השתפר בג'ל Sulfo-glycomics β-ביעור עבור מקיף O צמוד וReductive ידי ספקטרומטריית מסה
20 בנובמבר 2014
על מנת לחקור באופן מקיף את המגוון של גליקנים מקושרים O, הליך חדש לסילוק β רדוקטיבי בתוך הג'ל, בשילוב עם פרמתילציה ושיטת חלוקת פאזה מהירה, מיושם לניתוח גליקנים מקושרים O המשתחררים ישירות מגליקופרוטאינים שנפתרו על ידי SDS-PAGE וניתנים לניתוח גליקומי לאחר מכן על ידי ספקטרומטריית מסה.
צפו בתמליל המלא וקבלו גישה לאלפי סרטונים מדעיים
סקירה כללית
מאמר זה מציג פרוצדורה חדשנית לניתוח של גליקנים מקושרים ל-O שהופקו מחלבונים גליקוזיליים. השיטה כוללת הפרדת חלבונים באמצעות SDS-PAGE, ולאחריה ביצוע beta elimination רדוקטיבי ופרמתיליזציה, ומסתיימת בניתוח באמצעות ספקטרומטריית מסות.
מרכיבי מפתח של המחקר
תחום המדע
- גליקובוביולוגיה
- ספקטרומטריית מסות
- ביוכימיה
רקע
- גליקנים מסוג O-linked ממלאים תפקידים מכריעים בתהליכים ביולוגיים שונים.
- הבנת המגוון שלהם חיונית להשגת תובנות לגבי תפקודי גליקופרוטאינים.
- שיטות מסורתיות עשויות שלא לנתח גליקנים אלו ביעילות.
- מחקר זה מציג גישה יעילה ומפושטת לניתוחם.
מטרת המחקר
- פיתוח שיטה מקיפה להשגת גליקנים מקושרים ל-O.
- שיפור היעילות של אנליזה גליקומיקה.
- הקלה על גילוי וכימות של מבני גליקנים.
שיטות שהשתמשו בהן
- הפרדה של גליקופרוטאינים באמצעות SDS-PAGE.
- שטיפה של חלקי ג'ל המכילים את הגליקופרוטאינים המבוקשים.
- שחרור של גליקנים מסוג O-linked באמצעות beta elimination רדוקטיבי.
- פרמתיליציה של גליקנים ולאחריה הפרדה לשלבים (phase partitioning).
תוצאות עיקריות
- שחרור וניתוח מוצלחים של גליקנים מקושרים ל-O.
- זיהוי מבני גליקנים באמצעות ספקטרומטריית מסות טנדם.
- השגת כימות של שכיחות הגליקנים.
- השיטה מדגימה יעילות משופרת לעומת גישות מסורתיות.
מסקנות
- הפרוצדורה החדשה מנתחת ביעילות גליקנים מסוג O-linked.
- היא מספקת כלי בעל ערך למחקר גליקומי.
- יישומים עתידיים עשויים לשפר את ההבנה של תפקודי גליקופרוטאינים.
שאלות נפוצות
רלוונטיות תעשייתית למנהלים
סבב עבודה זה מאפשר ניתוח מקיף של קשרי O-linked ושל sulfoglycomic של גליקופרוטאינים שהופרדו באמצעות SDS-PAGE, ובכך פותר צוואר בקבוק מרכזי באפיון גליקופרוטאינים לצורך תיקוף מטרות (target validation). על ידי סילוק מזהמים שמקורם בג'ל ושיפור הרגישות לגילוי גליקנים מסולפטים, השיטה משפרת את איכות הנתונים לצורך הפחתת סיכונים מכניסטיים (mechanistic de-risking) בשלבי הגילוי המוקדמים. השיטה תומכת בשחרור ובכימות הדיורגיביליים של גליקנים, ומספקת מידע לתהליכי זיהוי מובילים (lead identification) ובחירת מודלים פרה-קליניים.
יישומים אסטרטגיים במחקר ופיתוח בביופארמה
גילוי מוקדם ותיקוף מטרה
- ערך מדעי: מאפשר בחינה של ההטרוגניות של גליקנים מסוג O-linked בחלבונים גליקוזילים מופרדים, על מנת להבהיר את הקשרים שבין מבנה לתפקוד של מטרות טיפוליות.
- ערך תפעולי: מספק שחרור יעיל של גליקנים באמצעות בטא-אלימינציה (β-elimination) רדוקטיבית בתוך הג'ל, דבר המפחית את אובדן הדגימה ומשפר את ההשבה בהשוואה לשיטות של חיתוך ג'ל.
סריקה ופיתוח בדיקה
- ערך מדעי: מייצר גליקנים מסוג O-linked מטוהרים המתאימים לסריקה מבוססת MS בשלבים הבאים, ללא זיהומי פוליאקרילאמיד המפריעים לסבלה.
- ערך תפעולי: מבטל את הצורך בניקוי באמצעות HPLC בקו הייצור (in-line), ובכך מייעל את זרימת העבודה ומגדיל את התפוקה של תהליכי ניתוח גליקנים.
מחקר תרגומי ופרה-קליני
- ערך מדעי: מקל על זיהוי ואפיון של גליקנים מסולפטים באמצעות הפרדה משופרת של חלוקת פאזות, מה שמאפשר ניתוח סולפוגליקומי של גליקופרוטאינים רלוונטיים למחלה.
- ערך תפעולי: מייצר נתונים כמותיים על שפע של גליקנים באמצעות MS טנדם, ובכך תומך בהתאמת סממנים ביולוגיים (biomarkers) ובקבלת החלטות על קידום מבוסס סיכונים.
שילוב תהליכים וזרימת עבודה
השיטה משתלבת ברצף הגילוי, החל מרזולוציית גליקופרוטאינים (SDS-PAGE) דרך שחרור גליקנים, טיהור, פרמתיליזציה ואנליזת MS, ובכך היא תומכת בשלבי זיהוי המולקולות המובילות (lead identification) ובשלבי התיקוף הפרה-קליני.
- ביולוגיה של גילוי: תומך בבדיקת השערות על ידי מתן אפשרות לפרופיל מקיף של גליקנים מקושרים ל-O מפסים של חלבונים מופרדים, כדי להבהיר את הביולוגיה של המטרה.
- סריקה: מספק דגימות גליקנים נקיות מזיהומים לסריקה מהימנה מבוססת MS ואפיון מבני.
- אנליטיקה: מספק מדידות כמותיות של שפע גליקנים ונתונים מבניים באמצעות MS טנדם להשוואת גליקופורמים בין תנאים שונים.
- מחקר תרגומי: מאפשר ניתוח סולפוגליקומי של גליקופרוטאינים, המקשר בין שינויים בגליקנים למנגנוני מחלה ולפוטנציאל כסממנים ביולוגיים.
- שימוש חוזר ארגוני: מבסס תהליך עבודה סטנדרטי וניתן לשימוש חוזר לניתוח גליקנים, הישים על מגוון יעדי גליקופרוטאינים וסוגי דגימות.
השפעה תפעולית וארגונית
- ערך מדעי: משפר את הביטחון החזוי בתיקוף המטרה על ידי מתן אפשרות לאפיון מקיף של גליקנים, ובכך מפחית עמימות מכניסטית בתפקוד גליקופרוטאינים.
- ערך תפעולי: משפר את השחזוריות והיכולת להרחבה (scalability) באמצעות שטיפת ג'ל חסונה והליכי ניקוי פשוטים, הממזערים שונות בין סדרות.
- ערך אסטרטגי: תומך בקבלת החלטות מושכלת יותר לגבי המשך או הפסקת הפיתוח (go/no-go) על ידי אספקת נתוני גליקנים באיכות גבוהה, המפחיתים סיכון ביולוגי בשלבים מאוחרים בתוכניות המכוונות לגליקופרוטאינים.
- השפעה על הפורטפוליו: מסייע בתעדוף מותאם סיכונים באמצעות פלטי גליקנים כמותיים המשקפים את המעורבות עם המטרה (target engagement) ואת המודולציה של המסלול.
שיקולי יישום
- דורש מומחיות בגליקוביולוגיה, SDS-PAGE וטכניקות לשחרור כימי של גליקנים.
- נדרש ציוד מעבדה סטנדרטי הכולל מבחנות זכוכית עם פקק הברגה, מיקרו-מבחנות, צנטריפוגה, וורטקס וגישה לספקטרומטריית מסות.
- נדרשת סטנדרטיזציה של שלבי שטיפת הג'ל, אינקובציית ה-β-elimination ושלבי הפרדת הפאזות בין משתמשים ומעבדות שונות.
- שיקולי התאמה כוללים אופטימיזציה עבור שונות בריכוז הגליקופרוטאין, גודל פיסת הג'ל ורמות סולפציה של הגליקנים.
- מגבלות מעשיות כוללות את זמן אינקובציית ה-β-elimination שנמשך 18 שעות ושלבי טיפול ידני העלולים להגביל אוטומציה מלאה.
שאלות נפוצות בתחום הביו-פארמה
Chapters in this video
0:05
Title
1:16
Gel Excision and Removal of Gel-derived Contaminants
3:14
In-gel O-glycan Release by Reductive β-Elimination and Desalting on Cation-exchange Chromatography
6:02
Borate Removal, C18 Clean-up and Base Preparation for Permethylation
8:03
Permethylation of Released Glycans C18 Clean-up and Mass Spectrometry Analysis
10:33
Results: Recovery and Mass Spectral Analysis of Permethylated O-linked Glycans
12:30
Conclusion
