Name: ניתוח מהיר של סטיות כרומוזום בעכבר לימפוציטים מסוג B על ידי הרשות הפלסטינית-FISH (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-08-19T16:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 54 s
Description: חקור שיטה לכימות אי-יציבות גנומית בלימפוציטים מסוג B בעכבר באמצעות הכנת מטאפאזות ו-FISH לזיהוי סטיות כרומוזומיות. שיטה זו מסייעת להבנת מסלולי תיקון DNA וזיהוי גנים המקדמים יציבות גנומית.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

עבודה זו נתמכה על ידי NIH המענק R00 CA160574 (SFB) ועל ידי מענק של תכנית רטגרס ביוטכנולוגיה ההדרכה (לSMM).

נוהל זה אושר על ידי הוועדה המוסדית הטיפול בבעלי חיים ושימוש באוניברסיטת רטגרס, אוניברסיטת ניו ג&#39;רזי המדינה. טופלו עכברים בהתאם למדריך NIH לטיפול והשימוש בחי מעבדה. מדענים צריכים להתייעץ ארגוני בעלי החיים הלאומיים ומוסדיים שלהם להנחיות שנקבעו ואושרו. לפני תחילת, להכין את הפתרונות מפורטים בטבלה 1. בידוד תא 1 B והפעלה להרדים עכבר באמצעות CO 2 ואחריו נקע בצוואר הרחם. מקם את העכבר כל כך בצד השמאל של הגוף הוא למעלה ולרסס את העכבר עם אתנול 70% עד הפרווה לחה. לנתח את הטחול ומניחים בצלחת תרבית רקמת 35 מ&quot;מ עם חיץ לשטוף 2 מ&quot;ל. בזרימה למינרית, בעדינות לשבור את הטחול בצלחת תרבית רקמה באמצעות הקצה השטוח של מזרק 5 מ&quot;ל. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכנס רשת ניילון 70 מיקרומטר ל50צינור מ&quot;ל ולהעביר את דגימת הטחול ב2 מ&quot;ל חיץ לשטוף לרשת הניילון. בעדינות לשבש את הטחול ברשת באמצעות הקצה השטוח של המזרק. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> יש לשטוף את הגב של המזרק וצלחת 35 מ&quot;מ עם 8 מ&quot;ל של חיץ לשטוף ולסנן דרך רשת ניילון 70 מיקרומטר. צנטריפוגה XG 300 10 דקות ב 4 ° C.. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשאוב ולזרוק supernatant וresuspend גלולה ב 3 מ&quot;ל של חיץ תמוגה ACK. פיפטה למעלה ולמטה לזמן קצר לשבש גושים ודגירה של 5 דקות. הוסף 10 מ&quot;ל של חיץ לשטוף ו צנטריפוגות ב XG 300 10 דקות ב 4 ° C.. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשאוב ולזרוק supernatant ו resuspend את הכדור על ידי הקשה על החלק התחתון של הצינור ולאחר מכן על ידי pipetting ב 1 מ&quot;ל של חיץ לשטוף. הוסף 50 μl של מיקרו חרוזים אנטי CD43 MACS ולדגור על קרח למשך 30 דקות. הוסף 10 מ&quot;ל של חיץ לשטוף, מערבב בעדינות, וצנטריפוגות ב XG 300 10 דקות ב 4 ° C.. הוסף 10 מ&quot;ל של חיץ לשטוף, מערבב בעדינות, וצנטריפוגות ב XG 300 10 דקות ב 4 ° C.. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הגדר אתMini-MACS טור על ידי הצבת עמודה על מגנט MACS. מקם צינור חרוטי 15 מ&quot;ל שכותרת מתחת לעמודה. הוסף 1 מ&quot;ל של חיץ לשטוף לעמודה ולאפשר לרוץ דרך צינור 15 מ&quot;ל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשאוב supernatant וגלול ב 1 מ&quot;ל של חיץ לשטוף. טען את המדגם בעמודה לאחר לשטוף החיץ יש להפעיל דרך. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אחרי המדגם לרוץ דרך העמודה, להוסיף למאגר לשטוף 1 מ&quot;ל לשטוף את העמודה. הוסף 7 מ&quot;ל של חיץ לשטוף ישירות למדגם שנאסף בצינור 15 מ&quot;ל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ספירת התאים באמצעות hemocytometer. העבר את הנפח הנדרש של תאים דרושים ל5,000,000 תאים / היטב לתוך צינור 50 מ&quot;ל. צנטריפוגה XG 300 10 דקות ב 4 ° C.. בינוני תא B מוסף עם 1 LPS: 500 וIL4 1: 1,000. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשאוב supernatant ולהוסיף הנפח המתאים של מדיום תא B בתוספת הדרושה לריכוז סופי של 1,000,000 תאים / מ&quot;ל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פלייט תאים ב6 צלחות גם עם 5 מ&quot;ל של תאים ב1,000,000 תא / מ&quot;ל ​​והמקום בhumidifiתרבית תאי חממת ed על 37 מעלות צלזיוס, 5% CO 2. </li></ol> קיבוע תא .2 B <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 50 μl של colcemid לC גם מכיל 5 מ&quot;ל של תאי B (לריכוז סופי של 100 ng / ml) ו דגירה שעה 1 ב37 מעלות. 75 פתרון מ&quot;מ KCl Prewarm באמבט מים 37 מעלות צלזיוס. העבר את תאי B לצינור 15 מ&quot;ל שכותרת. כסה את התווית עם קלטת ו צנטריפוגות ב XG 300 10 דקות ב 4 ° C.. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשאוב supernatant עוזב 1 מ&quot;ל בצינור וresuspend גלולה ידי pipetting. הוסף 5 מ&quot;ל של ירידת KCl prewarmed על ידי ירידה בזמן הקשה או פועם במערבולת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 10 מ&quot;ל של KCl ומערבבים על ידי היפוך. דגירה באמבט מים 37 מעלות צלזיוס במשך 15 דקות. הוסף 5 טיפות של מקבע ותערובת טריות על ידי היפוך. צנטריפוגה XG 300 10 דקות ב 4 ° C.. לשאוב supernatant עוזב 1 מ&quot;ל בצינור וresuspend גלולה ידי pipetting למעלה ולמטה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 5 מ&quot;ל של טיפה מקבע טרי על ידי ירידה בזמן הקשה או פועם בvorטקס. הוספה נוסף 10 מ&quot;ל של מקבע ודגירת 30 דקות בטמפרטורת חדר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צנטריפוגה XG 300 10 דקות ב 4 ° C.. לשאוב supernatant עוזב 1 מ&quot;ל בצינור וגלול על ידי pipetting. הוספת 14 מ&quot;ל של מקבע ו צנטריפוגות הטריים XG 300 10 דקות ב 4 ° C.. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חזור על שלב 2.7 עוד פעמיים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוספת 14 מ&quot;ל של מקבע טרי. חותם את הכובעים עם Parafilm ולאחסן לילה בשעה -20 מעלות צלזיוס. </li></ol> .3 הכנת ממרחי כרומוזום Metaphase <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להגדיר תא סביבתי מוסדר ל22.9 ° C ו52% לחות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צנטריפוגה קבועה תאי B XG 300 10 דקות ב 4 ° C.. לשאוב מקבע עוזב 70 μl בצינור והגלול על ידי pipetting. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הנח שקופיות שכותרתו בתא לחות בזווית 35 °. זרוק 35 μl של תאי B resuspended לשקופית ושחרר שתי שקופיות לדגימה. אפשר השקופיות לייבוש בתא לחות למשך 30 דקות לאחר מכן לאחסן את השקופיותבתיבת שקופיות על 37 C °. </li></ol> FISH .4 הטלומרים הרשות הפלסטינית <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכנת Probe <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פוראמיד deionized טרום חם ל37 מעלות צלזיוס. לערבב 2 μl של בדיקה הרשות הפלסטינית הטלומרים עם פוראמיד מראש חימם 7 μl deionized ולדגור על 37 ° C עם רעד במשך שעה 1. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תערובת אב FISH טרום חמה ל37 מעלות צלזיוס. להוסיף 7 μl תערובת אב FISH מראש חיממה לתערובת משלב 4.1.1 ולדגור על 37 מעלות צלזיוס למשך 1-3 שעות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לפגל תערובת הבדיקה במשך 8 דקות על 80 מעלות צלזיוס. טרום לחשל את החללית לשעה 1 ב37 מעלות צלזיוס. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> טיפול מקדים של שקופיות כרומוזום <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> טרום חם צנצנת שקופית מכתימה זכוכית המכילה 50 מ&quot;ל של 0.01 M HCl ל37 מעלות צלזיוס באמבט מים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מגלשות מקום בצנצנת שקופית מכתימה זכוכית שונה המכילה 2x SSC למשך 5 דקות בטמפרטורת חדר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 2 μl של מניית פפסין לצנצנת שקופית המכתימה הזכוכית מחוממת מראש ומערבבים על ידי היפוך. העברת שקופיות sl זכוכית זהצנצנת ide-מכתים ודגירה 90 שניות על 37 מעלות צלזיוס. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שטוף את השקופיות 2x בצנצנת שקופית מכתימה זכוכית שונה המכילה 1x PBS במשך 5 דקות כל אחד בטמפרטורת חדר, רועדת. לאחר מכן לשטוף את השקופיות עבור 5 דקות ב1x PBS / MgCl 2 בטמפרטורת חדר, רועד. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העברת השקופיות לצנצנת שקופית מכתימה זכוכית המכילה פורמלדהיד 1% המוכנים טרי / 1x PBS / MgCl 2 ל10 דקות בטמפרטורת חדר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שטוף את השקופיות עבור 5 דקות בצנצנת שקופית מכתימה זכוכית שונה המכילה 1x PBS בטמפרטורת חדר, רועד. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן סדרת התייבשות אתנול על ידי בעל צנצנות שקופית מכתימה זכוכית נפרדת המכילות 70%, 90%, ו100% אתנול. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העברת השקופיות לכל צנצנת במשך 3 דקות, מתחילה עם 70% אתנול, ולאחר מכן 90% אתנול, ולאחר מכן 100% אתנול. מניחים צנצנות אתנול ב -20 מעלות צלזיוס, כאשר סיימו. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אפשר שקופיות לייבוש באוויר על ידי הקשה אתנול עודף על מגבת נייר והשעין שקופיות בזווית 35 °. ברגע שיבש, maRK אזור 18 x 18 מ&quot;מ להכלאה על הגב של השקופיות באמצעות עט יהלומים. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Denaturation של שקופיות לדגים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> החל פוראמיד 120 μl 70% deionized / 2X SSC לcoverslip 24 x 60 מ&quot;מ. לגעת בשקופיות לcoverslip. לפגל שקופיות על 80 מעלות צלזיוס על פלטה חשמלית ל90 שניות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> במהירות ובזהירות להחליק את coverslip ולמקם את השקופית באתנול 70% קרים כקרח במשך 3 דקות, ואחריו 90% אתנול, ו100 אתנול% כל אחד במשך 3 דקות. אפשר שקופיות לייבוש באוויר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן תא לח על ידי המצפה קופסא פלסטיק עם מכסה הדוק ונייר טישו רטוב. הנייר צריך להיות לח, אבל לא רווי במים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בתא לח, להחיל את תערובת בדיקה-מרותק מראש מצעד 4.1.3 לאזור המסומן בשקופית, מכסה בכיסוי מ&quot;מ תלוש 18 x 18 ולדגור על 37 מעלות צלזיוס במשך שעה 1. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> רוחצת הודעה דגירה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פוראמיד 50% טרום חם / 2x SSC, 1x SSC, ו4x SSC / 0.1% Tween-20 ב45 °; C אמבט מים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מוציא בזהירות את coverslips ולשטוף את השקופיות ב50% פוראמיד דקות 3xfor 5 / 2x SSC מראש חימם כל אחד בחושך ורועד. שטוף את השקופיות בSSC 1x מראש חימם 3xfor 5 דקות כל אחד, רועדים. לבסוף, לשטוף את השקופיות במחוממים מראש 4x SSC / 0.1% דקות Tween-20 3xfor 5 כל אחד. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כתם השקופיות עבור 3 דקות בDAPI בצנצנת שקופית מכתימה זכוכית אור מוגנת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שטוף את השקופיות עבור 5 דקות ב2x SSC, רועדים. החל 35 μl של הרכבה בינונית Mowiol, מכסה ב24 x 60 coverslips מ&quot;מ ולאחסן את השקופיות ב 4 ° C.. </li></ol></li></ol> .5 ניתוח מיקרוסקופי של כרומוזומים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לנתח את שקופיות metaphase באמצעות מיקרוסקופ עלית הקרינה סטנדרטי. השתמש בפלטפורמת הדמיה עם שלב אוטומטי כגון פלטפורמת MetaSystems Metafer כדי להשיג תוצאות הטובות ביותר. לכל התפשטות metaphase, לאסוף תמונה אחת לקרינת DAPI לדמיין כרומוזומים, ותמונה אחת לאות הניאון מp הטלומריםגלימה. (לדוגמא, fluors האחר Cy3- זמין ולעבוד באותה מידה גם.) </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כיסוי התמונות עם תכנית ניתוח תמונה ולנתח. </li></ol>

<ol><li>Sancar, A., Lindsey-Boltz, L. A., Unsal-Kacmaz, K., Linn, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+mechanisms+of+mammalian+DNA+repair+and+the+DNA+damage+checkpoints%5BTitle%5D)+AND+%22Ann+Rev+Biochem%22%5BJournal%5D)">Molecular mechanisms of mammalian DNA repair and the DNA damage checkpoints.</a> Ann Rev Biochem. 73, 39-85 (2004).</li>
<li>Sperka, T., Wang, J., Rudolph, K. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA+damage+checkpoints+in+stem+cells%2C+ageing+and+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+reviews+Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">DNA damage checkpoints in stem cells, ageing and cancer.</a> Nature reviews Mol Cell Biol. 13 (9), 579-590 (2012).</li>
<li>Alexandrov, L. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Signatures+of+mutational+processes+in+human+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Signatures of mutational processes in human cancer.</a> Nature. 500 (7463), 415-421 (2013).</li>
<li>Bunting, S. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((53BP1+inhibits+homologous+recombination+in+Brca1-deficient+cells+by+blocking+resection+of+DNA+breaks%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">53BP1 inhibits homologous recombination in Brca1-deficient cells by blocking resection of DNA breaks.</a> Cell. 141 (2), 243-254 (2010).</li>
<li>Padilla-Nash, H. M., Barenboim-Stapleton, L., Difilippantonio, M. J., Ried, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spectral+karyotyping+analysis+of+human+and+mouse+chromosomes%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Spectral karyotyping analysis of human and mouse chromosomes.</a> Nat Protoc. 1 (6), 3129-3142 (2006).</li>
<li>Callen, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chimeric+IgH-TCRalpha%2Fdelta+translocations+in+T+lymphocytes+mediated+by+RAG%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Cycle%22%5BJournal%5D)">Chimeric IgH-TCRalpha/delta translocations in T lymphocytes mediated by RAG.</a> Cell Cycle. 8 (15), 2408-2412 (2009).</li>
<li>Boboila, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Alternative+end-joining+catalyzes+robust+IgH+locus+deletions+and+translocations+in+the+combined+absence+of+ligase+4+and+Ku70%5BTitle%5D)+AND+%22Natl+Acad+Sci+USA%22%5BJournal%5D)">Alternative end-joining catalyzes robust IgH locus deletions and translocations in the combined absence of ligase 4 and Ku70.</a> Natl Acad Sci USA. 107 (7), 3034-3039 (2010).</li>
<li>Benn, P., Delach, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+lymphocyte+culture+and+chromosome+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harb+Protoc%22%5BJournal%5D)">Human lymphocyte culture and chromosome analysis.</a> Cold Spring Harb Protoc. 2008, (2008).</li>
<li>Nguyen, H. N., Reijo Pera, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Metaphase+spreads+and+spectral+karyotyping+of+human+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harb+Protoc%22%5BJournal%5D)">Metaphase spreads and spectral karyotyping of human embryonic stem cells.</a> Cold Spring Harb Protoc. 2008, (2008).</li>
<li>Schreck, R. R., Disteche, C. M. Chapter 4. Chromosome banding techniques. Unit 2, Curr Protoc Hum Genet. (2001).</li>
<li>Gilley, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA-PKcs+is+critical+for+telomere+capping%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+USA%22%5BJournal%5D)">DNA-PKcs is critical for telomere capping.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 98 (26), 15084-15088 (2001).</li>
<li>Bolzan, A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chromosomal+aberrations+involving+telomeres+and+interstitial+telomeric+sequences%5BTitle%5D)+AND+%22Mutagenesis%22%5BJournal%5D)">Chromosomal aberrations involving telomeres and interstitial telomeric sequences.</a> Mutagenesis. 27 (1), 1-15 (2012).</li>
<li>Bolzan, A. D., Telomeres Bianchi, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((interstitial+telomeric+repeat+sequences+and+chromosomal+aberrations%5BTitle%5D)+AND+%22Mutat+Res%22%5BJournal%5D)">interstitial telomeric repeat sequences and chromosomal aberrations.</a> Mutat Res. 612 (3), 189-214 (2006).</li>
<li>Poon, S. S., Lansdorp, P. M. Chapter 18. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aPoon%2C+SS+%22Quantitative+fluorescence+in+situ+hybridization+%28Q-FISH%29%22">Quantitative fluorescence in situ hybridization (Q-FISH)</a>. Unit 18 14, Curr Protoc Cell Biol. (2001).</li>
<li>Morales, J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((53BP1+and+p53+synergize+to+suppress+genomic+instability+and+lymphomagenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+USA%22%5BJournal%5D)">53BP1 and p53 synergize to suppress genomic instability and lymphomagenesis.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 103 (9), 3310-3315 (2006).</li>
<li>Halaby, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synergistic+interaction+of+Rnf8+and+p53+in+the+protection+against+genomic+instability+and+tumorigenesis%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Genet%22%5BJournal%5D)">Synergistic interaction of Rnf8 and p53 in the protection against genomic instability and tumorigenesis.</a> PLoS Genet. 9 (1), e1003259(2013).</li>
</ol>

אי לנו אינטרסים מנוגדים.

ואילו לימפוציטים מסוג B מופעלים מתאימים במיוחד להכנת ממרחי כרומוזום mitotic, יכולים לשמש גם סוגי תאים אחרים. לימפוציטים מסוג T חולקים הרבה מהיתרונות של תאי B, כפי שהם יכולים להיות מטוהרים מבלוטות הטחול או לימפה, ויש לי מדד גבוה המיטוטי כאשר מגורה על ידי צמיחה במדיום המכיל mitogens המתאימה 8. תאי גזע עובריים (תאי גזע עובריים) מתאימים גם לכרומוזום metaphase ניתוח 9. אם אלה אינם זמינים, ניתן להשתמש בתאים פיברובלסטים, למרות שטיפול ארוך יותר עם ​​colcemid (למש...

A correction was made to: Rapid Analysis of Chromosome Aberrations in Mouse B Lymphocytes by PNA-FISH.&#160;Table 1 (the list of solutions to prepare) was omitted from the Protocol section. The contents of Table 1 are as follows:
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Solution</td>
			<td>Reagents</td>
			<td>Comments</td>
			<td>Storage</td>
		</tr>
		<tr>
			<td rowspan="3">B Cell Wash Buffer</td>
			<td>500 ml 1x Hanks Balanced Salt Solution</td>
			<td rowspan="3">Filter through 0.22 &#956;m stericup filtration unit</td>
			<td rowspan="3">4 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5 ml 50 &#176;C heat inactivated FCS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5 ml 100x Pen/Strep</td>
		</tr>
		<tr>
			<td rowspan="8">B Cell Medium</td>
			<td>418.5 ml RPMI-1640</td>
			<td rowspan="8">Filter through 0.22 &#956;m stericup filtration unit</td>
			<td rowspan="8">4 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 ml 50 &#176;C heat inactivated FCS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5 ml 100x Pen/Strep</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5 ml glutamine</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5 ml nonessential amino acids</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5 ml sodium pyruvate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.8 ml 14.2 M 2-mercaptoethanol</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5 ml 1M HEPES</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fixative</td>
			<td>3:1 v/v methanol/glacial acetic acid</td>
			<td></td>
			<td>Make fresh</td>
		</tr>
		<tr>
			<td rowspan="2">0.075 M KCl</td>
			<td>1.395 g KCl</td>
			<td rowspan="2"></td>
			<td rowspan="2">Room Temperature</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>250 ml distilled H2O</td>
		</tr>
		<tr>
			<td rowspan="3">FISH Master Mix</td>
			<td>40 ml 50% Dextran sulfate</td>
			<td rowspan="3">Vortex the solution and leave in a shaking platform overnight</td>
			<td rowspan="3">Aliquot and store at -20 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>20 ml 20x SSC</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>40 ml sterile distilled H2O</td>
		</tr>
		<tr>
			<td rowspan="3">70% Formamide/2x SSC</td>
			<td>10 ml 20x SSC</td>
			<td rowspan="3">Adjust to pH 7 with 1M HCl</td>
			<td rowspan="3">Aliquot and store at -20 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>20 ml distilled H2O</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>70 ml deionized formamide</td>
		</tr>
		<tr>
			<td rowspan="2">0.01 M HCl</td>
			<td>1 ml 1M HCl</td>
			<td rowspan="2">Adjust to pH 2.0</td>
			<td rowspan="2">Room Temperature</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>99 ml distilled H2O</td>
		</tr>
		<tr>
			<td rowspan="2">1x PBS/MgCl2</td>
			<td>50 ml 1M MgCl2</td>
			<td rowspan="2"></td>
			<td rowspan="2">Room Temperature</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>950 ml 1x PBS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td rowspan="3">50% Formamide/2x SSC</td>
			<td>20 ml 20x SSC</td>
			<td rowspan="3">Adjust to pH 7.25 
			Formamide used in this step does not have to be deionized.</td>
			<td rowspan="3">Make fresh</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>80 ml distilled H2O</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100 ml formamide</td>
		</tr>
		<tr>
			<td rowspan="3">4x SSC/0.1% Tween20</td>
			<td>50 ml 20x SSC</td>
			<td rowspan="3"></td>
			<td rowspan="3">Room Temperature</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>200 ml distilled H2O</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>250 &#956;l Tween20</td>
		</tr>
		<tr>
			<td rowspan="2">DAPI staining solution (80 ng/ml)</td>
			<td>40 &#956;l 0.2mg/ml DAPI stock</td>
			<td rowspan="2"></td>
			<td rowspan="2">4 &#176;C in light protected staining jar</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100 ml 2x SSC</td>
		</tr>
		<tr>
			<td rowspan="5">Mowiol Mounting Medium</td>
			<td>6 g glycerol</td>
			<td rowspan="5">Incubate at 50 &#176;C with stirring for 2hrs</td>
			<td rowspan="5">Aliquot and store at 4 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2.4 g Mowiol 4-88</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6 ml distilled H2O</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>12 ml 0.2 M TrisCl pH 8.5</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>230 &#956;l 1% Thimerosal (w/v in water)</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
Table 1. List of solutions.&#160;

A correction was made to: Rapid Analysis of Chromosome Aberrations in Mouse B Lymphocytes by PNA-FISH.

Erratum: Rapid Analysis of Chromosome Aberrations in Mouse B Lymphocytes by PNA-FISH

הסרטן נגרמים על ידי ההצטברות של מוטציות המשפיעות על גנים המווסתים את גדילת תאים נורמלית. מוטציה היא תוצאה של שינויים במבנה וברצף של הגנום שנגרם נזק לדנ&quot;א. נזק לדנ&quot;א יכול להתרחש באמצעות מגוון רחב של תהליך, כולל סוכנים אקסוגניים כגון קרינה מייננת, וכתוצר לוואי של חילוף חומרים בתאים נורמלים, כגון deamination הספונטני של בסיסי נוקלאוטיד או נזק המתרחשים על ידי מגע עם מיני חמצן תגובתי 1. למרות שתאי יונקים יש מגוון של פעילויות תיקון שיכול להפוך נזק לדנ&quot;א או לשחזר את הרצף באתרי הפסקה, מוטציות בכל זאת לצבור לכל אורך חייו של תא. נזק לדנ&quot;א יכול יתר על כן תורם להזדקנות ואובדן העוצמה של תאי גזע, שני תהליכים הקשורים למחלות הקשורות להזדקנות 2. הבנת התיקון של נזק לדנ&quot;א לכן חשיבות מרכזית בהתמודדות שני סימןנושאי ificant בבריאות הציבור. ראיות מצביעות על כך שהגדלת מסלולי תיקון דנ&quot;א של יונקים יכולים לתרום להתפתחות של הגנום של התאים הסרטניים 3,4, מה שהופך את זה אפילו יותר הכרחי כדי להבין את התהליכים מעורבים בדיכוי מוטציה ברמה המולקולרית. להדמיה ישירה של סטיות כרומוזום היא אמצעי רב עוצמה וכמותי של קביעת ההיקף של חוסר יציבות גנומית בסוג תא מסוים. כרומוזומים תמצית מהתאים בmetaphase יכולים להיות מבודדים ובדקו באמצעות אור או מיקרוסקופ פלואורסצנטי. גישות ציטוגנטית כאלה כבר בפועל במשך כמה עשורים וניתן להשתמש בו כדי להדגים את המראה של טרנסלוקציות או סוגים מסוימים של סטיות כרומוזום קשורות לאובדן של פעילות תיקון DNA. הפרוטוקול משאיל את עצמו לכמה סיומות אפשריות: יכולים להיות מתויג כרומוזומים עם בדיקות לkaryotyping רפאים (SKY) או ניאון ססגוניות הכלאה באתר(MFISH) לזהות טרנסלוקציות 5,6. טכניקות אלו מאפשרות גם את התדירות של טרנסלוקציות כרומוזום והמבנה של טרנסלוקציות כרומוזום המורכבת שייקבע, אשר מספק מידע נוסף מעבר למה שאפשרי עם פרוטוקול זה. לחלופין, יכולות להיות שנוצרו בדיקות רצף ספציפי ומשמשות לבדיקת התדירות של שבירת הדנ&quot;א באתרים הגנומי נבחרו 7. בפרוטוקול זה, אנו מתארים הכנה של כרומוזום metaphase מתפשטת מלימפוציטים מסוג B. בדיקה פפטיד fluorescently שכותרתו חומצות גרעין (PNA) לחזרות telomeric משמשת, אשר יעילות מסמנת הטלומרים בכרומוזום metaphase מתפשט פרוטוקול זה יש מספר יתרונות. יכולים להיגרם תאי B לצמוח במדד המיטוטי גבוה, כך שאופן עקבי ניתן להפיק מרווחים גבוהה באיכות. תאי B מעכברים גנטי שונה הם הרבה פחות סביר שיכילו מוטציות גנטיות משניים שיכול לבלבל את הניתוח של התרומה גםשל גנים ספציפיים לשלמות הגנום. גישת PNA-FISH ניתן להשלים ביום אחד, ומאפשרת ניקוד מדויק יותר של הפסקות כרומוזום. על ידי שימוש בגישה זו, במיוחד בשילוב עם ציוד ספציפי שתואר בפרוטוקול זה, ניתן לייצר מרווחים מאוד עקביים, באיכות גבוהה ובמהירות לנתח את השיעור והסוג של חוסר יציבות גנומית.

<table><tbody><tr><td>50% דקסטרן סולפט</td><td>אינטרגן</td><td>S4030</td><td></td></tr><tr><td>פורממיד נטול יונים</td><td>אמביון</td><td>9342</td><td></td></tr><tr><td>פפסין (5 גרם)</td><td>סיגמא</td><td>P 6887&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>FCS</td><td>Gemini</td><td>100-106</td><td></td></tr><tr><td>LPS (100 מ"ג)</td><td>Sigma</td><td>L2630</td><td></td></tr><tr><td>IL-4 (5 &mu; ז)</td> <td>סיגמא</td><td>I1020</td><td></td></tr><tr><td>PNA טלומר בדיקה</td><td>PNA Bio Inc</td><td>F1002</td> <td>(CCCTAACCCTAACCCTAA)</td></tr><tr><td>Colcemid</td><td>Roche</td><td>295892</td><td></td></tr><tr><td>Mowiol 4-88</td><td>Sigma</td><td>81381-50g</td><td></td></tr><tr><td>CD43 (ly-48_) מיקרו-חרוזים</td><td>Miltenyl Biotec.</td><td>130-049-801</td><td></td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Sigma</td><td>32670-5MG</td><td></td></tr><tr><td>Eclipse E800</td><td>Nikon</td><td></td><td></td></tr><tr><td>AxioImager.Z2</td><td>Zeiss</td><td></td><td></td></tr><tr><td>CDS-5 תא ייבוש ציטוגנטי</td><td>תרמוטרון</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

ניתוח מהיר של סטיות כרומוזום בעכבר לימפוציטים מסוג b על ידי הרשות הפלסטינית-fish

Rapid Analysis of Chromosome Aberrations in Mouse B Lymphocytes by PNA-FISH

תיקון DNA פגום מוביל לחוסר יציבות גנומית מוגבר, המהווה את סיבת השורש של מוטציות המובילות ליצירת גידולים. ניתוח של התדירות והסוג של סטיות כרומוזום בתאים מסוגים שונים מאפשר פגמים במסלולי תיקון DNA לא הובהרו. ביולוגיה תיקון דנ&quot;א של יונקים הבנה כבר סייעה רב בייצור של עכברים עם knockouts בגנים מסוימים. המטרה של פרוטוקול זה היא לכמת חוסר יציבות גנומית בB עכבר לימפוציטים. תיוג של הטלומרים באמצעות בדיקות PNA-FISH (חומצות גרעין פפטיד - ניאון הכלאה באתר) מאפשר ניתוח המהיר של חוסר יציבות גנומית במרווחי כרומוזום metaphase. יש לי תאי B יתרונות ספציפיים ביחס לפיברובלסטים, כי יש להם ploidy נורמלי ומדד המיטוטי גבוה יותר. תרבות לזמן הקצר של תאי B ולכן מאפשרת מדידה מדויקת של חוסר יציבות גנומית באוכלוסיית תא ראשונית שעשויה להיות מוטציה גנטית משנית פחותים יותר ממה שהוא נמצא בדרך כלל בfibroblasts הפך או שורות תאי חולה.

כרומוזומים Metaphase נגזרים מתא אחד צריכים ליצור אשכול דיסקרטי המכיל 40 הכרומוזומים (אם שימוש בתאי עכבר) (איור 1 א). לכל כרומוזום centromere בקצה אחד, שהוא נראה כמו כדור אור כחול. בכרומוזומים רגילים, שני אותות הטלומרים נראים בסוף chromatids ושני אותות על ידי כל אחד centromere. גרעיני שלבי ביניים יהיו נוכחים בשקופית גם כן. אלה יופיעו כתחומים כחולים, עם אותות הטלומרים אדומים, אבל אין כרומוזומים תמצית (ראה למשל איור 1). גרעיני הביניים ניתן להתעלם ממנ...

מסלולי תיקון DNA חיוניים לתחזוקה של שלמות הגנום ומוטצית מניעה וסרטן. המטרה של פרוטוקול זה היא לכמת חוסר יציבות גנומית על ידי תצפית ישירה של סטיות כרומוזום בmetaphase מתפשט מתאי B עכבר באמצעות ניאון הכלאה באתר (FISH) לחזרות דנ&quot;א telomeric.

ניתוח מהיר של סטיות כרומוזום בעכבר לימפוציטים מסוג B על ידי הרשות הפלסטינית-FISH

Defective DNA repair leads to increased genomic instability, which is the root cause of mutations that lead to tumorigenesis. Analysis of the frequency ...

המטרה הכוללת של הניסוי הבא היא לכמת את חוסר היציבות הגנומית בלימפוציטים B של עכברים. זה מושג על ידי בידוד תאי B לתרבית תאים ראשונית. לאחר מכן, התאים מקובעים ומקלים על הכנת ממרחי המטאפאזה.לבסוף, דגי טלומר PNA מבוצעים להדמיה של הטלומרים המסומנים בפלואורסצנט. בסופו של דבר, ניתן לכמת את הרמה של סוגים שונים של סטיות כרומוזומליות על ידי מיקרוסקופיה פלואורסצנטית. ההשלכות של טכניקה זו יכולות להרחיב את הבנתנו את מסלולי תיקון ה-DNA, מכיוון שהיא יכולה לסייע בזיהוי גנים המקדמים יציבות גנומית במודלים הממוקדים של העכברים שלנו.למרות ששיטה זו יכולה לספק תובנה לגבי שברים כרומוזומיים וסידורים מחדש כרומוזומליים גדולים אחרים, ניתן להתאים אותה גם למדידת צורות אחרות של חוסר יציבות גנומית כגון טרנסלוקציות. כדי לבודד את תאי B, התחל בהנחת טחול מבודד טרי בצלחת תרבית רקמה בגודל 35 מילימטר המכילה שני מיליליטר של מאגר כביסה במכסה זרימה למינרית. לאחר מכן השתמש בקצה האחורי של הבוכנה ממזרק של חמישה מיליליטר כדי להשרות בעדינות את הטחול.לאחר מכן, סנן את תמיסת הרקמות דרך מסננת רשת ניילון בגודל 70 מיקרומטר לתוך צינור של 50 מיליליטר באמצעות הבוכנה כדי ללחוץ בעדינות על פיסות הרקמה הגדולות יותר דרך המסננת. שוטפים את הצלחת והמזרק עם שמונה מיליליטר מאגר כביסה, ומסננים את הכביסה דרך המסננת. לאחר מכן לאחר סיבוב התאים, פיפטה

rapid-analysis-chromosome-aberrations-mouse-b-lymphocytes-pna

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

אימונולוגיה וזיהומים

מאמר זה מתאר את הבחירה של בדיקות מתאים FISH מתא בודד, טכניקות הפצת עבור גרעינים blastomere, וב הכלאה באתרו ניקוד האות, להחיל אבחון גנטי טרום השרשה (PGD) בסביבה קלינית.

FISH לאבחון גנטי טרום השרשה

Chromosomics: איתור של שינוי המספרי מבני 24 כרומוזומים כל אדם בו זמנית באמצעות Assay רומן דגים OctoChrome

יכולים להיות מבודדים הכרומוזומים מתאי חיים כגון לימפוציטים או fibroblasts עור, ומאורגניזמים כולל בני אדם או עכברים. הכנות כרומוזום אלה יכולים להיות מנוצלים נוספים עבור ה-G-פסים שיגרתי ונהלים ציטוגנטית מולקולריים כגון הקרינה הכלאה באתרו (FISH), הכלאה השוואתית גנומית (CGH), וkaryotyping ספקטרלי (SKY).

הכנת כרומוזום מתאים בתרבית

ניאון הכלאה באתרו (FISH) מאפשר זיהוי של חומצות גרעין בסביבה הטבעית שלהם בתוך תאים. אנחנו כאן מתארים פרוטוקול לזיהוי המשולב, בו זמני של RNA ו-DNA בדרך של דגים, אשר יכול לשמש כדי לחקור איון כרומוזום X בתאי גזע עובריים בעכבר.

DNA-RNA בשילוב פלורסנט<em&gt; באתרו</em&gt; הכלאה (דגים) לחקר איון כרומוזום X בתאי גזע הבדיל נקבה עכבר עוברי

פרוטוקול זה מתאר שיטות כימות ואפיון של סטיות כרומוזומליות במבחנה מקרופאגים העכבר RAW264.7 לאחר הטיפול עם חומר חלקיקי באוויר הסביבה.

ניתוח של סטיות כרומוזומליות Matter הנגרמת חלקיקי אמביינט שימוש<em&gt; במבחנה</em&gt; מערכת

הפרוטוקול הנוכחי מתאר את התועלת של הכלאה פלואורסצנטית מרובה באתרה (mFISH) וקריוטיפ ספקטרלי (SKY) בזיהוי סטיות יציבות בין-כרומוזומליות בתאי מח העצם של עכברים לאחר חשיפה לקרינה כוללת של הגוף.

איתור של סטיות יציבות אינטר-כרומוזומליות ידי קרינה נפוצה<em&gt; באתרו</em&gt; הכלאה (mFISH) ו ספקטרלית Karyotyping (SKY) בעכברים מוקרנים

מטרת טכניקה זו סקווש צנורית הוא להעריך במהירות תכונות cytological של פיתוח העכבר spermatocytes תוך שמירה על תקינות הסלולר. שיטה זו מאפשרת הלימוד בכל שלבי יצירת זרע, ניתן ליישם בקלות לצד הביוכימי והמולקולרי ביולוגי גישות אחרות לצורך המחקר של העכבר מיוזה.

טכניקה סקווש צנורית וכמה לניתוח Cytological של יצירת זרע שימוש במודל עכבר

כפולות משטח גרעיני הם כלי הכרחי עבור לימוד אירועי כרומוזום במהלך meiosis. כאן אנו מדגימים שיטה כדי להכין ולדמיין כרומוזומים מיוטיים במהלך prophase הייתי מתוך הדגים הספרציטים.

הכנת כרומוזום מיוסטי כפולות מדגים בזימטציטים

מוצג כאן הוא מבחנה לכמת היפרמוטציה סומטית בתוך לוקוז גנים שרשרת כבד אימונוגלובולין באמצעות תאי מרכז B נביטה מן המדבקות של העכבר פייר.

ניתוח של היפרמוטציה סומטית באינטרון JH4 של תאי מרכז נגרינל B מן המדבקות של עכבר פייר

שגיאה בהפרדת כרומוזומים היא תכונה נפוצה בביציות. לכן, חקר מחסום הרכבת הציר נותן רמזים חשובים על המנגנונים הדרושים לייצור ביצים בריאות. הפרוטוקול הנוכחי מתאר שלוש בדיקות משלימות להערכת שלמות מחסום הרכבת ציר בביציות עכבר.

הערכת שלמות מחסום הרכבת הציר בביציות עכבר

שגיאות מיוטיות בסינפסות ורקומבינציה נפוצות בביציות של יונקים. ניתוח קפדני של חלבונים המעורבים בתהליכים אלה חיוני להבנה כיצד ומדוע ביציות משתבשות לעתים קרובות. הטכניקות המוצגות כאן מאפשרות ניטור מקיף של רקומבינציה וסינפסות כדי להעריך את איכות הביציות בעכברים.

הכנת התפשטות כרומוזומים מיוטיים מביציות עכבר להערכת סינפסה ורקומבינציה

חקור שיטה לכימות אי-יציבות גנומית בלימפוציטים מסוג B בעכבר באמצעות הכנת מטאפאזות ו-FISH לזיהוי סטיות כרומוזומיות. שיטה זו מסייעת להבנת מסלולי תיקון DNA וזיהוי גנים המקדמים יציבות גנומית.

ניתוח מהיר של סטיות כרומוזום בעכבר לימפוציטים מסוג B על ידי הרשות הפלסטינית-FISH

גלה סרטונים נוספים