Multimodal שיטות מיקרוסקופית אופטיות לחשוף רקמות מורפולוגיה ומבנה פוליפ בקריביים אלמוגי בניית ריף

המטרה הכוללת של הניסוי הבא היא לדמות פוליפים של אלמוגים בעובי של מילימטר עד שניים בתלת מימד כדי להבין את המבנה העדין כמו גם את פיגמנטי האלמוגים והמיקום שלהם. זה מושג על ידי הטמעת הדגימה תחילה בשעווה, ולאחר מכן חיתוך הדגימה לחלקי מיקרון אחד באמצעות מיקרוטום. לאחר מכן, נעשה שימוש בטכניקת פנים בלוק סדרתי שתוכננה בהתאמה אישית כדי לדמות את פוליפי האלמוגים ולשחזר את התמונה התלת מימדית.

באמצעות תמונות דו-ממדיות מרובות, מתקבלות תוצאות המראות את יכולתה של הטכניקה לפתור פרטים מבניים עדינים של רקמת האלמוגים מבלי לפגוע בשלמות המבנית שלה. הדגמת ההליך. היום יהיה ד"ר מונדה סיווה גורו, משתף פעולה עם קבוצת המחקר שלי.

להכנת שעוות הסינון המוקדמת ממיסים 3.6 גרם היגוי בפתיתים בכוס זכוכית על צלחת חמה. לאחר מכן, הוסף 400 מיליגרם סודן. ארבע כדי למזער את הקרינה ברקע השעווה, מערבבים היטב ומחכים עד לקבלת תמיסה שקופה אדומה.

לאחר מכן מוסיפים 81 גרם פרפין ומערבבים היטב. לאחר מכן, מוסיפים 15 גרם מוט VI גרגירי לבן וממיסים לחלוטין באותה. לאחר ההמסה, מערבבים אותה שוב לקבלת תמיסת שעווה מעורבת לחלוטין.

כעת מוסיפים את התערובת לבקבוק זכוכית וסוגרים באופן רופף עם מכסה. הכניסו את בקבוק הזכוכית לתנור הסעה של 60 מעלות צלזיוס כדי לשמור על החומרים במצב נוזלי וכדי שכל ההסתננויות יתרחשו. ניתן להכין פתרון זה ל -200 מיליליטר ולפצל לשני בקבוקי 100 מיליליטר.

אחת לחדירה ואחת להטמעה סופית של דגימות אלמוגים בבניית שונית קריבית נאספו מ-AU וקובעו בפארה פורמלדהיד בשטח. כדי להטמיע את רקמות האלמוגים עבור SBFI, יש לשטוף תחילה את פוליפי האלמוגים שנאספו בשדה ולאחסן אותם בארבע מעלות צלזיוס בפארה פורמלדהיד. לאחר מכן, שטפו אותם ב-PB S3 פעמים במשך חמש דקות בכל פעם כשהם מוכנים לצילום.

הסירו את הפוליפים בתמיסה של Cal 2 למשך 24 שעות או עד שהפוליפים נטולי סידן פחמתי לחלוטין. דגרו מספר פוליפים של אלמוגים נטולי אבדן כבלוק יחיד בסדרה של 25, 50, 75 ו-100% אתנול ואחריו x קסילן אחד. החלף למשך 30 דקות בכל מפגש כדי לייבש את הדגימות.

לאחר מכן, הניחו את הפוליפים המעובדים ב-100% קסילן. מחליפים בתנור 65 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות. לאחר מכן, החליפו בתמיסה טרייה ודגרו למשך 30 דקות נוספות.

כוונו את הפוליפים כשהחלקים פונים כלפי מטה והמשטח שטוח ככל האפשר. עשה פתרונות של שניים לאחד, אחד לאחד ואחד לשניים. תחליף קסילן ושעוות טרום סינון.

ב-50 מיליליטר שפופרות פלקון דוגרות על פוליפי האלמוגים עם שלושת הריכוזים ההולכים וגדלים של שעווה לפני סינון, ולאחר מכן שלוש דגירות ב-100% שעווה לפני סינון למשך 30 דקות עד שעה בכל פעם. כעת העבירו את הדגימה לשעוות ההטמעה. הסר את שעוות ההטבעה לאחר 30 דקות, ולאחר מכן החלף בשעווה הטבעה טרייה והמשיך בדגירה למשך ארבע שעות לפחות בטמפרטורה של 65 מעלות צלזיוס.

לאחר מכן, צלמו את הבלוק. זה הכרחי מכיוון שלאחר הטמעה בשעווה, מיקום הדגימה יהפוך לבלתי נראה מכיוון שהשעווה האדומה המוטמעת אטומה. לאחר מכן, הניחו טיפות קטנות של שעווה בעלת נקודת התכה גבוהה סביב תבנית ההטמעה החדשה מנירוסטה שחוממה מראש והניחו לה להתקרר.

יוצקים נפח קטן של שעווה טרייה מומסת ומצעים מהאליקוט השני ומקמו את פוליפ האלמוגים עם הפנים כלפי מטה מעל נקודת השעווה הלבנה במהירות. לאחר מכן הניחו מחזיק מדגם פלסטיק על מגש הנירוסטה ושפכו עוד שעווה הטבעה כך שהשעווה תגיע אל פני תבנית הפלסטיק. כעת הוציאו את כל ההתקנה מהתנור של 65 מעלות צלזיוס והניחו לו להתקרר על ספסל או משטח קריר עד שהשעווה מתקשה לחלוטין.

לאחר מכן, הכניסו את הגוש המיובש למקרר בארבע מעלות צלזיוס, מוגן מפני אור לאחסון לטווח הארוך כדי לחתוך את הבלוק. ראשית, חתוך אותו וחתוך קטעים של מיקרון אחד. בעזרת מיקרוטום ללכוד את התמונה של פני הבלוק החלק, המכיל את הדגימה.

בכל פעם. כאשר מסירים קטע, הדגימה מופיעה כאשר השעווה הלבנה מתחילה להיעלם. לאחר מכן צלם את התמונות במצלמה מונוכרום באמצעות מסנן פלואורסצנטי כדי לקלוט את האוטו-פלואורסצנטיות של הכרומטופורים או תמונת פוליפ האלמוגים, שלוש עד ארבע ליבות נטולות אבדן מכל דגימה.

כדי לבצע הדמיה פלואורסצנטית של שני פוטונים, הנח את ליבות פוליפ האלמוגים השטופות בפורמלדהיד 4%para הפוך בצלחת תחתית זכוכית מכוסה באמצעות לייזר שני פוטונים בעירור של 780 ננומטר תמונת שלושה עד ארבעה פוליפים בשתי הגדלות שונות באמצעות מטרה של פי 10. לאחר מכן, השתמש במצב סריקת האריחים כדי לאסוף כ-25 עד 100 תמונות לכל מישור מוקד ב-XY במרווחים של 10 או 20 מיקרון. לאחר מכן אסוף 50 עד 100 תמונות דרך ציר Z במרווחים של 10 או 20 מיקרון, שיהיו בסביבות 5,000 עד 10,000 תמונות בסך הכל לכל פוליפ אלמוגים.

לאחר תמונה זו, שלושה עד ארבעה אזורי פוליפים המייצגים ליבה ומין אלמוגים. לאחר מכן אחסן את כל התמונות בפורמט נתונים גולמיים בדיסק הקשיח של המערכת. בהליך זה, חתוך את הנתונים הדו-ממדיים כדי להקטין את גודל הקובץ על ידי התמקדות בפוליפ בודד באמצעות כלי החיתוך הריבועי והדר אותו כקובץ TIF יחיד.

בתוכנת הרכישה. פתח את הקבצים המורכבים של נתוני SBFI או את ערימות ה-Z המרובות המרוצפות של שני חלקים אופטיים של פוטונים במודול התוכנית EMERIS עולים תחת פרויקט אלגוריתם נפח, נתוני SBFI מעובדים בתלת מימד. באמצעות הקרנת צל, צור מצב ISOSURFACE שבו הווקסלים הם סף ליצירת תבנית משטח מוצקה.

דמיין את ההקרנות התלת-ממדיות באמצעות אלגוריתם גזירה רגיל במצבים אורתוגונליים XY, xz ו-YZ כדי לחשוף את המבנה והצורה התלת-ממדיים של האלמוגים. לאחר מכן הנפש את ההקרנות באמצעות מודול הנפשה של מסגרת מפתח. באותה תוכנית שגיאות, צור קבצי וידאו בדחיסה של 5% וצור קטעי סרטים בפורמט VI באמצעות אופני נפח תלת מימד ואיזו-משטח.

להלן שתי תמונות תלת מימד פלואורסצנטיות של פוטונים של פוליפים אלמוגים מ-M Anis ו-M fa Lata. שתי התמונות הללו צולמו ללא הפרדה ספקטרלית של רכיבים באמצעות עירור של 780 ננומטר של שני לייזר הפוטונים עם האות האופטי שנאסף בין 450 ל-700 ננומטר, ושתי התמונות הללו נאספו באותה עירור, אך שני גלאי צינורות מכפיל צילום שימשו בו זמנית לאיסוף הנתונים משני רכיבים, האחד מ-500 עד 550 ננומטר והשני מ-650 עד 720 ננומטר. אלה תמונות מצופות עומק.

אדום הם הרדודים ביותר וכחול הם המרכיבים העמוקים ביותר בדו-ממד. כן. בעת ניסיון הליך זה, חשוב לזכור להכין את הדגימה המוטמעת בשעווה אדומה כראוי. שילוב של הדמיית פנים בלוק סדרתי ומיקרוסקופיה פלואורסצנטית של שתי רגליים מאפשר ניתוח של פיגמנטציה של אלמוגים ומבנה תאים במגוון קשקשי עדשות.

לאחר צפייה בסרטון זה, אתה אמור להבין היטב כיצד לטפל ולצלם אלמוגים בוני שוניות ותכונותיהם הספקטרליות בתלת מימד.