שילוב של Microstereolithography וElectrospinning כדי לייצר ממברנות מצויד בגומחות להתחדשות קרנית

המטרה הכוללת של הניסוי הבא היא להציג מורכבות מרחבית תלת מימדית בתוך פיגומי הנדסת רקמות על ידי שילוב של שימוש בטכניקות ייצור תוספות וספינינג אלקטרו. זה מושג על ידי יצירת תבנית בלתי מתכלה העשויה מפוליאתילן גליקול, D acrl או PEG DA, תוך שימוש בטכניקת ריפוי צילום שכבה אחר שכבה הנקראת מיקרו סטריאוליתוגרפיה. כצעד שני.

התבניות מחוברות למצע מתכתי ונעשה שימוש בספינינג אלקטרו לייצור קרום מתכלה המחקה את המורפולוגיה הבסיסית. לאחר מכן, נלמדים נהלי אריזה והשפלה של הממברנות המסתובבות האלקטרוניות. נמנעת השפלה מוקדמת של הממברנות המאוחסנות על ידי שליטה בטמפרטורה ולחות.

השלב האחרון מורכב מהנחת הממברנות המתכלות על מודל תלת מימד של קרנית פצועה ללימוד השימוש הפוטנציאלי בהן כמכשירי התחדשות קרנית. התוצאות מראות את הרבגוניות של שימוש בטכניקות ייצור תוספות וספינינג אלקטרו ליצירת ממברנות מורכבות המכילות כיסי מיקרו המחקים במידה מסוימת את נישת תאי הגזע הטבעיים. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא הרבגוניות שלה.

מכיוון שניתן ליצור את התבניות הבלתי מתכלות חדשות, תוך שימוש במגוון רחב של טכניקות ייצור, שיטה זו תהיה מעניינת הן בתחומי הייצור והן בתחומי התחדשות הרקמות, והיא תעזור לענות על שאלות מפתח הקשורות להתנהגות תאי גזע ונישת תאי הגזע. שיטה זו של ייצור פיגומים מיקרו מפוברקים יכולה לספק תובנה לגבי התחדשות הקרנית. ניתן ליישם אותו גם על רקמות אפיתל אחרות עם נישות תאי גזע כגון עור ורירית הפה, או לספק תכונות תלת מימד אחרות ופיגומים להנדסה של מגוון רחב של רקמות.

גם המנהיג אורטגה וגם תומאס פטרסון ידגימו את ההליך. התחל הליך זה על-ידי יצירת L one, השכבה הראשונה. זה יהפוך לבסיס המבנה באמצעות כל תוכנית ציור מתאימה לעיגול שחור של 1.2 סנטימטר.

לאחר מכן, צור L שתיים. השכבה השנייה, צייר עיגול שחור נוסף של 1.2 סנטימטר, אך כולל שישה עד שמונה מבנים לבנים בצורת פרסה בגודל 0.5 על 0.35 מילימטר. פזרו את צורות הפרסה הלבנות הקטנות בתוך מבנה העיגול השחור.

שמרו את L one ו-L two בפורמט JPEG כדי להגדיר מיקרו-סטריאוליתוגרפיה. ראשית, התאם ונקה בזהירות את האופטיקה של המערכת. הכניסו 300 מיקרוליטר של פוליאתילן גליקול די אקרל, או תערובת PEG D לבאר של צלחת תרבית רקמות 12 בארות.

יש לצבוע את הבאר מראש בטפלון או בחומר נון-סטיק אחר או להסיר בקלות את המבנה. לאחר הריפוי הפעל את הלייזר הכחול והעלה את L one לתוכנה הבסיסית של ALP שלוש. תוכנה זו היא ממשק USP המספק את הקישור בין המחשב למכשיר המיקרו מראה הדיגיטלי.

הקרינו את השכבה הראשונה למשך 60 שניות. הוסף לבאר עוד 250 מיקרוליטר מהיתד דה. העלה L שתיים והקרין L שתיים למשך 60 שניות.

הסר את הפולימר הלא נרפא ושטוף את הטבעות באיזופרופנול למשך הלילה ביום שלפני הספינינג האלקטרו, צור אספן ספינינג אלקטרו סטטי על ידי הפצת טבעות PEG DA על יריעת אלומיניום מצופה 12 סנטימטר על 20 סנטימטר. חבר את הטבעות באמצעות סרט פחמן מוליך. הכינו את תמיסת הפולי לקטיד קו-גליקו או PLGA וערבבו אותה למשך הלילה לפני השימוש למחרת.

הניחו ארבעה מזרקים של חמישה מיליליטר עם מחטים קהות בקוטר פנימי של 0.8 ס"מ על משאבת מזרק. משתמשים בארבעה מזרקים במקום מזרק בודד. כדי להבטיח ספינינג חשמלי מהיר יותר, טען 2.5 מיליליטר מתמיסת PLGA לכל מזרק.

להצלחת הליך זה, חשוב לנסות לשמור על משתני אורן הלארו קבועים ככל האפשר. השאירו מרחק בין המחטים לקולט של 15 סנטימטרים. הגדר קצב זרימה של 30 מיקרוליטר לדקה ומתחים הנעים בין 12 ל -15 קילו-וולט עבור סיבוב האלקטרו מסתובב למשך שעה ו -30 דקות.

בסיום הספינינג החשמלי, קלף בזהירות את יריעת הספוג האלקטרו PLGA מהאספן התומך בטבעות ה-PEG. ניתן לעשות שימוש חוזר בטבעות PEG DA כתבניות לספינינג אלקטרו. השתמש באגרוף חור עגול כדי לחתוך את פיגומי האלקטרו ספון לעיגולים בקוטר 22 מילימטר.

השארת מבנה הטבעת ממוקם במרכז להכנת ממברנות ה-PLGA לאחסון לטווח ארוך. הרכיבו כל אחד מהם במיכל קטן כמו צלחת פטרי מפלסטיק והניחו אותו בתוך שקית רפואית. הניחו שלוש שקיות של חומר ייבוש בתוך השקית הרפואית.

הוסף לתיק כרטיס חיווי לחות של שש נקודות זמין מסחרית. זה יזהה כל הצטברות לחות במהלך תקופת האחסון. השתמש במכונת איטום חום ואקום כדי לשאוב ולאטום את השקית.

לאחר מכן, ממברנות ה- PLGA נשלחות לחברה חיצונית, הגמא או הקרינה לפני האחסון. בניסוי זה, חצילים לימבליים של ארנב מבודדים מעיני ארנב המתקבלות מחווה בה מגדלים ארנבים לצריכה. ראשית יש לחטא את עיני הארנב באמצעות תמיסת חיטוי של 3%.

לאחר מכן, נקו את העיניים על ידי הסרת כל הרקמה העודפת סביב הקרנית. ניתן לזהות את האזור הלימבלי כאזור עגול דק בין הקרנית השקופה לסקלרה הלבנה. הפרד את האזור הלימבלי משאר הקרנית.

חותכים את האזור הלימבלי למקטעים באורך של כ -1.5 סנטימטרים, מחטאים את הקטעים הלימביים בתמיסה חיטוי של 1.5% למשך דקה. לאחר חיטוי, השתמש בלהב אזמל כדי לחתוך את הקטעים הלימביים לחתיכות קטנות. אחסן את חתיכות הרקמה הקטנות ב-DMEM בתוספת מדיה מקסימלית של 37 מעלות צלזיוס ו-5% פחמן דו חמצני או מקסימום שעה לפני השימוש.

כדי להתחיל בהליך זה, השתמש במגרד תאים כדי לצפות את ממברנות הטבעת ב -15 מיקרוליטר דבק פיברילין. מחלקים את הפיברילין באופן שווה תוך כדי עבודה תחת מיקרוסקופ מנתח. השתמש במחט בגודל 25 כדי למקם את האקספלנטים הלימבלים ישירות על כיסי המיקרו PLGA.

הניחו את הטבעות עם תצוגה הרקמה על קרניות חשופות שהוכנו בעבר. כאשר האקספלן פונה כלפי מעלה ובתנאי ממשק נוזל אוויר, טבעת ה-PLGA תירטב במהירות ותאמץ את צורת דגם הקרנית. שמרו על מודלים של תרבית איברים במשך ארבעה שבועות בחממה לחה בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס ו-5% פחמן דו חמצני החליפו את המדיה כל יומיים.

מיקרו סטריאוליתוגרפיה מאפשרת ייצור של טבעות PEG DA בגדלים שונים ושילוב בו זמנית של תכונות מיקרו. ניתן לייצר טבעות ולעשות בהן שימוש חוזר והן מחוברות בקלות ליריעת מתכת שיכולה לשמש כאספן ספינינג אלקטרו. בדוגמה זו, הטבעות מכילות תכונות מיקרו פרסה.

לאחר מכן אלקטרו ספינינג מייצר העתקי PLGA אריזת ואקום של ממברנות ה-PLGA משפרת משמעותית את האחסון לטווח ארוך גם ב-37 מעלות צלזיוס בתנאי לחות מכוונים. סוג השקית המשמשת משפיע גם על יציבות הממברנה, מיקרוסקופ אלקטרונים סורק ובחינת שלושת המסירים אינם מראים שינויים בשלמות הסיבים או בלחות של הסיבים השלמים. צמיחת תאים משתלים לימביים או נתמכת על ידי טבעות PLGA מתכלות טריות וטבעות לאחר שישה חודשי אחסון במינוס 20 מעלות צלזיוס.

בעת הנחת ממברנות ה-PLGA על מודלים תלת מימדיים של קרנית פצועה, העברת התאים הושגה לאחר ארבעה שבועות. תמונות H ו-e מראות את האפיתל הרב-שכבתי החדש שנוצר על ידי התאים היוצאים מהצמחים המונחים על הגומחות. הבקרה השלילית אישרה את היעדר היווצרות אפיתל חדש בהיעדר תאים נוספים.

בהשוואה לאפיתל קרנית קונבנציונאלי שנצפה בקרנית ארנב טרייה המשמשת כבקרה חיובית. כימיה של ציטו חיסוני הדגימה כי התאים שצמחו מהשתלים היו תאי אפיתל בקרנית מכיוון שהם היו חיוביים לציטוקרטין 3, סמן התמיינות בקרנית. מכיוון שקולטי הספינינג האלקטרו המכילים את התבניות הבלתי מתכלות ניתנים לשימוש חוזר, ניתן לבצע את ייצור הפיגומים תוך שעתיים כאשר הפרוטוקול מותאם.

טכניקה זו מאפשרת לחוקרים בתחומי הנדסת הרקמות לחקור דרך חדשה לייצור ממברנות מורכבות של הנדסת רקמות המכילות מיקרו תכונות לחקר התנהגות התא. לאחר צפייה בסרטון זה, אתה אמור להבין היטב כיצד ליצור תבנית מיקרו מפוברקת שאינה מתכלה על ידי שימוש בטכניקות ייצור תוספות או גישות דומות כגון דוגמנות וכיצד להשתמש בספינינג אלקטרו להוספת מורכבות לפיגומים שלך.