypoglossal Nerves of the Frog, and Observations of the Alterations Produced Thereby in the Structure of Their Primitive Fibres.</a> Philosophical Transactions of the Royal Society of London. 140, 423-429 Forthcoming.</li>
<li>Albuquerque, C., Joseph, D. J., Choudhury, P., MacDermott, A. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dissection%2C+Plating%2C+and+Maintenance+of+Dorsal+Root+Ganglion+Neurons+for+Monoculture+and+for+Coculture+with+Dorsal+Horn+Neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harbor+Protocols%22%5BJournal%5D)">Dissection, Plating, and Maintenance of Dorsal Root Ganglion Neurons for Monoculture and for Coculture with Dorsal Horn Neurons.</a> Cold Spring Harbor Protocols. , (2009).</li>
<li>Leach, M. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+culture+of+primary+motor+and+sensory+neurons+in+defined+media+on+electrospun+poly-L-lactide+nanofiber+scaffolds%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">The culture of primary motor and sensory neurons in defined media on electrospun poly-L-lactide nanofiber scaffolds.</a> J Vis Exp. (48), (2011).</li>
<li>Sasaki, Y., Araki, T., Milbrandt, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stimulation+of+nicotinamide+adenine+dinucleotide+biosynthetic+pathways+delays+axonal+degeneration+after+axotomy%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Stimulation of nicotinamide adenine dinucleotide biosynthetic pathways delays axonal degeneration after axotomy.</a> J. Neurosci. 26, 8484-8491 (2006).</li>
</ol>

למחברים אין מה לחשוף.

פרמטרים חשובים לקחת בחשבון בעת ​​התאמת טכניקה זו כוללים את האוכלוסייה העצבית שתילמד, מצע, גודל נקבובית של המסנן ועל פני שטח. כל הפרמטרים הללו ישפיעו על הספציפיות, איכות וכמות של הכנת neurite שהושגה, ויש לשקול בזהירות על ידי משתמש הקצה. בדוגמאות שהוצגו בפרוטוקול זה, השימוש בנוירונים DRG יש את היתרון של הארכת אקסונים בלבד, ובכך נותנת הכנה (ספציפית) טהורה אקסון. צמיחת אקסון של DRGs העוברי לעומת מהר מאוד לנוירונים ממ...

תא אקסון של נוירונים מראה מידה רבה של עצמאות תפקודית מתא somato-הדנדריטים. בנוירונים הקרנה, אקסונים מכילים את רוב 1,2 החלבון העצבי. חקר הפיסיולוגיה והפתופיזיולוגיה של אקסונים צבר תאוצה בקהילת מדעי המוח, כי מחקרים שנעשה לאחרונה הראו כי תפקוד לקוי של אקסון המוקדם נראה כי תכונה משותפת של מחלות ניווניות והפרעות נוירופסיכיאטריות 3. סביר להניח כי הבנה טובה יותר של מנגנוני אקסון בלעדי בתנאים נורמלים ופתולוגית שתשפוך אור על האירועים המוקדמים המניע את חוסר תפקוד. הפרוטוקול הנוכחי מתאר כיצד להשתמש בתרבות מוסיף נושאות קרום נקבובי (מסנן) כדי להשיג כמויות גדולות של חומר אקסון טהור כי הוא מתאים ביוכימי וimmunocytochemical מנתח. השימוש במסנן מוסיף ללמוד הביולוגיה אקסון יושמה לראשונה על ידי דייל ועמיתים 4 ופותחו עוד יותר על ידי Twiss ועמיתים 5 לתצורתו הנוכחית. הטכניקה היא כעת בשימוש שוטף על ידי קבוצות לימוד היבטים שונים של אקסון והביולוגיה דנדריט, עם שינויים קלים בכל מקרה כדי להתאים לאוכלוסייה של נוירונים למדו, הטיפולים שבוצעו ואת הסוג של ניתוחים ביוכימיים המשמשים 6-9. הפרוטוקול הנוכחי אינו מתכוון להכיל את כל החלופות למגוון כה רחב של יישומים, אלא מספק גישה פשוטה, שמתאימה למרבית היישומים. בפרט, הפרוטוקול המתואר כאן משתמש בציפוי משולש למיקסום תשואת אקסון עבור ניתוחים ביוכימיים והוא מתאים ביותר ללמוד אקסון ציפויי ניוון-אחר המתוארים בספרות המיוצר פחות אקסונים שיחזרו ולהידרדר מהר יותר כאשר נשללו מגורמים תזונתיים 9. בהליך זה, גופי תא עצביים נותרו מבודדים על גבי עלי לעשות סינוןאקסונים ile לעבור הדרך הנקבוביות ולגדול לאורך המשטח התחתון שלה. אקסונים טהורים (ללא גליה ומזהמים גוף תא עצביים) הגדלים על המשטח התחתון של המסנן יכולים להיות שנאספו עבור ניתוחים ביוכימיים או יכולים להיות קבוע באתר ונבחנו על ידי טכניקות immunocytochemical 9. ההליך מסתמך על השימוש בתאי עצב תחושתי עובריים מהגרעינים הגבי שורש (DRG). DRGs עוברי נמצא בשימוש נרחב ללמוד ביולוגיה אקסון בגלל neurites מהתאים אלה עוברות צמיחה מהירה וחזקה במבחנה, כאשר נשמר בגורם גדילה עצבי (NGF), וכי הם במהירות לעבור ניוון כאשר נשללו של גורם זה. כמו כן, הנוירונים DRG חסרי דנדריטים, כך שכל neurites שנאסף על ידי בשיטה זו הן אך ורק אקסונים. מוסיף מסנן מייצג יתרון גדול בהשוואה לגישות אחרות המשמשות ללמוד אקסונים. מחקרים להסתמך על השימוש במיקרוסקופ לבדל תהליכים המתרחשים בתא סומה מאלוxons לספק מידע ביוכימי מוגבל. כדוגמא נוספת, מערכות ממודרות תרבות (למשל, תאי Campenot 10 או מכשירי microfluidic 11) שימושיות לגישות הדמיה ולטיפול בהפרש של תאי תאים אלא לספק רק כמויות קטנות של חומר באקסון המונעות את השימוש בטכניקות אלה לניתוחים ביוכימיים אשר דורשים כמויות גדולות היחסי של מדגם. יתר על כן, השימוש בם דורש הכשרה משמעותית, כמו גם התקנים מיוחדים, והם גוזלים זמן. גישה אחרת המשמשת לעתים קרובות לבודד את האקסונים מ explants היא להסיר באופן ידני מרכז explant (המכיל גופי תא עצביים) לפני איסוף דגימת אקסון. למרות שזה יכול לייצר כמויות גדולות של תכשירים מועשר האקסון, ניתן עטפו אקסונים בתכשיר זה בגליה ומהירות הסרת הגופים של 20 explant ברציפות מ -6 בארות (כדוגמא לניסוי מינימאלי) היא זמן רב ועל גבול כדאיות. לעומת זאת, בשיטה המוצגת כאן מייצרת הכנות אקסון שופעים וטהורות, כי אז יכול להיות מנותחת על ידי כמעט כל טכניקה ביוכימיים המשמש בדרך כלל כדי לנתח lysates כל התא, כמו כתם מערבי, immunoprecipitation 6, כתם צפוני 5 ספקטרומטריית מסה 6, טיהור RNA 7,12,13, בין יתר. יתר על כן, הפרוטוקול יכול להיות מיושם על Immunofluorescence טכניקות (IF), כפי שאפשר לתקן אקסונים גדל בצד התחתון של המסנן כדי לבחון אותם עוד יותר על ידי אם. גישה זו מאוד מקלה על הניתוח של תהליכי אקסון ספציפי מכיוון שאין גופי תא בהכנה הסופית. זהו יתרון משמעותי שכן אות גבוהה immunofluorescent מגופי תא לעתים קרובות פוגעת בבחינה וניתוח של אותות חלשים שמקורם במבנים דקים כגון אקסונים. שני יישומים של שיטת התרבות ללמוד ar ניוון אקסוןדואר תאר; מודל של גיזום התפתחותיים ומודל של ניוון הנגרם פגיעה (המכונות ניוון Wallerian כ). המודלים של גיזום התפתחותי מבוסס על העובדה שתאי עצב תחושתי in vivo להתחרות על הגבלת סכומי NGF-derived יעד ואלו שלא הצליחו לקבל מספיק מנוון תמיכת נוירוטרופי 14. תופעה זו יכולה להיות חיקה בתרבויות DRG העובריים על ידי נסיגת NGF מהתקשורת והתרבות, אשר, כפי שקורה בvivo, יוזם ניוון אקסון אחריו הרס גוף תא. למודל ניוון Wallerian, הצד העליון של המסנן עם גופי התא שרוט משם. אקסונים שצמחו על הצד התחתון של המסנן להיות מופרד פיזי מהגופים התא ולאחר מכן לעבור את התהליך המהיר וסטריאוטיפי ניווניות המכונה ניוון Wallerian 15, על שמו של א &#39;וולר שדיווח על התופעה ראשונה בשנת 1850 16.

<table><tbody><tr><td>עכבר CD-1, הריון מתוזמן E13</td><td>צ'ארלס ריבר</td><td></td><td>בבית הריונות מתוזמנים יכולים להיעשות על ידי הזדווגות עכברים ובדיקת פקקים בנרתיק (יום E0)</td></tr> <tr><td>תרבית תאי פלקון מוסיפה</td><td>קורנינג</td><td>353102</td><td>1 ומיקרו; גודל נקבוביות m, מתאים לצלחות</td></tr><tr><td>נלוות לתרבית תאי פלקון</td> 6 בארות <td>קורנינג</td><td>353502</td><td>צלחות קבלה לתוספות</td></tr><tr><td>פולי-D-ליזין</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>P6407</td><td>בשימוש ב-1 מ"ג/מ"ל במים. ניתן לעשות שימוש חוזר פעם אחת.</td></tr><tr><td>למינין</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>L2020</td><td>בשימוש בגיל 10 ומיקרו; גרם/מ"ל במים. קח מלאי פי 100 מ-80 ו-deg; C ולהפשיר O/N ב-4 מעלות; C&nbsp;</td></tr><tr><td>תמיסת קולגן בקר PureCol</td><td>Advanced Biomatrix</td><td>5005-B</td><td></td></tr><tr><td>L-15 Medium</td><td>Invitrogen</td><td>11415-064</td> של לייבוביץ <td>ניתן להחלפה ב-DMEM</td></tr><tr><td>Neurobasal medium</td><td>Invitrogen</td><td>21103-049</td><td></td></tr><tr><td>B-27 תוסף ללא סרום</td><td>Invitrogen</td><td>17504-044</td><td></td></tr><tr><td>5-Fluoro-2&prime;-deoxyuridine (FDU)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F0503</td><td></td></tr><tr><td>NGF (2.5S, תת-יחידת בטא)</td><td>Cedarlane</td><td>CLMCNET-001</td><td></td></tr><tr><td>נוגדן נגד NGF</td><td>מוכן בבית</td><td></td><td>כמתואר ב: Acheson, A. et al. זיהוי פעילות נוירוטרופית דמוית גורם מוחי בפיברובלסטים ובתאי שוואן: עיכוב על ידי נוגדנים ל-NGF. נוירון. <חזק>7</חזק>, 265-75, (1991).</td></tr><tr><td>Alomone Labs</td><td>AN-240</td><td>אופציה</td><td></td>מסחרית</tr><tr><td>נוגדן נגד טובולין</td><td>Millipore</td><td>MAB5564</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488 נוגדן נגד עכבר עזים</td><td>Invitrogen</td><td>A-11029</td><td></td></tr><tr><td colspan="4"><חזק>מדיום תרבית DRG </חזק><</td></tr><tr>td colspan="4">תוסף נוירו-בזאלי בינוני 2% B27 תוסף נוירובזאלי 2 מ"מ l-גלוטמין 1% פניצילין-סטרפטומיזין 10 ומיקרו; M FDU 15 ננוגרם/מ"ל NGF (תא תחתון בלבד)</td></tr><tr><td colspan="4"><חזק>1x מאגר דגימת Laemmli</חזק></td></tr><tr><td colspan="4">2% SDS 50 מ"מ DTT 60 מ"מ טריס (pH 6.8) 5% גליצרול 0.01% (w/v) ברומופנול כחול</td></tr></tbody></table>

הפקה ובידוד של אקסונים מסנסורי ביוכימית ניתוח באמצעות מסננים נקבוביים

Production and Isolation of Axons from Sensory Neurons for Biochemical Analysis Using Porous Filters

אקסונים עצביים משתמשים במנגנונים ספציפיים כדי לתווך התפשטות, לשמור על שלמות ולגרום לניוון. נדרש איזון מתאים של אירועים אלה כדי לעצב מעגלים עצביים פונקציונליים. הפרוטוקול המתואר כאן מסביר כיצד להשתמש בתוספות תרבית תאים הנושאות קרום נקבובי (מסנן) כדי להשיג כמויות גדולות של תכשירים אקסונליים טהורים המתאימים לבדיקה בטכניקות ביוכימיות או אימונוציטוכימיות קונבנציונליות. הפונקציונליות של תוספות מסנן אלה תודגם עם מודלים של גיזום התפתחותי וניוון וולריאני, תוך שימוש בצמחים של גנגליון שורש גב עוברי. שלמות ותפקוד אקסונלי נפגעים במגוון רחב של פתולוגיות ניווניות. ואכן, כעת ברור כי תפקוד לקוי של אקסונל מופיע הרבה יותר מוקדם במהלך המחלה מאשר אובדן סומה עצבית במספר מחלות נוירודגנרטיביות, מה שמצביע על כך שתהליכים ספציפיים לאקסונל מכוונים בעיקר בהפרעות אלה. על ידי השגת דגימות אקסונליות טהורות לניתוח בטכניקות מולקולריות וביוכימיות, לטכניקה זו יש פוטנציאל לשפוך אור חדש על מנגנונים המווסתים את הפיזיולוגיה והפתופיזיולוגיה של אקסונים. זה בתורו ישפיע על הבנתנו את התהליכים המניעים מחלות ניווניות של מערכת העצבים.

explants גנגליון שורש הגבי מעכברי E13.5 לגדול בהרחבה על מסננים ברצף מצופה פולי-D-ליזין, laminin וקולגן (איור 1 ב, משמאל), והגיע עד 2 מ"מ בתוך 2 ימים בתרבות. שילוב מצע זה מניב צמיחה במיוחד שופעת; שילובים אחרים יניבו אקסונים שהם הרבה יותר קצרים (איור 1 ב, מימין). יתר על כן, DRGs שמר על מסננים להאריך יותר וארוכים יותר מאשר האקסונים DRGs גדל על 1C איור פלסטיק. מסננים...

מאמר זה מתאר מערכת תרבית עצבית שניתן להשתמש בה כדי להשיג כמויות גדולות של דגימות אקסונליות טהורות לאנליזות ביוכימיות ואימונוציטוכימיות. טכניקה זו תאפשר הבנה משופרת של פיזיולוגיה אקסונלית נורמלית ומסלולי איתות המובילים לניוון עצבי.

Neuronal axons use specific mechanisms to mediate extension, maintain integrity, and induce degeneration. An appropriate balance of these events is ...

מטרת הליך זה היא להשיג תכשירים אקסונליים טהורים המתאימים לבדיקה בטכניקות כימיות קונבנציונליות, ביוכימיות או אימונו-ציטו. זה מושג על ידי תרבית ראשונה של תאי גנגליון שורש גב עובריים על תוספות תרבית הנושאות מסנן ממברנה נקבובי כאשר נוירוני ה-DRG מרחיבים את האקסונים. חלק מהאקסונים גדלים דרך נקבוביות במסנן ונמשכים על פני השטח התחתונים שלו בעוד גופי התאים נשארים מבודדים על המשטח העליון לאחר המניפולציות הניסיוניות הרצויות, ההכנה האקסונלית מתקבלת על ידי הסרה פיזית של התאים בצד העליון של המסננים תוך שמירה על האקסונים שגדלו בצד התחתון.בסופו של דבר, ניתן לשקר את האקסונים המבודדים לניתוחים ביוכימיים או לתקן אותם לבדיקה אימונוכימית על ידי הפקת דגימות אקסונליות טהורות המתאימות לניתוח בטכניקות ביוכימיות קונבנציונליות. הליך זה הוכיח את עצמו כשימושי מאוד לחקירת הפיזיולוגיה והפתופיזיולוגיה של אקסונים. כפי שתראה, הטכניקה פשוטה יחסית ליישום וניתנת להתאמה לסביבות ניסוי מסוימות.אנו הולכים להדגים את השימוש בו בחקר מנגנוני ניוון אקסונלי יום לפני הציפוי. התחל בציפוי המסננים מתחת למכסה מנוע סטרילי לתרבית רקמות. מקום ראשון, מסנן 24 מילימטר מוסיף בצלחת קליטה של שש בארות.לאחר מכן הוסיפו שני מיליליטר של מיליגרם אחד למיליליטר, פולי דה ליצין במים לתא התחתון ומיליליטר אחד למעלה, ודגרו את התוספות למשך שעה בטמפרטורת החדר. הבא שלה שואב את הפולי דה ליצין ומקפיד להסיר את שאריות הנוזל שנלכד ישירות מתחת למסנן. לאחר מכן יש לשטוף פעם אחת במים לאחר שאיבת המים, לסגור את המכסה ולהשאיר את הצלחות לייבוש במכסה המנוע למשך הלילה.למחרת בבוקר מערבבים ומחממים תמיסת למינציה ומים בחום של 37 מעלות צלזיוס. דגרו את התוספות בתמיסת הלמינין למשך שעה בחממת תאים בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס באמצעות נפחים סטנדרטיים. לאחר השאיפה.הלמינין מוסיף 0.1 מיליגרם למיליליטר, קולגן במים ודוגר במשך שעה בטמפרטורת החדר, ואז שואב את הקולגן ושוטף פעם אחת במים סטריליים. המסננים מוכנים כעת לקליטת מדיית תרבית והסבר DRG לאחר מכן, לאחר ניתוח ועריפת ראש של עובר עכבר E 13 כמתואר בפרוטוקול הטקסט. הניחו את העובר על צדו בצלחת פטרי מלאה במדיה L 15 תוך התבוננות במיקרוסקופ מנתח, בצעו חתך לאורך הצדדים הצדדיים כדי להשליך את החזה, גפי הבטן והזנב.הנח את הגב המכיל את צד הגחון של עמוד השדרה כלפי מעלה והסר את כל איברי הקרביים בעזרת מספריים קפיציים קטנים. חשוף את כל חוט השדרה על ידי חיתוך עמוד השדרה מהצד הגחוני שלו לאורך קו האמצע. החזיקו את הפגר עם זוג אחד של מלקחיים מספר שלוש והשתמשו בזוג שני כדי להחזיק את חוט השדרה בהיבט הרוסטרלי ביותר שלו.כעת, משוך לאט ובעדינות את החוט הרחק מחלל החוליות. כאשר ה-DRGs נחשפים, השתמש במלקחיים דקים במיוחד מספר חמש כדי לצבוט אותם מחוט השדרה. מניחים את ה-DRG המנותקים בתחתית הכלי בעזרת קצה פיפטה של 200 מיקרוליטר שנחתך להגדלה.הפתיחה שלו. שאפו את ה-DRG שנאספו והניחו אותם בצינור על קרח. השלם את מדיית התא התחתון ב-15 ננוגרם למיליליטר של NGF תוך שמירה על התא העליון ללא NGF.לאחר מכן, הוסף מדיית DRG מלאה ב-37 מעלות צלזיוס לתוספות המצופות באמצעות נפחים סטנדרטיים. לאחר מכן השתמשו בפיפטה של 1000 מיקרוליטר עם עיטור קצה כדי להגדיל את הפתח שלה. הגדר את הפיפטה על 800 מיקרוליטר.לאחר מכן העבירו כ-200 מיקרוליטר של מדיה מהצד העליון של המסנן ל-DRG המכיל פיפטת צינור בנפח קטן למעלה ולמטה על מנת להחיות את ה-D RRG ששקעו לתחתית. לאחר השעיה מחדש שאפו את כל הנפח, כעת העבירו את ה-DRG למסנן על ידי טבילת קצה הפיפטה באמצע התוסף והוצאת ה-DRG. שמור על התרביות בחממת תאים ב-37 מעלות צלזיוס.החלפת המדיה כל יומיים-שלושה כדי להחליף את המדיה. שאפו תחילה את התא העליון, ואחריו את התא התחתון. הוסף מדיה חדשה בנפחים סטנדרטיים החל מהתא התחתון כדי לחקור את ההשפעה של נסיגת הגורם הטרופי על האקסונים.המתן יומיים כדי לאפשר הארכה אקסונלית. לאחר מכן, הסר את המדיה מהתאים העליונים והתחתונים. לאחר מכן כדי לבודד את כל מה שנותר או המיוצר באופן אנדוגני ו-GF להוסיף מדיה חסרת NGF ומכילה נוגדנים נגד NGF.החזר את הלוחות לחממת התאים ב-37 מעלות צלזיוס כדי לאפשר לניוון המושרה על ידי נסיגת NGF להמשיך למשך הזמן הרצוי ללימוד בזמן הניוון הארי. השתמש במסננים המכילים DRG explan השמור ב-NGF במשך יומיים. השתמש במגרד תאים כדי לגרד DRG מהצד העליון של המסנן.הקפידו על הסרה מוחלטת של גופי התאים העצביים על ידי הזזת המגרד קדימה ואחורה בכיווני x ו-y ובמעגלים. אשר את הצלחת הגירוד על ידי בדיקה שלא נשארים צמחי X מחוברים למסנן. לאחר מכן, השליכו את המדיה המכילה את הצמחים הצפים מהתא העליון והוסיפו מיליליטר אחד של מדיית DRG שלמה חמה מראש המכילה 10 ננוגרם למיליליטר ו-gf.לאחר מכן החזר את הצלחת לחממת התאים ב-37 מעלות צלזיוס כדי לאפשר לניוון וולרי להמשיך למשך הזמן הרצוי כדי לחלץ חלבון מהדגימות האקסונליות. התחל במילוי צינורות איסוף של 1.5 מיליליטר ב-75 מיקרוליטר של מאגר דגימת עלי כבש והנח את הצינורות על קרח. שטפו את המסנן המכיל את ה-DRG ב-PBS וגרדו את הצד העליון של המסנן כמו קודם.לאחר הוצאת התוספת מהצלחת, השתמש באפליקטור קצה כותנה כדי לנקות את הצד העליון של המסנן. לאחר מכן שאפו כל PBS נוסף מהצד העליון והתחתון. לאחר מכן, הניחו את התוספת הפוכה על ספסל והשתמשו באזמל חד כדי לחתוך את המסנן מהתוספת.ואז החזק את המסנן בעזרת מלקחיים. מלמטה למעלה. השתמש במספריים כדי לבצע חתך מההיקף למרכז המסנן.כעת הניחו את המסנן על גבי צינור האיסוף ובעזרת מלקחיים לחצו על מרכז המסנן במורד הצינור. תוך כדי כך, ייווצר משפך שידחוף את המסנן בצורת משפך לתחתית הצינור כך שהוא יהיה שקוע במאגר הדגימה של הלאלי. כעת השלם את מיצוי החלבון על ידי כיסוי הצינורות והנחתם במים רותחים למשך ארבע דקות.הסר את המסנן באמצעות מלקחיים והנח אותו הפוך בחלק העליון של הצינור וצנטריפוגה אותו לזמן קצר. בסיום, השליכו את המסננים המיובשים לאימונופלואורסצנטיות. שוטפים את התוספות ב- PBS בשש צלחות באר.לאחר מכן מקבעים את התוספות באלדהיד טרי של 4% פרפורמים ב- PBS למשך 10 דקות בטמפרטורת החדר על שייקר לאחר קיבוע, מגרדים ומנקים את הצד העליון של התוספות כדי להבטיח שרק אקסונים שגדלו אך ורק על המשטח התחתון של המסנן יוכתמו. לאחר מכן בצע אימונופלואורסצנציה סטנדרטית כמתואר בפרוטוקול הטקסט. לאחר השלמת כל הדגירות האימונופלואורסצנטיות.שופכים את ה- PBS מהכביסה האחרונה. נקו את הצד העליון של המסנן בעזרת מוליך קצה כותנה ושאבו את כל הנוזלים שנותרו מהצד העליון והתחתון. הנח את התוספת הפוכה על הספסל והשתמש באזמל חד כדי לחתוך את המסנן מהתוספת.ואז החזק את המסנן עם מלקחיים כלפי מטה. הניחו אותו על שקופית מיקרוסקופ. השתמש באמצעי הרכבה תואם פלורסנט כדי להניח החלקת כיסוי מעל המסנן ולתת למסנן להתייבש שטוח בחושך בארבע מעלות צלזיוס.סיים על ידי בחינה ולכידת תמונות באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי. הציפוי הרציף של מסננים עם פוליליזין, למינין וקולגן מביא לצמחים שמגדלים אקסונים יותר ויותר ארוכים בהשוואה לאלה הגדלים עם פוליליזין בלבד או פוליליזין וקולגן תחת אותו מצע. תנאי ציפוי.DRG Explan הנשמר על מסננים מראה צמיחה אקסונלית שופעת הרבה יותר מאשר צמחי X הגדלים על פלסטיק. התכשיר האקסונלי המתקבל לאחר גירוד הצד העליון של המסנן נטול גרעיני תאים המדגימים כי גופי התאים אינם נכללים מהצד התחתון של המסנן המוצג. להלן דוגמאות לאקסונים שמקורם בכ-17 אקספלן, שהשתרעו דרך נקבוביות המסנן כדי לצמוח בצד התחתון של מסנן 24 מילימטר.כתמים חיסוניים של ליזטים שנאספו מצמרות המסננים לעומת התחתונים מדגימים כי היסטון H 3, סמן גרעיני, מוגבל לחלק העליון של המסנן. תכולת החלבון הכוללת נורמלה על פני הדגימות השונות. ניסויי החסך של NGF מודגמים בתמונות אלה בהגדלות שונות של תכשירים אקסונליים מאקספלן שנשמרו ב-NGF או שנמנעו מ-NGF במשך 12 או 36 שעות.מחקרי הניוון האקסונלי של אריאן מוצגים בתמונות אלה של תכשירים אקסונליים מאקספלנטים שלמים או שלוש עד 7.5 שעות לאחר חתך, כמו במודלים אחרים של ניוון ולריאני. חמישה מילי-מולרי NAD פלוס מגן מפני ניוון המושרה על ידי חתך לאחר שליטה. טכניקה זו חזקה וקלה לשחזור.זה מאפשר ייצור כמויות גדולות של תכשירים אקסונליים אמינים מאז שתואר לראשונה על ידי טוויסט ועמיתיו בשנת 2001. וריאציות של טכניקה זו שימשו כדי לחקור היבטים רבים של פיזיולוגיה של אקסונים ודנדריטים. עיין בציטוטים בפרוטוקול הטקסט כדי לגלות יישומים אחרים של טכניקה זו.

production-isolation-axons-from-sensory-neurons-for-biochemical

Research

JoVE Journal

Neuroscience

מדעי המוח

אנו להדגים פרוטוקול לבידוד axoplasm מתוך עצב השת עכברוש מבוגר מבוסס על דיסקציה של fascicles עצב הדגירה במדיום hypotonic לשחרר המיאלין ואת lyse הלא axonal מבנים, ואחריו מיצוי של החומר האקסון מועשר הנותרים.

Axoplasm ניתוק מן החולדה עצב השת

שיטה להכין פעיל translationally, synaptoneurosomes שלם (SNS) של קליפת המוח עכבר מתואר. השיטה משתמשת שיפוע רציפה Percoll-סוכרוז צפיפות המאפשרת הכנה מהירה של פעיל SNS.

הכנת Synaptoneurosomes מ - עכבר Cortex באמצעות צבע רציפה Percoll-סוכרוז צפיפות

סרטון זה מתאר את הבידוד והטיפוח של תאי Schwann משורשי עמוד השדרה של עכבר. תאים מבודדים עוברים תרבית במדיה ספציפית. תאי Schwann מבודדים באמצעות עיכול דיפרנציאלי והיצמדות. לאחר מכן הם מועברים לכיסויים חוץ-תאיים מצופים מטריצה לצורך התקשרות והתפשטות.

בידוד תאי Schwann משורשי עמוד השדרה של העכבר

אנו מתארים את הנתיחה של מערכת העצבים של ים הארנבת...

בידוד של נוירונים חושיים של<em&gt; Aplysia californica</em&gt; להקלטות מהדק תיקון של זרמי glutamatergic

נוירונים חושיים מאותתים מידע חושי מהפריפריה למערכת העצבים המרכזית. זיהוי נוירונים אפרנטיים ספציפיים יעזור בהבנת הפיזיולוגיה שלהם. אנו מתארים שיטה של תיוג לאחור לזיהוי נוירונים אפרנטיים, וחוקרים את תעלות היונים עם שער המתח בתאי עצב אלה באמצעות אלקטרופיזיולוגיה ואימונוציטוכימיה של מהדק טלאי.

זיהוי אוכלוסיות נוירונים חושיים ספציפיים לחקר תעלות יונים מבוטאות

כאן, אנו מציגים פרוטוקול לשחול הידראולי של חוט השדרה וכן זיהוי ובידוד של גרעיני שורש גב ספציפיים (DRGs) באותו מכרסם. בהשוואה לשיטות בידוד חוט השדרה הסטנדרטיות, שיטה זו מהירה משמעותית ומפחיתה את הסיכון לנזק לרקמות.

שחול הידראולי של קורד ובידוד השדרה של גרעיני שורש הגבה במכרסמים

כאן, אנו מציגים שיטה כדי לטהר את התאים הסרטניים ואת תאי Schwann מפני חושים ועצבים מוטוריים בתוך מבחנה.

טיהור של פיברותקיעות ותאי Schwann מפני חושים ומוטוריים עצבים בחוץ גופית

הפרוטוקול הנוכחי מתאר זריעה והכתמה של מיטוכונדריה עצבית בתאים מיקרופלואידיים. שיפוע הלחץ הנוזלי בתאים אלה מאפשר טיפול סלקטיבי במיטוכונדריה באקסונים כדי לנתח את תכונותיהם בתגובה לאתגרים פרמקולוגיים מבלי להשפיע על תא גוף התא.

דה-פולריזציה סלקטיבית בסיוע מיקרופלואידיקה של מיטוכונדריה אקסונאלית

פרוטוקול זה מתאר מערכת מיקרופלואידית המדגמנת דינמיקה מטבולית עצבית לאחר פגיעה אקסונלית, המאפשרת הדמיה, ניתוח מולטי-אומיקס ומחקרים מכניסטיים של שיפוץ מטבולי מהותי.

שבב מיקרופלואידי עבור מודלים של פגיעות אקסונליות בנייה ומאפשר ניתוח מולטי-אומיקס

פרוטאזום הממברנה העצבית (NMP) זוהה לאחרונה בתת-קבוצה של נוירונים סומטוסנסוריים כמווסת מרכזי של תפיסת מגע, כאב וגירוד. מאמר זה מציג זרימת עבודה חזקה לניתוח ביטוי ותפקוד NMP ספציפי לסוג התא באמצעות מיון תאים, פרופיל טרנסקריפטום וניתוחים אימונו-פלואורסצנטיים מבוססי תרבית.

ניתוח ספציפי לתת-סוג תא של פרוטאזום ממברנה עצבית בנוירונים סומטוסנסוריים

מחקר זה מציג שיטה איתנה לבידוד mRNA אקסונים באמצעות הכנסות ממברנה נקבוביות, המאפשרת הפרדה מלאה בין נוירונים לנויריטים וטיהור RNA. בשילוב עם RTddPCR, הגישה מאפשרת כימות מוחלט של תמלילים בעותק נמוך, ומקלה על מחקרים של העברת mRNA ותרגום מקומי עם רגישות גבוהה, שחזוריות ויישום ניסויי רחב.

בידוד וכימות של mRNA אקסונליים באמצעות תוספות ממברנה נקבוביות ו-RTddPCR

למדו שיטה לבידוד אקסונים טהורים מתרביות תאי גנגליון שורשי עמוד השדרה עובריים באמצעות מסננים נקבוביים. טכניקה זו מאפשרת ניתוח ביוכימי ואימונוציטוכימי של פיזיולוגיה אקסונלית ותהליכי ניוון עצבי.

הפקה ובידוד של אקסונים מסנסורי ביוכימית ניתוח באמצעות מסננים נקבוביים

גלה סרטונים נוספים