ניצול של זיזי סיליקון המיקרוסקופים כדי להעריך את התפקוד נייד התכווצות במבחנה

מטרת הניסוי הבא היא למדוד את פעילות ההתכווצות של סיבי שריר מתורבתים בתגובה לגירוי בסביבה מבוקרת במבחנה. זה מושג על ידי ציפוי תאי שריר מנותקים על שלוחת סיליקון בקנה מידה מיקרו, והשראת היתוך של תאים חד-גרעיניים אלה ליצירת סיבים הנקראים צינורות מיו. שבבי שלוחה אלה התומכים בתאי שריר מובחנים מועברים לאחר מכן למיקרוסקופ אלקטרופיזיולוגיה המותאם לתמיכה בלייזר וגלאי צילום המשמשים למדידת סטיית שלוחה בתגובה להתכווצות השריר לאחר מיקום השבב באסדה.

הלייזר ממוקם כך שהוא מתמקד בקצה השלוחה וגלאי הצילום מיושר גם הוא כך שהוא תופס את הקרן המוסטת מתקבלות תוצאות המראות את מידת הסטייה של השלוחה, הנגרמת על ידי התכווצות שרירים בתגובה לטיפול חשמלי או כימי, ומספקת מדידה ישירה של פרופיל ההתכווצות של התאים הזרעים בזמן אמת. בסופו של דבר, ניתן לעבד תזוזה שלוחה כדי לספק קריאת כוח. מערכת זו מרובת כדי לספק מיטת בדיקה פוטנציאלית בתפוקה גבוהה להערכת שינויים בתפקוד ההתכווצות בתגובה לטיפול תרופתי, מחלה, מצב או פרוטוקולי פעילות גופנית.

היתרון העיקרי של טכניקה זו בהשוואה לשיטות קיימות כגון אלקטרופיזיולוגיה של מהדק תיקון, הוא ששיטה זו לניתוח פונקציונלי אינה פולשנית וניתנת להתאמה בקלות למחקרי תפוקה גבוהה. שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלות מפתח בתחום פיתוח התרופות, כגון זיהוי ריכוזי תגובה למינון מתאים לפני הערכה קלינית. ההשלכות של טכניקה זו משתרעות לכיוון טיפול במחלות שרירים מרובות מכיוון שהיא מספקת אמצעים לחקור את הביצועים התפקודיים של תאים מפנוטיפים פתולוגיים שונים בזמן אמת, עם זאת, שיטה זו יכולה לספק תובנה לגבי פתולוגיות שרירי השלד בשלד.

זה יכול לשמש גם למערכות רקמות אחרות כגון לב ושרירים חלקים מעוקרים, שבבי שלוחה שהוכנו בעבר והחלקות כיסוי 13 F בתמיסת אתנול 70% ומאפשרים להתייבש באוויר במכסה המנוע. לאחר מכן הניחו שבבי שלוחה בודדים על גבי פתקי כיסוי של 13 F. בתוך צלחת סטנדרטית של 12 בארות מצפים את השלוחים עם הביופולימר או שינוי פני השטח המותאם לסוג התא המשמש על פי פרוטוקולי תרבית תאים סטנדרטיים, ציפוי פני השטח לוקח 30 דקות בשיטת ההכנה שלנו, אך אולי משתנה בהתאם לפרוטוקול התרבות הספציפי של החוקר.

ריס היה התאים במדיום הגידול הספציפי שלהם לריכוז הרצוי, ואז מאות מיקרוליטרים של תרחיף התאים על פני שבב השלוחה, מה שמבטיח שבועת המדיום מכסה את חלונות השלוחה לחלוטין. העבירו את הצלחת המכילה את השבבים לחממה ואפשרו לתאים להיצמד לפחות שעה לאחר תקופת הציפוי הזו. השתמש במלקחיים סטריליים כדי להעביר את השבב לבאר נקייה ללא החלקת כיסוי של 13 F והוסף מיליליטר אחד של מצע גידול לכל אחד.

ובכן החזירו את הצלחת לחממה, שמרו על תאים על פי הפרוטוקול הסטנדרטי שלהם לתחזוקה חוץ גופית. על החלקות כיסוי, הניחו צלחת תרבית מחוממת על הבמה של מיקרוסקופ אלקטרופיזיולוגיה זקוף. הוסף שלושה מיליליטר ממדיום הזנת התאים הנוכחי למיקרוסקופ המחומם.

שלב אלקטרודות נירוסטה בחלק הפנימי של צלחת התרבות המחוממת במרחק הפרדה של 15 מילימטרים. חברו אותם למחולל פולסים המסוגל לייצר גירוי שדה, פולסים בעוצמה, תדר וצורת גל משתנים כדי לאפשר למערכת לייצר גירוי שדה של תאים בעת הצורך. הברג לייזר ניאון הליום המותקן על שלבי תרגום XY לצד התחתון של שולחן המיקרוסקופ.

לאחר מכן כוונן את הלייזר כך שקרן הלייזר תופנה דרך בסיס צלחת התרבות המחוממת בזווית של 30 מעלות ביחס למישור השלוחה. הבורג הבא, מודול גלאי צילום רביע המותקן על שלבי תרגום XY לצד התחתון של שלב המיקרוסקופ. התאם את מיקומה כך שקרן הלייזר המוחזרת תנחת במרכז ארבעת הרבעים.

כתוב תוכנה לשליטה במפעילים הליניאריים הסורקים על פני השלוחים בהתייחס לתרשים הזרימה המסופק בפרוטוקול הטקסט. הפעל את חומרת ניתוח השלוחה ואת התוכנה הנלווית. הכנס את הבמה המחוממת ther mrta לתוך המדיום והמתן עד שהוא יקרא 37 מעלות צלזיוס.

לאחר מכן, הכנס את שבב השלוחה לבמה כשהשלוחה מכוונת לכיוון הצד הימני של הבמה. הפעל את מקור האור של המיקרוסקופ. מקד את המיקרוסקופ כדי להציג את קצוות השלוחה והשתמש בתוכנת הבקרה של גלאי צילום הלייזר כדי למקם את קרן הלייזר על קצה השלוחה, בהנחה שהשלוחה מכוונת מימין לשלוחה הבמה.

אחד הוא זה שממוקם בפינה השמאלית העליונה של המערך והמספרים יורדים ל-16. בפינה הימנית התחתונה. קנטיליבר 17 נמצא בעמדה הימנית העליונה ומגיע ל-32.

בפינה השמאלית התחתונה לחץ על הפעל בתוכנת ההקלטה. מקם את גלאי הצילום כך שהאות יקרא אפס הן במסגרות x והן ב-y על ידי כוונון מנועי הצעד השולטים בגלאי הצילום. לאחר מכן הגדר את השלוחה במיקום אחד בתוכנת הבקרה של גלאי צילום הלייזר.

לאחר מכן, העבר את הלייזר לקצה שלוחה 16. חזור על המיקום של גלאי הצילום והגדר את מיקום השלוחה 16 בתוכנת הבקרה של גלאי צילום הלייזר. כעת העבר את הלייזר לקצה שלוחה 32.

חזור על המיקום של גלאי הצילום והגדר את מיקום השלוחה 32 בתוכנת הבקרה של גלאי צילום הלייזר. לבסוף, העבר את הלייזר לקצה שלוחה 17. חזור על המיקום של גלאי הצילום והגדר את מיקום השלוחה 17 בתוכנת הבקרה של גלאי צילום הלייזר.

כבה את מקור האור של המיקרוסקופ ולאחר מכן את האור העילי במעבדה. לחץ על הקלטה בתוכנת ההקלטה. הגדר את חומרת מחולל הדופק לפולסים של 40 אלפיות שנייה וחמישה וולט, תדר של הרץ אחד.

לאחר מכן הפעל את המכונה באמצעות תוכנת בקרת גלאי צילום הלייזר, הגדר את החומרה לסריקה על פני מערך 32 השלוחה. עצירה לחמש שניות בכל אחד מהם. לאחר השלמת הסריקה של 32 השלוחות, כבה את הממריץ.

לאחר מכן עצור את תוכנת ההקלטה והעלה את קובץ הנתונים. בדוק את העקבות המתועדות מכל שלוחה. לראיות לפעילות התכווצות.

התכווצות מוגדרת כשיא. אם הסטייה היא לפחות 0.1 וולט מעל קו הבסיס, רשום לכל שלוחה עם תגובות חיוביות. הסר את כל השלוחים שאינם מגיבים מפרוטוקול הסריקה בתוכנת הבקרה של גלאי צילום הלייזר.

לאחר מכן ניתן לסרוק מחדש את השלוחים הפעילים ללא גירוי על מנת לקבל קריאה של פעילות ההתכווצות הספונטנית של התא. לאחר מכן, הוסף תרכובת טיפולית למדיום כדי לבחון את השפעתה על התפוקה התפקודית של התאים המתורבתים. לאחר הוספת סריקות ריצה מורכבות עם או בלי גירוי חשמלי בשדה רחב, בצע הערכות עייפות על ידי גירוי חשמלי של התאים לתקופות ממושכות, ולאחר מכן סריקת רמות התכווצות כדי למדוד כמה זמן לוקח לשיא הכוח לרדת מתחת לסף מסוים.

בניסויים שבהם נוירונים מוטוריים נשמרים בתרבית משותפת עם שריר מודדים היווצרות צומת עצבי-שרירי באמצעות טיפול בתרביות קו-שלוחה של צינור נוירו-מיו מוטורי עם ממריץ עצבי או מעכב סינפטי וסריקה לעלייה וירידה בפעילות ספונטנית, המשך לנתח נתוני סטיית שלוחה כמפורט בפרוטוקול הטקסט. תרבית מוצלחת של תאים מתכווצים על שלוחה היא הליך פשוט יחסית המשתמש בטכניקות תרבית תאים סטנדרטיות. ניתן להשתמש בתוכנה אלקטרופיזיולוגית סטנדרטית כדי לנתח את הנתונים הגולמיים המאפשרים חישוב של מאפיינים פונקציונליים רלוונטיים, כגון זמן שיא כוח עד שיא כוח, וזמן עד חצי הרפיה.

פרוטוקולי גירוי מורחבים מספקים את האמצעים להעריך את שיעורי העייפות בתאים מתורבתים, ובכך מרחיבים את רמת הנתונים הפיזיולוגיים שניתן להשיג ממערכת זו. ניתן לשנות את מערכת תרבית השלוחה כך שתכלול נוירונים מוטוריים במערכת התרבות עם צינורות מיו של שרירי השלד, כדי לאפשר הערכה של היווצרות סינפסה עצבית-שרירית במבחנה. בתרביות כאלה, שיעורי ההתכווצות הספונטנית מושווים לשיעורי ההתכווצות בתגובה לטיפול בממריץ ספציפי לנוירון כגון גלוטמט.

כל עלייה שנצפתה בשיעורי ההתכווצות של גלוטמט מצביעה על הפעלה של נוירונים מתורבתים המובילים לשחרור אצטילכולין והפעלת צינור מיו לאחר מכן טיפול במעכבים סינפטיים כגון חוסם קולטן האצטילכולין, dtu rine המובילים להפסקת הפעילות המושרה על ידי גלוטמט מספק ראיות נוספות לנוכחות של סינפסות עצביות-שריריות תפקודיות בתרביות אלה. לאחר צפייה בסרטון זה, אתה אמור להבין היטב כיצד להשתמש בשלוחות סיליקון בקנה מידה מיקרו כדי להעריך את התכונות התפקודיות של שריר השלד המתורבת.