השתפר בג'ל Sulfo-glycomics β-ביעור עבור מקיף O צמוד וReductive ידי ספקטרומטריית מסה

המטרה הכוללת של הליך זה היא לקצור גליקנים של Olink. זה מושג על ידי פירוק ראשוני של גליקופרוטאינים על ידי דף SDS. השלב השני הוא לשטוף חתיכות ג'ל המכילות את הגליקופרוטאין המעניין.

לאחר מכן, הגליקנים של olink משתחררים על ידי חיסול בטא רדוקטיבי. השלב האחרון הוא גליקן לכל מתילציה עם חלוקת פאזה. בסופו של דבר גליקנים שעברו מתילציה מנותחים על ידי ספקטרומטריית מסה טנדם כדי לזהות מבנים ולכמת שפע.

היתרון העיקרי של טכניקה זו על פני שיטות קיימות כמו כרומטוגרפיה נוזלית בעלת ביצועים גבוהים, הוא שהשיטה שלנו מפרידה בין גליקנים ניטרליים וטעונים לכל גליקנים שעברו מתילציה בחלוקת פאזה מהירה. שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלות מפתח בתחום מדעי הגליקו על ידי מתן אפיון מקיף או גליקנים מקושרים המשתחררים מגליקופרוטאינים שנפתרו. לפני תחילת הליך זה, פתור גליקופרוטאינים באמצעות אלקטרופורזה של ג'ל.

לאחר האלקטרופורזה, הניחו את הג'ל על צלחת זכוכית והוציאו את אזור העניין באמצעות אזמל נקי כדי להגדיל את התפוקה של גליקנים OG. מעבירים את רצועת הג'ל המעניינת לצלחת זכוכית אחרת וחותכים חתיכה לקוביות של כשני מילימטרים. העבירו את חתיכות הג'ל הקטנות לצינור זכוכית עליון בורג בגודל 13 על 100 מילימטר בעזרת מרית מיקרוס מנירוסטה.

לאחר מכן, הוסף מיליליטר אחד של אמוניום ביקרבונט 25 מילי-מולרי או אמבי לצינור הדגימה. לאחר סגירת הצינור במכסה בורג קו טפלון, ערבבו בעדינות את התכולה על ידי לחיצה על הצינור לפני שתניחו לו לעמוד במשך 10 דקות. לאחר מכן הסר בזהירות את האמביט מצינור הזכוכית.

בעזרת מרעה או פיפטה מזכוכית, הוסף מיליליטר אחד של ניטריל אצטו לצינור הזכוכית כדי לכסות לחלוטין את חתיכות הג'ל. לאחר סגירת הצינור, ערבבו בעדינות את התוכן על ידי לחיצה על השפופרת לפני שתניחו לה לעמוד במשך 10 דקות. בסיום, הסר את ניטריל האצטו מצינור הזכוכית.

לאחר חזרה על השלבים הקודמים עד לביטול הצבע הכחול הבהיר, הוסיפו שני מיליליטר אתיל אצטט וסגרו מחדש את הצינור. מניחים את הצינור על ארבע מעלות צלזיוס למשך הלילה עם תסיסה מקצה לקצה. לאחר הסרת שטיפת אתיל אצטט, בצע שלוש שטיפות עם שני מיליליטר מים נטולי יונים.

לאחר ייבוש חתיכות הג'ל, הוסיפו 500 מיקרוליטר של תמיסת נתרן הידרוקסיד של 100 מילי-מולרי. ובואו נעמוד שלוש עד חמש דקות על קרח כדי לאזן את הג'ל לתנאים הבסיסיים המשפרים את התאוששות הגליקן. לאחר מכן, הוסף 500 מיקרוליטר של שני נתרן בורו הידריד מולרי ב-100 מילי-מולרי נתרן הידרוקסיד, וכתוצאה מכך ריכוזים סופיים של נתרן בורו הידריד מולרי אחד ב-100 מילי-מולרי נתרן הידרוקסיד.

לאחר ערבוב עדין של הצינור, דגרו את הדגימה בחום של 45 מעלות צלזיוס למשך 18 שעות. במהלך השעה הראשונה של הדגירה, מערבבים בעדינות את הצינור כל 15 דקות. לאחר שתגובת חיסול הבטא הושלמה והצינור הונח על קרח, הוסף לאט 10% חומצה אצטית.

כדי לנטרל את הבסיס, מערבל בעדינות את צינור הדגימה בין תוספות של חומצה אצטית, צנטריפוגה את הצינור כדי לחסל בועות ולמנוע זליגה במידת הצורך. כדי ליצור עמוד זכוכית קטן, יש לשרוט ולשבור את קצה פיפטת המרעה או הזכוכית באמצעות חותך קרמי כך שאורך קצה הפיפטה יהיה כסנטימטר אחד. לאחר פירוק פקק צמר זכוכית, דחף אותו לכיוון הקצה ויוצר תמיכה למיטת השרף.

אבטח את עמוד הפיפטה עם סיכת בגדים והניח מעל מבחנה מזכוכית. לאחר מכן, שטפו את הפיפטה הריקה המכילה צמר זכוכית עם מיליליטר אחד של מתנול ושלושה מיליליטר של חומצה אצטית 5%. לאחר מערבולת קטיון מימן Dow X החלפת תמיסת שרף בחומצה אצטית 5%.

העבירו מספיק ממנו כדי לייצר נפח מיטה של מיליליטר אחד בעמוד פיפטת המרעה, שטפו את העמוד באמצעות חמישה נפחים של חומצה אצטית של 5% ובדקו את הזרימה להופעת חלקיקי שרף. לאחר הנחת העמוד על צינור זכוכית עליון חדש בגודל 16 על 125 מילימטרים, טען את הדגימה על העמוד. לאחר איסוף הזרימה, יש להוציא גליקנים עם לפחות שלושה נפחים של חומצה אצטית 5% לאותו צינור.

לאחר הליופיליזציה, הוסף 300 מיקרוליטר של 10% חומצה אצטית במתנול לצינור הדגימה המיובש. לאחר המערבולת, הסר את הטרימתיל באט שנוצר על ידי אידוי מתחת לזרם חנקן בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס. לאחר חזרה על שלבי ההשעיה והייבוש לפחות ארבע פעמים, יש להרכיב מחדש את הדגימה בחומצה אצטית של 5%.

לאחר שהדגימה נטענה על עמודת C 18 מאוזנת, אסוף את הזרימה לתוך צינור מכסה בורג זכוכית בגודל 13 על 100 מילימטר. יש להוציא את הגליקנים של OOG עם שלושה מיליליטר של חומצה אצטית 5% לאותו צינור. לאחר מכן ליופיל את הדגימה כדי להכין את מגיב הבסיס למתילציה של סלסול.

הוסף 400 מיקרוליטר של 50% נתרן הידרוקסיד לצינור עליון בורג זכוכית נקי בגודל 13 על 100 מילימטר. לאחר מכן הוסף 800 מיקרוליטר של מתנול נטול מים לאותו צינור. הוסף ארבעה מיליליטר של תחמוצת דימתיל סולף נטולת מים ומערבולת כדי ליצור משקע לבן.

צנטריפוגה את הדגימה ב-600 פעמים G למשך דקה אחת כדי לגלול את המשקעים. לאחר השלכת הסופרנטנט והוספת ארבעה מיליליטר של תחמוצת דימתיל סולף נטולת מים למערבולת הגלולה, המגיב חזור על הפעולה ארבע פעמים נוספות עד שתמיסת הבסיס הופכת לשקופה. ממיסים את הבסיס הגלולי בשלושה מיליליטר של תחמוצת דימתיל סולף נטולת מים, ומערבבים בעדינות על ידי פיפטה למעלה ולמטה עם פיפטת מרעה נקייה.

לאחר מכן, הוסף 200 מיקרוליטר של תחמוצת דימתיל סולף נטולת מים לדגימה ולמערבולת המיובשת. כדי להחיות אותו, הוסף לדגימה 300 מיקרוליטר של תמיסת הבסיס המושהה, והוסף מיד 100 מיקרוליטר של מתאן ITOM. אוטמים את הצינור עם מכסה מרופד טפלון ומערבבים במרץ במשך חמש דקות על ידי מערבולת.

כדי לעצור את תגובת המתילציה של סלסול, הניחו את הצינור על קרח והוסיפו שני מיליליטר של חומצה אצטית 5%. לאחר המערבולת, פיפטה את התמיסה למעלה ולמטה חמש פעמים כדי להפחית את הנפח הנותר של מתאן ITOM על ידי אידוי. בשלב זה, הוסף שני מיליליטר של די כלורו מתאן לדגימה לאחר מערבולת וצנטריפוגה.

העבירו את השכבה המימית העליונה לצינור זכוכית חדש בגודל 13 על 100 מילימטר. לאחר חזרה על השטיפה המימית של שכבת הדי כלורו מתאן, שלב את השלב המימי השני עם השכבה המימית הראשונה. לאחר שטיפת המים של שלב הדי כלורו מתאן חזרה על עצמה פעמיים עד שלוש, העבירו את שלב הדי כלורו מתאן לצינור זכוכית נקי עם פיפטת מרעה נקייה.

לאחר מכן יבש את השלב האורגני מתחת לזרם חנקן בטמפרטורה של 42 מעלות צלזיוס. לאחר e איזון עמוד C 18 והעמסת השכבה המימית עליו. שטפו את עמודת C 18 במים ולאחר מכן השליכו את הגליקנים הסולפטיים לתוך צינור זכוכית חדש עם שני מיליליטר של 50% אצטו ניטריל לנתח גליקנים OG מתילציה על ידי עירוי ישיר לספקטרומטר מסה מתאים באמצעות מקור ריסוס ננו אלקטרו בקצב זרימת מזרק של 0.4 עד 0.6 מיקרוליטר לדקה ב-210 מעלות צלזיוס.

טמפרטורת נימי לפיצול על ידי דיסוציאציה הנגרמת על ידי התנגשות ב-MSM S ו-MS רב-ממדי של מכשיר מלכודת יונים מיישמים 30 עד 40% ספקטרום מסה מייצג של אנרגיית התנגשות של דגימות גליקן olink מתילציה ששוחררו ממוצין בקר באמצעות חיסול בטא רדוקטיבי של אינגל מוצגות כאן בפאנל העליון. הספקטרום נשלט על ידי מזהם פולי פיזור שמקורו בג'ל הפולי אקרילאמיד. הפאנל התחתון מדגים כי שטיפת אתיל אצטט של חתיכות הג'ל לפני חיסול הבטא מבטלת בעיה זו.

גליקנים אוינקים שוחררו ממוצין תת-מקסילרי בקר על ידי חיסול בטא רדוקטיבי של אינגל באמצעות חתיכות ג'ל שנחתכו קטנות או גדולות. ההתאוששות של גליקנים מחתיכות ג'ל קטנות הייתה גדולה כמעט פי עשרה מאשר מפרוסות ג'ל גדולות. גליקנים ניטרליים שעברו מתילציה מתאוששים בשלב הדי כלורו מתאן האורגני.

בעוד שגליקנים שעברו מתילציה אוניק מחולקים כמותית לשלב המים. היעילות והפשטות של שיטת חלוקת הפאזה מקלה מאוד על תפוקת הדגימה והגישות האנליטיות הבאות. גליקנים O שעברו מתילציה ללא סולפטציה התאוששו מהפאזה האורגנית, וכל הסול גליקנים שעברו מתילציה של סלסול התאוששו מהפאזה המימית, מה שמקל על זיהוי ואפיון של גליקנים כמעט איזובר סולפטיים ולא סולפטיים.

גליקנים אלה נבדלים זה מזה ב-0.1 יחידות מסה בלבד ויהיה קשה לפתור אותם מבלי להפריד פיזית בין שני המינים לפי חלוקת פאזה לאחר התפתחותו. טכניקה זו אפשרה חקירה יסודית של מגוון הגליקנים בדגימות רקמה, תאים מתורבתים, מערכות מודל ודגימות חולים. לאחר צפייה בסרטון זה, אתה אמור להבין היטב כיצד לחלק בהצלחה את כל הגליקנים המקושרים המשתחררים מחלבוני הגלי

נפתר על-ידי דף SDS.