Name: בידוד של תאי Murine לימפה צומת סטרומה (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-08-19T14:00:00.000+00:00
Duration: 5 min 47 s
Description: למדו לבודד תאי סטרומה מבלוטות לימפה במודל מורין באמצעות עיכול אנזימטי ופירוק מכני. שיטה זו שומרת על חיוניות התאים וביטוי מולקולות פני השטח לניתוח זרימה.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

המחברים מודים לסנג'יב לותר ועמיתיו על דיונים מועילים בביסוס פרוטוקול העיכול הנוכחי של בלוטות הלימפה. עבודה זו נתמכה על ידי מענקי SNF PPOOA-_119204 ו-PPOOP3_144918 ל-S.W.R.

בפרסום הסרטון הזה ופרוטוקול, את כל ההליכים בבעלי החיים נערכו בהתאם לפרוטוקול שאושר על ידי בעלי החיים קנטונלית הרשות באזל, שווייץ. .1 בלוטות הלימפה הכנה ועיכול <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מים מראש בחום בכוס ל37 מעלות צלזיוס בבוחש מגנטי עם צלחת חימום. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן בסיסי בינוני כדלקמן: DMEM בינוני (ללא פירובט) השלים עם FCS 2%, 1.2 מ&quot;מ CaCl 2 ופן / סטרפטוקוקוס (פניצילין 100 יחידות, של סטרפטומיצין 100 מיקרוגרם). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לעקר את כל מכשירים לנתיחה לפני השימוש. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להרדים עכברי תורם בלוטה לימפה לCO 2 מחנק וסביבה נקי מחיידקים לנתח את בלוטות הלימפה. אל לנתח את השומן שמסביב. הערה: פרוטוקול זה הוא מותאם לצומת היקפית-ניקוז עור לימפה (מפשעתי, זרוע, בית השחי). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים בלוטות לימפה בצלחת פטרי המכילה סטרילי בינוני בסיסית קר 2 מ&quot;ל קרח. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשבש את ca הבלוטה לימפהpsule באמצעות שתי 25 מחטי G קבועות במזרק 1 מ&quot;ל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העברת רקמת הבלוטה לימפה שיבש בצינור מסביב לתחתית 5 מ&quot;ל פוליפרופילן המכיל 750 בינוני בסיסי μl בתוספת 1 מ&quot;ג / י DNAse 40 מיקרוגרם / מ&quot;ל ​​מ&quot;ל Collagenase IV ו </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להוסיף בוחש מגנטי סטרילי אחד בצינור אחד. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צינור מקום בכוס עם 37 ° C שחומם מראש מים ומערבבים את הצינורות בקצב איטי (סיבוב 1 / sec) עבור 30 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את הצינור מהבוחש המגנטי עם צלחת חימום ולתת שברי בלוטה לימפה להתיישב. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מוציא בזהירות את supernatant המועשר ב&quot; תאים לא סטרומה &quot;. הערה: אם הניתוח של T, B, תאים דנדריטיים וCD45 - gp38 - CD31 - הוא צפוי, לשמור את החלק &quot;תאים שאינן סטרומה&quot;. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף נותר רקמת בלוטה לימפה פעם אחת עם 750 בינוניים בסיסי μl. הערה: שלב זה הוא הכרחי רק אם עובד עם עכברי חיסון מוסמך. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בואו ברי בלוטה לימפה להתיישב. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר אתשבריר צף תאים שאינה סטרומה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף לברי הבלוטה לימפה בינוניות בסיסי 750 μl בתוספת 3.5 מ&quot;ג / מ&quot;ל ​​Collagenase D ואני DNase 40 מיקרוגרם / מ&quot;ל </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צינור מקום בחזרה בכוס המכילה 37 ° C שחומם מראש מים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לעכל רקמת בלוטה לימפה במשך 5 דקות תוך ערבוב לאט. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שברי Disaggregate הלימפה רקמת צומת על ידי pipetting וערבוב 700 μl ל10 מחזורים במהירות המרבית באמצעות פיפטה רבה אוטומטית. הערה: זה משבש רקמת בלוטה לימפה כדי לשפר את העיכול. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים את הצינור בחזרה בכוס עם 37 מעלות מים שחומם מראש C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שברי רקמת הבלוטה לימפה Digest עוד 10 דקות תוך ערבוב לאט. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Disaggregate ברי רקמת בלוטה לימפה על ידי pipetting וערבוב ל99 מחזורים במהירות המרבית באמצעות פיפטה רבה אוטומטית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוספת 7.5 μl של 0.5 M EDTA כדי להבטיח תחזוקה של השעיה תא בודדת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שברי רקמת הבלוטה לימפה Disaggregate על ידי צינורtting וערבוב ל99 מחזורים במהירות המרבית באמצעות פיפטה רבה אוטומטית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף בינוני בסיסית 750 μl ולהעביר תאים דרך רשת ניילון 70 מיקרומטר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ההשעיה תא צנטריפוגה 5 דקות ב1,500 XG, 4 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תאי סטרומה כעת ניתן להשתמש לצורך ניתוח נוסף. </li></ol> .2 צביעת תאים לימפה צומת סטרומה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש בשילוב של אנטי CD45, אנטי podoplanin (gp38), נוגדנים נגד CD31 להכיר בהצלחה תאי TRC, LEC, BEC וDN. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה רקמת הבלוטה לימפה מתעכל עם גשש חי / מת, אנטי CD45-FITC (1: 200), אנטי gp38-PE (1: 200), אנטי CD31-APC (1: 200) ב100 μl HBSS המכיל 2 FCS% לפחות 20 דקות, 4 ° C, בחושך. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שוטף את התאים והוסיפו 500 l של HBSS המכילים 2% FCS </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ההשעיה תא צנטריפוגה 3 דקות XG ב 1500, 4 ° C.. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להשעות Re בשל HBSS 100 μl המכיל 2% FCS. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפעל את התאים המוכתמים בזרימה cytometer equippעורך עם אופטיקה הבאה: מקור עירור עם עד שלושה לייזרים: כחול (488 ננומטר,, מצב מוצק 20 mW מקורר אוויר), אדום (633 ננומטר, 17 mW HeNe), וסגול (405 ננומטר, 30 mW מצב מוצק) . </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השער CD45 - תאים שלא לכלול תאי hematopoietic. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> singlets השער (FSC-W) ותאי חיים (LIVE / גשש DEAD) שלא לכלול כפילויות ותאים מתים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> gp38 עלילה לעומת CD31 לדמיין TRC (gp38 + CD31 -), LEC, BEC (gp38 - CD31 +) (gp38 + CD31 +) וDN (gp38 - CD31 -) תאים (ראה איור 1). </li></ol>

<ol><li>Mueller, S. N., Ahmed, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lymphoid+stroma+in+the+initiation+and+control+of+immune+responses%5BTitle%5D)+AND+%22Immunological+reviews%22%5BJournal%5D)">Lymphoid stroma in the initiation and control of immune responses.</a> Immunological reviews. 224, 284-294 (2008).</li>
<li>Roozendaal, R., Mebius, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stromal+Cell+-+Immune+Cell+Interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">Stromal Cell - Immune Cell Interactions.</a> Annual Review of Immunology. 29 (1), 23-43 (2011).</li>
<li>Turley, S. J., Fletcher, A. L., Elpek, K. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+stromal+and+haematopoietic+antigen-presenting+cells+that+reside+in+secondary+lymphoid+organs%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Immunology%22%5BJournal%5D)">The stromal and haematopoietic antigen-presenting cells that reside in secondary lymphoid organs.</a> Nature Reviews Immunology. 10 (12), (2010).</li>
<li>Bajénoff, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stromal+cell+networks+regulate+lymphocyte+entry%2C+migration%2C+and+territoriality+in+lymph+nodes%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">Stromal cell networks regulate lymphocyte entry, migration, and territoriality in lymph nodes.</a> Immunity. 25 (6), 989-1001 (2006).</li>
<li>Katakai, T., Hara, T., Sugai, M., Gonda, H., Shimizu, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lymph+node+fibroblastic+reticular+cells+construct+the+stromal+reticulum+via+contact+with+lymphocytes%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+experimental+medicine%22%5BJournal%5D)">Lymph node fibroblastic reticular cells construct the stromal reticulum via contact with lymphocytes.</a> The Journal of experimental medicine. 200 (6), 783-795 (2004).</li>
<li>Link, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fibroblastic+reticular+cells+in+lymph+nodes+regulate+the+homeostasis+of+naive+T+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Immunology%22%5BJournal%5D)">Fibroblastic reticular cells in lymph nodes regulate the homeostasis of naive T cells.</a> Nature Immunology. 8 (11), 1255-1265 (2007).</li>
<li>Malhotra, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcriptional+profiling+of+stroma+from+inflamed+and+resting+lymph+nodes+defines+immunological+hallmarks%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Immunology%22%5BJournal%5D)">Transcriptional profiling of stroma from inflamed and resting lymph nodes defines immunological hallmarks.</a> Nature Immunology. 13 (5), 499-510 (2012).</li>
<li>Gretz, J. E., Norbury, C. C., Anderson, A. O., Proudfoot, A. E., Shaw, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lymph-borne+chemokines+and+other+low+molecular+weight+molecules+reach+high+endothelial+venules+via+specialized+conduits+while+a+functional+barrier+limits+access+to+the+lymphocyte+microenvironments+in+lymph+node+cortex%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+experimental+medicine%22%5BJournal%5D)">Lymph-borne chemokines and other low molecular weight molecules reach high endothelial venules via specialized conduits while a functional barrier limits access to the lymphocyte microenvironments in lymph node cortex.</a> The Journal of experimental medicine. 192 (10), 1425-1440 (2000).</li>
<li>Sixt, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+conduit+system+transports+soluble+antigens+from+the+afferent+lymph+to+resident+dendritic+cells+in+the+T+cell+area+of+the+lymph+node%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">The conduit system transports soluble antigens from the afferent lymph to resident dendritic cells in the T cell area of the lymph node.</a> Immunity. 22 (1), 19-29 (2005).</li>
<li>MartIn-Fontecha, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+dendritic+cell+migration+to+the+draining+lymph+node%3A+impact+on+T+lymphocyte+traffic+and+priming%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+experimental+medicine%22%5BJournal%5D)">Regulation of dendritic cell migration to the draining lymph node: impact on T lymphocyte traffic and priming.</a> The Journal of experimental medicine. 198 (4), 615-621 (2003).</li>
<li>Luther, S. A., Tang, H. L., Hyman, P. L., Farr, A. G., Cyster, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Coexpression+of+the+chemokines+ELC+and+SLC+by+T+zone+stromal+cells+and+deletion+of+the+ELC+gene+in+the+plt%2Fplt+mouse%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Coexpression of the chemokines ELC and SLC by T zone stromal cells and deletion of the ELC gene in the plt/plt mouse.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 97 (23), 12694-12699 (2000).</li>
<li>Braun, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Afferent+lymph-derived+T+cells+and+DCs+use+different+chemokine+receptor+CCR7-dependent+routes+for+entry+into+the+lymph+node+and+intranodal+migration%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Immunology%22%5BJournal%5D)">Afferent lymph-derived T cells and DCs use different chemokine receptor CCR7-dependent routes for entry into the lymph node and intranodal migration.</a> Nature Immunology. 12 (9), 879-887 (2011).</li>
<li>Fletcher, A. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reproducible+isolation+of+lymph+node+stromal+cells+reveals+site-dependent+differences+in+fibroblastic+reticular+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+immunology%22%5BJournal%5D)">Reproducible isolation of lymph node stromal cells reveals site-dependent differences in fibroblastic reticular cells.</a> Frontiers in immunology. 2, 35(2011).</li>
<li>Lukacs-Kornek, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulated+release+of+nitric+oxide+by+nonhematopoietic+stroma+controls+expansion+of+the+activated+T+cell+pool+in+lymph+nodes%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Immunology%22%5BJournal%5D)">Regulated release of nitric oxide by nonhematopoietic stroma controls expansion of the activated T cell pool in lymph nodes.</a> Nature Immunology. 12 (11), 1096-1104 (2011).</li>
<li>Siegert, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fibroblastic+reticular+cells+from+lymph+nodes+attenuate+T+cell+expansion+by+producing+nitric+oxide%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">Fibroblastic reticular cells from lymph nodes attenuate T cell expansion by producing nitric oxide.</a> PLoS ONE. 6 (11), e27618(2011).</li>
<li>Khan, O., Headley, M., Gerard, A., Wei, W., Liu, L., Krummel, M. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+T+cell+priming+by+lymphoid+stroma%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">Regulation of T cell priming by lymphoid stroma.</a> PLoS ONE. 6 (11), e26138(2011).</li>
<li>Svensson, M., Maroof, A., Ato, M., Kaye, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stromal+cells+direct+local+differentiation+of+regulatory+dendritic+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">Stromal cells direct local differentiation of regulatory dendritic cells.</a> Immunity. 21 (6), 805-816 (2004).</li>
<li>Onder, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endothelial+cell-specific+lymphotoxin-%CE%B2+receptor+signaling+is+critical+for+lymph+node+and+high+endothelial+venule+formation%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+experimental+medicine%22%5BJournal%5D)">Endothelial cell-specific lymphotoxin-β receptor signaling is critical for lymph node and high endothelial venule formation.</a> The Journal of experimental medicine. 210 (3), 465-473 (2013).</li>
<li>Fletcher, A. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lymph+node+fibroblastic+reticular+cells+directly+present+peripheral+tissue+antigen+under+steady-state+and+inflammatory+conditions%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+experimental+medicine%22%5BJournal%5D)">Lymph node fibroblastic reticular cells directly present peripheral tissue antigen under steady-state and inflammatory conditions.</a> The Journal of experimental medicine. 207 (4), 689-697 (2010).</li>
<li>Fletcher, A. L., Malhotra, D., Turley, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lymph+node+stroma+broaden+the+peripheral+tolerance+paradigm%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Immunology%22%5BJournal%5D)">Lymph node stroma broaden the peripheral tolerance paradigm.</a> Trends in Immunology. 32 (1), 12-18 (2011).</li>
<li>Cohen, J. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lymph+node-resident+lymphatic+endothelial+cells+mediate+peripheral+tolerance+via+Aire-independent+direct+antigen+presentation%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Experimental+Medicine%22%5BJournal%5D)">Lymph node-resident lymphatic endothelial cells mediate peripheral tolerance via Aire-independent direct antigen presentation.</a> Journal of Experimental Medicine. 207 (4), 681-688 (2010).</li>
<li>Lee, J. -W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Peripheral+antigen+display+by+lymph+node+stroma+promotes+T+cell+tolerance+to+intestinal+self%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Immunol%22%5BJournal%5D)">Peripheral antigen display by lymph node stroma promotes T cell tolerance to intestinal self.</a> Nat Immunol. 8, 181-190 (2006).</li>
<li>Nichols, L. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Deletional+self-tolerance+to+a+melanocyte%2Fmelanoma+antigen+derived+from+tyrosinase+is+mediated+by+a+radio-resistant+cell+in+peripheral+and+mesenteric+lymph+nodes%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">Deletional self-tolerance to a melanocyte/melanoma antigen derived from tyrosinase is mediated by a radio-resistant cell in peripheral and mesenteric lymph nodes.</a> J Immunol. 179, 993-1003 (2007).</li>
<li>Gardner, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Deletional+tolerance+mediated+by+extrathymic+Aire-expressing+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Deletional tolerance mediated by extrathymic Aire-expressing cells.</a> Science. 321, 843-847 (2008).</li>
<li>Gardner, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extrathymic+Aire-expressing+cells+are+a+distinct+bone+marrow-derived+population+that+induce+functional+inactivation+of+CD4%2B+T+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">Extrathymic Aire-expressing cells are a distinct bone marrow-derived population that induce functional inactivation of CD4+ T cells.</a> Immunity. 39, 560-572 (2013).</li>
<li>Magnusson, F. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+presentation+of+antigen+by+lymph+node+stromal+cells+protects+against+CD8+T-cell-mediated+intestinal+autoimmunity%5BTitle%5D)+AND+%22Gastroenterology%22%5BJournal%5D)">Direct presentation of antigen by lymph node stromal cells protects against CD8 T-cell-mediated intestinal autoimmunity.</a> Gastroenterology. 134, 1028-1037 (2008).</li>
<li>Tewalt, E. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lymphatic+endothelial+cells+induce+tolerance+via+PD-L1+and+lack+of+costimulation+leading+to+high-level+PD-1+expression+on+CD8+T+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Lymphatic endothelial cells induce tolerance via PD-L1 and lack of costimulation leading to high-level PD-1 expression on CD8 T cells.</a> Blood. 120 (24), 4772-4782 (2012).</li>
</ol>

המחברים מצהירים שאין להם אינטרסים פיננסיים מתחרים.

המחקר של תאי סטרומה בלוטה לימפה לאחרונה הפך למוקד מחקר עקב התפתחותם של שני פרוטוקולי עיכול פורסם 6,13. שני הפרוטוקולים מספיקים כדי לקבל תאי סטרומה הבלוטה לימפה בודדת אך שונים בשימוש באנזימי עיכול ואת הזמן של עיכול. מאחר ותאי סטרומה וסמני פני השטח שלהם רגישים לעיכול אנזימטי ולחץ מכאני, נדרש פרוטוקול מותאם. הבידוד של תאי סטרומה הבלוטה לימפה קיימא מהבלוטה לימפה טריות גזור הוא הצעד הראשון על מנת לבצע פנוטי...

בלוטות הלימפה הן תאים מיוחדים שבו תגובה חיסונית אדפטיבית נגד אנטיגנים עצמיים-זרים והם יזמו ותאמו. ההליך שהוצג כאן מתאר עיכול אנזימטי קצר בשילוב עם pipetting המכני האוטומטי לקבל השעיה תא בודד בלוטה לימפה ולקבל גישה לתאי סטרומה בלוטה לימפה קיימא השומרים על הבעת פני השטח של כמה מולקולות. תא סטרומה בלוטה לימפה בצורת הפיגום של בלוטות לימפה ולמלא שלושה תפקידים מרכזיים: ראשון שהם לסנן נוזלי גוף לדגום אנטיגנים, פתוגנים והדפוס שלהם הפתוגן הקשורים המולקולרי (PAMPs), כמו גם ציטוקינים ודפוס מולקולרי הקשורים סכנה (damps) נוכחי בגוף. שנית, הם מושכים ולהורות תאי הצגת אנטיגן (APC) ולימפוציטים מסוג האינטראקציה וליזום תגובה חיסונית אדפטיבית; ושלישית, הם מספקים סביבה מבנית להומאוסטזיס וההתמיינות של לימפוציטים מסוג 1-3. במהלך תאי סטרומה הבלוטה לימפה לדלקת לייצר גורמי גדילה, ציטוקינים וכמוקינים, להסתגל לנפיחות ובכך ארגון האינטראקציה בין תאים דנדריטים (DCS), טריקו, וB- תאים. התזמור של תגובות חיסוניות אפשרי רק בשל הארכיטקטורה המבנית המורכבת שהוקמה על ידי אוכלוסיות תאי סטרומה שונות. תאי סטרומה בלוטה לימפה הם תאים שליליים CD45 וניתן להבחין על ידי הביטוי של CD31 או gp38 בתאי fibroblastic ואנדותל 1 -6. Gp38 + CD31 - מגדיר תאי אזור T רשתי (TRC, הידוע גם בFRC: תאי רשתית fibroblastic), gp38 + CD31 + מגדיר תאי הלימפה אנדותל (LEC), gp38 - CD31 + מגדיר תאי האנדותל בדם (BEC). יתר על כן, אפיון של האוכלוסיות חשף את קיומם של תאי סטרומה בלוטה לימפה אחרים. ואכן, אוכלוסיית תאים כמו pericyte קטנה התאפיינה בתוךgp38 - CD31 - אוכלוסיית 7. לכן, עיבוד של הליך הבידוד הוא יתרון עבור זיהוי ואפיון של התכונות פונקציונליות של תאי סטרומה בלוטה לימפה שונים. לפני הפיתוח של מערכת עיכול תאי סטרומה בלוטה לימפה פרוטוקולי המחקר של תאי סטרומה בלוטה לימפה היה מוגבל בתצפיות באתר באמצעות סעיף ומיקרוסקופיה רקמה. עם זאת, מחקרים מבניים ותפקודיים הראו מאפיינים חשובים של תאי סטרומה בלוטה לימפה. תאי סטרומה בלוטה לימפה קשורים עם podoplanin, קולגן ומטריצת חוץ תאית חלבונים (ECM) כדי ליצור מבנה מורכב 3 ממדים הנקרא מערכת צינור, שמעביר חלבונים לימפה ומסה מולקולרית הקשורים נמוכה מסינוס subcapsular של הבלוטה לימפה לגבוהה אנדותל venules באזור תאי T 8. DCs נמצא בקשר הדוק עם תאי סטרומה ואפשר לראות בולט לקון צינורימבנה duit לדגום נוזל ולזהות אנטיגנים 8. האינטראקציה של תאי בלוטה לימפה סטרומה (TRCs וLECs) עם DCs מתווכת על ידי השחרור וההצגה של CCL21 כמוקינים וCCL19 9,10. CCL19 וCCL21 מוכרים על ידי קולטן CCR7 להקל DCs ותאי T לנדוד לאזור תא T הבלוטה לימפה 4,11. למרות שימוש בכמוקינים דומים, יש לי תאי DCs וT מסלולי נדידה שונים לבלוטות הלימפה 12. מאוחר יותר, באמצעות עיכול אנזימטי של בלוטות לימפה ובידוד של תאי סטרומה בלוטה לימפה טהורים, מחקרים פונקציונליים בוצעו על עצם את התפקיד של תאי סטרומה הבלוטה לימפה השונים והיכולת שלהם לתקשר עם DCs וT / תאי B 6,13. ראשית, crosstalk בין תאי IFN-γ ייצור מפעיל T ותאי סטרומה בלוטה לימפה גורם ייצור של תחמוצת חנקן המטבוליט מוצגת לצנן תגובות תא T ושגשוג באיברי הלימפה המשניים 14-16. שנית, לימפה nתאי סטרומה שיר הלל כבר דיווחו לתמיכה בבידול של תת DC רגולציה באמצעות הייצור של IL-10 17, ולווסת הומאוסטזיס תא T נאיבי באמצעות הייצור של IL-7 6,18. שלישית, ביטוי TLR בתאי סטרומה בלוטה לימפה מצביע על כך שתאי סטרומה רגישים לאותות הנגזרים מזיהום או מולקולות עצמית שפורסם במהלך פגיעה ברקמות. ואכן, הטיפול בתאים סטרומה בלוטה לימפה עם ליגנד של פולי TLR3 (אני: C) גורם גברת ביטוי צנועה של גדול אני כיתה המורכבת histocompatibility ביטוי וגברת ביטוי של מולקולת שיתוף מעכב PD-L1, אך לא של מולקולות costimulatory, וכתוצאה מכך שינויים דרמטיים ברקמות היקפי אנטיגנים ביטוי 19. כמה קבוצות הראו תאי סטרומה בלוטה לימפה לבטא אנטיגנים רקמות היקפיים ולגרום לסובלנות של תאי T עצמי תגובתי 19,21-27. לכן, הבנת יחסי הגומלין בין תאי סטרומה בלוטה לימפה ומחדש נודדים והאחרותתאי בלוטה לימפה sident יעזרו למצוא מולקולות יעד חדשות כדי לאפשר הפעלה או דיכוי של מערכת חיסונית בזמן דלקת. לכן, יש צורך ביישום ההפרדה האנזימטית שפורסמה של בלוטות לימפה. פרוטוקולים שפורסמו בעבר להשתמש בשילובים שונים של עיכול אנזימטי מבוסס collagenase עם לחץ מכאני נמוך 6,19,20. עם זאת, incubations הארוך עם אנזימי עיכול או שילוב של אנזים עיכול שונה עלול לבזות מולקולות פני השטח שונות הנדרשות על מנת לנתח את מצב ההפעלה ולזהות תאי סטרומה בלוטה לימפה חדשים. בהתאם לסוג של ניתוח תא סטרומה, פרוטוקול הקישור או פלטשר הפרוטוקול עשוי להיות מתאים יותר. בהליך המתואר, עיכול אנזימטי מעט קצר יותר בשילוב עם פיצול של מכאני אוטומטי כדי למזער השפלה סמן פני השטח של תאי סטרומה הבלוטה לימפה קיימא. הליך זה מאפשר בידוד מאוד לשחזור והבחנה של אוכלוסיות תאי סטרומה בלוטה לימפה עם שונות נמוכות וכדאיות יותר מ 95%. תאי סטרומה הבלוטה לימפה המבודדים הטרי ניתן להשתמש ישירות לביטוי סמן משטח, ניתוח חלבון, ומחקרי תעתיק, כמו גם הקמתה של קווי תאי סטרומה לבצע מבחני תפקודיים במבחנה.

<table><tbody><tr><td>DMEM</td><td>LifeTechnologies-Gibco</td><td>41965-039</td><td></td></tr><tr><td>FCS</td><td></td><td></td><td>ריכוז סופי 2%</td></tr><tr><td>CaCl2</td><td>Sigma</td><td>499609</td><td>ריכוז סופי 1.2 מ"מ</td></tr><tr><td>קולגנאז IV</td><td>Worthington Biochemical Corporation</td><td></td><td>>160 יחידות למ"ג משקל יבש, שימוש בריכוז סופי של 1 מ"ג/מ"ל</td></tr><tr><td>קולגנאז D</td><td>Roche</td><td>11088882001</td><td>לשימוש במינון 3.5 מ"ג/מ"ל</td></tr><tr><td>DNAse I</td><td>Roche&nbsp;</td><td>שימוש</td><td>11284932001 בגיל 40 ומיקרו; גרם/מ"ל</td></tr><tr><td>מגנטים לערבוב</td><td>FAUST</td><td></td><td>5 מ"מ אורך-2 מ"מ &oslash;</td></tr><tr><td>צינורות תחתונים עגולים מפוליסטירן 5 מ"ל</td><td>Falcon-BD Bioscience</td><td></td><td></td></tr><tr><td>מערבל מגנטי עם פונקציית חימום</td><td>IKA-RCT-סטנדרטי</td><td>9720250</td><td></td></tr><tr><td>צלחות פטרי 100 מ"מ, סטרילי</td><td>TPP</td><td>6223201</td><td></td></tr><tr><td>25 גרם מחטים</td><td>Terumo</td><td></td><td></td></tr><tr><td>אנטי עכבר CD45 Ab</td><td>Biolegend</td><td></td><td>Clone 30-F11</td></tr><tr><td>אנטי עכבר CD11c Ab</td><td>Biolegend</td><td></td><td>Clone N418</td></tr><tr><td>אנטי עכבר Podoplanin Ab</td><td>Biolegend</td><td></td><td>Clone 8.1.1</td></tr><tr><td>אנטי עכבר CD31 Ab</td><td>Biolegend</td><td></td><td>Clone MEC13.3</td></tr><tr><td> Eppendorf Xplorer plus, רב ערוצי</td><td>Eppendorf</td><td>4861 000.821/830</td><td>1.250 ומיקרו; l מקסימום נפח</td></tr><tr><td>אנטי עכבר CD140a</td><td>Biolegend</td><td></td><td>Clone APA5</td></tr><tr><td>אנטי עכבר CD80</td><td>Biolegend</td><td></td><td>Clone 16-10A1</td></tr><tr><td>אנטי עכבר CD40</td><td>Biolegend</td><td></td><td>Clone 1C10</td></tr><tr><td>אנטי עכבר I-Ab</td><td>Biolegend</td><td></td><td>Clone AF6-120.1</td></tr><tr><td>אנטי עכבר CD274 (PD-L1)</td> <td>Biolegend</td><td></td><td>Clone 10F.9G2</td></tr><tr><td>LIVE / DEAD Fixable ערכת כתמי תאים מתים Near-IR</td><td>Invitrogen</td><td>L10119</td><td></td></tr></tbody></table>

בידוד של תאי murine לימפה צומת סטרומה

Isolation of Murine Lymph Node Stromal Cells

איברי לימפה משניים כולל בלוטות לימפה מורכבים מתאי סטרומה המספקים סביבה מבנית להומאוסטזיס, הפעלה והתמיינות של לימפוציטים. תת-קבוצות שונות של תאי סטרומה זוהו על ידי ביטוי מולקולת ההדבקה CD31 וגליקופרוטאין פודופלנין (gp38), תאי רשתית באזור T או תאי רשתית פיברובלסטיים, תאי אנדותל לימפתיים, תאי אנדותל בדם ופריציטים דמויי FRC בתוך אוכלוסיית התאים השליליים הכפולים. עבור כל האוכלוסיות מתוארות פונקציות שונות הכוללות הפרדה ורירית של תאים שונים, משיכה ואינטראקציה עם סוגי תאים שונים, סינון הנוזלים המנקזים והתכווצות כלי הלימפה. בשנים האחרונות, קבוצות שונות תיארו תפקיד נוסף של תאי סטרומה בתזמור וויסות תגובות תאי T ציטוטוקסיות שעלולות להיות מסוכנות למארח. 
בלוטות לימפה הן מבנים מורכבים עם סוגי תאים רבים ושונים ולכן דורשים הליך מתאים לבידוד אוכלוסיות התאים הרצויות. נכון לעכשיו, פרוטוקולים לבידוד תאי סטרומה של בלוטות הלימפה מסתמכים על עיכול אנזימטי עם זמני דגירה משתנים; עם זאת, תאי סטרומה ומולקולות פני השטח שלהם רגישים לאנזימים אלה, מה שגורם לאובדן ביטוי סמני פני השטח ולמוות של תאים. כאן מוצע פרוטוקול עיכול אנזימטי קצר בשילוב עם שיבוש מכני אוטומטי להשגת השעיית תאים בודדים בת קיימא של תאי סטרומה של בלוטות הלימפה השומרים על ביטוי מולקולות פני השטח שלהם.

הפרוטוקול הנוכחי הוא פרוטוקול עיכול שונה פורסם על ידי קישור et al., 2007 6 עם זמן קצר יותר לעיכול (45 מרבי דקות) בשל פיצול של מכאני עם פיפטה רבה אוטומטית. בנוסף, ההליך הוא סטנדרטי יותר, ממזער פירוק של סמני משטח בתאי סטרומה בלוטה לימפה שונים ומאפשר את הטיפול במדגם אחד או יותר באותו הזמן. Collagenase IV וCollagenase D בקישורי פרוטוקול 6 ופרוטוקול נוכחי או Collagenase P וDispase בפלצ'ר...

בידוד של תאי סטרומה של בלוטות הלימפה הוא הליך רב-שלבי הכולל עיכול אנזימטי ופירוק מכני להשגת תאי רשתית פיברובלסטיים, תאי לימפה ותאי אנדותל בדם. בהליך המתואר, עיכול קצר משולב עם פירוק מכני אוטומטי כדי למזער את פירוק סמני פני השטח של תאי סטרומה של בלוטות לימפה קיימות.

בידוד של תאי Murine לימפה צומת סטרומה

Secondary lymphoid organs including lymph nodes are composed of stromal cells that provide a structural environment for homeostasis, activation and ...

המטרה הכוללת של הליך זה היא לבודד תאי סטרומה של בלוטות הלימפה. זה מושג על ידי שיבוש ראשון של קפסולת בלוטות הלימפה. בשלב השני, שברי בלוטות הלימפה מתעכלים עם קולגנאז ארבע ו- D nase אחד.לאחר מכן האנזימים מוחלפים בקולגנאז D ו-D nase אחד, והשברים מפורקים מכנית עם פיפטה רב-ערוצית אוטומטית. בסופו של דבר, ניתן לאפיין את ביטוי מולקולת פני התא של תאי בלוטות הלימפה המבודדות על ידי ציטומטריית זרימה. היתרון העיקרי של טכניקה זו על פני השיטה הקיימת הוא שבשיטה זו, תאי SHR של בלוטות הלימפה מתעכלים באמצעות הליך אנזימטי סטנדרטי המשלים פירוק מכני השומר על הכדאיות וביטוי מולקולות פני השטח של התאים.התחל בהנחת בלוטות הלימפה המנותחות בצלחת פטרי סטרילית המכילה שני מיליליטר של מדיום קר כקרח. לאחר מכן השתמש בשני מזרקים של מיליליטר אחד המצוידים במחטים בגודל 25 כדי לשבש את כמוסות בלוטות הלימפה. לאחר מכן, העבירו את הרקמה המופרעת לצינור חרוטי של חמישה מיליליטר המכיל 750 מיקרוליטר של מדיום, בתוספת קולגנאז ארבע ו-DNA אחד וערבוב מגנטי.לאחר מכן הניחו את הצינור בכוס המכילה מים שחוממו מראש ל-37 מעלות צלזיוס על מערבל מגנטי וערבבו את תמיסות התאים בסיבוב אחד לשנייה למשך 30 דקות. לאחר ערבוב, הניחו לשבר בלוטות הלימפה להתיישב ואז הסירו בזהירות את הסופרנטנט. כעת מועשר לתאים שאינם סטרומליים מעבירים לשברי בלוטות הלימפה 750 מיקרוליטר של מדיום טרי, בתוספת קולגנאז D ו-D nase אחד, ולאחר מכן מערבבים את הרקמה למשך חמש דקות נוספות ב-37 מעלות צלזיוס.לאחר מכן, השתמש בפיפטה רב-ערוצית אוטומטית כדי לפרק את שברי רקמת בלוטות הלימפה בנפח של 700 מיקרוליטר למשך 10 מחזורים במהירות מקסימלית, ולאחר מכן ערבב שוב את שברי הרקמה לאחר 10 דקות. יתר על כן, פרקו את גושי הרקמה עם הפיפטה הרב-ערוצית האוטומטית למשך 99 מחזורים במהירות מקסימלית. לאחר מכן הוסף 7.5 מיקרוליטר של 0.5 EDTA מולרי לצינור וערבב את תרחיף הרקמות למשך 99 מחזורים נוספים עם הפיפטה האוטומטית.לאחר מחזור הפירוק האחרון, הוסף 750 מיקרוליטר של מדיום לתמיסת התא וסנן את התאים דרך רשת ניילון של 70 מיקרומטר. לאחר מכן גלולה את התאים למשך חמש דקות ב-1500 גרם וארבע מעלות צלזיוס. כדי לדמיין אוכלוסיות תאי סטרומה של בלוטות הלימפה על ידי זרימה ציטומטרית, צבעו את דגימות התאים המתאימות עם גשש מת חי ואת הנוגדנים המעניינים ב-100 מיקרוליטר של HBSS המכילים 2% FCS למשך 20 דקות לפחות בארבע מעלות צלזיוס בחושך.לאחר מכן שטפו את התאים ב -500 מיקרוליטר של HBSS עם FCS והשעו מחדש. הכדורים ב-100 מיקרוליטר של HBSS ו-FCS מריצים את התאים על ציטומטר זרימה שמגדיר את התאים החיוביים CD 45 כדי להוציא את התאים ההמטופויאטיים, ואז ללכת על אוכלוסיית הסינגלטים החיה. לבסוף, שרטוט GP 38 לעומת CD 31 כדי לדמיין את תאי הרשתית באזור T, תאי אנדותל לימפה, תאי אנדותל בדם ותאים שליליים כפולים.אוכלוסיות תאים. מספר התאים הכולל שהתאושש לאחר העיכול של תת-קבוצות תאי הסטרומה של בלוטות הלימפה היה מעט גבוה יותר בפרוטוקול שהודגם זה עתה בהשוואה לפרוטוקולי הקישור ופלטשר, מה שמדגים כי הכדאיות של תאי הסטרומה של בלוטות הלימפה לאחר בידוד על ידי פרוטוקול זה דומה לזו שהתאוששה באמצעות פרוטוקולים שפורסמו. תאי רשתית באזור T ותאי אנדותל לימפטי שבודדו באמצעות זה ופרוטוקולי הקישור ופלטשר הושוו לביטוי IAB CD אחד 40 a CD 80, PD L אחד וביטוי CD 40.הביטוי של כל חמש מולקולות פני השטח היה גבוה יותר עם העיכול עם הפרוטוקול שהודגם זה עתה ופרוטוקול הקישור עבור שתי תת-קבוצות תאי הסטרומה, מה שמצביע על כך שהפירוק של כמה מולקולות פני השטח על ידי קולגנאז ארבע ו-D הוא פחות חזק מאשר עם קולגנאז p וחלל DYS. לאחר צפייה בסרטון זה, אתה אמור להבין היטב כיצד לבודד בהצלחה את ארבע תת-האוכלוסייה העיקרית של תאי סטרומה של בלוטות הלימפה תוך שמירה על הביטוי של מספר מולקולות פני השטח שימושיות להמשך אפיונם וניתוחם.

isolation-of-murine-lymph-node-stromal-cells

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

אימונולוגיה וזיהומים

בידוד של לימפוציטים באמצעות MACS Miltenyi ערכת מהווה דרך אמינה לטהר תאים שלמים homogenates רקמת הלימפה. תאים מטוהרים באמצעות מערכת Miltenyi הם בדרך כלל ≥ 96% טהור. הנה, אנחנו מדגימים את הצעדים שננקטו כדי לבודד תאים מסוג CD4 + T, אחת ערכות רבים המוצעים על ידי Miltenyi.

בידוד של תאים מסוג CD4 + T מ בלוטות לימפה עכבר באמצעות טיהור Miltenyi MACS

דרך יעילה לבודד את הלימפוציטים מדרכי מין עכבר מתוארת. שיטה זו מנצלת עיכול אנזים והפרדת השיפוע Percoll לאפשר בידוד יעיל. טכניקה זו היא גם להתאמה לשימוש במינים...

בידוד של לימפוציטים מעכבר גניטלי חוברות רירית

עם פונקציות מפעיל להבדיל מתת תא T אחר, תאי Th17 היו מעורבים באופן מרכזי באוטואימוניות דלקתיות. במבחנה פרוטוקול בידול Th17 זו מספק אמצעי כדי לקבוע אם לימפוציטים מסוג CD4 + T נאיביים יכולים להתמיין לתאי Th17, ולבחון את תפקידם באוטואימוניות ותגובת מארח נוסף.

בידוד ובידול של Th17 הנאיביים T מסוג CD4 לימפוציטים

מתואר יצירת כימרות של בלוטות לימפה/כריות שומן לחקר מקור תאי סטרומה של בלוטות הלימפה. השיטה כוללת בידוד של בלוטות לימפה מעכברים שזה עתה נולדו וכריות שומן עובריות, יצירת רפידות שומן של בלוטות לימפה כימריות, והעברתן מתחת לקפסולת הכליה של עכבר מארח.

יצירת כימרות של כריות שומן בלוטות לימפה לחקר מקור תאי סטרומה של בלוטות הלימפה

כאן אנו מתארים שיטה יעילה לבידוד, זיהוי, וטיהור של תאי אפיתל עכבר הרתי (Tecs). הפרוטוקול יכול להיות מנוצל ללימודים של פונקצית התימוס להתפתחות נורמלית T תא, תפקוד לקוי של בלוטת התימוס, וכינון מחדש של תאי T.

בידוד, זיהוי, וטיהור של תאי Murine הרתי אפיתל

יש עניין גובר באפיון הכמותי של לימפוציטים במעי עקב ההכרה הגוברת בכך שתאים אלה ממלאים תפקיד קריטי במגוון מחלות מעיים ומערכתיות. בפרוטוקול זה, אנו מתארים כיצד לבודד אוכלוסיות תאים בודדים מתאי מעי דק שונים לאפיון ציטומטרי זרימה לאחר מכן.

אפיון בידוד תזרים Cytometric של Murine קטנים מעיים לימפוציטים

לימפוציטים הם השחקנים העיקריים בתגובות חיסוניות נרכשות. כאן, אנו מציגים פרוטוקול טיהור לימפוציטים כדי לקבוע את הפונקציות הפיזיולוגיות של המולקולות הרצויות בהפעלת לימפוציטים במבחנה וב-vivo. הליכי הניסוי המתוארים מתאימים להשוואת יכולות תפקודיות בין לימפוציטים בקרה ללימפוציטים מהונדסים גנטית.

בידוד ההפעלה של Murine לימפוציטים

כאן נתאר פרוטוקול מפורט על הבידוד של לימפוציטים האתרים אינדוקטיבית כולל בלוטות לימפה mesenteric המנקזים ותיקונים של פייה רקמת הלימפה הקשורים הבטן, ואת האתרים אפקטור כולל את פרופריה. מוסקולריס ו אפיתל המעי של המערכת החיסונית קטנים במעיים.

לימפוציטים בידוד מן העכבר קטן המעי המערכת החיסונית

מאמר זה מתאר שיטה לבידוד מבוסס חרוזים מגנטיים של תאי אנדותל מורין מנימי לימפה עוריים. תאי האנדותל הלימפטיים המבודדים יכולים לשמש לניסויים במבחנה במורד הזרם ולניתוח ביטוי חלבונים.

Murine Dermal Lymphatic Endothelial Cell Isolation

כאן אנו מציגים פרוטוקולים המאפשרים בידוד של תאי סטרומה מעצם מורין, מח עצם, בלוטת התימוס ורקמה תימית אנושית התואמת למולטיומיקה של תא יחיד.

בידוד תאי סטרומה מאיברים המטופויטיים

פרוטוקול זה מתאר הליך הישרדות עבור לימפאדנקטומיה מזנטרית של עכברים בטוחה ונסבלת היטב, בכל אחת מארבע תחנות לאורך שרשרת בלוטות הלימפה המזנטריות. הליך זה ניתן להתאמה כדי לאפשר הפרעה סלקטיבית בתקשורת הלימפה עם המעי הגס הדיסטלי, המעי הגס הפרוקסימלי ו/או המעי הדק.

כריתת לימפאדנקטומיה מזנטרית של עכברים לשיבוש סלקטיבי בתקשורת לימפה עם מערכת העיכול הספציפית לאזור

למדו לבודד תאי סטרומה מבלוטות לימפה במודל מורין באמצעות עיכול אנזימטי ופירוק מכני. שיטה זו שומרת על חיוניות התאים וביטוי מולקולות פני השטח לניתוח זרימה.

בידוד של תאי Murine לימפה צומת סטרומה

גלה סרטונים נוספים