Biochip אלקטרוכימי מבוסס Microfluidic לניתוח הכלאה DNA ללא תווית

המטרה הכוללת של הניסוי הבא היא לבחון את ההשפעה של אירועי הכלאת DNA על ספקטרום העכבה באמצעות מכשיר אלקטרוכימי מיקרופלואידי. לשם כך, מיוצר שבב אלקטרוכימי כדי לאפשר מערך של חיישני אלקטרודות ושבב PDMS מיקרופלואידי. כדי להקל על הכנסת דגימות נפח מיקרו, שני השבבים מחוברים זה לזה ומתפקדים עם בדיקות DNA חד-גדיליות.

לאחר מכן מתווסף DNA חד-גדילי מטרה עם הכלאת DNA, כוח הדחייה החזק יותר בין ה-DNA הדו-גדילי הטעון שלילית לבין מולקולות הציאניד פריס ציאניד הטעונות שלילית מביא להתנגדות גבוהה יותר להעברת מטען. בסופו של דבר, ניתן לזהות אירועי הכלאה של DNA על ידי מדידת השינויים בספקטרום העכבה האלקטרוכימית. היתרון העיקרי של טכניקה זו על פני שיטות קיימות, כמו שימוש בקורא צלחות או בדיקת משמרת J, הוא שהמכשירים יכולים לבצע את אותה טכניקה עם נפח דגימה נמוך ובשבריר מהעלות מבלי לוותר על רגישות או ספציפיות.

שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלות מפתח בחקר הסרטן, זיהוי שפעת והנדסה גנטית על ידי מתן אפשרות לסריקת רצף DNA ספציפית מהירה וחקירת הקינטיקה הבינארית של רצפי DNA חד-גדיליים. מכיוון ששיטת ניתוח הכלאת DNA מהירה זו יכולה לבצע בנפח דגימה נמוך וללא שלבי הכנת דגימה מסובכים, ההשלכות של טכניקה זו משתרעות על האבחנה שלנו של הפרעות גנטיות, צורות שונות של סרטן או מחלות עם סמני DNA ספציפיים כגון שפעת. בדרך כלל אנשים חדשים בשיטה יתקשו מכיוון שפיתוח התקני מיקרו דורש פרמטרים של עיבוד בקרה וגישה איטרטיבית לפתרון בעיות כגון דליפת תמיסה.

לאחר הרכבת המכשיר כדי לעצב אלקטרודות זהב על השבב האלקטרוכימי, החזק פרוסת סיליקון ריקה בדרגה ראשונית בגודל ארבעה אינץ' עם פינצטה והשתמש בבקבוק כביסה כדי לשטוף את פני השטח של שני צידי הוופל עם אצטון, מתנול ולאחר מכן איזופרופנול. תהליך זה מכונה להלן ניקוי A MI תחת זרם של מים נטולי יונים. שטפו את האיזופרופנול מהרקיק, ולאחר מכן השתמשו באקדח חנקן כדי לייבש את הוופל.

טען את הוופל לתצהיר אדים כימי משופר בפלזמה או לציוד P-E-C-V-D. הזן את הפרמטרים כדי להניב שכבת סיליקון דו חמצני בעובי מיקרומטר אחד והתחל את התהליך האוטומטי לאחר מכן, באמצעות כלי התזה DC הניח שכבה של כרום בעובי 200 אנגסטרום על הוופל, ולאחר מכן הפקיד שכבה של זהב בעובי 2000 סטרומים. טען את הוופל על ספינר, אבק את המשטח באקדח חנקן ובעזרת פיפטה פסטר החל ספין PR ספין התנגדות לצילום חיובי אחד ליצירת סרט אחיד בעובי של כ -1.6 מיקרומטר.

לאחר מכן אופים מראש את הוופל למשך דקה בחום של 100 מעלות צלזיוס על צלחת חמה. טען את הוופל עם התנגדות הצילום לתוך ציוד יישור המסכה. לאחר מכן התחל חשיפה של 190 מילי-ג'אול לסנטימטר רבוע ב-405 ננומטר שבה מיישר המסכה יפתח את התריס ויחשוף את עמידות הצילום לאור דרך מסכה עם התכונות המעוצבות.

לאחר החשיפה יש לטבול את הוופל בכלי זכוכית המכיל מפתח 3 5 2 ולדגור למשך 30 שניות בניעור עדין. לאחר מכן שוטפים את הוופל תחת זרם מים ומייבשים עם אקדח החנקן כמו קודם. לאחר מכן, טבלו את הוופל בכלי זכוכית המכיל תמיסת תחריט זהב ודגרו למשך 1.5 דקות בניעור עדין.

לאחר מכן מעבירים את הוופל לכלי זכוכית המכיל כרום שהוזכר ודוגרים בניעור עדין עד שסימני הכרום על הוופל נעלמים. זה אמור להימשך כ-30 שניות. שוטפים את הוופל במים ומייבשים עם אקדח החנקן המחזיק את הוופל בפינצטה.

הסר את התנגדות הצילום באמצעות הליך ניקוי MI. לאחר מכן יש לשטוף במי DI ולייבש עם אקדח החנקן כשהוא לובש שתי שכבות של כפפות. טבלו את הוופל בכלי טפלון עם תמיסה נקייה של פיראנה למשך דקה.

לאחר מכן שוטפים את הוופל במים ומייבשים בעזרת אקדח חנקן. לאחר דפוס אלקטרודות הפלטינה, טען את הוופל על סביבון. אבק את המשטח באמצעות אקדח חנקן ובאמצעות פיפטה פסטר מחלק PR שני התנגדות פוטו חיובית על פני השטח מסתובב ליצירת סרט אחיד בעובי של כ -1.4 מיקרומטר.

מניחים את הוופל על צלחת חמה בחום של 100 מעלות צלזיוס ואופים מראש דקה אחת. לאחר האפייה המוקדמת, חשפו את הוופל ב-30 מילי-ג'אול לסנטימטר רבוע 405 ננומטר דרך מסכת צילום. לאחר מכן מניחים את הוופל על צלחת חמה בחום של 125 מעלות צלזיוס ואופים במשך 45 שניות.

הסר את המסכה מהמסכה, מיישר היישור והצפה. חשוף את הפרוסה עם 1000 מילי-ג'אול לסנטימטר בריבוע באורך גל של 405 ננומטר ללא מסיכת צילום. לאחר החשיפה, פתח את הוופל על ידי טבילתו בכלי זכוכית המכיל שישה לאחד תמיסת מפתח Z 400 K.

מדגרים במשך שתי דקות בניעור עדין. לאחר מכן שוטפים את הוופל במים ומייבשים בעזרת אקדח חנקן. באמצעות מערכת אידוי קרן E, הניחו שכבה של טיטניום בעובי 400 אנגסטרום ואחריה שכבה בעובי 1600 אנגסטרום של פלטינה על הוופל.

מניחים את הוופל בכלי זכוכית מלא באצטון ומניחים את המנה באמבט אולטראסוני למשך חמש דקות כדי להרים את התמונה. התנגד ואז החזק את הוופל בפינצטה. השתמש בבקבוק כביסה כדי לשטוף את שני משטחי הוופל באצטון ולאחר מכן באיזופרופנול.

שוטפים את הוופל במים ומייבשים עם אקדח החנקן. כדי להכין את התבנית לתעלות הבדיקה, שטפו פרוסת סיליקון ריקה באיכות של ארבעה אינץ' בדרגת בדיקה בהליך ניקוי MI. כמו קודם, יש לשטוף את האיזופרופנול מהרקיק במים, ולאחר מכן לייבש בעזרת אקדח חנקן.

טען את הוופל על ספינר, אבק את פני הפרוסה באקדח חנקן ובעזרת פסטי פיפטה מחלק PR שלושה נגטיבים לפוטו התנגדות על פני השטח ליצירת סרט אחיד בעובי של כ -100 מיקרומטר. הניחו את הוופל על צלחת חמה כדי לאפות אותו מראש באמצעות הליך אפייה דו-שלבי. ראשית, העלו את הטמפרטורה מטמפרטורת החדר ל-65 מעלות צלזיוס ב-300 מעלות צלזיוס לשעה.

לאחר מכן החזיקו בטמפרטורה של 65 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות. רמפה עד 95 מעלות צלזיוס ב-300 מעלות צלזיוס לשעה ולאחר מכן החזק למשך 30 דקות. חשוף את הפרוסה עם 2,500 מילי-ג'אול לסנטימטר בריבוע באורך גל של 405 ננומטר דרך מסיכת צילום.

לאחר מכן מניחים את הוופל על צלחת חמה ולאחר אופים את הוופל על ידי העלאה מטמפרטורת החדר ל-95 מעלות צלזיוס ב-300 מעלות צלזיוס לשעה. יש להחזיק בטמפרטורה של 95 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות. טבלו את הוופל בכלי זכוכית המכיל פרופילן גליקול, מונומתיל אתר אצטט או מפתח P-G-M-E-A והניחו לו להתפתח במשך 10 דקות.

שוטפים את הוופל באיזופרופנול ומייבשים בעזרת אקדח חנקן כדי לייצר תעלות בדיקה כדי למצוא מארז סביב פרוסת התבנית עם נייר אלומיניום ויוצקים לאט את הפולי דימתיל סובוקסן או PDMS הלא נרפא על התבנית. אופים את התבנית עם ה-PDMS בתנור קופסה בהליך אפייה דו-שלבי בו הטמפרטורה עולה מטמפרטורת החדר ל-80 מעלות צלזיוס במשך חמש דקות ונשארת על 80 מעלות צלזיוס למשך 17 דקות. לאחר שהתבנית התקררה מקלפים את ה-PDMS מהתבנית ומניחים על נייר אלומיניום.

חותכים את שבבי הבדיקה בעזרת סכין כירורגית ומגדירים חורים בעזרת כלי ניקוב ביופסיה כפי שמוצג כאן. יישר ידנית את ערוצי בדיקת ה-PDMS עם האלקטרודות העובדות על השבב האלקטרוכימי. PDMS נדבק היטב לשבב האלקטרוכימי, אוטם את התעלות ומונע דליפה.

חבר צינורות גמישים למרפק פלסטיק או למחבר ישר באמצעות צינור גמיש קצר כמתאם לתפקוד ערוצי המיקרו האנכיים. חבר מזרק המכיל את בדיקת ה-DNA החד-גדילית לצינור והנח אותו במשאבת מזרק. חבר את המחברים לכל אחד מהכניסות המנוקבות במכשיר.

ההיבט הקשה ביותר בהליך זה הוא הזרמת התמיסה במיקרו-ערוצים מבלי ליצור בועות. כדי להבטיח הצלחה, זרום את התמיסה לאט מאוד כדי להשיג מילוי הומוגני של התעלה, הפעל את המשאבה בקצב זרימה של 200 מיקרוליטר לשעה כדי למלא לאט כל אחד משלושת המיקרו-ערוצים הנפרדים בתמיסת דגירה שונה של בדיקת DNA חד-גדילית. לאחר דגירה של שעה, החלף את צינור המזרק והמחבר כדי לשטוף את המיקרו-תעלות עם PBS לאחר מכן החלף את צינורות המזרק והמחברים כדי למלא את המיקרו-ערוץ בתמיסה המורכבת ממילימולרית אחת, שש מר, CAPTO, H אתנול MCH ב-10 מילי-מולארי PBS, 100 מילי-מולרי נתרן כלורי, ו-1.395 מילי-מולרי TCEP מודגר למשך שעה.

לאחר מכן יש לשטוף עם PBS כמו לפני השימוש בפינצטה. הרם את ה-PDMS מסובב 90 מעלות לכיוון אופקי ומונח למטה. זה יחשוף שורות נפרדות של תאי תגובה כאשר כל שורה מכילה מונה ואלקטרודת ייחוס ייחודית לניתוח הכלאת ה-DNA.

החלפה, צינורות המזרק והמחברים למילוי תעלות המיקרו בתמיסת מדידת בקרה של מאגר נתרן ציטראט SSC מרוכז במט"ח למשך 20 דקות לאחר הדגירה החלף את המזרק כדי למלא את תעלות המיקרו בחמישה מילי-מולארי פריס ציאניד חמישה מילי-מולארי פרעה ציאניד בתמיסת PBS. לאחר מכן, כדי לרשום את ערכי עכבת הרקע של המערכת האלקטרוכימית עבור תדרים שונים על ידי ספקטרוסקופיה של עכבה אלקטרוכימית או EIS, חבר סטטיסטיקה פוטנציאלית למונה העבודה ואלקטרודות ייחוס באמצעות קצות בדיקה. הזן את הפרמטרים של מדידת EIS לתוכנת המחשב ולאחר מכן התחל את המדידה.

חזור על מדידה זו עבור כל אלקטרודה עובדת בערוצי המיקרו כדי למדוד הכלאת DNA עבור כל חילופי יעד DNA חד-גדיליים שאינם משלימים ומשלים. צינור המזרק והמחבר. מלאו את תעלות המיקרו במאגר SSC מרוכז פי ארבעה המכיל מיקרומולר אחד של ה-DNA החד-גדילי של המטרה ודגרו למשך 20 דקות.

בצע מדידות על ידי התחלת מדידת EIS עם תוכנה במחשב עבור כל תמיסת DNA חד-גדילית מטרה כדי לאמת את הפעילות האלקטרוכימית של נפח הביו-צ'יפ המחזורי. מדידות טלמטריה נלקחו בתעלות המיקרו המלאות בחמצון חיזור אלקטרואקטיבי זוג ציאניד ציאניד המוצגים כאן הם מברקי נפח מחזוריים של תשע אלקטרודות עובדות. הצורה הדומה, גובה השיא והפרדת השיא עבור כל האלקטרודות מדגימים יכולת שחזור גבוהה כדי להדגים את יכולתם של השבבים לזהות אירועי הכלאה של DNA.

וריאציות עכבה אלקטרוכימיות נמדדו עבור אירועי הכלאה בין שלוש בדיקות DNA חד-גדיליות ומטרות ה-DNA החד-גדיליות המשלימות והלא משלימות שלהן, נצפו שינויים גבוהים יותר בהתנגדות להעברת מטען כאשר הוכנסה מטרה DNA חד-גדילית משלימה והוכלאה עם הגשושית בהשוואה להכנסת מטרות DNA חד-גדיליות לא משלימות כדי להדגים את הרגישות של החיישן הביולוגי. ריכוזים שונים של יעד DNA חד-גדילי משלים הוכנסו לבדיקת החישה המוצגת כאן תרשים נייקוויסטי של מדידות ספקטרוסקופיה של עכבה אלקטרוכימית לאחר הכנסת ריכוזי DNA חד-גדיליים הולכים וגדלים המצוינים על ידי החץ בגרף. ערכי עכבה מוגברים נראו בתדרים נמוכים של כ-15 הרץ עבור ריכוזי DNA חד-גדיליים גבוהים יותר עקב כוחות הדחייה החזקים יותר בין ה-DNA הדו-גדילי למולקולות ה-Ferro cyanide Ferris cyanide.

בסך הכל, ה-BIOCHIPS מראה את היכולת לחוש במהירות את נוכחותם של אירועי הכלאת DNA. לאחר צפייה בסרטון זה, אתה אמור להיות בעל הבנה טובה כיצד לפתח ולייצר מכשיר אלקטרוכימי מיקרופלואידי, ולהשתמש בו כדי לזהות אירועי הכלאה של DNA. בעת ניסיון הליך זה, חשוב לזכור לבצע אופטימיזציה של פרמטרים שונים של BIOS כגון יחס אות לאחות, יציבות ורגישות בעקבות הליך זה.

ניתן לבצע שיטות אחרות כמו הכנסת מטרות DNA חד-גדיליות עם רצפים מעט שונים של חומצות גרעין על מנת לענות על שאלות נוספות כמו שילוב מוטציות DNA ותחרות. אל תשכח שעבודה עם פתרונות תהליך ייצור מיקרו עלולה להיות מסוכנת ביותר, והגנה על העיניים והידיים צריכה תמיד להזהיר בעת ביצוע הליך זה.