תאי מציגי הרוצח המלאכותי Antigen (KaAPC) ליעיל במבחנה דלדול של תאי T אנושי אנטיגן ספציפי

המטרה הכוללת של ניסוי זה היא ליצור תא אנטיגן מלאכותי רוצח מבוסס HLA IG שאינו תאי, או K-A-A-P-C לדלדול אוכלוסיות תאי T אוטוראקטיביות או לא רצויות. זה מושג על ידי קישור קוולנטי ראשון של מולקולות HLA IG ונוגדנים חד שבטיים של אנטיפה על חלקיקי דקסטרן ברזל בגודל תא ליצירת ה-K-A-A-P-C הפונקציונלי בשלב השני, ה-K-A-A-P-C מאופיינים בזרימה ציטומטרית כדי להבטיח את הפונקציונליות התקינה שלהם. לאחר מכן, ה-K-A-A-P-C עמוסים בפפטידים שונים מעניינים כדי להתמקד באוכלוסיית תאי ה-T הספציפיים לאנטיגן הלא רצוי.

בסופו של דבר, ניתן לבצע ניתוח ציטרי זרימה כדי למדוד את ההרג המתווך אנטי-שומן ספציפי לאנטיגן של תאי ה-T על ידי העומס הקוגנטי. ק-א-א-פ-ק. הרעיון לשיטה זו עלה לראשונה כאשר נתקלנו בבעיות בעבודה על פיתוח תא מציג אנטיגן רוצח מבוסס תאים בזמן שאנחנו, במקביל, עובדים על פיתוח פלטפורמה מבוססת ביט. טכנולוגיה לאפנון תאי חיסון כדי ליצור K-A-A-P-C תחילה, הוסף 250 מיקרוליטר של חרוזי אפוקסי ממלאי ו-250 מיקרוליטר של מאגר בוראט טרי שהוכן לבקבוקון זכוכית עליון סטרילי.

הנח את הבקבוקון על מגנט כדי לאפשר לחרוזים להיצמד לאחר שתי דקות, שאב את המאגר והסר את הבקבוקון מהמגנט. שטפו את החרוזים פעם אחת עם מיליליטר נוסף של מאגר שמונה קדחים, ולאחר מכן השעו אותם מחדש ב-550 מיקרוליטר של HLA A שני IG ו-CD 95 MAB אנטי-אנושי. יש לנער את הבקבוקון בעדינות כדי לערבב את החרוזים עם הנוגדנים ולאחר מכן לדגור את החרוזים על מסובב מקצה לקצה בארבע מעלות צלזיוס למשך 24 שעות.

למחרת, סובבו את החרוזים למשך שתי דקות ב-300 גרם וטמפרטורת החדר והניחו את הבקבוקון בחזרה על המגנט. לאחר שתי דקות, שאפו את מאגר הטעינה. הסר את הבקבוקון מהמגנט ושטוף את החרוזים במיליליטר אחד של מאגר כביסה בניעור זהיר.

לאחר הכביסה השלישית, סובב את הבקבוקון במיליליטר אחד של מאגר שטיפת חרוזים טריים כדי לחסום את כל אתרי קשירת החלבון שנותרו. למחרת, סובב שוב את החרוזים והנח את הבקבוקון בחזרה על המגנט. לאחר שתי דקות, שאפו את מאגר הכביסה.

הסר את הבקבוקון מהמגנט והוסף מיליליטר אחד של PBS ל-KAPC. כדי לבדוק את איכות החרוזים, העבירו 1.5 פעמים 10 עד החמישית של ה-K-A-A-P-C לתוך צינור פקס ושטפו אותם עם מיליליטר אחד של מאגר שטיפת פקס Resus. השעו את גלולת החרוזים ב-100 מיקרוליטר של מאגר הכביסה והוסיפו מיקרוליטר אחד של IgG נגד עכבר, PE אחד כדי לזהות את ה-HLA A, שני IG ומיקרוליטר אחד של אנטי עכבר IG MFI TC כדי לזהות את ה-CD 95 MAB האנטי-אנושי.

לאחר מכן לאחר דגירה של 15 דקות בארבע מעלות צלזיוס, שטפו את החרוזים במיליליטר אחד של מאגר שטיפת פקס Resus. השעו אותם ב-250 מיקרוליטר של מאגר כביסה וקראו את הדגימות על ציטומטר זרימה להעמסת פפטידים. העבירו פעמיים 10 לשביעי של ה-K-A-A-P-C לבקבוקון זכוכית סטרילי חדש.

לאחר מכן, לאחר הנחת החרוזים על המגנט למשך שתי דקות, שאפו את ה-PBS והשעו מחדש את החרוזים ב-500 מיקרוליטר של PBS טרי המכיל חמישה מיקרוגרם של פפטיד. סמן את הבקבוקון עם התאריך ושם הפפטיד הטעון, K-A-A-P-C. לאחר מכן אחסן את ה-K-A-A-P-C הטעון בארבע מעלות צלזיוס למשך שלושה ימים לפחות כדי לאפשר העמסת פפטיד מספקת על הדימר HLA A שני IG כדי לבצע בדיקת הרג A-K-A-A-P-C במבחנה.

שטפו את ה-K-A-A-P-C הטעון בפפטיד כפי שהודגם לפחות שש פעמים כדי להסיר את כל הפפטידים החופשיים. לאחר מכן העבירו את K-A-A-P-C ופעמיים 10 לתאי T ספציפיים לאנטיגן החמישי לבאר אחת לכל דגימה של צלחת תחתונה עגולה של 96 בארות ב-200 מיקרוליטר של מדיום תרבית משותפת ביחס של אחד לאחד לאחר 48 שעות של תרבית בחממה לחה ב-37 מעלות צלזיוס ו-5% פחמן דו חמצני. העבר את הדגימות לצינורות הפקס המתאימים ושטוף אותן במיליליטר אחד של מאגר מחייב נקסין חמש.

לאחר מכן, השעו מחדש את הכדורים ב-100 מיקרוליטר של מאגר נקסין חמש קשירה, ולאחר מכן דגרו את הדגימות במיקרוליטר אחד של נקסין חמישה FITC וחמישה מיקרוליטרים של שבעה a a d בטמפרטורת החדר. לאחר 10 עד 15 דקות, שטפו את הדגימות עם מיליליטר אחד של מאגר קשירה נקסין חמש והשעו מחדש את הכדורים ב-250 מיקרוליטר של מאגר קשירה של נין חמש. לאחר מכן קרא מיד את הדגימות על ציטומטר זרימה.

תצוגה K-A-A-P-C HLA A שני IG ו-Antifa MAB בו זמנית, אשר בהשוואה לגישות מבוססות תאים, אינה משתנה על ידי יעילות קידוד או התמרה וניתן לווסת אותה בקלות במהלך הייצור. K-A-A-P-C מסוגלים לדלל תאי T ספציפיים לאנטיגן במבחנה כאשר הם טעונים בפפטיד קוגנטי, בעוד שהם טעונים שאינם קוגניטים. K-A-A-P-C אינם מדלדלים את תאי ה-T, ולכן K-A-A-P-C מושרה אפופטוזיס של תאי T באופן ספציפי לאנטיגן.

לאחר מכן, כאשר משתמשים ב-K-A-A-P-C לדלדול סלקטיבי של תאי T ספציפיים לאנטיגן מתערובת של ספציפיות תאי T שונים בלבד, ציטוטוקסיות מינימלית דולפת לתאי T שכנים. לפיכך, K-A-A-P-C מייצג כלי מעולה לאנטיגן במבחנה, דלדול ספציפי לאנטיגן של תאי T ספציפיים לאנטיגן המופעל על ידי בני אדם עם יישום קליני פוטנציאלי לטיפול במחלות אוטואימוניות ודחיית אלוגרפט לאחר פיתוחו. טכניקה זו סללה את הדרך לחוקרים בתחום האימונולוגיה התאית לחקור גישות חדשות לטיפול במחלות אוטואימוניות בתיווך תאי T ודחיית השתלות.