בידוד של תאי Murine לימפה צומת סטרומה

בידוד של תאי סטרומה של בלוטות הלימפה הוא הליך רב-שלבי הכולל עיכול אנזימטי ופירוק מכני להשגת תאי רשתית פיברובלסטיים, תאי לימפה ותאי אנדותל בדם. בהליך המתואר, עיכול קצר משולב עם פירוק מכני אוטומטי כדי למזער את פירוק סמני פני השטח של תאי סטרומה של בלוטות לימפה קיימות.

המטרה הכוללת של הליך זה היא לבודד תאי סטרומה של בלוטות הלימפה. זה מושג על ידי שיבוש ראשון של קפסולת בלוטות הלימפה. בשלב השני, שברי בלוטות הלימפה מתעכלים עם קולגנאז ארבע ו- D nase אחד.

לאחר מכן האנזימים מוחלפים בקולגנאז D ו-D nase אחד, והשברים מפורקים מכנית עם פיפטה רב-ערוצית אוטומטית. בסופו של דבר, ניתן לאפיין את ביטוי מולקולת פני התא של תאי בלוטות הלימפה המבודדות על ידי ציטומטריית זרימה. היתרון העיקרי של טכניקה זו על פני השיטה הקיימת הוא שבשיטה זו, תאי SHR של בלוטות הלימפה מתעכלים באמצעות הליך אנזימטי סטנדרטי המשלים פירוק מכני השומר על הכדאיות וביטוי מולקולות פני השטח של התאים.

התחל בהנחת בלוטות הלימפה המנותחות בצלחת פטרי סטרילית המכילה שני מיליליטר של מדיום קר כקרח. לאחר מכן השתמש בשני מזרקים של מיליליטר אחד המצוידים במחטים בגודל 25 כדי לשבש את כמוסות בלוטות הלימפה. לאחר מכן, העבירו את הרקמה המופרעת לצינור חרוטי של חמישה מיליליטר המכיל 750 מיקרוליטר של מדיום, בתוספת קולגנאז ארבע ו-DNA אחד וערבוב מגנטי.

לאחר מכן הניחו את הצינור בכוס המכילה מים שחוממו מראש ל-37 מעלות צלזיוס על מערבל מגנטי וערבבו את תמיסות התאים בסיבוב אחד לשנייה למשך 30 דקות. לאחר ערבוב, הניחו לשבר בלוטות הלימפה להתיישב ואז הסירו בזהירות את הסופרנטנט. כעת מועשר לתאים שאינם סטרומליים מעבירים לשברי בלוטות הלימפה 750 מיקרוליטר של מדיום טרי, בתוספת קולגנאז D ו-D nase אחד, ולאחר מכן מערבבים את הרקמה למשך חמש דקות נוספות ב-37 מעלות צלזיוס.

לאחר מכן, השתמש בפיפטה רב-ערוצית אוטומטית כדי לפרק את שברי רקמת בלוטות הלימפה בנפח של 700 מיקרוליטר למשך 10 מחזורים במהירות מקסימלית, ולאחר מכן ערבב שוב את שברי הרקמה לאחר 10 דקות. יתר על כן, פרקו את גושי הרקמה עם הפיפטה הרב-ערוצית האוטומטית למשך 99 מחזורים במהירות מקסימלית. לאחר מכן הוסף 7.5 מיקרוליטר של 0.5 EDTA מולרי לצינור וערבב את תרחיף הרקמות למשך 99 מחזורים נוספים עם הפיפטה האוטומטית.

לאחר מחזור הפירוק האחרון, הוסף 750 מיקרוליטר של מדיום לתמיסת התא וסנן את התאים דרך רשת ניילון של 70 מיקרומטר. לאחר מכן גלולה את התאים למשך חמש דקות ב-1500 גרם וארבע מעלות צלזיוס. כדי לדמיין אוכלוסיות תאי סטרומה של בלוטות הלימפה על ידי זרימה ציטומטרית, צבעו את דגימות התאים המתאימות עם גשש מת חי ואת הנוגדנים המעניינים ב-100 מיקרוליטר של HBSS המכילים 2% FCS למשך 20 דקות לפחות בארבע מעלות צלזיוס בחושך.

לאחר מכן שטפו את התאים ב -500 מיקרוליטר של HBSS עם FCS והשעו מחדש. הכדורים ב-100 מיקרוליטר של HBSS ו-FCS מריצים את התאים על ציטומטר זרימה שמגדיר את התאים החיוביים CD 45 כדי להוציא את התאים ההמטופויאטיים, ואז ללכת על אוכלוסיית הסינגלטים החיה. לבסוף, שרטוט GP 38 לעומת CD 31 כדי לדמיין את תאי הרשתית באזור T, תאי אנדותל לימפה, תאי אנדותל בדם ותאים שליליים כפולים.

אוכלוסיות תאים. מספר התאים הכולל שהתאושש לאחר העיכול של תת-קבוצות תאי הסטרומה של בלוטות הלימפה היה מעט גבוה יותר בפרוטוקול שהודגם זה עתה בהשוואה לפרוטוקולי הקישור ופלטשר, מה שמדגים כי הכדאיות של תאי הסטרומה של בלוטות הלימפה לאחר בידוד על ידי פרוטוקול זה דומה לזו שהתאוששה באמצעות פרוטוקולים שפורסמו. תאי רשתית באזור T ותאי אנדותל לימפטי שבודדו באמצעות זה ופרוטוקולי הקישור ופלטשר הושוו לביטוי IAB CD אחד 40 a CD 80, PD L אחד וביטוי CD 40.

הביטוי של כל חמש מולקולות פני השטח היה גבוה יותר עם העיכול עם הפרוטוקול שהודגם זה עתה ופרוטוקול הקישור עבור שתי תת-קבוצות תאי הסטרומה, מה שמצביע על כך שהפירוק של כמה מולקולות פני השטח על ידי קולגנאז ארבע ו-D הוא פחות חזק מאשר עם קולגנאז p וחלל DYS. לאחר צפייה בסרטון זה, אתה אמור להבין היטב כיצד לבודד בהצלחה את ארבע תת-האוכלוסייה העיקרית של תאי סטרומה של בלוטות הלימפה תוך שמירה על הביטוי של מספר מולקולות פני השטח שימושיות להמשך אפיונם וניתוחם.