Name: תרבויות Organotypic Slice ללמוד oligodendrocyte Dynamics וmyelination (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-08-25T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 45 s
Description: חקור דינמיקה של תאי אוליגודנדרוציטים ותהליכי מיאלינציה באמצעות תרבויות פרוסות אורגנוטיפיות ממוח עכברים טרנסגניים. השיטה שומרת על ארכיטקטורת רקמות ומאפשרת הדמיה של תאים בודדים לאורך זמן.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

עבודה זו מומנה על ידי מענקים מהאגודה הלאומית לטרשת נפוצה (RG4179 ל-A.N.), המכונים הלאומיים לבריאות (NIH R01NS073425 ו-R01NS074870 ל-A.N.) והקרן הלאומית למדע (A.N). אנו מודים לד"ר פרנק קירכהוף (אוניברסיטת סארלנד, הומבורג, גרמניה) על שסיפק PLPDsעכברים טרנסגניים אדומים. אנו מודים ליופן סאן על עזרתה בשימור מושבת העכברים הטרנסגניים.

הערה: כל נהלי בעלי החיים פועלים בהתאם להנחיות ואושרו על ידי הוועדה המוסדית הטיפול בבעלי חיים והשימוש (IACUC) באוניברסיטת קונטיקט. הערה: בניסויים אלה (JAX # 008,538) המכוננים NG2cre 18 (JAX # 008,533) ועין מתנהלת NG2creER 16 עכברים הטרנסגניים חצו לZ / EG 19 (JAX # 003,920) או gtRosa26: בהתאמה שמשו כתב YFP (# 006,148 JAX) קווי 20 לתאי NG2 תמונה וצאצאיהם. לoligodendrocytes הבוגרת תמונה, עכברים הטרנסגניים PLPDsRed 21 היו בשימוש. להישרדות עולה בקנה אחד, יכולות להיות מבודדות מעכברי פרוסות עד לאחר לידה יום 10 משני המוח הקדמי ובמוח הקטן. .1 Slice הכנה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> במנדף תרבות, המקום מוסיף תרבית רקמה בשש צלחות גם ולהוסיף בינוני 1 מ&quot;ל פרוסת תרבות (מתכון בסעיף חומרים כימיים). שים את הצלחות בחממת תרבות תא ב37 ° C עם 5% CO 2 לפחות 2 שעות לפני לנתיחה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לעקר את כל הכלים ומסוק רקמות עם 70% אתנול. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חיץ בועת דיסקציה (מתכון בסעיף חומרים כימיים) עם 95% O 2, 5% CO 2 על קרח לפחות 15 דקות לפני תחילת הנתיחה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הרדימי גורי עכבר על ידי הצבת אותם על קרח ל5-10 דקות על פי פרוטוקולים של בעלי חיים שאושרו. לברר את העומק המתאים של הרדמה על ידי המאשר כי העכברים אינם מגיבים לזנב וצביטת הבוהן. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לערוף בעלי חיים באמצעות מספריים חדים בעקבות פרוטוקולים של בעלי חיים. להסיר במהירות את הגולגולת מעל המוח הקדמי ובמוח הקטן על ידי ביצוע חתך sagittal ואחריו חתך לרוחב, תוך שימוש בכלים מעוקרים הראשון. לחתוך עצבי גולגולת מפני שטח הגחון של המוח והמוח הקטן על ידי גלגול הרקמה לצד בזהירות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הנח רקמה בצלחת 35 מ&quot;מ סטרילית המכילה מאגר נתיחת חומצן קר כקרח. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> באמצעות סכין גילוח, לנתק את המוח הקטן ומוח קדמי. ואז לעשות חתך באמצע sagittal throאיכס המוח הקדמי ובמוח קטן, שמפריד בין האונות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חותך 300 סעיפי העטרה וsagittal מיקרומטר בעובי של המוח הקדמי ובמוח קטן עם מסוק רקמה ידני. הערה: מסוק רקמה ידני מאפשר עיבוד מהיר מנתיחה כדי דגירה התרבות ללא הצורך בהטבעת agarose. גם vibratome יכול לשמש כפי שתואר לעיל 9. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העבר את הפרוסות מופרדות לחיץ לנתיחה קרה טרי מבעבע על קרח. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש לנתח קטן או במשקל מריות להפריד חלקים בודדים ולהעבירם לpreincubated שש מנות היטב עם התרבות מוסיף. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את כל חיץ נתיחה עודף מפני שטח של להכניס את התרבות באמצעות פיפטה העברה חד פעמית או קצה pipet P 200. שתיים עד שלושה מוח קדמי או שלוש פרוסות של מוח קטנים יכולים להיות ממוקמים על להכניס את התרבות אחד. הערה: לקבלת תוצאות בקנה אחד עם תרבויות מוח קדמיות, הוא אידיאלי לקחת פרוסות פורש קדמי שליש מכפיס המוח(איור 1 א) כדי ללמוד את שני אזורי החומר האפורים ולבנים באותו פרוסה. כל בעל חיים, בדרך כלל מניב 6 פרוסות מוח קדמיות ו6 פרוסות המוח הקטן. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים את שש הצלחות גם בחממה ולהחליף את המדיום פרוס עם 1 מ&quot;ל של מדיום פרוס יום 1 לאחר הכנת פרוסה ולאחר מכן בכל יום אחר, עד שקיבעון פרוסה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בהתאם לניסוי, להשתמש פרוסות אחרי 5-7 ימים בתרבות. השתמש רק בפרוסות שנעשות שקוף לאחר הימים הראשונים וזורקים אותם שיש להם אזורים אטומים אחידים. הערה: אזורים אטומים בתוך פרוסות נראים על ידי העין ומופיעים כגוש של תאים שחורים מתחת לניגוד שלב. לאחר הטכניקה כבר שולטת, פרוסות אטומות מתות מתרחשות רק לעתים נדירות, בפחות מ 1-5% מפרוסות. </li></ol> 2 זמן לשגות הדמיה של חלוקת תא NG2 וoligodendrocyte בידול הערה: כדי לבצע הדמיה זמן לשגות של התפשטות תאי NG2 ובידול אנו משתמשים NG2cre: עכברי ZEG 16המבטא EGFP בתאי NG2 וצאצאיהם (תרשים 1C-E). ביטוי עיתונאי בתחום הזה הוא מספיק חזק כדי להשיג תמונות חיות של GFP + תאים בפרוסות מייד לאחר חתך לתקופה של לפחות ארבעה שבועות זמן. התמונות הברורות ביותר מתקבלות לאחר תקופת הדילול הראשונית של הפרוסה, אשר מתרחשת על 3-5 הימים הראשונים בתרבות. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאורך כל הניסוי, לשמור את הפרוסות בתרבית תאי חממה ב 37 מעלות צלזיוס ולהסיר רק לפרקי זמן קצרים (פחות מ -15 דקות לכל פרוסה), שמירה על המכסה על הצלחת גם שש תוך הדמיה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי הפוך מצוידים במצלמה דיגיטלית, ללכוד תמונות בנקודת הזמן הראשונה באמצעות מטרת 10X. הערה: נקודות בפעם ראשונה משתנות בהתאם לניסוי ויכול להיות היום שבו את הפרוסות הוכנו או כל נקודה לאחר זמן. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צלם תמונות מאזורים מרובים בנקודה אחת בזמן בשני אזורי החומר האפורים ולבנים של הפרוסה. ה הערהאזור הדואר צילם על ידי ציוני דרך ספציפיות בתוך הפרוסה ועל ידי מיפוי מיקום תמונה על סכמטי שיכול לשמש לפגישות הדמיה הבאות. ציוני דרך שימושיים יכול לכלול קצוות של הפרוסות ו / או נטייה של שטחים בחומר לבנים. תמונה 7:56 מקומות על כל פרוסה בכל נקודת זמן. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צלם תמונות שלאחר מכן בהפרש של 4-6 hr אם בוחנים חלוקת תאי NG2 ובידול oligodendrocyte, באופן אידיאלי על 5-7 ימים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ללכוד תמונה סופית של כל האזורים ולתקן את הפרוסות באופן מיידי. הוסף 1 מ&quot;ל של מקבע (PFA 4% עם 0.1M l-ליזין meta-periodate 0.01 M נתרן) לתחתית להכניס את התרבות, ולאחר מכן להוסיף 1 מ&quot;ל נוסף על גבי פרוסות. יש להיזהר שלא להשפריץ מקבע ישירות על הפרוסה כפי שהוא יכול להתנתק מהקרום. לתקן את הרקמות ל30 דקות ולהמשיך עם אימונוהיסטוכימיה באמצעות סמנים בשלב מסוים התפתחותי כפי שתואר בסעיף 4. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פרוסות לשטוף עם חיץ פוספט 0.2 M נתרן 3 x 10 מ &#39;ב. אם פרוסות נחוצות, לאחסן ב 4 ° C ב0.2 חיץ פוספט M נתרן ל1-3 ימים לפני immunostaining אבל באופן אידיאלי לבצע צביעה בתוך 24 שעות. להמשיך עם אימונוהיסטוכימיה כמתואר להלן בסעיף 4 על מנת לקבוע את חלקם של תאים שמובחנים לoligodendrocytes (איור 2 ד-F). </li></ol> .3 גורל מיפוי של צאצאיהם של תאי NG2 באמצעות עכברים והעין מתנהל כתב מהונדס בתרבויות פרוסה הערה: כדי לעקוב אחר גורלם של תאי NG2 מנקודת זמן מסוים בתרבות, NG2creER מושרה: ניתן להשתמש בעכברים מהונדסים YFP. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לגרום רקומבינציה Cre וביטוי עיתונאי על ידי הוספת 100 4OHT ננומטר מומס באתנול למדיום התרבות. הערה: תאים חיוביים Reporter אמורים להופיע בטווח של 1-2 ימים ביעילות גיוס של ~ 20-25% YFP + NG2 + / NG2 + תאים ובנקודה זו בזמן הכול יהיו תאים בשלב תא NG2 (איור 2A-C) </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לתקן ולשטוף את הפרוסהים בנקודות זמן שונה לאחר מניפולציות שונות (כמתואר בסעיפים 2.5 ו2.6). </li></ol> .4 Slice אימונוהיסטוכימיה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חותך את הקרומים עם פרוסות המצורפות מתוך מוסיף באמצעות אזמל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העבר את הפרוסות לבארות בודדות של מלח 24 פוספט צלחת המכילה גם סליין (PBS) באמצעות סדרה של פינצטה, נזהר שלא לשבש את ההרכב של הפרוסה כאשר מרים את הקרום. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העבר את הפרוסות לצלחת גם 24 עם חסימת תמיסה המכילה 5% עזים בסרום נורמלי (NGS) ו0.1% Triton-X100 בPBS עבור שעה 1. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה את הפרוסות בO נוגדן הראשוני / N ב5 NGS% PBS על 4 מעלות צלזיוס. לזיהוי תאים בשלב תא NG2, להשתמש נוגדנים לNG2 וPDGFRα. לזיהוי oligodendrocytes מובחנת, להשתמש נוגדן לאנטיגן coli polyposis adenomatous (APC; גג 1 &#39;שיבוט). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> על פרוסות לשטוף היום השניה בדקות 3 x15 PBS, אז דגירה בantibo המשניתמת ב5 NGS% PBS עבור שעה 1 ב RT. לשטוף פרוסות בPBS 3 דקות x15 והר בשקופיות. הר עם פרוסות וקרום מול השקופיות, כך שהקרום לא יהיה בין המטרה והרקמה. </li></ol>

<ol><li>Stoppini, L., Buchs, P. A., Muller, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+simple+method+for+organotypic+cultures+of+nervous+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience+Methods%22%5BJournal%5D)">A simple method for organotypic cultures of nervous tissue.</a> Journal of Neuroscience Methods. 37 (2), (1991).</li>
<li>Gogolla, N., Galimberti, I., DePaola, V., Caroni, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preparation+of+organotypic+hippocampal+slice+cultures+for+long-term+live+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Preparation of organotypic hippocampal slice cultures for long-term live imaging.</a> Nature Protocols. 1 (3), 1165-1171 (2006).</li>
<li>Gähwiler, B. H., Capogna, M., Debanne, D., McKinney, R. A., Thompson, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Organotypic+slice+cultures%3A+a+technique+has+come+of+age%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Neurosciences%22%5BJournal%5D)">Organotypic slice cultures: a technique has come of age.</a> Trends in Neurosciences. 20 (10), 471-477 (1997).</li>
<li>Yamamoto, N., Kurotani, T., Toyama, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neural+connections+between+the+lateral+geniculate+nucleus+and+visual+cortex+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Neural connections between the lateral geniculate nucleus and visual cortex in vitro.</a> Science. 245 (4914), 192-194 (1989).</li>
<li>Bahr, B. A., Kessler, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stable+maintenance+of+glutamate+receptors+and+other+synaptic+components+in+long-term+hippocampal+slices%5BTitle%5D)+AND+%22Hippocampus%22%5BJournal%5D)">Stable maintenance of glutamate receptors and other synaptic components in long-term hippocampal slices.</a> Hippocampus. 5 (5), 425-439 (1995).</li>
<li>Noctor, S. C., Flint, A. C., Weissman, T. A., Dammerman, R. S., Kriegstein, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neurons+derived+from+radial+glial+cells+establish+radial+units+in+neocortex%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Neurons derived from radial glial cells establish radial units in neocortex.</a> Nature. 409 (6821), 714-720 (2001).</li>
<li>Noctor, S. C., Martínez-Cerdeño, V., Ivic, L., Kriegstein, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cortical+neurons+arise+in+symmetric+and+asymmetric+division+zones+and+migrate+through+specific+phases%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Cortical neurons arise in symmetric and asymmetric division zones and migrate through specific phases.</a> Nature Neuroscience. 7 (2), (2004).</li>
<li>Kapfhammer, J. P., Gugger, O. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+analysis+of+purkinje+cell+dendritic+morphology+in+organotypic+slice+cultures%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments+JoVE%22%5BJournal%5D)">The analysis of purkinje cell dendritic morphology in organotypic slice cultures.</a> Journal of Visualized Experiments JoVE. (61), (2012).</li>
<li>Elias, L., Kriegstein, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Organotypic+slice+culture+of+E18+rat+brains%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments+JoVE%22%5BJournal%5D)">Organotypic slice culture of E18 rat brains.</a> Journal of Visualized Experiments JoVE. (6), e235(2007).</li>
<li>Nishiyama, A., Komitova, M., Suzuki, R., Zhu, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Polydendrocytes+%28NG2+cells%29%3A+multifunctional+cells+with+lineage+plasticity%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Polydendrocytes (NG2 cells): multifunctional cells with lineage plasticity.</a> Nature Reviews Neuroscience. 10 (1), 9-22 (2009).</li>
<li>Haber, M., Vautrin, S., Fry, E. J., Murai, K. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Subtype-specific+oligodendrocyte+dynamics+in+organotypic+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Glia%22%5BJournal%5D)">Subtype-specific oligodendrocyte dynamics in organotypic culture.</a> Glia. 57 (9), 1000-1013 (2009).</li>
<li>Bin, J. M., Leong, S. Y., Bull, S. -J., Antel, J. P., Kennedy, T. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oligodendrocyte+precursor+cell+transplantation+into+organotypic+cerebellar+shiverer+slices%3A+a+model+to+study+myelination+and+myelin+maintenance%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+one%22%5BJournal%5D)">Oligodendrocyte precursor cell transplantation into organotypic cerebellar shiverer slices: a model to study myelination and myelin maintenance.</a> PloS one. 7 (7), (2012).</li>
<li>Birgbauer, E., Rao, T. S., Webb, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lysolecithin+induces+demyelination+in+vitro+in+a+cerebellar+slice+culture+system%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience+Research%22%5BJournal%5D)">Lysolecithin induces demyelination in vitro in a cerebellar slice culture system.</a> Journal of Neuroscience Research. 78 (2), 157-166 (2004).</li>
<li>Harrer, M. D., von Budingen, H. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Live+imaging+of+remyelination+after+antibody-mediated+demyelination+in+an+ex+model+for+immune+mediated+CNS+damage%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+Neurology%22%5BJournal%5D)">Live imaging of remyelination after antibody-mediated demyelination in an ex model for immune mediated CNS damage.</a> Experimental Neurology. 216 (2), 431-438 (2009).</li>
<li>Fancy, S. P. J., Harrington, E. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Axin2+as+regulatory+and+therapeutic+target+in+newborn+brain+injury+and+remyelination%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Axin2 as regulatory and therapeutic target in newborn brain injury and remyelination.</a> Nature Neuroscience. 14 (8), 1009-1016 (2011).</li>
<li>Zhu, X., Hill, R. A., Dietrich, D., Komitova, M., Suzuki, R., Nishiyama, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Age-dependent+fate+and+lineage+restriction+of+single+NG2+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Age-dependent fate and lineage restriction of single NG2 cells.</a> Development. 138 (4), 745-753 (2011).</li>
<li>Hill, R. A., Patel, K. D., Medved, J., Reiss, A. M., Nishiyama, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NG2+Cells+in+White+Matter+But+Not+Gray+Matter+Proliferate+in+Response+to+PDGF%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">NG2 Cells in White Matter But Not Gray Matter Proliferate in Response to PDGF.</a> Journal of Neuroscience. 33 (36), 14558-14566 (2013).</li>
<li>Zhu, X., Bergles, D. E., Nishiyama, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NG2+cells+generate+both+oligodendrocytes+and+gray+matter+astrocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">NG2 cells generate both oligodendrocytes and gray matter astrocytes.</a> Development. 135 (1), 145-157 (2008).</li>
<li>Novak, A., Guo, C., Yang, W., Nagy, A., Lobe, C. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Z%2FEG%2C+a+double+reporter+mouse+line+that+expresses+enhanced+green+fluorescent+protein+upon+Cre-mediated+excision%5BTitle%5D)+AND+%22Genesis%22%5BJournal%5D)">Z/EG, a double reporter mouse line that expresses enhanced green fluorescent protein upon Cre-mediated excision.</a> Genesis. 28 (3-4), 147-155 (2000).</li>
<li>Soriano, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generalized+lacZ+expression+with+the+ROSA26+Cre+reporter+strain%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Genetics%22%5BJournal%5D)">Generalized lacZ expression with the ROSA26 Cre reporter strain.</a> Nature Genetics. 21 (1), 70-71 (1999).</li>
<li>Hirrlinger, P. G., Scheller, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+of+reef+coral+fluorescent+proteins+in+the+central+nervous+system+of+transgenic+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+and+Cellular+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Expression of reef coral fluorescent proteins in the central nervous system of transgenic mice.</a> Molecular and Cellular Neuroscience. 30 (3), 291-303 (2005).</li>
<li>Nave, K. -A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Myelination+and+support+of+axonal+integrity+by+glia%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Myelination and support of axonal integrity by glia.</a> Nature. 468 (7321), 244-252 (2010).</li>
<li>Rivers, L. E., Young, K. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PDGFRA%2FNG2+glia+generate+myelinating+oligodendrocytes+and+piriform+projection+neurons+in+adult+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">PDGFRA/NG2 glia generate myelinating oligodendrocytes and piriform projection neurons in adult mice.</a> Nature Neuroscience. 11 (12), 1392-1401 (2008).</li>
<li>Dimou, L., Simon, C., Kirchhoff, F., Takebayashi, H., Gotz, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Progeny+of+Olig2-expressing+progenitors+in+the+gray+and+white+matter+of+the+adult+mouse+cerebral+cortex%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Progeny of Olig2-expressing progenitors in the gray and white matter of the adult mouse cerebral cortex.</a> The Journal of Neuroscience. 28 (41), 10434-10442 (2008).</li>
<li>Kang, S. H., Fukaya, M., Yang, J. K., Rothstein, J. D., Bergles, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NG2%2B+CNS+glial+progenitors+remain+committed+to+the+oligodendrocyte+lineage+in+postnatal+life+and+following+neurodegeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">NG2+ CNS glial progenitors remain committed to the oligodendrocyte lineage in postnatal life and following neurodegeneration.</a> Neuron. 68 (4), 668-681 (2010).</li>
<li>Ioannidou, K., Anderson, K. I., Strachan, D., Edgar, J. M., Barnett, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Time-lapse+imaging+of+the+dynamics+of+CNS+glial-axonal+interactions+in+vitro+and+ex+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+one%22%5BJournal%5D)">Time-lapse imaging of the dynamics of CNS glial-axonal interactions in vitro and ex vivo.</a> PloS one. 7 (1), e30775(2012).</li>
<li>Ghoumari, A. M., Baulieu, E. E., Schumacher, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Progesterone+increases+oligodendroglial+cell+proliferation+in+rat+cerebellar+slice+cultures%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Progesterone increases oligodendroglial cell proliferation in rat cerebellar slice cultures.</a> Neuroscience. 135 (1), 47-58 (2005).</li>
<li>Azim, K., Butt, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((GSK3%CE%B2+negatively+regulates+oligodendrocyte+differentiation+and+myelination+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Glia%22%5BJournal%5D)">GSK3β negatively regulates oligodendrocyte differentiation and myelination in vivo.</a> Glia. 59 (4), 540-553 (2011).</li>
<li>Hussain, R., El-Etr, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Progesterone+and+nestorone+facilitate+axon+remyelination%3A+a+role+for+progesterone+receptors%5BTitle%5D)+AND+%22Endocrinology%22%5BJournal%5D)">Progesterone and nestorone facilitate axon remyelination: a role for progesterone receptors.</a> Endocrinology. 152 (10), 3820-3831 (2011).</li>
<li>Pampaloni, F., Reynaud, E. G., Stelzer, E. H. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+third+dimension+bridges+the+gap+between+cell+culture+and+live+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews.+Molecular+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">The third dimension bridges the gap between cell culture and live tissue.</a> Nature Reviews. Molecular Cell Biology. 8 (10), 839-845 (2007).</li>
<li>Lubetzki, C., Demerens, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Even+in+culture%2C+oligodendrocytes+myelinate+solely+axons%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Even in culture, oligodendrocytes myelinate solely axons.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 90 (14), 6820-6824 (1993).</li>
<li>Demerens, C., Stankoff, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induction+of+myelination+in+the+central+nervous+system+by+electrical+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Induction of myelination in the central nervous system by electrical activity.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 93 (18), 9887-9892 (1996).</li>
<li>Wood, P. M., Bunge, R. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evidence+that+sensory+axons+are+mitogenic+for+Schwann+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Evidence that sensory axons are mitogenic for Schwann cells.</a> Nature. 256 (5519), 662-664 (1975).</li>
<li>Stevens, B., Tanner, S., Fields, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Control+of+myelination+by+specific+patterns+of+neural+impulses%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Control of myelination by specific patterns of neural impulses.</a> The Journal of Neuroscience. 18 (22), 9303-9311 (1998).</li>
<li>Stevens, B., Porta, S., Haak, L. L., Gallo, V., Fields, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adenosine%3A+a+neuron-glial+transmitter+promoting+myelination+in+the+CNS+in+response+to+action+potentials%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Adenosine: a neuron-glial transmitter promoting myelination in the CNS in response to action potentials.</a> Neuron. 36 (5), 855-868 (2002).</li>
<li>Wake, H., Lee, P. R., Fields, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Control+of+local+protein+synthesis+and+initial+events+in+myelination+by+action+potentials%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Control of local protein synthesis and initial events in myelination by action potentials.</a> Science. 333 (6049), New York, N.Y 1647-1651 (2011).</li>
<li>Rosenberg, S. S., Kelland, E. E., Tokar, E., De la Torre, A. R., Chan, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+geometric+and+spatial+constraints+of+the+microenvironment+induce+oligodendrocyte+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">The geometric and spatial constraints of the microenvironment induce oligodendrocyte differentiation.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105 (38), 14662-14667 (2008).</li>
</ol>

המחברים מצהירים כי אין להם אינטרסים כלכליים מתחרים

Myelination במערכת העצבים המרכזית הוא חיוני לתקשורת עצבית יעילה והישרדות axonal 22. תאי NG2 ברציפות ליצור oligodendrocytes myelinating לבגרות תוך שמירה על אוכלוסיית תושב באזורים במוח ביותר 16,23 - 25. כמה מנגנונים גנטיים ומולקולריים המסדירים את ההתמיינות של תאים אלו תוארו אבל הרבה עדיין לא גילו. תרבויות הפרוסה organotypic הן כלי נוח לחקור מנגנונים אלה בשל מאפייניהם הייחודיים של שמירה על אזורים אנטומיים, מניפולציה קלה של הסביבה תאית, myelination חזק, והנוכחות ...

תרבויות פרוסה Organoytpic של מערכת העצבים המרכזית הוכיחו להיות מאוד שימושי לחקר תא עצב וביולוגיה של תא גליה במערכת semiintact 1 - 4. תרבויות אלה הן פשוטות יחסית לאמץ ולשמור על יתרונות רבים של תרביות תאים ניתק עיקריות כגון מניפולציה של הסביבה תאית וגישה קלה להדמית תא חי לטווח ארוך חוזר ונשנה וקלטות אלקטרו 5 - 9. בנוסף, תרבויות פרוסה לשמור cytoarchitecture רקמה 3 ממדים, קישוריות עצבית אזורית, ואת רוב סוגי תאים קיימים במערכת. תכונות אלו הופכות את תרבויות אלה מערכת ייחודית ונוחה לחקור בודדת התנהגות תא ופיזיולוגיה עם אינטראקציות הסלולר וסביבתיות. תאי NG2 הם אוכלוסייה של תאי גליה במערכת העצבים המרכזית של היונקים שממשיכות להתרבות וליצור מ &#39;yelinating oligodendrocytes במהלך עוברי ולאחר לידה פיתוח 10. הם נחקרו רבים בתרביות תאים ראשוניים ניתק, והפיתוח האחרון של קווי עכבר מהונדסים עם ביטוי תא ספציפי NG2 של חלבוני ניאון יש להקל במיפוי גורל vivo וקלטות אלקטרו בהכנות פרוסה חריפות. גם בלימודים אלה, מעט מאוד ידוע על הדינמיקה הזמנית של התפשטות תאי NG2 ובידול oligodendrocyte. למרות שתרבית תאים ניתקים היא בשימוש נרחב למתקן היחסי במניפולציות תרופתית וגנטיות, זה לא מתאים לחקירת הבדלים פונקציונליים של תאים אלה באזורי מוח שונים ובמיוחד כאשר הוא רצוי לשמור על ההקשר של microenvironment הסלולרי. תרבויות פרוסה לספק אלטרנטיבה פשוטה שניתנים למניפולציות תרופתיים והיה בשימוש כדי לחקור myelination oligodendrocyte 11,12, תאתגובת ular לאחר lysolecithin (LPC) או נוגדן מושרה פגיעה במיאלין 13,14, ואינדוקציה של חידוש יצירת המיאלין באמצעות טיפול תרופתי 15. שיטה לחקור ולבצע הדמיה חיה ורקמות קבועות (או postfixation) ניתוח של התפשטות NG2 והתמיינות של תאי oligodendrocyte בתרבויות פרוסה organotypic נלקחו משני המוח הקדמי ובמוח הקטן מתוארת. זוהי שיטה רבת עוצמה שיכול לשמש כדי לחקור את גורל התא של תאי NG2 אחד לאחר חלוקת 16 ולגלות הבדלי region- ותלוי גיל בהתפשטות תאי NG2 המושרה גורם גדילה 17. טכניקה פשוטה יחסית זו היא נגישה לציבור רחב כדי לחקור תא נוסף פנימי ו / או סביבתי מנגנונים המסדירים את הפיסיולוגיה של תאי גליה אלה ותגובתם לפעילות עצבית או נזק המיאלין.

<table><tbody><tr><td colspan="4">Slice Culture Medium</td></tr><tr><td>Minimum Essential Medium</td><td>Invitrogen</td><td>11090</td><td>50%</td></tr><tr><td>Hank' s תמיסת מלח מאוזנת</td><td>Invitrogen</td><td>14175</td><td>25%</td></tr> <tr><td>HEPES</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H-4034</td><td>25mM</td></tr><tr><td>L-Glutamine</td><td>Invitrogen</td><td>25030</td><td>1mM</td></tr><tr><td>אינסולין</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>I6634</td><td>1 מ"ג/ליטר</td></tr><tr><td>חומצה אסקורבית</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A-0278</td><td>0.4mM</td></tr><tr><td>סרום</td><td>סוסים Hyclone</td><td>SH30074.03</td><td>25%</td></tr><tr><td colspan="4">טיטראט ל-pH 7.22 עם NaOH, מסנן עם מסנן על הבקבוק, ומאחסנים ב-4 מעלות צלזיוס</td></tr><tr><td colspan="4"><מאגר חיתוך חזק></חזק></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>S3014</td><td>124mM</td></tr><tr><td>KCl</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>P5405</td><td>3.004 מ"מ</td></tr><tr><td>KH2PO4</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P5655</td><td>1.25mM</td></tr><tr><td>MgSO4 (נטול מים)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M7506</td><td>4.004mM</td></tr><tr><td>CaCl2 2H2O</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C7902</td><td>2mM</td></tr><tr><td>NaHCO3</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S5761</td><td>26mM</td></tr><tr><td>D-(+)-גלוקוז</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>G7021</td><td>10 מ"מ</td></tr><tr><td>חומצה</td> <td>אסקורביתSigma-Aldrich</td><td>A-0278</td><td>2.0mM</td></tr><tr><td>Adenosine</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A4036</td><td>0.075mM</td></tr><tr><td colspan="4">מסנן עם מסנן עליון בקבוק ומאחסנים ב-4 מעלות צלזיוס, מחמצנים עם 95% O2 5% CO2 לפני השימוש</td></tr><tr><td colspan="4"><חזק>ריאגנטים ואספקה אחרים</חזקים></td></tr><tr><td>4-הידרוקסי טמוקסיפן (4OHT)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H7904</td><td>100nM</td></tr><tr><td>Paraformaldehyde (PFA)</td><td>EM Sciences</td><td>19200</td><td>4%</td></tr> <tr><td>L-Lysine</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L-6027</td><td>0.1M</td></tr><tr><td>נתרן Metaperiodate</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S-1878</td><td>0.01M</td></tr><tr><td>ארנב אנטי NG2 נוגדן</td><td>Chemicon (Millipore)</td> <td>AB5320</td><td>1:500</td></tr><tr><td>עכבר נגד CC1 נוגדן</td><td>Calbiochem (Millipore)</td> <td>OP80</td><td>1:200</td></tr><tr><td>עכבר נגד Ki67 נוגדן</td><td>Vision Biosystems</td><td>NCL-Ki67-MM1</td><td>1:300</td></tr><tr><td>עכבר נגד נוגדן</td><td>NeuN Chemicon (Millipore)</td> <td>MAB377</td><td>1:500</td></tr><tr><td>נוגדנים משניים ספציפיים</td><td>למין Jackson Immunoresearch</td><td></td><td></td></tr><tr><td>סרום עיזים רגיל (NGS)</td><td></td><td></td> <td>5%</td></tr> <tr><td>טריטון X-100</td><td></td><td></td><td>0.10%</td></tr> <tr><td>מדיום הרכבה עם DAPI</td><td>Vector Labs</td><td>H-1200</td><td></td></tr><tr><td>מוסיף ממברנת תרבית מילי-תא 0.45&mu; m גודל נקבוביות</td><td>פישר סיינטיפיק</td><td>PICM03050</td><td></td></tr><tr><td>בקבוק מסננים עליונים</td><td>פישר סיינטיפיק</td><td>09-740-25E</td><td></td></tr><tr><td>אתנול</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>95% O2 5% CO2 תערובת</td><td></td><td></td><td></td>גז</tr><tr><td>פוספט חוצץ מלח (PBS)</td><td></td><td></td><td></td></tr> <tr><td>סטרילי שש צלחות</td><td></td><td></td><td></td> באר</tr><tr><td>ניתוח (היפוקמפוס) או מרית</td><td></td><td></td><td></td>שקילה</tr><tr><td>קוצץ</td><td></td><td></td><td></td>רקמות ידני או אוטומטי</tr><tr><td>סכיני</td><td></td><td></td><td></td>גילוח</tr><tr><td>פיפטות העברה חד פעמיות</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>35 מ"מ ו-60 מ"מ צלחות</td><td></td><td></td><td></td>פטרי סטריליות</tr><tr><td>סטריומיקרוסקופ</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>שלב הפוך מיקרוסקופ</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>זרימה למינרית מכסה מנוע</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>חממת</td><td></td><td></td><td></td>תרבית</tr><tr><td>רקמות הפוכה מיקרוקופה</td><td></td><td></td><td></td> פלואורסצנטית</tr></tbody></table>

תרבויות organotypic slice ללמוד oligodendrocyte dynamics וmyelination

Organotypic Slice Cultures to Study Oligodendrocyte Dynamics and Myelination

תאי NG2 להביע (polydendrocytes, תאי מבשר oligodendrocyte) הם אוכלוסיית תאי גלייה הגדולה הרביעית במערכת העצבים המרכזית. במהלך התפתחות עוברית ואחרי לידה הם פעילים להתרבות וליצור oligodendrocytes myelinating. תאים אלה בדרך כלל נחקרו בתרבויות עיקריות ניתקו, cocultures נוירון, וברקמות קבועות. קווים מהונדסים זמינים עתה באמצעות עכבר פורסים מערכות תרבות יכולות לשמש כדי לחקור התפשטות והתמיינות של תאי שושלת oligodendrocyte בשני אזורי החומר האפורים ולבנים של המוח הקדמי ובמוח קטן. תרבויות פרוסה מוכנות מעכברים לאחר לידה מוקדמות ונשמרות בתרבות לתקופה של עד חודש 1. ניתן הדמיה פרוסות אלה מספר רב של פעמים על פני תקופת התרבות לחקור את התנהגות ואינטראקציות הסלולר. שיטה זו מאפשרת הדמיה של חלוקת תא NG2 ואת המדרגות מובילות לבידול oligodendrocyte תוך שהוא מאפשר ניתוח מפורט של אזור-תלויהתא ent NG2 והטרוגניות פונקציונלית oligodendrocyte. זוהי טכניקה רבת עוצמה שיכול לשמש כדי לחקור את האותות הפנימיים וחיצוניים המשפיעים על תאים אלה לאורך הזמן בסביבה סלולרית שדומה מאוד שמצאו in vivo.

דוגמאות לנתוני נציג הם כדלקמן שהתקבלו באמצעות תרבויות פרוסה משני המוח הקדמי ובמוח הקטן של P8 NG2cre: ZEG, NG2creER: YFP וPLPDsRed קווי עכבר מהונדסים. ניתן הדמיה תאי NG2 מעל ימים במוח קדמי ובמוח קטן פרוסות (איור 1 ב-D, 1 וידאו) ואת הפנוטיפ של תאים אלה ניתן לקבוע לאחר הקיבוע וimmunostaining עם NG2 ונוגדנים גג 1 '(איור 1E). בנוסף לחיות הדמיה, התפשטות תאים יכולה גם להיות מוערכת באמצעות מכתים immunohistochemical עבור סמני התפשטות תאים כגון Ki67 <strong...

מתוארת טכניקה לחקר תאי NG2 ואוליגודנדרוציטים באמצעות מערכת תרבית פרוסות של המוח הקדמי והמוח הקטן. שיטה זו מאפשרת לבחון את הדינמיקה של התפשטות והתמיינות של תאים בתוך שושלת האוליגודנדרוציטים שבה ניתן לתפעל בקלות את הסביבה החוץ-תאית תוך שמירה על ציטו-ארכיטקטורת רקמות.

תרבויות Organotypic Slice ללמוד oligodendrocyte Dynamics וmyelination

NG2 expressing cells (polydendrocytes, oligodendrocyte precursor cells) are the fourth major glial cell population in the central nervous system. During ...

המטרה הכוללת של הליך זה היא לחקור התפשטות והתמיינות של תאי שושלת אוליגודנדרוציטים בסביבה הדומה מאוד למה שנמצא in vivo. זה מושג על ידי הכנת תרביות פרוסות של ארבעה מוחות ומוח קטן מעכברים טרנסגניים מוקדמים לאחר הלידה. לאחר מכן מדמים תאים בודדים בפרוסות לאורך פרקי זמן של שעות עד ימים כדי לדמיין את הדינמיקה התאית של התפשטותם והתמיינותם.לאחר הדמיה, אימונוהיסטוכימיה פוסט-הוק של התאים משמשת לקביעת מאפיינים תאיים שונים. בסופו של דבר, התוצאות יכולות להראות את הדינמיקה של התפשטות התאים והתמיינות בתנאים רגילים ולאחר מניפולציה תרופתית או גנטית. היתרון העיקרי של טכניקה זו על פני שיטות קיימות כמו פחם מנותק, תרביות של נוירונים ותאי שושלת ליגה אינציט הוא שתרביות פרוסות מאפשרות מניפולציה של הסביבה הא-תאית תוך שמירה על ארכיטקטורת ציטו רקמות.כל ההליכים בבעלי חיים פועלים בהתאם להנחיות ואושרו על ידי הוועדה המוסדית לטיפול ושימוש בבעלי חיים באוניברסיטת קונטיקט לפחות שעתיים לפני הנתיחה. הכן תוספות תרבית רקמות בשש צלחות באר לכל אחת. ובכן, הוסף מיליליטר אחד של מדיום תרבית פרוסות, ולאחר מכן העביר את הצלחות לחממת תרבית התאים ב-37 מעלות צלזיוס עם 5% פחמן דו חמצני לפחות 15 דקות לפני הדיסקציה.שים את מאגר הדיסקציה על קרח והתחל לבעבע אותו עם 95% חמצן, 5% גז פחמן דו חמצני. כמו כן, ודא שכל הכלים ומסוק הרקמות מעוקרים עם 70% אתנול. העבירו את הרקמה לצלחת סטרילית בגודל 35 מילימטר המכילה מאגר חיתוך מחומצן קר כקרח.לאחר מכן, בעזרת סכין גילוח, חתכו את המוח הקטן והמוח הקדמי לאחר מכן עם חתך סגיטלי דרך המוח הקדמי והמוח הקטן המפריד בין ההמיספרות. כעת באמצעות המסוק הידני, צור חלקים קורונליים וסגיטלים בעובי 300 מיקרון של ארבעת המוח והמוח הקטן. כל בעל חיים מניב בדרך כלל שש פרוסות ארבע פרוסות מוח ושש פרוסות מוח קטן.באופן אידיאלי לוקח פרוסות המשתרעות על השליש הקדמי של הקורפוס קלוסום על מנת לחקור אזורי חומר אפור ולבן באותה פרוסה. מעבירים את הפרוסות המופרדות למאגר חיתוך קר טרי מבעבע על קרח במאגר, בעזרת מרית קטנה לחיתוך או שקילה. הפרד את החלקים הבודדים והעביר אותם לדגירה מראש.שש כלי באר ובהם תוספות תרבית. ניתן להניח שתיים עד שלוש פרוסות על תרבות אחת. הכנס את הצינור מכל מאגר חיתוך עודף מפני השטח של התרבית.הכנס והעביר את הצלחות לחממה עד לקיבוען. יש להחליף את מדיום הפרוסה יום לאחר הכנת הפרוסה, ולאחר מכן כל יומיים עד לקיבוע הפרוסה כאמור בפרוטוקול. בהתאם לניסוי, השתמש בפרוסות לאחר חמישה עד שבעה ימים.בתרבות. השתמש רק בפרוסות שהופכות שקופות לאחר הימים הראשונים והשליך את אלה שיש להן אזורים אטומים לא אחידים הנראים לעין בלתי. תחת ניגודיות פנים, אזורים אטומים אלה נראים כגוש של תאים כהים.אם מבוצעים כהלכה, אזורים אטומים מתים מתרחשים בלא יותר מאחד עד 5% מהפרוסות. כדי לבצע הדמיית זמן-lapse של התפשטות והתמיינות של שני תאי NG, השתמש בפרוסות בנות שלושה עד חמישה ימים מעכברים המבטאים EGFP בשני תאי NG. אל תתנו למגלשות לרדת מתחת ל-37 מעלות צלזיוס במשך יותר מ-15 דקות.בכל סשן הדמיה, תוך שמירה על הלוח סגור, השתמש במטרה של פי 10 של מיקרוסקופ פלואורסצנטי הפוך כדי לצלם תמונות בפעם הראשונה. נקודת התרבות. דמיינו ארבעה עד שמונה מיקומים בכל פרוסה מאזורי החומר האפור והלבן של הפרוסה.כמו כן, ציוני דרך שימושיים בתמונה כגון קצוות הפרוסות, תאים מסוימים או כיוון של מסלולים של חומר לבן למטרות העברה. תמונת נקודת הזמן הקודמת יכולה לשמש כתמונת ייחוס במהלך רילוקיישן עבור חלוקת שני תאים של NG והתמיינות אוליגודנדרוציטים. צלם תמונות כל ארבע עד שש שעות למשך חמישה עד שבעה ימים.אם נעשה שימוש בסמן ההשראה NG two cre, ER YFP, לגרום לביטוי מדווח באמצעות מדיום תרבית עם 100 ננו טוחנת. ארבעה הידרוקסי טמוקסיפן מומסים בפעילות מדווח אתנול אמורים להופיע תוך יום עד יומיים. לקיבוע, הוסף מיליליטר אחד של קיבוע לתחתית התרבות.מכניסים ומוסיפים עוד מיליליטר על גבי הפרוסות. אין להשפריץ את הקיבוע ישירות על הפרוסות אחרת הן עלולות להתנתק. מקבעים את הטישו למשך 30 דקות בארבע מעלות צלזיוס ולאחר מכן בעזרת אזמל.חותכים את הממברנות כשהפרוסות מחוברות. בעזרת פינצטה מעבירים בזהירות את הפרוסות לבארות בודדות של צלחת 24 באר עמוסה ב- PBS. לאחר מכן, העבירו את הפרוסות לצלחת שנייה של 24 בארות עמוסה בתמיסת חסימה המכילה 5% סרום עיזים רגיל ו-0.1% טריטון X 100 ב-PBS.אפשר להם לדגור בתמיסה החוסמת למשך שעה בטמפרטורת החדר. לאחר החסימה, העבירו את הפרוסות לצלחת עמוסה בנוגדנים ראשוניים ב-PBS עם 5% NGS. אפשר להם לדגור למשך הלילה בארבע מעלות צלזיוס למחרת.שוטפים את הפרוסות ב- PBS. לאחר מכן דגרו את הפרוסות עם נוגדנים משניים ב-PBS עם 5% NGS. הניחו לדגירה למשך שעה בטמפרטורת החדר.עקוב אחר זה עם שלוש שטיפות נוספות ב-PBS כמו קודם והרכיב את הפרוסות כשהממברנה פונה לשקופית כך שהיא לא תהיה בין המטרה לרקמה. כדי לנתח את הדינמיקה הזמנית של התמיינות אוליגודנדרוציטים, התקבלו תמונות של חלוקת שני תאים של NG מתרביות פרוסות של המוח הקדמי מעכברים טרנסגניים P 8 NG שני זוחלים במשך מספר ימים, רצפי זמן-lapse נלקחו במשך 122 שעות. הפנוטיפ של התאים המחולקים נקבע עם נוגדנים NG two ו-CC one.התפשטות התאים הוערכה גם באמצעות צביעה אימונוהיסטוכימית לסמן התפשטות התאים. מיפוי פיתיון KI 67 של שני תאים NG בוצע לאחר אינדוקציה של רקומבינציה של CRE בפרוסות משני עכברי CRE YFP. יומיים לאחר הוספת ארבעה הידרוקסי טמוקסיפן.מדווח YFP המבטא NG נמצאו שני תאים חיוביים בתרביות. ארבעה ימים לאחר מכן, חלק מהתאים הללו התמיינו לציטים אוליגודנדרוציטים חיוביים CC אחד. אוליגודנדרוציטים בוגרים צולמו בתרביות פרוסות מוח קטן מ-P-L-P-D-S.נוירוני פרקין עם מיאלין של עכברים אדומים היו נוכחים בתרבויות אלה. הדמיה חוזרת ונשנית הראתה תוספת של מיאלין DS אדום המבטא אוליגודנדרוציטים כימיה אימונוהיסטו בפרוסות אלה הראתה ביטוי משמעותי של חלבון בסיסי של מיאלין. לבסוף, הדמיה ברזולוציה זמנית גבוהה יותר חשפה גופי תאי אוליגודנדרוציטים יציבים עם כמה תנועות קלות בתהליכים דיסטליים.לאחר צפייה בסרטון זה, אתם אמורים להבין היטב כיצד להכין תרביות פרוסות הן מארבעת המוח והן מהמוח הקטן לדמות שוב ושוב תאים בודדים במשך ימים עד שעות ולנתח את גורלם של תאי תמונה באמצעות אימונוהיסטוכימיה לאחר הו. בנוסף להדמיה, פרוסות אלו מאפשרות גם מניפולציה של הסביבה התאית תוך שימוש בטכניקות מיפוי גורל כגון רקומבינציה של קרם השראת בפרוסה מוכנה.

organotypic-slice-cultures-to-study-oligodendrocyte-dynamics

Research

JoVE Journal

Neuroscience

מדעי המוח

זהו פרוטוקול להכין ולתחזק הכנה פרוסה neocortical בתרבות organotypic לצורך ביצוע הקלטות חשמל עצב פירמידליים.

הקלטה נייד שלמים מן ההכנה פורסים Organotypic של הניאוקורטקס

סרטון זה מדגים טכניקת ex vivo לגרימת מוות של תאי מוח המתווכים באמצעות תאי T ציטוטוקסיים CD8+. עם קבלת פרוסות המוח, תאי CD8+ T מופעלים המכוונים אוליגודנדרוציטים מועברים לפרוסות כדי להתמקד במעטפת המיאלין ובאוליגודנדרוציטים. לאחר הדגירה, הנזק למיאלין ומוות עצבי ניתן להעריך היסטולוגית באזורי עניין.

טכניקת Ex Vivo לגרימת מוות עצבי באמצעות תאי T ספציפיים לאוליגודנדרוציטים CD8+

מקור: Kennedy, L. H., et. al. הדמיה והדמיה חיה של אברוני אוליגודנדרוציטים בפרוסות מוח אורגנוטיפיות באמצעות וירוס הקשור לאדנו ומיקרוסקופיה קונפוקלית. J. Vis. Exp. (2017)סרטון זה מדגים את ההדמיה של מיטוכונדריה אוליגודנדרוציטים בפרוסות מוח אורגנוטיפיות של עכבר. הפרוסה מונחת בתוך תא אמבטיה עם זרימת נוזלים רציפה וטמפרטורה מבוקרת. לאחר הגדרת פרמטרים שונים של המיקרוסקופ הקונפוקלי, נלכדות תמונות זמן-lapse של מיטוכונדריה עם פלואורסצנטיות אדומה, ואחריהן תמונות Z-stack של האוליגודנדרוציטים עם...

הדמיה קונפוקלית של תנועה מיטוכונדריאלית בתוך אוליגודנדרוציטים בתרביות פרוסות מוח אורגנוטיפיות

כדי לטפל במנגנונים של דה-מיאלינציה ואפופטוזיס עצבי בנגעים בקליפת המוח של הפרעות דמיאלינטיות דלקתיות, נעשה שימוש במודלים שונים של בעלי חיים. אנו מתארים כאן גישה ex vivo על ידי שימוש בתאי CD8+ T ספציפיים לאוליגודנדרוציטים על פרוסות מוח, וכתוצאה מכך מוות אוליגודנדרוגליאלי ועצבי. נדונים יישומים ומגבלות פוטנציאליים של המודל.

Ex vivo דגם של התקפת T-Cell-מכוון oligodendrocyte בפרוסות המוח חריף

כאן אנו מתארים טכניקה ללימוד neurogenesis לאחר הלידה בהיפוקמפוס באמצעות טכניקת התרבות הפרוסה organotypic. שיטה זו מאפשרת למניפולציה במבחנה של neurogenesis למבוגרים ומאפשרת היישום הישיר של סוכנים תרופתיים להיפוקמפוס התרבותי.

תרבויות Organotypic Slice ללימודים של אחרי לידה נוירוגנזה

Organotypic פרוסה בהיפוקמפוס תרבויות (OHSC) מייצגים במבחנה דגם המדמה את המצב ויוו היטב. כאן נתאר מבוסס-vibratome משופרת עם פרוסות פרוטוקול כדי לקבל פרוסות באיכות גבוהה לשימוש בהערכת הפוטנציאל neuroprotective של חומרים חדשניים או ההתנהגות הביולוגית של תאים סרטניים.

Organotypic תרבויות פרוסה בהיפוקמפוס כמודל מחקר Neuroprotection, Invasiveness של תאים סרטניים

Oligodendrocytes להפוך Myelinating לקדם הפצת פוטנציאל הפעולה מהירה והישרדות עצביים. המתוארים כאן הוא פרוטוקול ספציפי אוליגודנדרוציטים ביטוי של חלבונים פלורסנט ב organotypic פרוסות המוח עם הדמיה בצילום מואץ עוקבות. עוד, מוצג הליך פשוט להמחשת המיאלין וללא רבב.

ויזואליזציה והדמיה בשידור חי של Organelles אוליגודנדרוציטים בפרוסות Organotypic המוח באמצעות וירוס Adeno-הקשורים ומיקרוסקופיה קונפוקלית

כאן אנו מציגים שיטה להכין organotypic פרוסה תרבויות מן המוח הקטן העכבר מיאלין, צביעת על-ידי אימונוהיסטוכימיה מתאים לחקור מנגנונים של myelination ו- remyelination במערכת העצבים המרכזית.

Immunostaining של Myelinating Organotypic פרוסה אסטרוציטומה תרבויות והכנה

הvivo לשעבר פרוסה מאפשרת העצב outculמניע העצבים כדי להיות בתמונה בזמן אמת. פרוסות מופקים על ידי הטבעת e 10.5 איי. איי. או. עוברי העוברים ב-agarose, הפרוסות על הרטט, וגדלים בחממה בשלב העליון. התפקיד של מסלולים הדרכה אקסון מוערך על ידי הוספת מעכבי התקשורת התרבות.

לשעבר Vivo Oculomotor ניע את התרבות של מעובריים GFP-הביע עכברים עבור זמן הדמיה של מניע העצבי החיצוני

להלן, אנו מציגים שיטה יעילה לטיהור של oligodendrocytes הפוך וייצור של מדיום אוליגודנדרוציטים ממוזג שניתן להשתמש בהם לניסויים בשיתוף התרבות.

דור מoligodendrocytes הפוך ומדיום ממוזג לניסויים בשיתוף תרבות-שיתוף

חקור דינמיקה של תאי אוליגודנדרוציטים ותהליכי מיאלינציה באמצעות תרבויות פרוסות אורגנוטיפיות ממוח עכברים טרנסגניים. השיטה שומרת על ארכיטקטורת רקמות ומאפשרת הדמיה של תאים בודדים לאורך זמן.

תרבויות Organotypic Slice ללמוד oligodendrocyte Dynamics וmyelination

גלה סרטונים נוספים