ניתוח מהיר של סטיות כרומוזום בעכבר לימפוציטים מסוג B על ידי הרשות הפלסטינית-FISH

המטרה הכוללת של הניסוי הבא היא לכמת את חוסר היציבות הגנומית בלימפוציטים B של עכברים. זה מושג על ידי בידוד תאי B לתרבית תאים ראשונית. לאחר מכן, התאים מקובעים ומקלים על הכנת ממרחי המטאפאזה.

לבסוף, דגי טלומר PNA מבוצעים להדמיה של הטלומרים המסומנים בפלואורסצנט. בסופו של דבר, ניתן לכמת את הרמה של סוגים שונים של סטיות כרומוזומליות על ידי מיקרוסקופיה פלואורסצנטית. ההשלכות של טכניקה זו יכולות להרחיב את הבנתנו את מסלולי תיקון ה-DNA, מכיוון שהיא יכולה לסייע בזיהוי גנים המקדמים יציבות גנומית במודלים הממוקדים של העכברים שלנו.

למרות ששיטה זו יכולה לספק תובנה לגבי שברים כרומוזומיים וסידורים מחדש כרומוזומליים גדולים אחרים, ניתן להתאים אותה גם למדידת צורות אחרות של חוסר יציבות גנומית כגון טרנסלוקציות. כדי לבודד את תאי B, התחל בהנחת טחול מבודד טרי בצלחת תרבית רקמה בגודל 35 מילימטר המכילה שני מיליליטר של מאגר כביסה במכסה זרימה למינרית. לאחר מכן השתמש בקצה האחורי של הבוכנה ממזרק של חמישה מיליליטר כדי להשרות בעדינות את הטחול.

לאחר מכן, סנן את תמיסת הרקמות דרך מסננת רשת ניילון בגודל 70 מיקרומטר לתוך צינור של 50 מיליליטר באמצעות הבוכנה כדי ללחוץ בעדינות על פיסות הרקמה הגדולות יותר דרך המסננת. שוטפים את הצלחת והמזרק עם שמונה מיליליטר מאגר כביסה, ומסננים את הכביסה דרך המסננת. לאחר מכן לאחר סיבוב התאים, פיפטה את הכדור למעלה ולמטה כמה פעמים בשלושה מיליליטר של מאגר ליזה CK.

לאחר חמש דקות, עצרו את התגובה עם 10 מיליליטר מאגר כביסה. לאחר מכן לאחר סיבוב התאים שוב, הקש על תחתית הצינור כדי להשעות מחדש את הגלולה ולהוסיף מיליליטר אחד של מאגר כביסה לתאים. לאחר מכן, דגרו על התאים עם 50 מיקרוליטר של חרוזי מיקרו אנטי CD 43 מקסימום על קרח.

לאחר 30 דקות יש לשטוף בעדינות את התאים ב -10 מיליליטר מאגר כביסה. במהלך הצנטריפוגה הנח עמוד מינימקס על המגנט וצינור חרוטי מסומן של 15 מיליליטר מתחת לעמודה. לאחר מכן הוסף מיליליטר אחד של מאגר כביסה לעמודה, ואוסף את ה- EIT בצינור.

השעו מחדש את גלולת התא במיליליטר אחד של מאגר כביסה, ולאחר מכן טענו את התאים על העמודה לאחר שהדגימה עברה, שטפו את העמודה במיליליטר אחד של מאגר כביסה והוסיפו שבעה מיליליטר של מאגר כביסה ישירות לדגימה שנאספה. לאחר ספירת התאים שנאספו, העבירו אותם לצינור של 50 מיליליטר לצנטריפוגה. לאחר מכן, כדי להפעיל את תאי B, השעו מחדש את הגלולה בפעם אחת 10 מתוך ששת התאים למיליליטר במדיום תאי B משלים ודגרו על התאים בשש צלחות באר בחמישה מיליליטר תאים לבאר בחממת תרבית תאים לחה ב-37 מעלות צלזיוס ו-5% פחמן דו חמצני כדי לתקן את תאי B.

הבא ב -50 מיקרוליטר של smid לכל אחת מהבארות. לאחר דגירה של שעה ב-37 מעלות צלזיוס, העבירו את תאי B לצינור מסומן של 15 מיליליטר. מכסים את התווית בנייר דבק וסובבו את התאים.

לאחר מכן שאפו את כל הסופרנטנט מלבד מיליליטר אחד והשעו מחדש את הגלולה על ידי פיפטינג. הוסף חמישה מיליליטר של 37 מעלות צלזיוס, אשלגן כלורי, טיפה אחר טיפה תוך כדי פעימה על מערבולת. לאחר מכן מוסיפים 10 מיליליטר נוספים של אשלגן כלורי ומערבבים את תמיסת התא על ידי היפוך.

לאחר מכן, דגרו את התאים באמבט מים של 37 מעלות צלזיוס למשך 15 דקות. לאחר מכן מוסיפים שוב חמש טיפות של ערבוב מקבע טרי על ידי היפוך. לאחר מכן סובב את התאים לאחר החייאה, תלה את הגלולה במיליליטר אחד של סופרנטנט, הוסף חמישה מיליליטר של קיבוע טרי, טיפה אחר טיפה תוך כדי פעימה על מערבולת ודגירה על התאים ועוד 10 מיליליטר של קיבוע בטמפרטורת החדר.

לאחר 30 דקות, גלולה את התאים והסר את כל המיליליטר מלבד אחד של הקיבוע. ואז לאחר שטיפת התאים, פעמיים נוספות ב -15 מיליליטר של קיבוע, השעו מחדש את הגלולה ב -70 המיקרוליטר האחרונים של הסופרנטנט. כעת הניחו שקופיות מסומנות בזווית של 35 מעלות בתא לחות המוגדר ל-22.9 מעלות צלזיוס ו-52% לחות.

זרוק 35 מיקרוליטר מתאי B תלויים על כל שקופית, והכן שתי שקופיות לכל דגימה. לאחר מכן, לאחר שאפשרתם לשקופיות להתייבש בתא הלחות למשך 30 דקות, אחסן את השקופיות בקופסת שקופיות בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס עד לייבוש מלא. לאחר הייבוש, השתמש בעט יהלום כדי לסמן שטח של 18 על 18 מילימטר להכלאה בגב כל שקופית כדי לנטרל את המגלשות לדגים.

לאחר מכן, יש למרוח 120 מיקרוליטר של אמיד נטול יונים של 70% על החלקות כיסוי בגודל 24 מילימטר על 60 מילימטר, ולאחר מכן לגעת בכל שקופית בהחלקת כיסוי. דנטור את המגלשות על פלטה חמה של 80 מעלות צלזיוס למשך 90 שניות, ולאחר מכן החלק במהירות ובזהירות את החלקות הכיסוי וברצף. הנח את המגלשות בקור קרח 70, 90 ו-100% אתנול כל אחת למשך שלוש דקות לאחר שהשקופיות התייבשו, הנח את השקופיות בתא לח והחל תערובת בדיקה לפני הצורך על האזורים המסומנים במגלשות.

מכסים את תערובת הגשושית בהחלקת כיסוי בגודל 18 על 18 מילימטר ומדגרים את המגלשות בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך שעה. לאחר מכן שטפו את השקופיות בשני XSSC שהוזהרו מראש עם טלטול. לאחר חמש דקות, מרחו 35 מיקרוליטר של מדיום הרכבה מויאל על המגלשות.

מכסים את המדיום בהחלקות כיסוי בגודל 24 מילימטר על 60 מילימטר ומאחסנים את השקופיות בארבע מעלות צלזיוס. לבסוף, נתח את שקופיות המטאפאזה באמצעות מיקרוסקופ אפי פלואורסצנטי סטנדרטי. כרומוזומי מטפאזה שמקורם בתא עכבר אחד צריכים ליצור אשכול דיסקרטי המכיל 40 כרומוזומים.

לכל כרומוזום יש צנטרומר בקצה אחד, קרוב לשני אותות טלומרים, כמו גם שני אותות טלומרים נוספים בקצה השני של הכרומוזום. הפסקות כרומטידות הן הפסקות באחת משתי הכרומטידות האחיות המרכיבות כל כרומוזום מטפאזי. במקרים מסוימים, ניתן לראות את הקצה השבור של הכרומוזום כשבר עם אותות טלומרים באותה התפשטות מטאפאזה.

כרומוזומי רדיו הם סידורים מחדש מורכבים הכוללים שני כרומוזומים. כרומוזומים עשויים גם להצטרף ליצירת כרומוזומים דיצנטריים, המופיעים כהיתוך מקצה לקצה של כרומוזומים עם צנטרומרים בשני הקצוות. טרנסלוקציות רוברטסוניות הן סוג של טרנסלוקציה בין הצנטרומרים של שני כרומוזומים, המופיעים כארבע זרועות כרומט אחיות המחוברות לצנטרומר יחיד.

בתמונה אחרונה זו, מוצגת מטאפאזה שאין בה אותות טלומרים. היעדר אותות טלומרים יכול להתרחש משגיאות בהכנת הגשושית או מבועות אוויר מתחת להחלקת הכיסוי במהלך ההכלאה. בעקבות הליך זה, ניתן לבצע שיטות אחרות כמו ניתוח מחזור התא ומידע על המעי הגס כדי לענות על שאלות נוספות כמו האם אי יציבות גנומית מוגברת משפיעה על כדאיות התא.