תרבויות Organotypic Slice ללמוד oligodendrocyte Dynamics וmyelination

המטרה הכוללת של הליך זה היא לחקור התפשטות והתמיינות של תאי שושלת אוליגודנדרוציטים בסביבה הדומה מאוד למה שנמצא in vivo. זה מושג על ידי הכנת תרביות פרוסות של ארבעה מוחות ומוח קטן מעכברים טרנסגניים מוקדמים לאחר הלידה. לאחר מכן מדמים תאים בודדים בפרוסות לאורך פרקי זמן של שעות עד ימים כדי לדמיין את הדינמיקה התאית של התפשטותם והתמיינותם.

לאחר הדמיה, אימונוהיסטוכימיה פוסט-הוק של התאים משמשת לקביעת מאפיינים תאיים שונים. בסופו של דבר, התוצאות יכולות להראות את הדינמיקה של התפשטות התאים והתמיינות בתנאים רגילים ולאחר מניפולציה תרופתית או גנטית. היתרון העיקרי של טכניקה זו על פני שיטות קיימות כמו פחם מנותק, תרביות של נוירונים ותאי שושלת ליגה אינציט הוא שתרביות פרוסות מאפשרות מניפולציה של הסביבה הא-תאית תוך שמירה על ארכיטקטורת ציטו רקמות.

כל ההליכים בבעלי חיים פועלים בהתאם להנחיות ואושרו על ידי הוועדה המוסדית לטיפול ושימוש בבעלי חיים באוניברסיטת קונטיקט לפחות שעתיים לפני הנתיחה. הכן תוספות תרבית רקמות בשש צלחות באר לכל אחת. ובכן, הוסף מיליליטר אחד של מדיום תרבית פרוסות, ולאחר מכן העביר את הצלחות לחממת תרבית התאים ב-37 מעלות צלזיוס עם 5% פחמן דו חמצני לפחות 15 דקות לפני הדיסקציה.

שים את מאגר הדיסקציה על קרח והתחל לבעבע אותו עם 95% חמצן, 5% גז פחמן דו חמצני. כמו כן, ודא שכל הכלים ומסוק הרקמות מעוקרים עם 70% אתנול. העבירו את הרקמה לצלחת סטרילית בגודל 35 מילימטר המכילה מאגר חיתוך מחומצן קר כקרח.

לאחר מכן, בעזרת סכין גילוח, חתכו את המוח הקטן והמוח הקדמי לאחר מכן עם חתך סגיטלי דרך המוח הקדמי והמוח הקטן המפריד בין ההמיספרות. כעת באמצעות המסוק הידני, צור חלקים קורונליים וסגיטלים בעובי 300 מיקרון של ארבעת המוח והמוח הקטן. כל בעל חיים מניב בדרך כלל שש פרוסות ארבע פרוסות מוח ושש פרוסות מוח קטן.

באופן אידיאלי לוקח פרוסות המשתרעות על השליש הקדמי של הקורפוס קלוסום על מנת לחקור אזורי חומר אפור ולבן באותה פרוסה. מעבירים את הפרוסות המופרדות למאגר חיתוך קר טרי מבעבע על קרח במאגר, בעזרת מרית קטנה לחיתוך או שקילה. הפרד את החלקים הבודדים והעביר אותם לדגירה מראש.

שש כלי באר ובהם תוספות תרבית. ניתן להניח שתיים עד שלוש פרוסות על תרבות אחת. הכנס את הצינור מכל מאגר חיתוך עודף מפני השטח של התרבית.

הכנס והעביר את הצלחות לחממה עד לקיבוען. יש להחליף את מדיום הפרוסה יום לאחר הכנת הפרוסה, ולאחר מכן כל יומיים עד לקיבוע הפרוסה כאמור בפרוטוקול. בהתאם לניסוי, השתמש בפרוסות לאחר חמישה עד שבעה ימים.

בתרבות. השתמש רק בפרוסות שהופכות שקופות לאחר הימים הראשונים והשליך את אלה שיש להן אזורים אטומים לא אחידים הנראים לעין בלתי. תחת ניגודיות פנים, אזורים אטומים אלה נראים כגוש של תאים כהים.

אם מבוצעים כהלכה, אזורים אטומים מתים מתרחשים בלא יותר מאחד עד 5% מהפרוסות. כדי לבצע הדמיית זמן-lapse של התפשטות והתמיינות של שני תאי NG, השתמש בפרוסות בנות שלושה עד חמישה ימים מעכברים המבטאים EGFP בשני תאי NG. אל תתנו למגלשות לרדת מתחת ל-37 מעלות צלזיוס במשך יותר מ-15 דקות.

בכל סשן הדמיה, תוך שמירה על הלוח סגור, השתמש במטרה של פי 10 של מיקרוסקופ פלואורסצנטי הפוך כדי לצלם תמונות בפעם הראשונה. נקודת התרבות. דמיינו ארבעה עד שמונה מיקומים בכל פרוסה מאזורי החומר האפור והלבן של הפרוסה.

כמו כן, ציוני דרך שימושיים בתמונה כגון קצוות הפרוסות, תאים מסוימים או כיוון של מסלולים של חומר לבן למטרות העברה. תמונת נקודת הזמן הקודמת יכולה לשמש כתמונת ייחוס במהלך רילוקיישן עבור חלוקת שני תאים של NG והתמיינות אוליגודנדרוציטים. צלם תמונות כל ארבע עד שש שעות למשך חמישה עד שבעה ימים.

אם נעשה שימוש בסמן ההשראה NG two cre, ER YFP, לגרום לביטוי מדווח באמצעות מדיום תרבית עם 100 ננו טוחנת. ארבעה הידרוקסי טמוקסיפן מומסים בפעילות מדווח אתנול אמורים להופיע תוך יום עד יומיים. לקיבוע, הוסף מיליליטר אחד של קיבוע לתחתית התרבות.

מכניסים ומוסיפים עוד מיליליטר על גבי הפרוסות. אין להשפריץ את הקיבוע ישירות על הפרוסות אחרת הן עלולות להתנתק. מקבעים את הטישו למשך 30 דקות בארבע מעלות צלזיוס ולאחר מכן בעזרת אזמל.

חותכים את הממברנות כשהפרוסות מחוברות. בעזרת פינצטה מעבירים בזהירות את הפרוסות לבארות בודדות של צלחת 24 באר עמוסה ב- PBS. לאחר מכן, העבירו את הפרוסות לצלחת שנייה של 24 בארות עמוסה בתמיסת חסימה המכילה 5% סרום עיזים רגיל ו-0.1% טריטון X 100 ב-PBS.

אפשר להם לדגור בתמיסה החוסמת למשך שעה בטמפרטורת החדר. לאחר החסימה, העבירו את הפרוסות לצלחת עמוסה בנוגדנים ראשוניים ב-PBS עם 5% NGS. אפשר להם לדגור למשך הלילה בארבע מעלות צלזיוס למחרת.

שוטפים את הפרוסות ב- PBS. לאחר מכן דגרו את הפרוסות עם נוגדנים משניים ב-PBS עם 5% NGS. הניחו לדגירה למשך שעה בטמפרטורת החדר.

עקוב אחר זה עם שלוש שטיפות נוספות ב-PBS כמו קודם והרכיב את הפרוסות כשהממברנה פונה לשקופית כך שהיא לא תהיה בין המטרה לרקמה. כדי לנתח את הדינמיקה הזמנית של התמיינות אוליגודנדרוציטים, התקבלו תמונות של חלוקת שני תאים של NG מתרביות פרוסות של המוח הקדמי מעכברים טרנסגניים P 8 NG שני זוחלים במשך מספר ימים, רצפי זמן-lapse נלקחו במשך 122 שעות. הפנוטיפ של התאים המחולקים נקבע עם נוגדנים NG two ו-CC one.

התפשטות התאים הוערכה גם באמצעות צביעה אימונוהיסטוכימית לסמן התפשטות התאים. מיפוי פיתיון KI 67 של שני תאים NG בוצע לאחר אינדוקציה של רקומבינציה של CRE בפרוסות משני עכברי CRE YFP. יומיים לאחר הוספת ארבעה הידרוקסי טמוקסיפן.

מדווח YFP המבטא NG נמצאו שני תאים חיוביים בתרביות. ארבעה ימים לאחר מכן, חלק מהתאים הללו התמיינו לציטים אוליגודנדרוציטים חיוביים CC אחד. אוליגודנדרוציטים בוגרים צולמו בתרביות פרוסות מוח קטן מ-P-L-P-D-S.

נוירוני פרקין עם מיאלין של עכברים אדומים היו נוכחים בתרבויות אלה. הדמיה חוזרת ונשנית הראתה תוספת של מיאלין DS אדום המבטא אוליגודנדרוציטים כימיה אימונוהיסטו בפרוסות אלה הראתה ביטוי משמעותי של חלבון בסיסי של מיאלין. לבסוף, הדמיה ברזולוציה זמנית גבוהה יותר חשפה גופי תאי אוליגודנדרוציטים יציבים עם כמה תנועות קלות בתהליכים דיסטליים.

לאחר צפייה בסרטון זה, אתם אמורים להבין היטב כיצד להכין תרביות פרוסות הן מארבעת המוח והן מהמוח הקטן לדמות שוב ושוב תאים בודדים במשך ימים עד שעות ולנתח את גורלם של תאי תמונה באמצעות אימונוהיסטוכימיה לאחר הו. בנוסף להדמיה, פרוסות אלו מאפשרות גם מניפולציה של הסביבה התאית תוך שימוש בטכניקות מיפוי גורל כגון רקומבינציה של קרם השראת בפרוסה מוכנה.