מודל הלמידה Lateralized ריח חולדות ילודים לביתור גיבוש עצבי מעגל בבסיס זיכרון
18 באוגוסט 2014
פרוטוקול זה מציג למידה רוחבית של העדפת ריח מוקדמת בחולדות באמצעות חסימת נאריס בודדת חריפה. למידה רוחבית מאפשרת בחינה של תוצאות התנהגותיות ובסיס מנגנונים ביולוגיים בתוך אותם בעלי חיים, ומפחיתה את השונות הנגרמת על ידי עיצובים בין בעלי חיים. ניתן להשתמש בפרוטוקול זה כדי לחקור מנגנונים מולקולריים העומדים בבסיס למידת ריח מוקדמת.
פרוטוקול זה מציג למידה רוחבית של העדפת ריח מוקדמת בחולדות באמצעות חסימות חד פעמיות חדות. זה מושג על ידי בניית פקקי אף פוליאתילן נשלפים תחילה. השלב השני הוא לחסום את טלה הרצוי לפני אימון התנהגותי.
לאחר מכן, הכינו את המצעים הריחניים ולאחר מכן אימנו את החיה במצעים הריחניים תוך כדי ליטוף במכחול. השלב האחרון הוא בדיקת העדפת ריח לרוחב באמצעות מכשיר בדיקה דו-ברירה. בסופו של דבר, אימונוהיסטוכימיה של חלבון קושר אלמנט תגובת C amp זרחני או עריסת P משמשת להדגמת השתקה חד צדדית של פעילות עצבית עקב בידוד יחיד והפיכות השיטה.
היתרון העיקרי של טכניקה זו של שיטות הפיקוח הקיימות שלנו הוא שאנו מסוגלים להפחית את השונות ואת מספר בעלי החיים באמצעות אופי התכנון הניסויי שלנו לפני שכבה 11 לאחר הלידה, עקב היעדר תחזיות של תקשורת קדמית בוגרת MA, ששתי המיספרות הריח אינן מחוברות. זה מאפשר לנו לתפעל חצי כדור אחד ללא תלות בשנייה באמצעות חסימת ההזנה היחידה. חצאי הכדור החסומים משמשים כבקרה בתוך בעלי חיים.
למרות שטכניקה זו מתמקדת בלמידת חוש הריח בחולדות יילודים, ההשלכות יאפשרו לנו לענות על שאלות בסיסיות הנוגעות לתהליכים עצביים במהלך למידה וזיכרון, כגון פלסטיות סינפטית, מטאפלסטית והמנגנונים המולקולריים העומדים בבסיסם. ניתן להכליל את המסקנות העולות ממחקרים בשיטה זו לעקרונות בסיסיים של למידה וזיכרון ויונקים, במיוחד בתקופות קריטיות לאחר הלידה. זה יעזור לנו לבנות רקע מבטיח לטיפולים פוטנציאליים לאובדן זיכרון הקשור למצבים פתופיזיולוגיים.
שיטה זו מתאימה מאוד גם לתהליכים אחרים הקשורים לריח כגון תפיסת ריח וציפוי ריח. פקק האף בנוי מצינורות פוליאתילן 20 ושלושה חוטי תפר משי אפס. ראשית, חותכים חתיכה קטנה של פוליאתילן 22 עד כ- 0.8 סנטימטרים.
לאחר מכן השחילו את תפר המשי דרך הצינור המוכן כך שיהיה חוט משני צידי קטע הצינור. בקצה אחד של החוט מחוץ לתקע, קשרו קשר. משוך את קטע הצינור כלפי מטה מעל הקשר בחוט.
הקשר צריך להתמקם בתוך הצינור. חתוך את שני קצוות החוט, כך שכשני מילימטרים של חוט בולטים מקצה אחד של הצינור. כדי להתחיל בהליך זה, הוציאו את הגור מהסכר והניחו אותו בכלי מאובטח מכוסה במצעים רגילים.
בעזרת אפליקטור עם קצה כותנה יש לטפוח ג'לי הרדמה מקומי, 2% קסילוקאין על הטלה שיש לחסום. הניחו לגור לנוח בצלחת כשלוש דקות. לוצין בגור הוא השלב הקריטי ביותר בהליך זה.
יש ליטול ריפוי במהלך החדרת פקק האף כדי למנוע דימום ונזק לרקמות. לאחר מכן, הרימו את הגור והחזיקו אותו בעדינות אך בבטחה ביד הלא דומיננטית עם היד הדומיננטית, הרימו אף, סתמו וטפטפו את אותו ג'לי הרדמה מקומי סביב הקצה שממנו החוט אינו בולט. זה ישמש גם כחומר הרדמה לכל כאב קל הקשור להחדרת פקק וגם כחומר סיכה בתוך ה-nes.
הכנס בעדינות את פקק האף על ידי אחיזה חזקה של הגור וסיבוב איטי של הפקק בלחיצות עדינות מאוד עד שהפקק מוכנס במלואו ורק חוט שני המילימטר בולט ממזל טלה. לא אמור להיות דימום מאף אחד משני מזל טלה במהלך תהליך זה. לא ניתן להשתמש בגורים עם דימום במהלך החדרת פקק האף לניסוי.
הניחו לבעל החיים לנוח בכלי במשך חמש דקות על מנת להתרגל לתקע לפני תחילת האימון למניעת זיהום ריח, הכינו את המצעים הריחניים במכסה אדים ותוך כדי לבישת כפפות חדשות, הניחו 500 מיליליטר מצעי שבבי עץ לשקית ניילון. השתמש במזרק כדי לשאוב 0.3 מיליליטר תמצית מנטה ורסס אותה על המצעים בשקית הניילון. קשרו את השקית, נערו את השקית במרץ והניחו למצעים לנוח בתיק למשך חמש דקות, הניחו את המצעים הריחניים בקופסת אימונים אקרילית רדודה שקופה בגודל 20 על 20 על חמישה סנטימטרים שנחשפה במכסה האדים למשך חמש דקות לפני השימוש.
לאחר הכנת המצעים, השליכו את הכפפות המשומשות. אל תאפשר לכפפות לבוא במגע עם בעלי החיים. הניחו 500 מיליליטר של מצעים ללא ריח בקופסת אימונים אקרילית נקייה אחרת וודאו שהיא לא תבוא במגע עם מצעים ריחניים או כפפות משומשות.
התחילו את פרדיגמת מיזוג הריח על ידי הנחת הגור המורגל על המצעים הריחניים לריח ניסיוני. בנוסף גורים חיוביים של מערכת ההפעלה. לטפו את הגור במשך 30 שניות.
בעזרת מכחול קטן, השתמש בתנועות מעגליות מהירות בעיקר סביב האזור האחורי של הגור. ליטוף גורם לשחרור נוראדרנלין לפקעת הריח ולקליפת הריח. זה משמש כגירוי ללא תנאי.
הניחו לגור לנוח במשך 30 שניות. חזור על 30 שניות הליטוף, ולאחר מכן 30 שניות מנוחה למשך 10 דקות בסך הכל. לאחר השלמת 10 הזיווגים של ליטוף בתוספת ריח, הוציאו את הגור מקופסת המיזוג.
הסר את פקק האף והחזיר את הגור לסכר לשליטה. ריח רק גורים שליליים של מערכת ההפעלה. הניחו את הגור המורגל על המצעים הריחניים למשך 10 דקות ללא כל ליטוף.
לאחר 10 דקות, הוציאו את הגור מקופסת המיזוג. הסר את פקק האף והחזיר את הגור לסכר. בדיקת העדפת ריח רוחבית מבוצעת בנקודות זמן שונות לאחר האימון הסופי.
הבדיקה מתבצעת בתא בדיקה מנירוסטה בגודל 30 על 20 על 18 ס"מ המונח על גבי שתי קופסאות אימון אקריליות המופרדות על ידי אזור ניטרלי של שני סנטימטרים. קופסת אימונים אחת מכילה מצעים ריחניים ואילו הקופסה השנייה מכילה מצעים נקיים ללא ריח. הכינו מצע אחד בניחוח מנטה ומצע אחד ללא ריח כפי שהוצג קודם לכן, והניחו כל קופסה מתחת לצדדים מנוגדים של תא הבדיקה.
שני סנטימטרים זה מזה. הנח את רשת הפלסטיק על רצפת רשת המתכת של תא הבדיקה. הסר את ה-P מהסכר והניח טיפה יציבה של שומן סיליקון חסר ריח על הטלה החסום.
במהלך האימון ניתן למרוח מחדש את השומן לאורך הליך הבדיקה הראשון לפי הצורך. הנח את הגור באזור הנייטרלי של תא הבדיקה. אפשרו לגור לחקור את החדר למשך דקה אחת ולתעד כמה זמן הגור בילה על שני צידי החדר, כלומר על מנטה או מצעים בניחוח ניטרלי.
העבירו את הגור לתא אחיזה מפלסטיק מכוסה והניחו לו לנוח למשך דקה. חזור על ניסויי הבדיקה למשך 10 דקות בסך הכל, והחלף את הכיוון הראשוני של הגור בתא על מנת לשלוט בהעדפות הכיוון. מיד לאחר הבדיקה, נגב את השומן ממזל טלה.
הכניסו פקק אף מפוליאתילן למזל טלה הנגדי, בהתאם לאותו הליך בידוד RY שהודגם קודם לכן, ואפשרו לבעל החיים לנוח במשך 10 דקות. לאחר מכן, מבוצעת בדיקת העדפת ריח לרוחב על הגור. שוב. בסיום הבדיקה, הסר את התקע והחזיר את הגור לסכר.
בידוד צר יחיד במהלך אימון ריח פלוס ליטוף מוביל לזיכרון ריח רוחבי המוגבל ל-NRIs שנחסכו. כאשר גורים נבדקים להעדפת ריח באותה מידה מבודדת כמו במהלך האילוף, הם מראים העדפה לריח המותנה. זה לא נצפה כאשר הבדיקה נעשתה עם הנגדי מבודד.
לעומת זאת, קבוצות ביקורת של ריח בלבד אינן מראות העדפת ריח ללא קשר לאיזה ריח חסום. במהלך הבדיקה, אימון הריח הרוחבי מביא להפעלה רוחבית של מערכת הריח במהלך חשיפה לריח, אימונוהיסטוכימיה של פקעת הריח או OB וקליפת המוח הפיריפורמית הקדמית או PC הראתה באופן משמעותי פחות Creb זרחני בחצי הכדור החסום בעקבות חשיפה לריח בהשוואה לחצי הכדור הנגדי. צביעת ניסל מדגימה גופי תאים דומים בשכבת התאים המיטרלית של ה-OB ובשכבת התאים הפירמידלית של ה-PC של שתי ההמיספרות.
24 שעות לאחר הסרת פקק האף, ביטוי סרטן אפונה בעקבות חשיפה לריח בתאים מיטרליים של ה-OB ותאי הפירמידה ב-PC דומים בין חצאי הכדור החסומים והחסוכים. זה מצביע על כך שההשפעה של בידוד נרי בניסוי יחיד היא חולפת והפיכה ואינה גורמת לנזק עצבי גלוי לטווח ארוך שעלול להשפיע על תפיסת הריח וההפעלה העצבית לריחות במהלך הבדיקה. לאחר שליטה ניתן לבצע חסימת NA תוך פחות מחמש דקות אם היא מבוצעת כראוי.
בעת ניסיון הליך זה, חשוב להיות זהיר ביותר בעת סתימת הנחיר. כל כוח מופרז או טכניקה לא נכונה עלולים לגרום לדימום ולכן נזק לנחיר בעקבות הליך זה. ניתן להשתמש בשיטות אחרות כמו אלקטרופיזיולוגיה ex vivo וטכניקות מולקולריות כדי לענות על שאלות נוספות הנוגעות לפלסטיות סינפטית.
לאחר צפייה בסרטון זה, אתה אמור להבין היטב כיצד להשתמש בחסימות צרות חד צדדיות זמניות על מנת לרוחב למידת ריח ולנתח את המעגלים העצביים העומדים בבסיס היווצרות הזיכרון.
צפו בתמליל המלא וקבלו גישה לאלפי סרטונים מדעיים
סקירה כללית
פרוטוקול זה מציג למידה מוקדמת של העדפת ריח עם לטרליזציה בחולדות, באמצעות חסימה חדה של נחיר בודד. שיטה זו מאפשרת לבחון תוצאות התנהגותיות ומנגנונים ביולוגיים באותם נבדקים, ובכך לצמצם את השונות הנובעת מהבדלים בין בעלי חיים.
מרכיבי מפתח של המחקר
תחום מדעי
- מדעי המוח
- ביולוגיה התנהגותית
- למידה ריחית
רקע
- למידה לטרלית (Lateralized learning) היא שיטה לחקר תגובות התנהגותיות.
- חסימה של נחיר אחד היא טכניקה המשמשת למניפולציה של קלט תחושתי.
- גישה זו יכולה לסייע בהבנת הבסיס המולקולרי של למידת ריחות.
- טכניקות של אימונוהיסטוכימיה יכולות לחשוף שינויים בפעילות העצבית.
מטרת המחקר
- לחקירת למידה מוקדמת של העדפת ריח בחולדות.
- להערכת ההשפעות של שלילת חישה חד-צדדית על ההתנהגות.
- לבחינת המנגנונים הביולוגיים העומדים בבסיס למידת ריח.
שיטות שנעשה בהן שימוש
- בנייה של פקקי אף נשלפים מפוליאתילן לחסימת הנחיריים.
- אימון התנהגותי במצע ריהוט בניחוח תוך כדי ליטוף בעל החיים.
- בדיקה של העדפת ריח לטראלית באמצעות מכשיר לבחירה בין שתי אפשרויות.
- אימונוהיסטוכימיה של CREB מפספור כדי להעריך פעילות נוירונלית.
תוצאות עיקריות
- הדגימה השתקה חד-צדדית של פעילות עצבית כתוצאה מחסימת הנריים.
- הראתה את ההפיכות של שיטת החסימה.
- סיפקה תובנות לגבי התוצאות ההתנהגותיות של למידה לטרלית.
- הדגישה את הפוטנציאל למחקרי מולקולריים נוספים.
מסקנות
- ניתן לחקור ביעילות למידה של העדפה לריח בעלת לטרליזציה באמצעות פרוטוקול זה.
- השיטה מפחיתה שונות על ידי שימוש באותם נבדקים להערכות התנהגותיות וביולוגיות.
- מחקרים עתידיים יכולים להסתמך על ממצאים אלו כדי להעמיק בחקירת מנגנונים מולקולריים.
שאלות נפוצות
רלוונטיות תעשייתית למנהלים
מודל זה ללמידת ריחות לטרלית מאפשר השוואה בתוך אותו בעל חיים כדי להפחית שונות ניסויית במחקרי היווצרות זיכרון, ובכך תומך בתיקוף מטרות ובצמצום סיכונים מכניסטיים בשלבים מוקדמים של הגילוי. על ידי בידוד המעגלים העצביים העומדים בבסיס הזיכרון האולפקטורי, השיטה מספקת ביטחון ניבוי לבדיקת פלסטיות סינפטית ומנגנונים מולקולריים הרלוונטיים להפרעות קוגניטיביות. התועלת ממנה בחולדות רכים במהלך תקופות פוסטנטאליות קריטיות מציעה מערכת רלוונטית למחלה לצורך חקירת ביומרקרים טרנסלציונליים ושיפור של מודלים פרה-קליניים.
יישומים אסטרטגיים במחקר ופיתוח בביופארמה
גילוי מוקדם ותיקוף מטרה
- ערך מדעי: מאפשר בחינה של היפותזות טיפוליות באמצעות לטרליזציה של יצירת זיכרון ריח כדי לנתח שינויים במעגלים עצביים.
- ערך תפעולי: מפחית שונות באמצעות תכנון של ביקורת תוך-חייתית, ובכך מקטין את מספר בעלי החיים הנדרש ומעלה את העוצמה הסטטיסטית.
- ערך ניבוי: תומך בהפחתת סיכונים ביולוגיים על ידי קישור התנהגות של העדפת ריח לסממנים של פעילות נוירונלית חד-צדדית, כגון CREB זירחון.
סריקה ופיתוח בדיקה
- ערך מדעי: הכנת מערכות ביולוגיות שעברו תיקוף לצורך סטנדרטיזציה של בדיקות המשך, תוך שימוש בחסימה הפיכה של הנחיריים ליצירת עקבות זיכרון לטרליים.
- ערך תפעולי: מאפשר מדידות כמותיות של משתנים תלויים באמצעות מכשיר בדיקה של בחירה בין שתי אפשרויות ותוצאות של אימונוהיסטוכימיה.
- מוכנות לסריקה: מקל על הערכה אמינה של תרכובות על ידי מתן אפשרות להשוואה של העדפת ריח בין המיספרות השונות בתוך אותו נבדק.
מחקר תרגומי ופריקליני
- המשכיות תרגומית: מקשרת בין למידה מוקדמת של העדפת ריח לבין תיקוף פרה-קליני על ידי בחינת הבסיסים המולקולריים של היווצרות זיכרון.
- הפחתת סיכונים מכניסטית: מתמקדת במנגנוני פלסטיסיות סינפטית ומטפלאסטיסיות הניתנים להכללה ללמידה של יונקים במהלך תקופות קריטיות לאחר הלידה.
- קידום מותאם סיכונים: מאפשרת ביצוע קורלציה בין שינויים פיזיולוגיים לבין חוזקו ומשכו של הזיכרון כדי לספק מידע לקבלת החלטות של המשך או הפסקת הניסוי (go/no-go).
שילוב תהליכים וזרימת עבודה
השיטה משתלבת בתהליכי עבודה של שלבי הגילוי המוקדמים על ידי מתן אפשרות לבחינת השערות לגבי מעגלים עצביים המעורבים ביצירת זיכרון, כאשר התוצאים מזינים את שלבי זיהוי המועמדים (lead identification) והתיקוף הפרה-קליני.
- ביולוגיה של הגילוי: תומכת בהבהרת מסלולים ובצמצום סיכונים ביולוגיים באמצעות בידוד התפקוד של ההמיספירה האולפקטורית על ידי חסימה חד-צדדית של נחיר.
- סריקה: מספקת מוכנות לבדיקה באמצעות הכנה סטנדרטית של מצע ריחני ובדיקת בחירה בין שתי אפשרויות למדידה כמותית של העדפת ריח.
- אנליטיקה: מספקת אימונוהיסטוכימיה של CREB זלפוסף כקריאה כמותית להשוואת הפעלת נוירונים בין ההמיספירות החסומה והפתוחה.
- מחקר טרנסלציונלי: מתחבר להמשכיות פרה-קלינית על ידי מתן אפשרות לחקירת מנגנונים מולקולריים העומדים בבסיס זיכרון ריח הרלוונטי לטיפולים קוגניטיביים.
- שימוש חוזר ארגוני: מבססת פלטפורמה ניתנת לשימוש חוזר למניפולציה סנסורית לטראלית בתהליכים הקשורים לחוש הריח, כגון תפיסת ריח וציפוי.
השפעה תפעולית וארגונית
- ערך מדעי: ביטחון ניבוי בתיקוף מטרה באמצעות תובנה מכניסטית לגבי מעגלי היווצרות הזיכרון.
- ערך תפעולי: סטנדרטיזציה ושחזוריות באמצעות מודל פקק אף אקוטי והפיך הממזער נזק לרקמות ושונות.
- ערך אסטרטגי: שיפור בקבלת החלטות go/no-go על ידי הפחתת סיכון ביולוגי בשלבים מאוחרים באמצעות הפחתת סיכונים מוקדמת של מטרות הקשורות לזיכרון.
- השפעה על הפורטפוליו: תיעדוף מותאם סיכונים המתאפשר על ידי השוואה בתוך אותו בעל חיים, המגבירה את הביטחון בנתוני מעורבות המטרה.
שיקולי יישום
- דורש מומחיות בטיפול במכרסמים ביונאות ובטכניקות כירורגיות קלות לחסימת הנחיריים.
- תלוי בציוד לבנייה מדויקת של פקקי אף באמצעות צינוריות פוליאתילן ותפרי משי.
- מחייב סטנדרטיזציה בין צוותים להכנת ריחות, פרדיגמות של ליטוף והקמת תא הבדיקה.
- כולל שיקולי התאמה בין מערכות מודל עקב התפתחות תלויית-מין של קשרי הקומיסורה הקדמית.
- מגבלה מעשית: יעיל רק במהלך התקופה הפוסטנטלית המוקדמת (≤10 ימים) לפני היווצרות קשרי המיספירה האולפקטורית הבוגרים.
שאלות נפוצות בתחום הביופארמה
Chapters in this video
0:05
Title
2:15
Nose Plug Construction
2:59
Naris Occlusion Before Training
4:23
Scented Bedding Preparation
5:19
Odor Conditioning Paradigm
6:26
Lateralized Odor Preference Testing
8:16
Results: Naris Occlusion is an Effective Method for Isolating Odor Input and Producing Lateralized Odor Memory
9:49
Conclusion
