Name: פעילות telomerase באזורים שונים של מוח עכבר: הטלומרז לא רדיואקטיבי חזור הגברה פרוטוקול Assay (TRAP) (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-09-02T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 14 s
Description: חקור פעילות טלומראז באזורים שונים של מוח עכבר באמצעות פרוטוקול TRAP לא רדיואקטיבי. שיטה זו מאפשרת זיהוי הבדלים בין זכרים לנקבות ביעילות ובעלות נמוכה.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

עבודה זו נתמכה בחלקה על ידי הטכנולוגיה של ב.ג. נגב ותרומתה של לינדה פאוורס.

ניסויים בבעלי חיים אושרו על ידי ועדת האתיקה לניסויים בבעלי חיים באוניברסיטת בן גוריון (IL-39-08-2010). הפקת חלבון .1 עכבר מוח <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן 3 צינורות של 15 מ&quot;ל כל אחת מכיל 5 מ&quot;ל צינורות הפתרון ומקום של רינגר על קרח. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להקריב את העכבר באמצעות ההרדמה Isoflurane (זהירות - להשתמש במנדף כימי) ל10-20 שניות אחריו נקע בצוואר הרחם ועריפת ראש מיידי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את המוח מהגולגולת ולשטוף במשך כמה שניות עם הפתרון של קרח קר הצלצול כדי למנוע נזק לרקמת המוח. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> באמצעות סכין כירורגית, להפריד את המוח הקטן (CR) וגזע המוח (BS) מקליפת המוח הקדמית. בשלב הבא, להפריד את המוח הקטן מגזע המוח ולחתוך את האונה הקדמית (FL) מקליפת המוח הקדמית; להסיר את הנורה חוש הריח מהאונה הקדמית. הנח את האזורים במוח 3 ב15 מ&quot;ל הצינורות המיועדים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Homogenize הרקמות בצינור אחד. הוספת frפתרון קרח אש הצלצול של קר ולכן כל צינור מכיל את אותו נפח ו צנטריפוגות במשך 7 דקות ב800 x גרם. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את supernatant ולהוסיף של חיץ תמוגה בחורים 100 μl על צינור אחד. מערבבים היטב, על ידי העברה כמה פעמים הפתרון (~ 10) באמצעות מזרק 1 מ&quot;ל עם מחט G 21, ולדגור על קרח למשך 30 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העבר את התוכן של כל צינור לצינור מיקרו צנטריפוגות חדש ו צנטריפוגות במשך 30 דקות ב 13,000 x גרם. העבר את supernatant לצינור מיקרו צנטריפוגות חדש ולקבוע את ריכוז החלבון בשיטה הוקמה בעבר. אחסן את תמציות החלבון בaliquots של 10 μl ב -80 מעלות צלזיוס. </li></ol> .2 TRAP Assay הכנת מכשירים, פתרונות תגובה, וחישובי דילול חלבון <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן מספר המתאים של צינורות מיקרו צנטריפוגות שכותרתו עבור דילולים תמצית חלבון וחיץ תגובת telomerase. לבצע את כל pipetting בפרוטוקול באמצעות טיפים מסנן למניעת זיהום. </li&gt; <li style=";text-align:right;direction:rtl"> להפשיר את הפתרונות על הקרח הבא: תערובת TRAP תגובת 10x, פריימר TS, dNTP של, תמציות UPW וחלבון (ראה טבלה של חומרים לריכוזי חומרים כימיים וחומרים כימיים). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לדלל את הפתרון של תמצית החלבון לריכוז סופי של 1 מיקרוגרם / μl באמצעות מים טהורים לחלוטין (UPW). </li></ol> .3 תגובת הטלומרז <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן תערובת תגובת telomerase ידי הוספה הבאה לצינור מיקרו צנטריפוגות: לערבב 2 μl TRAP (10x), פריימר μl 1 TS (0.1 מיקרוגרם), dNTPs 1 μl (10 מ&quot;מ) ו15 UPW μl. לדוגמאות רבות, להכפיל כמויות הנ&quot;ל במספר דוגמאות, בתוספת 1. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוספת 19 μl של תערובת התגובה לצינור כל תגובה ולהוסיף 1 μl של התמצית מדוללת חלבון (1 מיקרוגרם חלבונים) על צינור אחד עבור נפח סופי של μl 20. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים את צינורות התגובה באמבט מים מחוממים מראש 30 מעלות צלזיוס למשך 45 דקות. </li></ol> .4 תגובת PCR <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חמש עשרה מילn לפני סוף תגובת telomerase, להפשיר הפתרונות הבאים: פריימר ACX, טיטניום תקי הצפת, UPW. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן תערובת תגובת PCR על ידי הוספה הבאה לצינור מיקרו צנטריפוגות: 2.5 μl טיטניום תקי חוצץ (10x), פריימר 1 μl ACX (0.1 מיקרוגרם), 2 μl UPW (μl 1 כאשר IC משמש) ו0.5 μl טיטניום תקי פולימראז (50x). לדוגמאות רבות, להכפיל כמויות הנ&quot;ל במספר דוגמאות בתוספת 2. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להוסיף 6 μl של PCR לערבב על צינור אחד PCR ולהוסיף כל הנפח של תגובת telomerase (20 μl) לצינור אחד עבור נפח סופי של μl 26. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכנס את צינורות PCR לCycler תרמו PCR ולהפעיל את התכנית הבאה: - 90 ° C - 2 דקות. - 94 ° C -. שניות 30 * - 60 ° C -. שניות 30 * - 72 ° C -. שניות 45 * - 72 ° C - 2 דקות. מוצרי PCR חנות ב -20 C °. * = 34 מחזורים </li></ol> .5 Agarose Mini-GEהכנת ליטר, דוגמאות ריצה, וג&#39;ל הכתמה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 25 מ&quot;ל חיץ אלקטרופורזה המצונן (TBE) ובר ומערבב לכוס שהיא 2-4 פעמים הנפח של פתרון החיץ ומפזרים באיטיות ב1.125 גרם של הרזולוציה הגבוהה אבקת agarose (HR) ואילו הפתרון הוא עורר במהירות . הסר את בר והמערבב, מכסה את הכוס עם ניילון נצמד ופירס בחור קטן לאוורור. מחממים את הכוס במיקרוגל בעצמה &quot;נמוכה&quot; במשך 3 דקות ולאחר מכן לעבור לשלטון &quot;גבוה&quot; ולחמם את הפתרון בפולסים קצרים עם טיפול שלא לגרום לשפיכה. שים לב שכאשר הקצף שנוצר על ידי חימום הופך בועות גדולות ונעלם אחרי כמה שניות, agarose מוכן. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עופרת ג&#39;ל למנגנון מיני ג&#39;ל אופקי, לאחר ג&#39;ל מתמצק בטמפרטורת חדר מאפשר את הג&#39;ל לצנן ל20 דקות ב 4 ° C לפני השימוש. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לטעון כל מסלול עם 25 μl של מדגם TRAP (מוצרי PCR TRAP 20 μl ו5 צבע ג&#39;ל טעינת μl 6x) ולרוץ ב110 V עבור 3 שעות בחדר קר 4 מעלות צלזיוס. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן 3x כתם חומצת גרעין עובד פתרון על ידי הוספת 15 μl 10,000x כתם גרעין חומצה, פתרון מניות 50 מ&quot;ל זוגי מים מזוקקים (DDW) עם 0.1 M NaCl (0.29 ז). כתם ג&#39;ל ל20 דקות עם רעד עדין. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש transilluminator UV עם 302 אורך גל כדי לראות את להקות DNA סולם TRAP. </li></ol>

<ol><li>Urquidi, V., Tarin, D., Goodison, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+telomerase+in+cell+senescence+and+oncogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Med%22%5BJournal%5D)">Role of telomerase in cell senescence and oncogenesis.</a> Annu Rev Med. 51, 65-79 (2000).</li>
<li>Cong, Y., Shay, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Actions+of+human+telomerase+beyond+telomeres%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Res%22%5BJournal%5D)">Actions of human telomerase beyond telomeres.</a> Cell Res. 18, 725-732 (2008).</li>
<li>Tichon, A., et al. Oxidative stress protection by novel telomerase activators in mesenchymal stem cells derived from healthy and diseased individuals. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aTichon%2C+A+%22Curr.Mol.+Med%22">Curr.Mol. Med</a>. 13, 1010-1022 (2013).</li>
<li>Lannilli, F., Zalfa, F., Gartner, A., Bagni, C., Dotti, C. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cytoplasmic+TERT+associates+to+RNA+granules+in+fully+mature+neurons%3A+Role+in+the+translational+control+of+the+cell+cycle+inhibitor+p15INK4B%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+one%22%5BJournal%5D)">Cytoplasmic TERT associates to RNA granules in fully mature neurons: Role in the translational control of the cell cycle inhibitor p15INK4B.</a> PloS one. 8, e66602(2013).</li>
<li>De Jesus, B. B., Blasco, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Potential+of+telomerase+activation+in+extending+health+span+and+logevity%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+opinion+in+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Potential of telomerase activation in extending health span and logevity.</a> Curr opinion in Cell Biology. 24, 1-5 (2012).</li>
<li>Blackburn, E., Collins, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Telomerase%3A+An+RNP+enzyme+synthesizes+DNA%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harb+Perspect+Biol%22%5BJournal%5D)">Telomerase: An RNP enzyme synthesizes DNA.</a> Cold Spring Harb Perspect Biol. 3, 1-9 (2011).</li>
<li>Klapper, W., Shin, T., Mattson, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+regulation+of+telomerase+activity+and+TERT+expression+during+brain+development+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci.+Res%22%5BJournal%5D)">Differential regulation of telomerase activity and TERT expression during brain development in mice.</a> J. Neurosci. Res. 64, 252-260 (2001).</li>
<li>Caporaso, G. L., Lim, D. A., Alvarez-Buylla, A., Chao, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Telomerase+activity+in+the+subventricular+zone+of+adult+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Cell+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Telomerase activity in the subventricular zone of adult mice.</a> Mol. Cell Neurosci. 23, 693-702 (2003).</li>
<li>Eitan, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Novel+Telomerase-increasing+compound+in+mouse+brain+delays+the+onset+of+amyotrophic+lateral+sclerosis%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+Mol.+Med%22%5BJournal%5D)">Novel Telomerase-increasing compound in mouse brain delays the onset of amyotrophic lateral sclerosis.</a> EMBO Mol. Med. 4, 313-329 (2012).</li>
<li>Kim, N. W., Wu, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Advances+in+quantification+and+characterization+of+telomerase+activity+by+the+telomeric+repat+amplification+protocol+%28TRAP%29%5BTitle%5D)+AND+%22Nuc.+Acid+Res%22%5BJournal%5D)">Advances in quantification and characterization of telomerase activity by the telomeric repat amplification protocol (TRAP).</a> Nuc. Acid Res. 25, 2595-2597 (1997).</li>
</ol>

המחברים מצהירים שאין להם אינטרסים פיננסיים מתחרים.

ניתוח של פעילות telomerase במוח העכבר באמצעות assay TRAP מורכב מ -4 שלבים עיקריים: 1) חלבוני חילוץ מאזורים ספציפיים של רקמת המוח 2) TS התארכות פריימר על ידי telomerase - תגובת telomerase 3) הגברה של תוצרי תגובת telomerase על ידי 4 PCR הפרדה) של מוצרי PCR באמצעות ג&#39;ל agarose ברזולוציה גבוהה. assay TRAP שונה זה מטפל בשני קשיים עיקריים העולים מassay המסורתי: השימוש בdCTP של רדיואקטיביים לגילוי רגיש של הפרדת מוצר...

Telomerase הוא ribonucleoprotein המורכבת מtelomerase ההפוך transcriptase (טרט), למקטע הקטליטית של telomerase, ומרכיב RNA (TERC). התפקיד הקנוני של telomerase הוא לשמר את האורך הנכון של הטלומרים על ידי הוספת רצפים חוזרים (TTAGGG) לקצות telomeric, לכן קידום יושרת גנומי, ותא התפשטות 1. תפקידים נוספים יוחסו לטרט בתאים, כלומר היא מעניקה התנגדות לאפופטוזיס הנגרם על ידי סוכן מזיק שונים 2, מגן על תאי גזע mesenchymal אדם מלחץ חמצוני 3, ומשחק תפקיד הפרו הישרדות בתאי עצב מובחן באופן מלא על ידי הקשר שלה לTIA1 RNA החיובי גרגרים 4. טרט מתבטא ופועל בעיקר בתאים סומטיים החלוקה וברוב סוגי הסרטן, ואילו רמות ביטוי אנזים והפעילות מוסדרות בחוזקה בתאי החלוקה הלא 5,6. מחקרים הראו כי בrמוח אודנט, פעילות telomerase הופך בלתי ניתנת לגילוי על ידי לאחר לידה יום 10, בעוד טרט mRNA נשמר ברמות נמוכות יותר בבגרותם 7. מחקרים אחרים הראו פעילות telomerase בתוך האזור הבוגר תת חדרית, הנורה חוש הריח, ההיפוקמפוס, ובמוח הקטן המבוגר והקליפה 8. אנחנו הוכיחו לאחרונה כי תרכובות רומן המגבירות ביטוי telomerase ופעילות במייתרי המוח ועמוד השדרה הפעילו השפעות נוירו בN-מתיל-D-aspartate (NMDA) - עכברים שהוזרקו, עכבו את תחילתו ואת התקדמות המחלה הטרשת לרוחב amyotrophic במהונדס SOD1 עכברים והגדילו את ההישרדות של תאי עצב מוטוריים בחוט השדרה של עכברים אלה 9. כדי להבין את התפקיד הפרו הישרדות של telomerase בתאי עצב ובמוח באופן מלא, זה חיוני כדי לפתח assay מהיר פשוט ויחסית רגיש לזיהוי של פעילות telomerase באזורים השונים של המוח. R telomericפרוטוקול ההגברה EPEAT (TRAP) הוא assay רגיש ידוע שילוב הפעילות הקנוני של telomerase ותגובת השרשרת של פולימראז (PCR). ב assay זה, telomerase מוסיף TTAGGG חוזר למצע telomerase (פריימר TS) oligonucleotide, ואחריו ההגברה PCR אשר מייצרת 6 זוגות בסיס סולם DNA (נ&quot;ב) באמצעות TS פריימר ההפוכה -. ACX 32 P כותרת dCTP של המשמשים לאיתור כמות נמוכה של מוצרי PCR. סולם DNA נפתר על ידי ג&#39;ל אלקטרופורזה polyacrylamide רצף (עמוד). שתי עוצמת להקות DNA ואורכו של סולם DNA משקפים הסכום של מולקולות אנזים פעילים וprocessivity בהתאמה 10. assay המסורתי זה מחזיק כמה קשיים עיקריים: הסכנה של חשיפה לחומרים רדיואקטיביים, גדולים וקשים להתמודד עמוד רצף והצריכה של ריצת ג&#39;ל הזמן וחשיפת סרט של מוצר רדיואקטיבי (לילה בשני המקרים). </p&gt; פרוטוקול זה מציע assay משופר אינו רדיואקטיביים agarose מיני ג&#39;ל המבוסס. הסולם נ&quot;ב DNA 6 נפתר באמצעות 4.5% agarose ג&#39;ל ברזולוציה גבוהה והאיתור מושגת באמצעות כתם חומצת גרעין רגיש מאוד. השילוב של שימוש ברזולוציה גבוהה agarose מיני ג&#39;ל וכתם חומצת גרעין רגיש מציע קל לטפל assay, מבטל את הסכנה של חשיפה לקרינה רדיואקטיבית ולקצר באופן משמעותי את משך זמן assay הכולל מ3 ימים לכמה שעות.

<table><tbody><tr><td>TRAP Mix (10x)</td><td></td><td></td><td>מיוצר ידנית, מערבבים את הדברים הבאים ב-UPW: 630 מ"מ KCl, 200 מ"מ Tris-HCl pH 8.2, 10 מ"מ EDTA, 15 מ"מ MgCl2, 1 מ"ג/מ"ל BSA, 0.5% TWEEN (נרכש מ-Sigma). Aliquots קפואים ב -20 מעלות צלזיוס.</td></tr><tr>הפתרון <td></td><td></td><td>של רינגר</td><td>מיוצר באופן ידני, מערבבים את הדברים הבאים ב-DDW: 124 מ"מ NaCl, 3 מ"מ KCl, 1.25 מ"מ NaH<תת>2</תת>PO<תת>4</תת>&middot; H2O, 2 mM MgSO4, 26 mM NaHCO3, 1.802 g/L D-(+)-גלוקוז נטול מים.</td></tr><tr><td>איזופלורן</td><td>מינרד בע"מ</td><td>NDC 60307-110-10</td><td>טפל בזהירות במכסה מנוע כימי</td></tr><tr><td>dNTPs (10 מ"מ)</td><td>Sigma</td><td>D7295</td><td></td></tr><tr><td>TS פריימר (5'-AATCCGTCGAGCAGAGTT-3')</td><td>Sigma</td><td></td><td>DNA oligos מסודרים בפורמט DRY ו-UPW נוסף לפי ריכוז נדרש</td></tr><tr><td>ACX פריימר (5'-GCGCGGCTTACCCTTACCCTTACTACTACTACTACTACTAC-3')</td><td>Sigma</td><td></td><td>DNA oligos שהוזמנו בפורמט DRY ו-UPW נוספו בהתאם לדרישה ריכוז</td></tr><tr><td>טיטניום טאק פולימראז/חוצץ</td><td>Clontech</td><td>S1792/S1793</td><td></td></tr><tr><td>אגרוז ברזולוציה גבוהה</td><td>סיגמא</td><td>A4718</td><td>כל אגרוז ברזולוציה גבוהה באיכות גבוהה עשוי להיות ניתן להתקנה</td></tr><tr><td>מכשיר מיני ג'ל</td><td>Bio-Rad</td><td>170-4466</td><td></td></tr><tr><td>כתם חומצת גרעין (GEL-RED)</td> <td>פריימר IC ביוטיום</td><td>41003</td><td></td></tr><tr><td>(5'-ATCGCTTCTCGGCCTTTT-3')</td><td>אוליגוס DNA סיגמא</td><td></td><td>שהוזמנו בפורמט DRY ו-UPW נוספו לפי הריכוז הנדרש</td></tr><tr><td>CHAPS lysis buffer</td><td>טכנולוגיית איתות תאים</td><td>9852S</td><td>הוסף PMSF (מעכב פרוטאז) לריכוז סופי של 1 מ"מ</td></tr><tr><td>מים טהורים במיוחד (UPW)</td> <td>תעשיות ביולוגיות</td><td>01-866-1B</td><td></td></tr><tr><td>CD-1 עכברים</td><td>HARLAN Laboratories INC.</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

פעילות telomerase באזורים שונים של מוח עכבר: הטלומרז לא רדיואקטיבי חזור הגברה פרוטוקול assay (trap)

Telomerase Activity in the Various Regions of Mouse Brain: Non-Radioactive Telomerase Repeat Amplification Protocol (TRAP) Assay

Telomerase, ribonucleoprotein, הוא אחראי לשמירה על אורך הטלומרים ולכן קידום יושרה, התפשטות, ותוחלת חיים הגנומי. בנוסף, telomerase מגן על המיטוכונדריה מלחץ חמצוני ומעניק התנגדות לאפופטוזיס, המצביע על החשיבות האפשרית שלו שלשרד של אי mitotic, תאים מאוד פעילים כגון תאי עצב. אנחנו הוכיחו בעבר את היכולת של מפעילי telomerase רומן להגביר את פעילות telomerase וביטוי באזורים במוח העכבר השונים ולהגן על תאי הנוירונים מוטוריים מלחץ חמצוני. תוצאות אלו מחזקות את הרעיון שtelomerase מעורב בהגנה על תאי עצב מנגעים שונים. כדי להדגיש את תפקידו של telomerase במוח, אנחנו כאן להשוות את הפעילות של telomerase במוח עכבר זכר ונקבה ואת תלותה בגיל. assay TRAP הוא שיטה סטנדרטית לאיתור פעילות telomerase ברקמות שונות או שורות תאים. כאן אנו מדגימים את analyאחות של פעילות telomerase בשלושה אזורים במוח העכבר על ידי שאינו denaturing הפקת חלבון באמצעות בחורים תמוגה חיץ ואחריו שינוי של assay TRAP הסטנדרטי. ב assay 2-שלב זה, telomerase אנדוגני מתארך מצע ספציפי telomerase (פריימר TS) על ידי הוספת TTAGGG 6 חזרות נ&quot;ב (תגובת telomerase). תוצרי תגובת telomerase הם מוגברים על ידי תגובת PCR יצירת סולם DNA של 6 תוספות נ&quot;ב. הניתוח של סולם DNA נעשה על ידי 4.5% ג&#39;ל אלקטרופורזה agarose ברזולוציה גבוהה ואחרי צביעה עם כתם חומצת גרעין רגיש מאוד. בהשוואה לassay TRAP המסורתי שעושה שימוש ב32 P כותרת dCTP של רדיואקטיביים לגילוי DNA וג&#39;ל אלקטרופורזה polyacrylamide לפתרון סולם DNA, פרוטוקול זה מציע זמן שאינו רעיל חיסכון assay מלכודת להערכת פעילות telomerase במוח העכבר, הממחיש את היכולת לזהות הבדלים בtelomerasפעילות דואר באזור במוח עכבר הנשי וגברי השונים.

תמציות חלבון תא כל הוכנו מהאונה הקדמית (FL), גזע המוח (BS) ומוח קטן (CR), הנגזרים מ3 CD-1 עכברי זכרי CD-1 נשים ו -3 בגילים ישנים 1 ו -3 חודשים ל assay הותאם TRAP ו3 עכברי זכרים CD-1 בגיל 2 חודשים ישנים עבור assay TRAP רדיואקטיבי. פעילות telomerase זוהתה ב1 מיקרוגרם חלבונים לחלץ באמצעות assay TRAP שונה ו2 מיקרוגרם חלבונים לחלץ עבור assay TRAP רדיואקטיבי. איתור של פעילות הטלומרז ידי assay TRAP רדיואקטיביים ועל ידי assay TRAP שונה מראה כי להדמיה טובה יותר ורזולוציה של מוצרי DNA telom...

טלומראז מתבטא במוח היילוד וגם באזורים שונים במוח הבוגר. אנו מציגים מבחן TRAP לא רעיל שחוסך זמן לניתוח פעילות הטלומראז באזורים שונים במוח העכבר וזיהוי הבדלים בפעילות הטלומראז בין מוחות עכברים זכרים ונקביים.

פעילות telomerase באזורים שונים של מוח עכבר: הטלומרז לא רדיואקטיבי חזור הגברה פרוטוקול Assay (TRAP)

Telomerase, a ribonucleoprotein, is responsible for maintaining the telomere length and therefore promoting genomic integrity, proliferation, and ...

המטרה הכוללת של הליך זה היא למדוד את פעילות הטלומראז ברקמת מוח תקינה. זה מושג על ידי הכנת תמציות חלבון תאים שלמים מרקמות מוח שונות כמקור לאנזים טלומראז פעיל. השלב השני הוא הוספת כמויות שוות של תמציות החלבון לתערובת תגובת טלומראז ספציפית המכילה את הסובסטרט והנוקלאוטידים הדרושים לפעילות הטלומראז.לאחר מכן, תוצרי תגובת הטלומראז מוגברים על ידי PCR ומנותחים על ידי אלקטרופורזה של ג'ל ארוס ברזולוציה גבוהה. השלב האחרון הוא לדמיין את תוצרי תגובת הטלומראז המוגברים על ידי צביעת ג'ל הארוס בחומר צביעת DNA רגיש ביותר בסופו של דבר נובע מבדיקת פרוטוקול ההגברה החוזרת של תומה ריי זו מראה תוספת של שישה זוגות בסיסים, סולמות DNA שווי ערך לפעילות של קרן תומה ברקמות מוח שונות. היתרון העיקרי של טכניקה זו על פני שיטות קיימות, כמו בדיקת מלכודת רדיואקטיבית או ערכות בדיקת מלכודות מסחריות, הוא שפרוטוקול זה מציע חלופה חסכונית יחסית בזמן ובעלות.למרות ששיטה זו יכולה לספק תובנה לגבי הפעילות הרוסית ברקמת המוח, ניתן ליישם אותה גם על כל רקמה חיה אחרת או תרבית תאים. לפני תחילת הליך זה, הכינו שלוש שפופרות של 15 מיליליטר שכל אחת מהן מכילה חמישה מיליליטר של תמיסת רינגר. הניחו את הצינורות על קרח לאחר הסרת המוח מעכבר שהורדם.שטפו את המוח למשך מספר שניות עם תמיסת צלצול קרה כקרח כדי למנוע נזק לרקמת המוח. בעזרת להב כירורגי, הפרד את המוח הקטן וגזע המוח מקליפת המוח הקדמית. לאחר מכן, הפרד את המוח הקטן מגזע המוח.הסר את נורת הריח מהאונה הקדמית וחתוך את האונה הקדמית מקליפת המוח הקדמית. מקם את שלושת אזורי המוח בצינורות המיועדים של 15 מיליליטר, הומוגניזציה של הרקמה בכל צינור. לאחר מכן, הוסף תמיסת צלצול קרה כקרח טרייה כך שכל צינור יכיל את אותו נפח וצנטריפוגה למשך שבע דקות ב 800 פעמים G, הסר את הסופרנטנט והוסף 100 מיקרוליטר פרוסות צ'אפ.חוצץ לכל צינור. מערבבים היטב על ידי העברת התמיסה כ -10 פעמים דרך מזרק מיליליטר אחד עם דגירה של אטריות בגודל 21 על קרח למשך 30 דקות. לאחר 30 דקות, העבירו את תכולת כל צינור לצינור מיקרו צנטריפוגה וצנטריפוגה חדשים למשך 30 דקות.ב-13,000 פעמים, G, העבירו את הסופינטה לצינור מיקרו צנטריפוגה חדש. לאחר קביעת ריכוז החלבון בשיטה שנקבעה בעבר, יש לאחסן את תמציות החלבון במינונים של 10 מיקרוליטר במינוס 80 מעלות צלזיוס. התחל חלק זה של הפרוטוקול על ידי הכנת המספר המתאים של צינורות מיקרו צנטריפוגה מסומנים עבור דילול תמצית החלבון ומאגר תגובת הטלומראז עבור התמיסות הבאות על קרח.תערובת תגובת מלכודת 10 x DS פריימר dn tps, מים טהורים במיוחד ותמציות חלבון מדללים את תמיסת תמצית החלבון לריכוז סופי של מיקרוגרם אחד למיקרוליטר. באמצעות מים טהורים במיוחד בצע את כל הפיפטינג באמצעות קצות סינון כדי למנוע זיהום או תגובת הטלומרים. כל דגימה דורשת תערובת תגובת טלומרים המורכבת משני מיקרוליטר של מלכודת תערובת מיקרוליטר אחד של פריימר TS, מיקרוליטר אחד של DN NTPs ו-15 מיקרוליטר מים טהורים במיוחד עבור מספר דגימות.הכפילו את הנפחים הללו במספר הדגימות ועוד אחת, הוסיפו 19 מיקרוליטר מתערובת תגובת MASE לכל צינור תגובה, ואחריו מיקרוליטר אחד של תמצית החלבון המדולל. לנפח סופי של 20 מיקרוליטר, הניחו את צינורות התגובה באמבט מים שחומם מראש ל -30 מעלות צלזיוס למשך 45 דקות. 15 דקות לפני סיום תגובת ה-thres, התכוננו להגברה של תוצרי תגובת thres על ידי שימוש בתמיסות הבאות, פריימר CX, מאגר טיטניום ומים טהורים במיוחד.כל דגימה דורשת תערובת תגובת PCR המורכבת מ-2.5 מיקרוליטר של טיטניום טק בופר, מיקרוליטר אחד של פריימר CX, שני מיקרוליטר של מים אולטרה-טהורים ו-0.5 מיקרוליטר של טיטניום טק פולימראז עבור מספר דגימות. הכפל את הנפחים הללו במספר הדגימות ועוד שתיים. הוסף שישה מיקרוליטר מתערובת תגובת ה-PCR לכל צינור PCR והוסף את כל הנפח עם תגובת המייסה לכל צינור.לנפח סופי של 26 מיקרוליטר, הכנס את צינורות ה-PCR לתרמו-סייקלר PCR והפעל את התוכנית הבאה, 90 מעלות צלזיוס למשך שתי דקות, ולאחר מכן 34 מחזורים של 94 מעלות צלזיוס למשך 30 שניות. 60 מעלות צלזיוס למשך 30 שניות ו-72 מעלות צלזיוס למשך 45 שניות. ושתי דקות אחרונות ב-72 מעלות צלזיוס.לאחר השלמת תגובת ה-PCR, אחסן את מוצרי ה-PCR במינוס 20 מעלות צלזיוס. כדי להכין תחילה את ורדי הביצים ליציקת המיני ג'ל, הוסיפו 25 מיליליטר של מאגר אלקטרופורזה TBE צונן ומוט ערבוב לכוס שהיא פי שניים עד ארבעה מנפח תמיסת החיץ והתחילו לערבב. לאחר מכן מפזרים לאט פנימה 1.125 גרם של אבקת ארוס ברזולוציה גבוהה.בזמן שהתמיסה מערבבת במהירות, הסר את סרגל הכוכב. מכסים את הכוס בניילון נצמד ומנקבים חור קטן לאוורור. כאשר פוגעים באגרוס, קריטי להגיע לנקודת הרתיחה כדי להמיס את האגרוס לחלוטין.הקפידו להקדיש תשומת לב מלאה לכוס במיקרוגל כדי לוודא שהקצף שנוצר לא יישפך. מחממים את הכוס במיקרוגל בעוצמה נמוכה במשך שלוש דקות לאחר מכן עוברים לעוצמה גבוהה ומחממים את התמיסה בפולסים קצרים תוך זהירות כדי למנוע שפיכה. יצקו את הג'ל במנגנון מיני ג'ל אופקי ותנו לו להתמצק בטמפרטורת החדר לאחר שהג'ל התמצק במשך 20 דקות בארבע מעלות צלזיוס.לפני השימוש לאלקטרופורזה, טען כל נתיב ב-25 מיקרוליטר של דגימת מלכודת והפעל ב-110 וולט למשך שלוש שעות בחדר קירור של ארבע מעלות צלזיוס בזמן שהג'ל פועל. הכן תמיסת עבודה של כתמי חומצות גרעין שלוש x על ידי הוספת 15 מיקרוליטר של 10,000 x תמיסת מלאי כתמי חומצות גרעין ל-50 מיליליטר מים מזוקקים כפולים עם 0.1 נתרן כלורי מולרי. לאחר השלמת האלקטרופורזה של הדגימות, יש לצבוע את הג'ל למשך 20 דקות בטמפרטורת החדר בניעור עדין.לבסוף, השתמש בתאורת טרנס UV באורך גל של 302 ננומטר. כדי לראות את סולם המלכודות, פעילות הטלומרים של רצועות ה-DNA זוהתה באזורים במוח העכבר על ידי מבחני המלכודת המסורתיים והמותאמים. הדמיה ורזולוציה טובים יותר של תוצרי ה-DNA של הטלומרים נצפתה עם הבדיקה המותאמת כפי שניתן לראות על ידי אורך ועוצמת סולם ה-DNA.ירידה הדרגתית בתוצרי ה-DNA של הטלומרים נצפתה כאשר נעשה שימוש בריכוזים יורדים של תמציות חלבון במבחן המלכודת המותאם, מה שמרמז על רגישותו לזיהוי פעילות טלומרים בריכוזים נמוכים יותר של חלבונים, זיהוי פעילות טלומראז על ידי הבדיקה המותאמת בשלושה אזורי מוח של עכברים נקבות וזכרים בני חודש לא הראה הבדלים משמעותיים. עם זאת, בעכברים בני שלושה חודשים, פעילות טלומראז גבוהה יותר מוצגת באונה הקדמית ובגזע המוח בהשוואה למוח הקטן, כפי שמתגלה על ידי עוצמת רצועות ה-DNA ואורך סולם מוצרי ה-DNA. במהלך המעבר של העכבר לבגרות, פעילות קרן התומה עולה באונה הקדמית ופוחתת בגזע המוח ובמוח הקטן.נראה כי פעילות הטלומרים גבוהה יותר גם באונה הקדמית אצל נקבות. בניגוד לפעילות טלומרית גבוהה יותר בגזע המוח ובמוח הקטן אצל גברים, לאחר שליטה, ניתן לבצע טכניקה זו תוך שש עד שבע שעות אם היא מבוצעת כראוי. לאחר צפייה בסרטון זה, אתה אמור להבין היטב כיצד לקבוע בקלות את פעילות התומה ברקמה שבחרת.

telomerase-activity-various-regions-mouse-brain-non-radioactive

Research

JoVE Journal

Neuroscience

מדעי המוח

EpiMark 5-5-HMC ו MC ערכת ניתוח יכול לשמש כדי לנתח לכמת 5-5-methylcytosine ו hydroxymethylcytosine בתוך מוקד spe cific. הערכה מבדיל 5-MC מתוך 5-HMC על ידי תוספת של גלוקוז אל קבוצת הידרוקסיל של 5-HMC דרך התגובה האנזימטית ניצול β-glucosyltransferase (T4-BGT). כאשר 5-HMC מתרחשת בהקשר של CCGG, שינוי זה ממיר אתר cleavable MspI לאתר הלא cleavable.

רגישות גבוהה 5-hydroxymethylcytosine איתור ברקמה Balb / C המוח

שיטה מדויקת, קצרה, מתוחכמת וזולה מתוארת מעריך כי אורך הטלומרים ברקמות ומינים באמצעות qRT-PCR מרובים. בנוסף, נתאר assay פשוט כדי להעריך את פעילות טלומראז כמבחן עמוד השדרה משלים לאורך הטלומרים.

אורך הטלומרים ופעילות Telomerase; יין והיאנג של הזדקנות תא

אנו מתארים נהלים לתיוג וgenotyping עכברי יילוד ויצירת תרבויות עצביות עיקריות מהם. Genotyping הוא מהיר, יעיל ואמין, ומאפשר למיצוי גרעין חומצה אוטומטי. זה שימושי במיוחד עבור עכברי neonatally קטלניים והתרבויות שלהם שדורשות השלמה מוקדמת של genotyping.

המהיר Genotyping של בעלי חיים ואחרי הקמת תרבויות עיקריות של נוירונים במוח

טלומרים וטלומראז ממלאים תפקידים חיוניים בהזדקנות ובגידולים. מטרת פרוטוקול זה היא להראות כיצד ליצור שני אללים של טלומראז הניתנים להשראת עכברים וכיצד להשתמש בהם במחקרים על ניוון/התחדשות רקמות וסרטן.

ניצול Murine עין מתנהל הטלומרז אללים במחקרים של ניוון רקמה / התחדשות והסרטן

RNA in situ hybridization (ISH) מאפשר הדמיה של RNA בתאים וברקמות. כאן אנו מראים כיצד ניתן להשתמש בהצלחה בשילוב של RNAscope ISH עם אימונוהיסטוכימיה או צבעים היסטולוגיים כדי לזהות mRNAs הממוקמים באקסונים בחלקים של מוחות עכברים ובני אדם.

איתור של Axonally המותאם למקום mRNAs בסעיפי מוח באמצעות ברזולוציה גבוהה<em&gt; באתר</em&gt; הכלאה

טלומראז האנושי רוורס טרנסקריפטאז (טרט) מסנתז לא רק דנ א telomeric, אלא גם כפול גדילי RNA באמצעות פעילות RNA פולימראז תלוי-RNA. כאן, אנו מתארים את assay שהוקם כדי לזהות פעילות RNA פולימראז תלוי-RNA של טרט אנדוגני.

גילוי הכמותיים למחצה של RNA תלוית RNA פולימראז פעילות החלבון רוורס טרנסקריפטאז טלומראז אנושי

כאן, אנו מציגים פרוטוקול ליצירת סרטן התא שיבוטים המכיל תגית רצף MS2 ב subtelomere יחיד. גישה זו, בהסתמך על מערכת MS2-GFP, מאפשרת הדמיה של התרשימים אנדוגני של telomeric המכילים חוזר RNA (TERRA) הביע מ טלומר יחיד בתאים חיים.

הדור של סרטן התא שיבוטים כדי להמחיש Telomeric המכילים חוזר RNA טרה הביע מ טלומר יחיד בתאים חיים

כאן, אנו מתארים פרוטוקול כדי ליצור מודל קיימא נשי מורטין עם כרומוזום לא אקראי הפעלה X, כלומר, maternally בירושה כרומוזום X אינו פעיל ב 100% של התאים. כמו כן, אנו מתארים פרוטוקול לבדיקת היתכנות, סבילות, ובטיחות של ההפעלה הפרמקולוגית של כרומוזום X לא פעיל ב vivo.

מודל עכבר שאינו אקראי עבור ההפעלה הפרמקולוגית של Mecp2 על כרומוזום X לא פעיל

הצלחנו להמיר בהצלחה את התקן טלומר חוזר פרוטוקול (מלכודת) האפשרות להיות מועסק בתגובות שרשרת droplet דיגיטלית פולימראז. שיטת הפעולה החדשה, הנקראת ddtrap, רגישה יותר וכמותית, ומאפשרת זיהוי טוב יותר וניתוח סטטיסטי של פעילות טלומראז בתוך תאים אנושיים שונים.

מלכודת droplet דיגיטלית (ddTRAP): הסתגלות פרוטוקול Telomere חזרה הגברה על תגובת שרשרת התגובה של רביב דיגיטלי

היכולת לסמן באופן קבוע תאי גזע וצאצאיהם באמצעות פלואורופור באמצעות קו עכברים מהונדס בלתי ניתן להשראה מאפשרת ניתוח מרחבי וזמני של הפעלה, התפשטות, נדידה ו/או התמיינות in vivo. מעקב אחר שושלת יכול לחשוף מידע חדש על מחויבות לשושלת, תגובה להתערבויות ורב-תחומיות.

מעקב אחר שושלת של תאי גזע בעלי תווית פלואורסצנטית אינדוקטיבית במוח העכבר הבוגר

חקור פעילות טלומראז באזורים שונים של מוח עכבר באמצעות פרוטוקול TRAP לא רדיואקטיבי. שיטה זו מאפשרת זיהוי הבדלים בין זכרים לנקבות ביעילות ובעלות נמוכה.

פעילות telomerase באזורים שונים של מוח עכבר: הטלומרז לא רדיואקטיבי חזור הגברה פרוטוקול Assay (TRAP)

גלה סרטונים נוספים