Name: ניתוח metabolomic של מוח חולדה על ידי ספקטרוסקופיה בתהודה מגנטית הגרעינית ברזולוציה גבוהה של תמציות רקמות (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-09-21T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 1 s
Description: למד ניתוח metabolomic של מוח חולדה באמצעות ספקטרוסקופיית NMR ברזולוציה גבוהה. השיטה כוללת הומוגניזציה של רקמה בנוזלי חילוץ, ליופיליזציה וניתוח כמותי של מטבוליטים. גישה זו מאפשרת חקר שינויים נוירוכימיים במחלות נוירולוגיות.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

תמיכת המרכז הלאומי למחקר מדעי (CNRS, UMR 6612 ו-7339) זוכה להכרת תודה.

<ol><li>Manger, P. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Is+21st+century+neuroscience+too+focused+on+the+rat%2Fmouse+model+of+brain+function+and+dysfunction%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Neuroanat%22%5BJournal%5D)">Is 21st century neuroscience too focused on the rat/mouse model of brain function and dysfunction.</a> Front Neuroanat. 2, 5(2008).</li>
<li>Buxbaum, J. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimizing+the+phenotyping+of+rodent+ASD+models+enrichment+analysis+of+mouse+and+human+neurobiological+phenotypes+associated+with+high-risk+autism+genes+identifies+morphological%2C+electrophysiological%2C+neurological%2C+and+behavioral+features%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Autism%22%5BJournal%5D)">Optimizing the phenotyping of rodent ASD models enrichment analysis of mouse and human neurobiological phenotypes associated with high-risk autism genes identifies morphological, electrophysiological, neurological, and behavioral features.</a> Mol Autism. 3, 1(2012).</li>
<li>Papaioannou, V., Behringer, R. R. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aPapaioannou%2C+V+%22Mouse+Phenotypes+A+Handbook+of+Mutation+Analysis%22">Mouse Phenotypes A Handbook of Mutation Analysis</a>. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. Woodbury. (2004).</li>
<li>Yu, F. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reduced+sodium+current+in+GABAergic+interneurons+in+a+mouse+model+of+severe+myoclonic+epilepsy+in+infancy%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Reduced sodium current in GABAergic interneurons in a mouse model of severe myoclonic epilepsy in infancy.</a> Nat Neurosci. 9, 1142-1149 (2006).</li>
<li>Mallolas, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+polymorphism+in+the+EAAT2+promoter+is+associated+with+higher+glutamate+concentrations+and+higher+frequency+of+progressing+stroke%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Experimental+Medicine%22%5BJournal%5D)">A polymorphism in the EAAT2 promoter is associated with higher glutamate concentrations and higher frequency of progressing stroke.</a> The Journal of Experimental Medicine. 203, 711-717 (2006).</li>
<li>Crusio, W. E., Sluyter, F., Gerlai, R. T., Pietropaolo, S. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aCrusio%2C+WE+%22Behavioral+Genetics+of+the+Mouse+Genetics+of+Behavioral+Phenotypes%22">Behavioral Genetics of the Mouse Genetics of Behavioral Phenotypes</a>. Vol. 1, Cambridge University Press. New York. (2013).</li>
<li>Viola, A., Saywell, V., Villard, L., Cozzone, P. J., Lutz, N. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Metabolic+fingerprints+of+altered+brain+growth%2C+osmoregulation+and+neurotransmission+in+a+Rett+syndrome+model%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">Metabolic fingerprints of altered brain growth, osmoregulation and neurotransmission in a Rett syndrome model.</a> PLoS ONE. 2, e157(2007).</li>
<li>Lutz, N. W., Sweedler, J. V., Wevers, R. A. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aLutz%2C+NW+%22Methodologies+for+Metabolomics%22">Methodologies for Metabolomics</a>. , Cambridge University Press. New York. (2013).</li>
<li>Rabinowitz, J. D., Purdy, J. G., Vastag, L., Shenk, T., Koyuncu, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Metabolomics+in+drug+target+discovery%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harb+Symp+Quant+Biol%22%5BJournal%5D)">Metabolomics in drug target discovery.</a> Cold Spring Harb Symp Quant Biol. 76, 235-246 (2011).</li>
<li>Wishart, D. S. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aWishart%2C+DS+%22Methodologies+for+Metabolomics%22">Methodologies for Metabolomics</a>. Wevers, R. A., Lutz, N. W., Sweedler, J. V., et al. , Cambridge University Press. New York. (2013).</li>
<li>Ponten, U., Ratcheson, R. A., Salford, L. G., Siesjo, B. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimal+freezing+conditions+for+cerebral+metabolites+in+rats%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neurochemistry%22%5BJournal%5D)">Optimal freezing conditions for cerebral metabolites in rats.</a> Journal of Neurochemistry. 21, 1127-1138 (1973).</li>
<li>Henry, P. G., Oz, G., Provencher, S., Gruetter, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Toward+dynamic+isotopomer+analysis+in+the+rat+brain+in+vivo+automatic+quantitation+of+13C+NMR+spectra+using+LCModel%5BTitle%5D)+AND+%22NMR+Biomed%22%5BJournal%5D)">Toward dynamic isotopomer analysis in the rat brain in vivo automatic quantitation of 13C NMR spectra using LCModel.</a> NMR Biomed. 16, 400-412 (2003).</li>
<li>Lutz, N. W., Cozzone, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiparametric+optimization+of+%2831%29P+NMR+spectroscopic+analysis+of+phospholipids+in+crude+tissue+extracts+2+Line+width+and+spectral+resolution%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Chem%22%5BJournal%5D)">Multiparametric optimization of (31)P NMR spectroscopic analysis of phospholipids in crude tissue extracts 2 Line width and spectral resolution.</a> Anal Chem. 82, 5441-5446 (2010).</li>
<li>Lutz, N. W., Cozzone, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiparametric+optimization+of+%2831%29P+NMR+spectroscopic+analysis+of+phospholipids+in+crude+tissue+extracts.+1.+Chemical+shift+and+signal+separation%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Chem%22%5BJournal%5D)">Multiparametric optimization of (31)P NMR spectroscopic analysis of phospholipids in crude tissue extracts. 1. Chemical shift and signal separation.</a> Anal Chem. 82, 5433-5440 (2010).</li>
<li>Lutz, N. W., Cozzone, P. J. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aLutz%2C+NW+%22Methodologies+for+Metabolomics%22">Methodologies for Metabolomics</a>. Lutz, N. W., Sweedler, J. V., Wevers, R. A. , Cambridge University Press. New York. (2013).</li>
<li>Lutz, N. W., Fernandez, C., Pellissier, J. F., Cozzone, P. J., Beraud, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cerebral+biochemical+pathways+in+experimental+autoimmune+encephalomyelitis+and+adjuvant+arthritis+a+comparative+metabolomic+study%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">Cerebral biochemical pathways in experimental autoimmune encephalomyelitis and adjuvant arthritis a comparative metabolomic study.</a> PLoS ONE. 8, e56101(2013).</li>
<li>Lutz, N. W., Cozzone, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Principles+of+multiparametric+optimization+for+phospholipidomics+by+31P+NMR+spectroscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys+Rev%22%5BJournal%5D)">Principles of multiparametric optimization for phospholipidomics by 31P NMR spectroscopy.</a> Biophys Rev. 5, 295-304 (2013).</li>
<li>Pearson, G. A. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aPearson%2C+GA+%22Shimming+an+NMR+magnet%22">Shimming an NMR magnet</a>. , University of Iowa. Iowa City. (1991).</li>
<li>Lane, A. N., Fan, T. W. M., Higashi, R. M. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aLane%2C+AN+%22Biophysical+tools+for+biologists%22">Biophysical tools for biologists</a>. Correia, J. J., Detrich, H. W. Vol. 1, In vitro techniques, Academic Press. Waltham. (2008).</li>
<li>Peeling, J., Wong, D., Sutherland, G. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nuclear+magnetic+resonance+study+of+regional+metabolism+after+forebrain+ischemia+in+rats%5BTitle%5D)+AND+%22Stroke%22%5BJournal%5D)">Nuclear magnetic resonance study of regional metabolism after forebrain ischemia in rats.</a> Stroke. 20, 633-640 (1989).</li>
</ol>

למחברים אין מה לחשוף.

ספקטרוסקופיה NMR היא שיטה יעילה למדידת ריכוזים של תרכובות כימיות בפתרון בצורה מאוד לשחזור ומדויק. עם זאת, כדי לקבל נתונים באיכות גבוהה יש צורך לדבוק בכללים מסוימים הנוגעים להכנת מדגם וניתוח. בקביעת ריכוזי המטבוליט ידי ספקטרוסקופיה NMR, לא הדור ולא הקבלה של אות NMR שולטת שגיאת quantitation, אלא אם כן את עוצמת אות שנצפתה מתקרבת לסף הגילוי (אות חלשה במיוחד). בכל המקרים האחרים השתנות ביולוגית, טכניקת הכנת מדגם (יעילות חילוץ, יציבות פיזית וכימית של תרכובות, pipetting ומשקל טעויות ו...

מודלים עכבריים כבר נוצלו בהרחבה בחקר מוח 1. מתאמי גנוטיפ, פנוטיפ נחקרו במוח עכבר וחולדה על ידי לימוד ביטוי גנים בRNA ו / או רמות חלבון מצד האחד, ופנוטיפים מורפולוגיים, תפקודיים, אלקטרו ו / או התנהגותי על 2-6 האחר. עם זאת, כדי להבין את המנגנונים המקשרים פנוטיפ לגנוטיפ לחלוטין, זה הכרחי כדי לחקור את האירועים המולקולריים במורד הזרם של ביטוי חלבון, כלומר. חילוף החומרים של מצעים ביוכימיים שעליו אנזימים לפעול 7. דרישה זו הובילה, על 10 עד 15 השנים האחרונות, לרנסנס של מחקר מטבולים בענפים רבים של 8,9 ביולוגיה. בעוד שמחקרים מטבוליים קלאסיים פעמים רבות מתמקדים בפרטים של מסלולים ספציפיים, גישת metabolomic החדשה מיועדת לחקירה כוללנית של הפרופיל המטבולי הגלובלי של הרקמה תחת שיקול.אחת תוצאות של תפיסה זו היא צורך ברור לכלים אנליטיים שלמזער את ההטיה לכיוון מסלולי מטבוליים ספציפיים ו / או סוגי תרכובות. עם זאת, assay ביוכימיים קלאסי מבוסס על תגובה כימית מסוימת של אנליטי ספציפי שצריך להיות מוגדרים לפני assay מבוצע. בניגוד לכך, טכניקות ספקטרוסקופיות כגון תהודה מגנטית ספקטרוסקופיה הגרעינית (NMR) וספקטרומטריית מסה (MS) (i) מבוססות על מאפיינים מסוימים מולקולריים (פיזיים) של תרכובות ביוכימיות, כל אחד מהם מעורר אותות אחד או כמה ברורים בספקטרום זוהה במהלך ניסוי אחד; וכן (ii) לזהות מספר רב של תרכובות שונות לכל ניסוי. לפיכך, כל ספקטרום מכיל מידע המשולב של מגוון רחב של מטבוליטים כל. מסיבה זו, שיטות ספקטרוסקופיות הם כלים נאותים לmetabolomics, כמו שאף בחירה לפני צריכה להיעשות לגבי אופי אנליטי כדי להימדד 8 </sup&gt;. כתוצאה מכך, הטכניקות הללו באופן טבעי להשאיל את עצמם ללימודי חיפושי נפט מכיוון שיקלו על זיהוי של שינויים מטבוליים בלתי צפויים במידה רבה. למרות ספקטרוסקופיה NMR וMS ניתן להשתמש לסירוגין לניתוח מטבוליטים רבים, כל שיטה הוא בעל יתרונות וחסרונות לאחרונה כי נבדקו 10 ספציפיים. בקצרה, ספקטרוסקופיה NMR יכולה בדרך כלל להתבצע מתמציות גולמיים ואינה דורשת הפרדת chromatographic של תרכובות מדגם לפני הניתוח. בניגוד לכך, MS עובד עם גז או כרומטוגרפיה נוזלית (GC או LC) הפרדה, למעט התפתחויות מסוימות האחרונות כגון הדמיה ספקטרומטריית מסה. בכמה מקרים מיוחדים, כגון הניתוח של סוכרים, הפרדת LC עשויה להיות הכרח עבור ספקטרוסקופיה NMR, כמו גם, כי קווי התהודה של סוכרים שונים חופפים באופן משמעותי בפרוטון (1 H) NMR ספקטרום. אף על פי כן, ספקטרוסקופיה H NMR 1 ללא chrהפרדת omatographic נשארה השיטה הפופולרית ביותר, כמעט אוניברסלי השימושית metabolomic NMR. באופן כללי, הכנת מדגם היא יותר זמן רב ומורכב עבור MS מאשר לספקטרוסקופיה NMR. בעיות חמורות בשל השפעות מטריצה ​​הן הרבה פחות נפוצות בספקטרוסקופיה NMR מאשר בטרשת הנפוצה שבו הם עלולים להוביל לאותות משמעותי מוחלשים. quantitation המטבוליט ניתן להשיג גם עם שיטה. עם זאת, תרכובות סטנדרטיים מרובות נדרשות עבור MS עקב שינויים בהשפעות מטריצה ​​ויעילות יינון בין מטבוליטים. לעומת זאת, רק אחד סטנדרטית לדגימה דרושה לניתוח ספקטרוסקופיות NMR כי בתנאי מדידה מתאימים, השיטה השנייה היא מהותית בזכות כמותיים לתגובת NMR ליניארי בקפדנות על ידי הגרעינים שנצפו. חסרון עיקרי של NMR הוא הרגישות הנמוכה יחסית שלה. MS, בLC-MS בפרט, הוא רגיש יותר מתמ&quot;ג על ידי צווים שונים של גודל; מסיבה זו, הטרשת הנפוצה היא להיות מועדפת על פני NMR לניתוח של תרכובות המתרחשות בריכוזים נמוכים מאוד. מצד השני, הטבע הורסות של ניסוי NMR הוא יתרון ברור על פני MS; בדרך זו, ניתן לבצע NMR שוב ושוב על אותו המדגם, למשל, לגרעיני NMR פעיל שונים כגון 1 H, זרחן 31 ב( 31 בP), פחמן -13 (C 13), פלואור-19 (19 F) וכו &#39;., כמו שאף חומר הנצרך על ידי NMR בניגוד למדידות MS. יכולים להיות מועסק NMR וMS הן במצבים שונים, כל אחד מהם להיות אופטימלי לזיהוי של תרכובות עם מאפיינים כימיים מסוימים. לדוגמא, ביום 31 בP NMR הוא לעתים קרובות מתאים יותר מ1 H NMR לניתוח של תרכובות פוספורילציה מרוכזות במתינות, אם כי מטבוליטים כמעט כל פוספורילציה גם מכילים פרוטונים. עם זאת, 1 אותות H NMR שלהם עשויים להיות מוסתרים על ידי 1 אותות H NMR מתרכובות אחרות, שאינה פוספורילציה, ואילו האחרוניםברור שאתה לא לגרום לאותות רקע ביום 31 בספקטרום P NMR. במצב אנלוגי, 19 ניתוח F NMR יש להעדיף לתרכובות פלואור, למשל, תרופות פלואור (אין אותות רקע ממטבוליטים אנדוגני), ואילו במקרה המיוחד של 13 C NMR הוא עניין כמעט אך ורק אם גורלו של 13 C- מבשרי חילוף חומרים אקסוגניים שכותרת צריך להיות אחרי, בשל השפע הטבעי הנמוך מאוד של איזוטופ 13 C (בערך 1%). ספקטרומטרים המוניים רבים לעבוד במצב או יונים שליליים או במצב יון חיובי. לכן, חשוב לדעת מראש את הניתוח אם היונים כדי לצפות חיוב או לשלילה יחויבו. אנו מתמקדים כאן בפרוטוקול לניתוח metabolome רקמת המוח על ידי H 1 ויום 31 בספקטרוסקופיה P NMR כי שיטה זו מניבה מספר גדול של ריכוזי המטבוליט חשובים בעלות נמוכה במונחים של זמן (i) דרוש למדגם הכנהnd (ii) מאמץ הנדרש כדי לכמת את המטבוליט. ניתן לבצע את כל הניסויים באמצעות הציוד של מעבדה כימיה רטובה סטנדרטית ומתקן ספקטרוסקופיה NMR ברזולוציה גבוהה. דרישות נוספות המתוארים בסעיף הפרוטוקול להלן.

<table><tbody><tr><td>Isoflurane</td><td>Virbac</td><td>Vetflurane</td><td>Anesthet לבעלי חיים</td></tr><tr><td>Isoflurane וופורייזר Ohmeda</td><td></td><td>Isotec 3</td><td>דגם חדש יותר זמין: Isotec 4</td></tr><tr><td>אזמל, מספריים, מלקחיים, מהדקים</td><td>מכשירי הרווארד Fisher Scientific</td><td>שונים </td><td>ציוד כירורגי שונים לבעלי חיים</td></tr><tr><td>כלי מהדק הקפאה</td><td>ביתי</td><td>n/a</td><td>מלקחיים עם לוחות אלומיניום, להכנסה בחנקן נוזלי לקירור</td></tr><tr><td>Dewar</td><td>Nalgene</td><td>4150-4000</td><td></td></tr><tr><td>חנקן</td><td>נוזלי אוויר נוזלי</td><td>n/a</td><td></td></tr><tr><td>גז חנקן</td><td>אוויר נוזלי</td><td>n/a</td><td></td></tr><tr><td>מאייד חנקן</td><td>Organomation Associates</td><td>N-EVAP 111</td><td>ניתן להחליף במכשיר תוצרת בית</td></tr><tr><td>Mortar</td><td>Sigma-Aldrich</td><td></td><td></td>Z247472</tr><tr><td>עלי</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>Z247510</td><td></td></tr><tr><td>הומוגנייזר רקמות</td><td>קינמטיקה</td><td>פוליטרון</td><td>עם מבחנות המתאימות פיר הומוגנייזר</td></tr><tr><td>משקל אלקטרוני</td><td>Sartorius</td><td>n/a</td><td></td></tr><tr><td>מתנול</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>M3641</td><td></td></tr><tr><td>כלורופורם</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>366910</td><td></td></tr><tr><td>צינורות צנטריפוגה מזכוכית</td><td>Kimble</td><td>45500-15, 45500-30</td><td>Kimax 15 מ"ל, צינור 30 מ"ל</td></tr><tr><td>צינורות מיקרוצנטריפוגה</td><td>Kimble</td><td>45150-2</td><td>Kimax 2 מ"ל; צריך להחליף שפופרת "Eppendorf" אם תואם לרוטור צנטריפוגה</td></tr><tr><td>פיפטות פוליסטירן</td><td>Costar Corning</td><td>Stripettes</td><td>5 ו-10 מ"ל נפחים</td></tr><tr><td>Deuterochloroform</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>431915</td><td>99.96% deuterated</td></tr><tr><td>תחמוצת דאוטריום</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>423459</td><td>99.96% דאוטריום</td></tr><tr><td>כלוריד</td><td>אלפא אסאר</td><td>42406</td><td>20% בתחמוצת דאוטריום</td></tr><tr><td>נתרן דאוטרוקסיד</td><td>סיגמא-אולדריץ</td><td>' 164488</td><td>30% בתחמוצת דאוטריום</td></tr><tr><td>ליופילייזר</td><td>כריסט</td><td>אלפא 1-2</td><td></td></tr><tr><td>צנטריפוגה קרה</td><td>הראוס</td><td>מגפוגה 16R</td><td></td></tr><tr><td>מד pH</td><td>Eutech Cybernetics</td><td>Cyberscan</td><td></td></tr><tr><td>CDTA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D0922</td><td></td></tr><tr><td>צזיום הידרוקסיד</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>516988</td><td></td></tr><tr><td>צינורות NMR</td><td>Wilmad</td><td>528-PP</td><td></td></tr><tr><td>NMR גזע קואקסיאלי הכנסה</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>Z278513</td><td>מאת וילמד</td></tr><tr><td>NMR פיפטות</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>Z255688</td><td></td></tr><tr><td>מחקר פיפטס</td><td>אפנדורף</td><td></td><td>עם טיפים לנפחים מ-0.5 עד 1,000 &mu; l</td></tr><tr><td>Pipet-Aid</td><td>Drummond</td><td>XP</td><td></td></tr><tr><td>ספקטרומטר NMR</td><td>Bruker</td><td>AVANCE 400</td><td>כולל בדיקה ואביזרים אחרים</td></tr><tr><td>תוכנת NMR</td><td>Bruker</td><td>TopSpin 1.3</td><td>גרסה חדשה יותר זמינה: Topspin 3.2</td></tr><tr><td>תרכובות סטנדרטיות מסיסות במים</td><td>Sigma-Aldrich</td><td></td> תרכובות סטנדרטיות שונות <td></td>של</tr><tr><td>פוספוליפידים</td><td>Avanti Polar Lipids Doosan Serdary Sigma-Aldrich</td><td>שונים שונים מקור שונה</td><td>לפלסמלוגנים, אך עשוי להיות < 70 - 80% טוהר</td></tr><tr><td>מתילנדיפוספונאט</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>M9508</td><td></td></tr><tr><td>TSP-d4</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>269913</td><td></td></tr></tbody></table>

ניתוח metabolomic של מוח חולדה על ידי ספקטרוסקופיה בתהודה מגנטית הגרעינית ברזולוציה גבוהה של תמציות רקמות

Metabolomic Analysis of Rat Brain by High Resolution Nuclear Magnetic Resonance Spectroscopy of Tissue Extracts

מחקרים על ביטוי גנים ברמות ה-RNA והחלבון שימשו זה מכבר לחקר תהליכים ביולוגיים העומדים בבסיס מחלות. לאחרונה, גנומיקה ופרוטאומיקה הושלמו על ידי ניתוח כמותי מקיף של מאגר המטבוליטים הקיים במערכות ביולוגיות. אסטרטגיה זו, המכונה מטבולומיקה, שואפת לספק אפיון גלובלי של משלים המולקולות הקטנות המעורב בחילוף החומרים. בעוד שהגנום והפרוטאום מגדירים את המשימות שהתאים יכולים לבצע, המטבולום הוא חלק מהפנוטיפ בפועל. בין השיטות המשמשות כיום במטבולומיקה, טכניקות ספקטרוסקופיות מעניינות במיוחד מכיוון שהן מאפשרות לנתח בו זמנית מספר רב של מטבוליטים ללא בחירה מוקדמת עבור מסלולים ביוכימיים ספציפיים, ובכך לאפשר גישה רחבה ובלתי מוטה. כאן, מוצג פרוטוקול ניסיוני אופטימלי לניתוח מטבולומי על ידי ספקטרוסקופיה NMR ברזולוציה גבוהה, שהיא שיטת הבחירה לכימות יעיל של מטבוליטים של רקמות. נקודות חוזק חשובות של שיטה זו הן (i) שימוש בתמציות גולמיות, ללא צורך בטיהור הדגימה ו/או מטבוליטים נפרדים; (ii) האופי הכמותי הפנימי של NMR, המאפשר כימות של כל המטבוליטים המיוצגים על ידי ספקטרום NMR עם תרכובת ייחוס אחת בלבד; ו-(iii) האופי הלא הרסני של NMR המאפשר שימוש חוזר באותה דגימה למדידות מרובות. הטווח הדינמי של ריכוזי המטבוליטים שניתן לכסות הוא ניכר בשל התגובה הליניארית של אותות NMR, אם כי מטבוליטים המתרחשים בריכוזים נמוכים במיוחד עשויים להיות קשים לזיהוי. עבור התרכובות הפחות נפוצות, שיטת ספקטרומטריית המסה הרגישה ביותר עשויה להיות יתרון, אם כי טכניקה זו דורשת הליכי הכנת דגימה וכימות מורכבים יותר מאשר ספקטרוסקופיה של NMR. אנו מציגים כאן פרוטוקול NMR המותאם לניתוח מוח של חולדות; עם זאת, ניתן ליישם את אותו פרוטוקול על רקמות אחרות עם שינויים קלים.

כדי להשיג רזולוציה הטובה ביותר בספקטרום NMR חילוף חומרים של מוח ותמציות רקמות אחרות, זה כבר זמן רב מנהג נפוץ כדי להסיר או יוני מסכת מתכת (הכי חשוב: יוני פאראמגנטיים) קיימים בפתרוני תמצית. זו הושגה על ידי הוספת סוכן chelating כגון EDTA או CDTA לתמצית 19, או על ידי העברת התמצית דרך שרף חילוף יונים כגון Chelex-100 20. התוצאות מוצגות באיור 1 מראות כי צעד זה אינו הכרחי לצורך הניתוח ספקטרוסקופיות NMR H 1 אם תמציות מוח שהוכנו בקפידה על פי...

הנוירוכימיה של מוח היונקים משתנה במחלות נוירולוגיות ומערכתיות רבות. ניתן להשיג ביעילות פרופילים אופייניים של מטבוליטים מוחיים על סמך תמציות גולמיות של רקמת המוח. לשם כך נעשה שימוש בספקטרוסקופיה של תמ"ג ברזולוציה גבוהה, המאפשרת ניתוח כמותי מפורט של ריכוזי מטבוליט (מטבולומיקה).

Studies of gene expression on the RNA and protein levels have long been used to explore biological processes underlying disease. More recently, genomics ...

המטרה הכוללת של הליך זה היא להשיג פרופילי מטבוליט ברזולוציה גבוהה מתמציות מוח של חולדות. זה מושג על ידי קצירת מוחות של חולדות והקפאתם בחנקן נוזלי. השלב השני הוא חילוץ מטבוליטים במוח על ידי הומוגניזציה של רקמה במי מתנול כלורופורם, ולאחר מכן הסרת חלבונים מפורקים וממיסים אורגניים.לאחר מכן, הדגימות המימיות עוברות ליופיליזציה וכל הדגימות הן רזול בממיסים מוגדרים היטב. לניתוח ספקטרוסקופי אופטימלי של NMR, השלב האחרון הוא הגדרה קפדנית ואופטימיזציה של ניסויי NMR מטבולומיים. בסופו של דבר, ספקטרום NMR נדרש בתנאי ניסוי מוגדרים היטב ומוערך באמצעות פרוטוקולי עיבוד נתונים אופטימליים.למרות ששיטה זו יכולה לספק תובנה לגבי חילוף החומרים במוח, ניתן ליישם אותה גם על רקמות רכות אחרות כגון גידולים, כבד, כליות ואיברים אחרים. ראשית, הסר דגימת רקמת מוח קפואה שהוכנה בעבר מהמקפיא במינוס 80 מעלות צלזיוס. לאחר מכן העבירו מיד את דגימת הרקמה למרגמה מלאה חלקית בחנקן נוזלי.השתמש בעלי חנקן נוזלי קר כדי לשבור את רקמת המוח הקפואה לחתיכות קטנות יותר שנכנסות בקלות למבחנות המשמשות להומוגניזציה של רקמות. בעקבות הערבוב הזה, החתיכות הקטנות של רקמת המוח הקפואה שוקלות ביסודיות 250 עד 350 מיליגרם של הרקמה ומעבירות אותה למבחנה מלאה בסך הכל בארבעה מיליליטר של מתנול קר כקרח. בכל פעם שמוסיפים חתיכות של רקמה קפואה למבחנה, הפוך אותן להומוגניזציה מיד עם הומוגנייזר הרקמות.לאחר שהחתיכה האחרונה של דגימת מוח של חולדה קפואה נוספה למבחנה והומוגנית, העבירו את ההומוגנאט לבקבוקון זכוכית גדול או שווה ל-20 מיליליטר. סגור את מכסה הבורג והניח את ההומוגנאט על קרח למשך 15 דקות. לאחר מכן, הוסף ארבעה מיליליטר של כלורופורם קר כקרח להומוגנאט ולמערבולת ביסודיות.בסיום, הניחו את ההומוגנאט על קרח למשך 15 דקות. הוסף ארבעה מיליליטר מים להומוגנאט לאחר מערבולת יסודית, תן להומוגנאט לעמוד על מינוס 20 מעלות צלזיוס למשך הלילה. להפרדת פאזה מלאה, העבירו את התמיסה ההומוגנטית של רקמת המוח לצינור גדול או שווה צינור צנטריפוגה עמיד לכלורופורם של 20 מיליליטר וצנטריפוגה את הדגימה ב-13,000 גרם וארבע מעלות צלזיוס למשך 40 דקות.לאחר צנטריפוגה, השתמש בפיפטה פסטר כדי להעביר את השלב העליון לצינור מתאים עמיד בפני מתנול של 15 מיליליטר. לאחר מכן השתמש בפיפטה פסטר טרייה כדי להעביר את השלב התחתון לצינור מתאים, גדול או שווה של 15 מיליליטר עמיד לכלורופורם, והנח אותו על קרח תוך שמירה על הצינור עם שלב המתנול במים על קרח. אידוי המתנול על ידי הפניית זרם חנקן יבש לתמיסת התמצית.סיים את תהליך האידוי כאשר חנקן מבעבע. כבר לא גורם להפחתת נפח בתמיסת התמצית. לאחר הנחת הצינור עם שלב המתנול כלורופורם על קרח, אידוי המתנול על ידי הפניית זרם חנקן יבש על פני תמיסת המיצוי.כאשר כל הממס מתאדה, סגור את הצינור ושמור את הדגימה במינוס 80 מעלות צלזיוס עד שתהיה מוכנה לניתוח NMR. כדי להכין את השלב המימי לליופיליזציה, העבירו את הדגימה המימית לצינור צנטריפוגה שטוף היטב של 50 מיליליטר. לאחר מכן הקפיאו את תמיסת התמצית על ידי סיבוב צינור הצנטריפוגה בחנקן נוזלי כך שהמשטח הפנימי של הצינור מכוסה בהדרגה על ידי הנוזל הקפוא.כאשר כל הנוזל קפוא, מכסים את הצינור במכסה בורג מנוקב כדי לאפשר לאדים לברוח והנח את הצינור בבקבוק מסנן ואקום רחב צוואר. לאחר הצמדת הבקבוק למייבש ההקפאה, התחל את הליופיליזציה, סיים את תהליך הליופיליזציה. כאשר הדגימה יבשה לחלוטין, שמור את הדגימה במינוס 80 מעלות צלזיוס בצינור סגור עד לשימוש לניתוח NMR.לניתוח תמ"ג זרחן של פוספוליפידים, ממיסים את השומנים המיובשים ב-700 מיקרוליטר של תערובת של חמישה עד ארבעה לאחד של מתנול כלורופורם דוטראט, ותמיסת CDTA מימית של 200 מילי-מולאר. העבירו את הדגימה לצינור מיקרו צנטריפוגה באמצעות מיקרו פיפטה עם תזוזה ישירה עם קצה עמיד לכלורופורם. בשלב זה, הגדר את ויסות הטמפרטורה של בדיקת ה-NMR לערך היעד הרצוי, שהוא בדרך כלל צנטריפוגה של 25 מעלות צלזיוס.תמיסת תמצית הפוספוליפידים בארבע מעלות צלזיוס ו-11,000 גרם למשך 30 דקות כדי לסובב את השאריות המוצקות בדגימה. בסיום, העבירו 600 מיקרוליטר של הסופר נאטין לצינור NMR איכותי בקוטר חיצוני של חמישה מילימטרים. הכן את גזע ההכנסה הקואקסיאלי המתאים מלא בתמיסת מתילן דיפוספט מימית של 20 מילי-מולרית ב-pH 7.0 לצורך התייחסות וכימות של הסטה כימית.הנח את התוספת הזו בצינור ה-NMR המלא בתמיסת תמצית הפוספוליפידים. לאחר מכן, התקן את צינור ה-NMR עם הספינר המתאים והעביר אותו למגנט ה-NMR. סובב את הדגימה ב-15 עד 20 הרץ לאחר המתנה עד שהדגימה הסתגלה לטמפרטורה שנקבעה.צמצם בזהירות את השדה המגנטי בהומוגניות על פני הדגימה על ידי התאמת זרמי סליל ה-shim של ציר המופעל ומחוץ לציר מגדירים את פרמטרי רכישת ספקטרום ה-NMR לערכים האופטימליים, שעשויים להשתנות כפונקציה של חוזק שדה המגנט. לאחר סיום רכישת הספקטרום, עבד את דעיכת האינדוקציה החופשית באמצעות פרמטרים אופטימליים כדי להשיג את התוצאות הטובות ביותר עבור כל מגוון התהודה הפוספוליפידית. חזור על העיבוד באמצעות שני הליכי סינון שונים לפחות.לבסוף, סנן אותות חלשים ורחבים מאוד ללא חפיפה משמעותית על ידי איזציה כדי להגדיל את יחס האות לרעש. בניסוי זה התקבלו קווים ספקטרליים צרים במיוחד עבור כל האזורים הספקטרליים שנותחו גם באזורים צפופים מאוד. פסגות במרחק של פחות מ-0.01 P PP M ניתנות להפרדה כמעט לחלוטין ב-400 מגה-הרץ.כתוצאה מכך, ניתן לחזות ניתוח איכותי וכמותי של הפסגות הקטנות הרבות, אך שאינן מוקצות כרגע, בקו העתידי ההולך ומצטמצם על ידי בחירה ב-1000 מילי-מולר במקום 200.מילי-מולארי. CDTA היה רצוי אך הביא להיצרות סופרפוזיציה של קו אותות הפוספוליפידים על ידי בחירה ב-277 קלווין במקום 297. קלווין היה רצוי אך הביא גם לסופרפוזיציה של אותות פוספוליפידים.ירידה בריכוז ה-CDTA מ-200 מילי-מולרי ל-50 מילי-מולרית מביאה רק לעלייה צנועה ברוחב הקו וכמעט ללא שינוי בתזוזות הכימיות. עם זאת, שימו לב שריכוז הרקמה בתמצית CDTA של 50 מילי-מולרית גבוה במחצית מהריכוז בתמצית CDTA של 200 מילי-מולרי. כדי להסביר את הקווים הצרים יחסית, זוהה מספר רב של פוספוליפידים הניתנים לכימות המכסים טווח ריכוזים ניכר.רזולוציה ספקטרלית מספיקה אפילו כדי לזהות באופן שגרתי פיצול חלקי של פסגות מסוימות. כתוצאה מכך, ניתן לצפות בעתיד ניתוח איכותי וכמותי של תת-קבוצות פוספוליפידים נוספות. בעת ניסיון הליך זה, חשוב לזכור לבצע כל שלב בזהירות רבה כדי להבטיח ניתוח מטבוליט אופטימלי.

metabolomic-analysis-rat-brain-high-resolution-nuclear-magnetic

Research

JoVE Journal

Neuroscience

מדעי המוח

שיטה להפקת המטבוליט מקהילות planktonic חיידקים מוצגת. דגימה כל הקהילה מושג באמצעות סינון על מסנני שהוכנו במיוחד. לאחר lyophilization, מימית מסיסים מטבוליטים חילוץ. גישה זו מאפשרת יישום של metabolomics סביבתיים חוצה omics חקירות של קהילות חיידקים טבעיים או ניסיוני.

ריכוז מטבוליטים של צפיפות נמוכה עבור קהילות Planktonic metabolomics הסביבה באמצעות תהודה מגנטית גרעינית ספקטרוסקופיה

אנו מתארים מודל עכברים של הפרעת פוסט טראומטית (PTSD) החושפת את השינויים המתמשכים בתפקוד נוירואנדוקריניים ותגובה המאוחרת לטווח ארוך, המוגזמת פחד, אופייניים לחולי PTSD. מודל החיה ושיטות שתוארו כאן הם שימושיים עבור correlating סמנים ביולוגיים בגרעיני מוח, שהם מכאניים אך לא ניתן למדוד בחולים, עם סמנים ביולוגיים בתאי דם לבן בפריפריה, שיכול.

סמנים ביולוגיים במודל חיה לחשיפה קושרת עצבית, המטולוגית, והתנהגות של PTSD

הליך קולוניזציה פרוגרסיבי מתואר להמשיך להעריך את השפעתה על מטבוליזם בכבד המארח. ההתיישבות מנוטר הלא פולשני על ידי הערכת הפרשת השתן של חיידקים שיתוף מטבוליטים על ידי אפיון NMR מבוססי המטבולית בזמן חילוף החומרים בכבד נבחנת על ידי Magic רזולוציה גבוהה זווית ספינינג (MAS HR) פרופיל התמ"ג של ביופסיה ללא פגע.

הערכת שינויים מטבוליים כבדית במהלך להתיישבות מתקדמת של עכבר נבט בחינם על ידי 1 H NMR ספקטרוסקופיה

דופאמין הוא מוסדר בבירור בגרעין המוח התיכון, אשר מכילים תאים הגופות דנדריטים של נוירונים דופאמין. כאן נתאר את הגישה לנתיחה ו מדגם הטיפול על מנת למקסם את התוצאות, ולכן מסקנות ותובנות, על ויסות הדופמין בגרעין המוח התיכון של nigra substantia (SN) ואזור tegmental הגחוני (VTA) במכרסמים.

פרופיל מקיף של הסדרת substantia nigra הדופמין ואזור Tegmental הגחון

מקור: Blanc, J., et al. ספקטרוסקופיה של תהודה מגנטית פונקציונלית ב-7 T בקליפת המוח של חבית החולדה במהלך הפעלת השפם. J. Vis. Exp. (2019)סרטון זה מדגים את השיטה לניתוח שינויים מטבוליים בקליפת חבית החולדה באמצעות ספקטרוסקופיה תהודה מגנטית תפקודית במהלך גירוי שפם. ספקטרום מטבוליט בסיסי מושווה לספקטרום מגורה כדי לזהות עלייה בלקטט בקליפת החבית, מה שמאשר הפעלה עצבית מוצלחת.

ספקטרוסקופיה תהודה מגנטית תפקודית של קליפת המוח של חבית החולדה במהלך גירוי שפם

טומוגרפיה של פליטת פוזיטרונים של בעלי חיים קטנים מאפשרת להעריך את שני מצעי האנרגיה העיקריים של המוח: גלוקוז וקטונים. בשיטה הנוכחית, 11C-acetoacetate ו-18F-fluorodeoxyglucose מוזרקים ברצף בכל בעל חיים, וספיגתם נמדדת כמותית באזורי מוח ספציפיים שנקבעו מתמונות התהודה המגנטית.

פרוטוקול PET-MRI Dual Tracer למדידה כמותית של קליטת מצעי אנרגיה אזוריים במוח בחולדה

לאחר בדיקת על-ידי דם חמצן-רמת-תלויי-פונקציונלי דימות תהודה מגנטית (fMRI מודגש) זה האזור המקביל של קליפת שדה חבית המגע (נקרא S1BF) כראוי מופעל, הראשי מטרתו של מחקר זה היא לכמת לקטט תוכן תנודות המוח עכברוש מופעל על ידי פרוטון מקומי תהודה מגנטית ספקטרוסקופיה (1H-גברת) ב ט...

ספקטרוסקופיה תהודה מגנטית תפקודית-7 T בקליפת חבית חולדה במהלך ההפעלה שפם

אנו מתארים הליכים לעיבוד רקמות המוח היילוד הנולד כדי להשיג מיקרוגרפים אלקטרונים ברזולוציה גבוהה עבור ניתוח מורמטרי של הפצת שלפוחית סינפטית במסופי העצבים. המיקרוגרפים שהושגו בשיטות אלה יכולים לשמש גם לחקר המבנה של מספר רכיבים סלולאריים אחרים ולמערכות היחסים המבדיות שלהם.

הכנת התינוק היילוד רקמת המוח עבור ניתוח בדיקת מבנית באולטרסאונד של הפצת שלפוחית סינפטית במסופי העצבים

פרוטוקול זה מתאר שיטה לקבלת נתוני הדמיית תהודה מגנטית תפקודית יציבה של מצב מנוחה (rs-fMRI) מעכברוש המשתמש באיזופלוראן במינון נמוך בשילוב עם dexmedetomidine במינון נמוך.

רכישת נתוני הדמיית תהודה מגנטית תפקודית של מצב מנוחה בחולדה

מאמר זה מציג את השימוש ב-PSYCHE וב-SAPPHIRE-PSYCHE באפיון מטבולי של צמחים וכולל נהלים מפורטים להכנת דגימות והקלטה אופטימלית של ספקטרום NMR Pure Shift. דוגמאות שבאמצעותן נדון הרווח ברזולוציה שהושג על ידי ניתוק הומו-גרעיני המאפשר הבנה מקיפה יותר של המערכת.

תהודה מגנטית גרעינית Pure Shift: כלי חדש למטבולומיקה של צמחים

רכישת נתוני טומוגרפיה דינמית של פליטת פוזיטרונים (PET) ושחזור למסגרות זמן מאפשרת ניתוח קישוריות מוחית מטבולית ברמת הנבדק היחיד. אנו מתארים שיטה לרכישת נתוני PET דינמיים [18F]FDG של מוח החולדה וקבלת מטריצת קישוריות באמצעות חילוץ עקומות זמן-פעילות של נפחים מעניינים.

חקר קישוריות מוחית מטבולית באמצעות טומוגרפיה דינמית של פליטת פוזיטרונים 2-deoxy-2-[18F]Fluoro-D-Glucose ברמת נבדק יחיד

למד ניתוח metabolomic של מוח חולדה באמצעות ספקטרוסקופיית NMR ברזולוציה גבוהה. השיטה כוללת הומוגניזציה של רקמה בנוזלי חילוץ, ליופיליזציה וניתוח כמותי של מטבוליטים. גישה זו מאפשרת חקר שינויים נוירוכימיים במחלות נוירולוגיות.

ניתוח metabolomic של מוח חולדה על ידי ספקטרוסקופיה בתהודה מגנטית הגרעינית ברזולוציה גבוהה של תמציות רקמות

גלה סרטונים נוספים