פלטפורמה הרימה-Air-מרוצף שטוחה: שיטה חדשה לשילוב עם התנהגות מיקרוסקופית או אלקטרופיזיולוגיה על Awake לנוע בחופשיות מכרסמים

שלום, אני הל לין, סטודנטית לתואר שני במרכז המדע הקרוב באוניברסיטת הלסינקי. היום עמיתיי ואני נראה לך כיצד לבצע הקלטות אופטיות ואלקטרופיזיולוגיות בתיקון ראש ער, אך חוץ מזה בעלי חיים נעים ומתנהגים בחופשיות. השיטה שלנו יוצרת סביבה מוחשית ומוכרת לעכבר לנווט ולחקור.

במהלך הדמיה מיקרוסקופית או הקלטות אלקטרופיזיולוגיות של תא בודד, הדורשות קיבוע יציב של ראש החיה, אנו משתילים חלון גולגולתי כרוני ומרגילים את העכבר לכלוב ביתי נייד המוטס, המחליק מתחת לרגלי החיה. במהלך תנועה על משטח ישר, ניתן למקם את כלוב הבית הנייד תחת מיקרוסקופ זקוף סטנדרטי להדמיית שני פוטונים או למקם אותו באלקטרופיזיולוגיה שהוגדרה להקלטות מהדק טלאי במוח עכבר ער. כל ההליכים הניסיוניים המוצגים כאן אושרו על ידי ועדת האתיקה המקומית.

אנו משתילים חלונות גולגולת על פי פרוטוקולים שפורסמו עם שינויים קלים עם השתלת חלון הגולגולת. לבעל החיים מותר להתאושש לפחות שבועיים או שלושה במהלך תקופת החלמה זו, החלון בדרך כלל חוזר לשקיפותו. בעלי חיים עם סימנים כלשהם של דלקת שיורית לאחר הניתוח אינם נכללים בניסויים.

לאמן את בעלי החיים שנבחרו למחקר כדי להרגיל אותם לקיבוע ראש. בכלוב הבית הנייד, טפל בעכבר בשלווה במשך חמש עד 10 דקות, הימנע מתנועות ורעשים פתאומיים, ואז החזר אותו לכלוב הביתי. חזור על ההליך פעמיים או שלוש במרווחי זמן לא שווים.

כלוב הבית הנייד מאפשר קיבוע ראש ללא הרדמה של בעל החיים לפני קיבוע הראש. השתמש בסמרטוט כדי לעטוף את העכבר פעמיים או שלוש במרווחים לא שווים. ודא שהחיה נשארת רגועה כשהיא עטופה.

אחרת, חזור על ההליך עד שהעכבר יתרגל אליו לחלוטין. התחל את האילוף פעמיים ביום של העכברים בכלוב הבית הנייד למחרת לאחר סיום הטיפול. שקלו את בעלי החיים לפני כל אימון.

יש להוציא מהמחקר בעלי חיים המראים ירידה במשקל מעל 10%. התאם את מיקום זרוע קיבוע הראש כך שיתאים לגודל החיה המאולפת. חבר את כניסת האוויר של מכשיר הכלוב הביתי הנייד ליציאת האוויר בלחץ המעבדה הסטנדרטית.

ודא שלחץ האוויר מספיק לציפה חופשית של הכלוב הביתי המורם. התחל באילוף בעלי חיים מורגלים בכלוב הבית הנייד. משתק את העכבר על ידי עטיפתו בסמרטוט.

הכנס את מחזיק המתכת המחובר לראש החיה לזרוע קיבוע הראש וקבע אותו היטב על ידי הידוק הברגים. הפעל את זרימת האוויר כדי לגרום לכלוב הביתי המורם לרחף. הסר את הסמרטוט ואפשר לעכבר לחקור את כלוב הבית.

במהלך האימון הראשון, עכברים עשויים להפגין התנהגות קפואה ורעד וזקפת זנב. כדי להרגיל את החיה לרעש, ספקו חשיפה מתמדת לצלילי הסביבה באמצעות, למשל, תרגום רדיו או מוזיקה ודיבור מוקלטים במהלך כל האימונים כמו גם במהלך הניסויים. כדי למנוע מתח כרוני, השתמש בתאורה בהירה במהלך השעה הראשונה של האימון.

לאחר השעה הראשונה, ערכו אימונים בחושך והשתמשו במצלמת אינפרא אדום קרובה כדי לעקוב אחר התנהגות החיה. בסיום האימון, שחרר את החיה מזרוע קיבוע הראש על ידי איבוד הברגים. החזירו את בעל החיים לכלוב הביתי לפחות שעתיים לפני האימון הבא.

החזקת העכבר בכלוב עם שני עכברים אחרים או יותר תפחית את רמת הלחץ. לחלופין, תוכלו למקם את הכלוב המורם יחד עם החיה בכלוב הביתי שלה. זה יעשיר את הסביבה ועשוי לחזק את מגורי החיה בכלוב הבית הנייד.

במהלך האימון האחרון, עכברים רגילים לקיבוע ראש וצריכים להפגין התנהגות נטולת מתח בניווט רגוע סביב הכלוב הביתי המוטס. בהיעדר אור נראה, ניתן לעקוב אחר מסלול תנועת העכבר על ידי ניטור תנועות הכלוב באמצעות מצלמת אינפרא אדום קרובה או באמצעות עכבר מחשב אופטי. במהלך אימונים ממושכים שנמשכים יותר משעה או שעתיים, שקול לספק לעכבר מי שתייה, באופן ידני או באמצעות מחזיק פיפט המחובר למסגרת הכלוב הביתי הנייד.

התרשים הבא מסכם את ציר הזמן של מחקר ניסיוני טיפוסי. המחקר מתחיל בהשתלת חלון הגולגולת שבועיים לפני הטיפול בעכבר, וממשיך בשמונה אימונים פעמיים ביום. המחקר הטיפוסי כולל מספר מפגשי הדמיה או מפגשי הקלטת מהדק טלאי המרווחים במרווח של מספר שעות עד מספר ימים או שבועות.

ניתן לבצע ניסויים אופטיים ואלקטרופיזיולוגיים במקביל לגירויים וקריאות קוגניטיביות או התנהגותיות. מיקרוסקופיה דו-פוטונית היא טכנולוגיה אופטית לא ליניארית ייחודית המאפשרת הדמיה בזמן אמת של מבנים תאיים ואפילו תת-תאיים בשכבות קליפת המוח העמוקות של מוח מכרסמים. כדי לבצע ניסוי הדמיה מיקרוסקופית של שני פוטונים, הנח בעל חיים מאומן בכלוב הבית הנייד, כוונן את המעצורים כדי להגן על אופטיקת המיקרוסקופ מפני נזק מקרי.

נקה את זכוכית הכיסוי של חלון הגולגולת כדי להסיר חלקיקי אבק. זרוק נוזל טבילה על זכוכית הכיסוי. אנו ממליצים להשתמש בתמיסת ויסקוס מכיוון שהמים מתאדים במהירות.

ניתן למקם את הפלטפורמה על גבי שולחן אופטי ממונע טיפוסי באמצעות מצב השדה הרחב של מיקרוסקופ הקרינה ומסנן פליטה ארוך. העריכו את כלי הדם במוח ובחרו אזור עניין. כדי לדמות כלי דם בקליפת המוח להזריק לווריד הזנב של בעל חיים קבוע ומשותק ראש, טקסט מצומד אדום של 70 קילו דלטון, טקסס.

רצף תמונות זה מציג הקלטה בהילוך מהיר של מקומות ועורקים בקליפת המוח של עכבר מתנהג בזמן שהוא מנווט סביב כלוב הבית הנייד. על ידי שרטוט פרופיל הקווים המשורטטים על פני לומן הכלי, ניתן למדוד את השינויים בקוטר הכלי ואת התנועתיות של מקטעי כלי דם בודדים. ניתן למדוד את קצב זרימת הדם בעורקים ובוורידים על ידי סריקת קווים לאורך הקווים המצוירים במקביל לדופן כלי הדם. קנס.

ניתן לדמיין פרטים על מורפולוגיה של נוירונים בעכברים טרנסגניים המבטאים YFP בתת-אוכלוסיית הנוירונים תחת מקדם טייוואן. שני הזאקים הללו משווים את יציבות ההדמיה בין בעלי חיים מורדמים לערים. הפאנל הימני מציג דנדריטים מהחיה מורדמים בתערובת קטמין קסילזין.

בעוד שהפאנל השמאלי מציג תמונה של דנדריטים בחיה ערה מסתובבת בכלוב בית נייד. ניתן לנתח מורפולוגיה אינדיבידואלית של עמוד השדרה בבעלי חיים ערים באותה אמינות ודיוק כמו בעכברים מורדמים. תזוזה של המוח במהלך ריצה של בעלי חיים אינה עולה בדרך כלל על מיקרומטר עד מיקרומטר וחצי.

תנועות אלו מתרחשות בכיוונים אופקיים ולעיתים רחוקות מאוד גורמות לשינוי של מישור ההדמיה, מה שהופך את תיקון חפצי התנועה למיותר. ברוב המקרים, היכולת לנטר באופן כרוני את הפעילות העצבית במוח החי הער חיונית להבנת הארגון והתפקוד של מערכת העצבים. באמצעות הקשירה של שלושה עכברים טרנסגניים, אנו מדמים פעילות עצבית ספונטנית בעכברים ערים המתנהגים בכלוב הבית הנייד.

רצף תמונות זה של זמן-lapse מציג דוגמאות מייצגות של קפיצות סידן בגופי תאי עצב, ניטים ואקסונים. הדמיה אופטית המבוססת על אותות פנימיים מאפשרת מיפוי ההתפלגות המרחבית של תחומים פונקציונליים לביצוע ניסוי הדמיה אופטית פנימית. הנח את החיה המאומנת בכלוב הביתי הממוקם מתחת למטרת המצלמה.

נקה את זכוכית הכיסוי מאבק. שים טיפת גליצרול וכסה אותה בהחלקת כיסוי עגולה של חמישה מילימטרים. כוונן את המיקום של מצלמה במהירות גבוהה.

הניחו מניפולטור עם צינור נושף אוויר מול הוויברה הנגדית. השתמש באורות ירוקים כדי לדמות את מפת כלי השיט. התמקדו עמוק יותר לתוך קליפת המוח, כ-400 מיקרומטר מתחת לכלי הדם בקליפת המוח.

הניחו מסנן מעבר פס מול המצלמה והאירו את קליפת המוח באור אדום. אפשר לעכבר להתאמץ לפלטפורמה למשך 30 דקות לפחות. הקליטו את הפעילות הבסיסית במהלך פרק של שש דקות.

עוררו את הוויברה כל 10 שניות עם נשיפות אוויר למשך שש דקות בסך הכל. תמונה זו ממחישה פעילות עצבית המתפשטת לאורך קליפת המוח הסומטוסנסורית בתגובה לגירוי ויברה בתדר של 0.05 הרץ. כדי לבצע רישומים אלקטרופיזיולוגיים של תא בודד, הנח את בעל החיים המאומן המושתל עם חלון גולגולת הפוך בכלוב הבית הנייד.

לאט ובזהירות, הסר את זכוכית הכיסוי ממחזיק המתכת. רעננו את המאגר בקליפת המוח ונקו את חלון הגולגולת מפסולת בעזרת טמפון המוסטטי. הנח את האלקטרודה הקרקעית לתוך המאגר בקליפת המוח.

מלאו את פיפטת מהדק התיקון בתמיסה תוך-תאית. הפעל לחץ חיובי על פיפטת ההקלטה באמצעות מיקרו מניפולטור ממונע, העמק את הפיפטה לתוך קליפת המוח וקבל מגע חותם ג'יגה עם התא המבוקש. לאחר ההקלטה, הסר את הפיפטה, רענן את המאגר בקליפת המוח וסגור את חלון הגולגולת על ידי דבק בכוס כיסוי למחזיק המתכת.

השימוש בכלוב ביתי מוטס מאפשר שילוב של הדמיה ואלקטרופיזיולוגיה עם פרדיגמות התנהגותיות קלאסיות כגון למידה, שיקום או התנהגות הקשורה לחרדה. חוש הריח הוא קלט חושי חשוב לעכברים ויכול לשמש לגירוי במבחני זיכרון, ולהערכת תגובה לחידוש. כדי לבצע בדיקת ריח של הרגל, הנח את החיה המאומנת בכלוב הבית הנייד ואפשר לה לאמץ.

למשך 30 דקות, חבר חתיכת כותנה נקייה ספוגה במי ברז לקיר הפנימי של כלוב הבית הנייד באמצעות סרט דבק דו צדדי. לאחר חמש דקות, החליפו את הכותנה הנקייה על קיר הכלוב הביתי בכותנה חדשה ספוגה בנוזל המכיל את ריח הווניל. חזור על החשיפה של חמש דקות לריח הווניל שלוש פעמים במרווחים של חמש דקות בין המפגשים.

למדוד את רמת העניין בריח. ספרו את הזמן המצטבר שבעל החיים מבלה מול אזור היעד ואת הזמן הכולל של תנועת כלוב הבית הנייד. במהלך המפגש החמישי האחרון, הציגו ריח בעל משמעות חברתית.

הרטיבו את מוליך הכותנה החדש בכמה טיפות שתן מעכברים מהמין השני. כדי להעריך את התגובה לחידוש, חלקו את כלוב הבית הנייד לארבעה אזורים. חבר שתי חתיכות כותנה מנוגדות זו לזו. צבע.

קודד אותם עם טושים בצד החיצוני של קירות הכלוב הביתי במהלך הניסיון הראשון. מניחים שתי חתיכות כותנה נקיות. לאחר מכן החלף את שניהם בכותנה ספוגה בתמצית וניל של 1%.

במהלך הניסוי השלישי, הכניסו את כותנת הוניל לאזור מספר אחת ואת חתיכת הכותנה הספוגה בתמצית בננה של 1% לאזור. מספר שתיים, למדוד את ההעדפה ללא ריח. חשב את הזמן שבעלי חיים מבלים מול ללא ריח כאחוז מהזמן המצטבר מול אזורים אחרים.

היי, אני ליאו קירו, חוקר ראשי במרכז למדעי המוח באוניברסיטת הלסינקי. אני מקווה שנהניתם לצפות בסרטון ומצאתם אותו שימושי. אנחנו עובדים עם כפול על מיקרוסקופיה in vivo בחמש השנים האחרונות, והשימוש בכללי ואסתטי תמיד היה דאגה גדולה מכיוון שאסתטיקה מפריעה לתפקוד המוח, לזרימת הדם ולכל דבר.

והיום אני שמח שאנו יכולים לעבוד על בעלי חיים ערים ולבצע ניסויי הדמיה מיקרוסקופיים יציבים ולאמת ולאמת את התוצאות שהשגנו בעבר בבעלי חיים מורדמים. אני בטוח שהשימוש בכלוב ביתי נייד והשיטות שהצגנו היום יגדילו את הרלוונטיות של מחקר in vivo בכלל ויובילו לתוצאות חדשות ופורצות דרך, ואני מצפה לזה.