Name: שיטה חדשה ללוקליזציה חרוזי ניאון כתב סמוך לפני שטח תרבית תאים לגרירה מיקרוסקופית כוח (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-09-16T13:00:00.000+00:00
Duration: 13 min 30 s
Description: למד שיטה חדשה ללוקליזציה של חרוזי ניאון בג'ל פוליאקרילאמיד לקרבת פני השטח. השיטה משפרת מדידות מיקרוסקופיית כוח גרירה בתרביות תאים.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

המחברים מבקשים להודות תכנית היוזמה הבינתחומי החדשנות, אוניברסיטת אילינוי, להעניק 12035. SK מומן בUIUC מהקרן הלאומית למדע גרנט (NSF) 0,965,918 IGERT: הכשרת הדור הבא של חוקרים בניידים ומכניקה מולקולרית וBioNanotechnology.

בודה וfunctionalizing ג&#39;לי הרשות הפלסטינית בדרגות שונות של stiffnesses עם microspheres הניאון המוטבע קרוב לפני שטח תרבית תאים. .1 Functionalizing החלקות המכסה העליון הזכוכית <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> התלושים נקיים כיסוי זכוכית (# 1.0, קוטר מ&quot;מ 12.) עם מים וסבון, ואחריו אתנול כדי להסיר אבק זר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כיסוי זכוכית מקום מחליק על משטח מגורד (כלומר בעל קצה פיפטה) באופן שהם לא נוגעים כדי להקל על קלות של אינטראקציה עם coverslips. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מעיל כל פני השטח של תלושי לכסות עם פולי-D-ליזין (0.1 מ&quot;ג / מ&quot;ל) במשך שעה 1 (איור 1 א). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> במהלך הזמן הזה, לבצע דילול 1: 10,000 מפתרון קולואיד של 0.1 מיקרומטר קוטר, microspheres ניאון אדום עם deionized מים (DI) כדי להשיג צפיפות חלקיקים של כ microsphere 1 לכל 20 מיקרומטר 2 על פני השטח ג&#39;ל. ראה איור 2 לתוצאות של דילולים שונים. dilutio זהn יכול להיות שונה כדי לענות על הצורך של ניסויים ספציפיים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים את הפתרון המדולל באמבט מים קולי ל30 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אחרי שעה 1, להשתמש בפינצטה כדי להרים בזהירות כל פיסת כיסוי ומכה יבשה עם אוויר. החזר את המכסה מחליק היבשה על פני השטח צהובה מגוררת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את פתרון קולואיד המדולל מהאמבטיה ופיפטה 150 μl קולי על גבי כל אחד להחליק את המכסה. השאר למשך 10 דקות (איור 1). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להשתמש בפינצטה כדי להרים בזהירות כל פיסת כיסוי ומכה יבשה עם אוויר. החזר את הכיסוי היבש מחליק על פני השטח והחנות מגורדים בחושך עד מוכן לשימוש. </li></ol> .2 הכנת הרשות ג&#39;ל ישירות על צלחות פטרי זכוכית תחתונה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פלטה חשמלית מחממים 100 C °. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להוציא את המספר הרצוי של צלחות פטרי זכוכית תחתונה (מנה מ&quot;מ 35 עם 14 מ&quot;מ מיקרו היטב, # 1.0) על משטח שטוח במנדף הכימי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כסה את חלק הזכוכית של כל מיקרו גם צלחת פטרי עם 97% 3-aminopropyl-trimethoxysליאן (3-APTES) במשך 7 דקות להפעלה כימית. קח זהירות כדי למנוע טפטוף מכוון של 3-APTES אל פני השטח של הפלסטיק בצלחת פטרי, כדי למנוע השפלה של הקלקר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר 7 דקות, למלא את צלחת פטרי עם מים די ולהשליך לתוך מיכל פסולת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חזור על שלב 2.4 3x עבור כל מנה, ולאחר מכן ללחוץ את צלחת פטרי כדי להסיר מים נוספים. מניחים את צלחות פטרי על הצלחת החמה עד חלק הזכוכית הוא יבש. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את צלחות פטרי מהצלחת החמה ולחזור למשטח שטוח במנדף כימי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> במנדף הכימי, להפוך את הפתרון של 0.5 glutaraldehyde% ולכסות את חלק הזכוכית של כל צלחת פטרי היטב עם הפתרון ל30 דקות. קח זהירות כדי למנוע טפטוף מכוון של glutaraldehyde אל פני השטח של הפלסטיק בצלחת פטרי, כדי למנוע השפלה של הפלסטיק. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר 30 דקות, למלא את צלחת פטרי עם מים די ולהשליך לתוך מיכל הפסולת לשטוף ולהסיר את glutaraldehyde. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חזור על שלב 2.4 3x עבור כל מנה, ולאחר מכן ללחוץ את צלחת פטרי כדי להסיר מים נוספים. מניחים את צלחות פטרי על הצלחת החמה עד חלק הזכוכית הוא יבש. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לפני ערבוב הרכיבים של פתרון ג&#39;ל הרשות הפלסטינית, להעביר שקופיות הזכוכית פונקציונליות למנדף הכימי כך שהם נגישים בקלות, ומאפשר לרבדה מהירה של הג&#39;ל עם תחתית זכוכית צלחות פטרי לאחר ערבוב פתרון ג&#39;ל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בצינור צנטריפוגות 15 מ&quot;ל, לערבב bisacrylamide 40%, 2% acrylamide, וחומצה אקרילית ברציפות מיידית בריכוזים המפורטים בטבלה 1 (מותאם מפרוטוקול שפורסם 10) כדי להשיג את גמישות המטריצה ​​הרצויה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 100 HEPES מ&quot;מ, 10% persulfate אמוניום, וTEMED בכמויות מפורטות בטבלה 1 המקביל לגמישות מטריצה ​​רצויה כדי להשלים את פתרון ג&#39;ל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מייד פיפטה 15 μl של פתרון ג&#39;ל על גבי במרכז חלק הזכוכיתשל צלחות פטרי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מייד להרים לכסות להחליק זכוכית פונקציונליות עם פינצטה. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפוך את כיסוי הזכוכית להחליק על כך שחרוזי הניאון נמצאים בקשר צד עשייה עם פתרון ג&#39;ל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הנח להחליק את המכסה בעדינות על גבי ג&#39;ל הרשות הפלסטינית כעת הנוזלי כך שהצד פונקציונליות הוא במגע עם ג&#39;ל (איור 1 ג). הערה: לקבלת התוצאות הטובות ביותר, אדם שני מומלץ לתפקיד של הוספה להחליק את המכסה על מנת למנוע אפשרות של פילמור החלקי תוך pipetting פתרון ג&#39;ל רשות נוזלי על גבי צלחות פטרי מרובות. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פליפ כל צלחות פטרי על מנת לסייע במניעת השפעות כוח הכבידה על חלקיקי ניאון polymerizing לרמות נמוכות יותר של ג&#39;ל הרשות הפלסטינית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחכות לפחות 35 דקות, או עד שפתרון המניות של ג&#39;ל הרשות polymerized בעליל בצינור צנטריפוגות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפוך את צלחות פטרי בחזרה שוב ולמלא אותם עם PBS על מנת לסייע בהסרה להחליק את המכסה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להפוך בזהירות במגע עם חלק הזכוכית של צלחת פטרי ואת קווי המתאר של להחליק את המכסה, באמצעות פינצטה כדי לגרד את ההיקף להחליק את המכסה. לבצע כמה מחזורים עד להחליק את המכסה נעקר ממקומה. הסר להחליק את המכסה ולהיפטר במכל פסולת החדה נכון. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר הסרת כל המכסה מחליק, חרוזי ניאון יהיו העבירו לג&#39;ל (1D איור). כסה ג&#39;לי הרשות הפלסטינית עם לחלוטין PBS, למקם את המכסה צלחת פטרי על כל מנה, ולאחסן ב 4 ° C. </li></ol> .3 Functionalizing ג&#39;ל הרשות הפלסטינית עם פיברונקטין <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן את הפתרונות מעורבבים מראש הבאים כפי שתואר בפרוטוקול הוקם 11: משרים פתרון (137 mM NaCl, 5% (v / v) גליצרול) וחיץ 2x נטיה (0.2 M 2 (-morpholino N) חומצת ethanesulfonic (MES), 10 גליצרול% (v / v), pH 4.5). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש במשאבת ואקום במנדף ביולוגי כדי להסיר את כל PBS מהזכוכית תחתונה המנות המכילות ג&#39;ל הרשות הפלסטינית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Pipette לספוג פתרון על כל ג&#39;ל כזה שג&#39;ל הוא שקוע לחלוטין. דגירה בטמפרטורת חדר למשך שעה לפחות 1. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> -3-1 אתיל [3 dimethylaminopropyl-] carbodiimide hydrochloride החם (EDC) ו-hydroxysulfosuccinimide N (NHS) לטמפרטורת חדר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מערבבים 10x פתרונות של EDC (150 מ&quot;מ, 19 מ&quot;ג / מ&quot;ל ​​במי DI) ושירותי בריאות (250 מ&quot;מ, 29 מ&quot;ג / מ&quot;ל ​​במי DI). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מערבבים חלק 1 10x EDC, חלק 1 10x NHS, 3 חלקי מים די, ו -5 חלקים 2x חיץ הצמידה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש במשאבת ואקום במנדף ביולוגי כדי להסיר את הפתרון לספוג. ודא שכל הנוזלים הוא להסיר את פני השטח ג&#39;ל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף פתרון NHS / EDC מספיק כדי לכסות את פני השטח ג&#39;ל ולמלא גם הזכוכית התחתונה של צלחת פטרי (150-250 μl). דגירה בטמפרטורת חדר למשך 30 דקות בחושך. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פיברונקטין הפשרה בטמפרטורת חדר. מופשר פעם, לערבב מים די סטרילי כדי ליצור / פתרון פיברונקטין מ&quot;ל 50 מיקרוגרם. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש במשאבת ואקום במנדף ביולוגי כדי להסיר את solu NHS / EDCtion. ודא שכל הנוזלים הוא להסיר את פני השטח ג&#39;ל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 150 μl של פתרון פיברונקטין לכל ג&#39;ל. דגירה בטמפרטורת חדר למשך 35 דקות, כדי לאפשר התקשרות של פיברונקטין. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר 35 דקות, להוסיף PBS על כל צלחת פטרי ולאחסן ב 4 מעלות צלזיוס למשך עד 2 שבועות. </li></ol> .4 ניסויי גרירה חיל <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תקשורת חמה תא, PBS, וטריפסין ל37 מעלות צלזיוס באמבט מים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> יש לשטוף את ג&#39;לי 5x עם PBS סטרילי, aspirating PBS בין שטיפות, ולהשאיר מכוסה בברדס. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 1 מ&quot;ל טריפסין ל25 2 סנטימטר לתאי בקבוק המכיל. לאחר התאים הרימו מבקבוק, לדלל את טריפסין עם תקשורת סלולארי ולספור את התאים. בהתבסס על שטח פן ג&#39;ל, לקבוע את מספרם של התאים הנדרשים לג&#39;ל לצפיפות זריעת תא סופית של 3,000 תאים / 2 סנטימטר. לדלל או לרכז את ההשעיה באופן ש150 μl של תערובת תאי התקשורת מכילה מספר זה של תאים. 150 μl Aliquot של suspens התאיון בזה לזה ג&#39;ל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים את צלחות פטרי המכילות תאים באינקובטור במשך 30 דקות. לאחר מכן, להסיר בזהירות את צלחות פטרי ולמלא את שאר צלחת פטרי עם תקשורת (כ 2 מ&quot;ל) באופן שעל פני השטח של הצלחת הוא שקועים לחלוטין. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים את צלחות פטרי בחזרה בחממה עד לרכישת תמונה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן את מערכת רכישת מיקרוסקופ ונתונים להדמיה: הכנס את מטרת טבילת 40x מים, להכניס פריזמה התערבות הפרש לעומת זאת (DIC), בחר בmCherry או מסנן ניאון שווה ערך, ולהפעיל את התא הסביבתי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כאשר התכוננו להדמיה, להסיר אחד צלחת פטרי מהחממה ולמקם אותו בעדינות על הבמה מיקרוסקופ. הסר את המכסה צלחת פטרי להדמית דסק&quot;ש. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אתר תא בודד וללכוד תמונת סטילס יחידה של התא בדסק&quot;ש. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מבלי להזיז את הבמה מיקרוסקופ, לעבור את מצב ההדמיה כדי הקרינה. להתמקד בmicrospheres וrec הניאוןORD תמונה של microspheres. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מוציא בזהירות תקשורת סלולארי מצלחת פטרי עם טפטפת ולהוסיף 0.05% טריפסין-EDTA. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תמונה המיקרוסקופית מתחת לתא לאחר שהתאים מנותקים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> velocimetry תמונת ניתוח חלקיקי שימוש (PIV) ב12 ImageJ כדי לחשב את שדה העקירה בשל כוחות סלולריים. </li></ol>

<ol><li>Pelham, R. J., Wang, Y. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+locomotion+and+focal+adhesions+are+regulated+by+substrate+flexibility%5BTitle%5D)+AND+%22PNAS%22%5BJournal%5D)">Cell locomotion and focal adhesions are regulated by substrate flexibility.</a> PNAS. 94 (25), 13661-13665 (1997).</li>
<li>Dembo, M., Wang, Y. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stresses+at+the+cell-to-substrate+interface+during+locomotion+of+fibroblasts%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys.+J%22%5BJournal%5D)">Stresses at the cell-to-substrate interface during locomotion of fibroblasts.</a> Biophys. J. 76 (4), 2307-2316 (1999).</li>
<li>Lo, C. M., Wang, H. B., Dembo, M., Wang, Y. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+movement+is+guided+by+the+rigidity+of+the+substrate%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys.+J%22%5BJournal%5D)">Cell movement is guided by the rigidity of the substrate.</a> Biophys. J. 79 (1), 144-152 (2000).</li>
<li>Aratyn-Schaus, Y., Oakes, P. W., Stricker, J., Winter, S. P., Gardel, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preparation+of+Complaint+Matrices+for+Quantifying+Cellular+Contraction%5BTitle%5D)+AND+%22JoVE%22%5BJournal%5D)">Preparation of Complaint Matrices for Quantifying Cellular Contraction.</a> JoVE. , http://www.jove.com/index/Details.stp?ID=2173 (2010).</li>
<li>Kandow, C. E., Georges, P. C., Janmey, P. A., Beningo, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Polyacrylamide+Hydrogels+for+Cell+Mechanics%3A+Steps+Toward+Optimization+and+Alternative+Uses%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Polyacrylamide Hydrogels for Cell Mechanics: Steps Toward Optimization and Alternative Uses.</a> Methods in Cell Biol. 83, 29-46 (2007).</li>
<li>Marinkovic, A., Mih, J. D., Park, J. -A., Liu, F., Tschumperlin, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improved+throughput+traction+microscopy+reveals+pivotal+role+for+matrix+stiffness+in+fibroblast+contractility+and+TGF-%CE%B2+responsiveness%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Physiol.+Lung+Cell+Mol.+Physiol%22%5BJournal%5D)">Improved throughput traction microscopy reveals pivotal role for matrix stiffness in fibroblast contractility and TGF-β responsiveness.</a> Am. J. Physiol. Lung Cell Mol. Physiol. 303 (3), 169-180 (2012).</li>
<li>Buxboim, A., Rajagopal, K., Brown, A. E. X., Discher, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((How+deeply+cells+feel%3A+methods+for+thin+gels%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Phys.%3A+Condens.+Matter%22%5BJournal%5D)">How deeply cells feel: methods for thin gels.</a> J. Phys.: Condens. Matter. 22 (2010), 194116-194126 (2010).</li>
<li>Polio, S. R., Rothenberg, K. E., Stamenovic,, Smith, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+micropatterning+and+image+processing+approach+to+simplify+measurement+of+cellular+traction+forces%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Biomaterialia%22%5BJournal%5D)">A micropatterning and image processing approach to simplify measurement of cellular traction forces.</a> Acta Biomaterialia. 8, 82-88 (2012).</li>
<li>Wang, Y. L., Pelham, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preparation+of+a+flexible%2C+porous+polyacrylamide+substrate+for+mechanical+studies+of+cultured+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Enzymol%22%5BJournal%5D)">Preparation of a flexible, porous polyacrylamide substrate for mechanical studies of cultured cells.</a> Methods in Enzymol. 298, 489-496 (1998).</li>
<li>Tse, J. R., Engler, A. J. Preparation of Hydrogel Substrates with Tunable Mechanical Properties. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aTse%2C+JR+%22Current+Protocols+in+Cell+Biol%22">Current Protocols in Cell Biol</a>. , Chapter 10, Unit 1 16(2010).</li>
<li>Poellmann, M. J., Wagoner Johnson, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterizing+and+Patterning+Polyacrylamide+Substrates+Functionalized+with+N-Hydroxysuccinimide%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+and+Mol.+Bioengineering%22%5BJournal%5D)">Characterizing and Patterning Polyacrylamide Substrates Functionalized with N-Hydroxysuccinimide.</a> Cell and Mol. Bioengineering. 6 (3), 299-309 (2013).</li>
<li>Tseng, Q., Duchemin-Pelletier, E., Deshiere, A., Balland, M., Guillou, H., Filhol, O., Théry, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spatial+organization+of+the+extracellular+matrix+regulates+cell%E2%80%93cell+junction+positioning%5BTitle%5D)+AND+%22PNAS%22%5BJournal%5D)">Spatial organization of the extracellular matrix regulates cell–cell junction positioning.</a> PNAS. 109 (5), 1506-1511 (2012).</li>
<li>Trappmann, B., Gautrot, J. E., Connelly, J. T., Strange, D. G. T., Li, Y., Oyen, M. L., Cohen Stuart, M. A., Boehm, H., Li, B., Vogel, V., Spatz, J. P., Watt, F. M., Huck, W. T. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extracellular-matrix+tethering+regulates+stem-cell+fate%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Materials%22%5BJournal%5D)">Extracellular-matrix tethering regulates stem-cell fate.</a> Nature Materials. 11, 642-649 (2012).</li>
<li>Wong, J. Y., Leach, J. B., Brown, X. Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Balance+of+chemistry%2C+topography%2C+and+mechanics+at+the+cell-biomaterial+interface%3A+Issues+and+challenges+for+assessing+the+role+of+substrate+mechanics+on+cell+response%5BTitle%5D)+AND+%22Surface+Science%22%5BJournal%5D)">Balance of chemistry, topography, and mechanics at the cell-biomaterial interface: Issues and challenges for assessing the role of substrate mechanics on cell response.</a> Surface Science. 570 (1-2), 119-133 (2004).</li>
<li>Mih, J. D., Sharif, A. S., Marinković, A., Symer, M. M., Tschumperlin, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Multiwell+Platform+for+Studying+Stiffness-Dependent+Cell+Biology%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">A Multiwell Platform for Studying Stiffness-Dependent Cell Biology.</a> PLoS ONE. 6 (5), e19929(2011).</li>
<li>Butler, J. P., Tolić-Nørrelykke, I. M., Fabry, B., Fredberg, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Traction+fields%2C+moments%2C+and+strain+energy+that+cells+exert+on+their+surroundings%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Physiol+Cell+Physiol%22%5BJournal%5D)">Traction fields, moments, and strain energy that cells exert on their surroundings.</a> Am J Physiol Cell Physiol. 282, 595-605 (2001).</li>
<li>Tolić-Nørrelykke, I. M., Butler, J. P., Chen, J., Wang, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spatial+and+temporal+traction+response+in+human+airway+smooth+muscle+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Physiol+Cell+Physiol%22%5BJournal%5D)">Spatial and temporal traction response in human airway smooth muscle cells.</a> Am J Physiol Cell Physiol. 283, 1254-1266 (2002).</li>
<li>Atanackovic, T., Guran, A. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aAtanackovic%2C+T+%22Theory+of+Elasticity+for+Scientists+and+Engineers%22">Theory of Elasticity for Scientists and Engineers</a>. , Maple-Vail Book Manufacturing Group. York, PA. (2000).</li>
</ol>

החוקרים מצהירים כי אין להם אינטרסים כלכליים מתחרים.

בעת שימוש בטכניקה זו, הוא חיוני, כי פתרון חרוז מדולל כראוי והחרוזים נבחרים על בסיס קוטר רצוי, נוקשות הרשות הפלסטינית מצע ג'ל, והגודל בקנה המידה של התופעות שנחקרו בניסוי הרצוי. יש לנקוט זהירות בעת דילול פתרון חרוז לפני functionalizing תלושי כיסוי זכוכית עליון. המרווח בין חרוזים על פני השטח ג'ל ניתן לשנות על ידי שינוי הגורם לדילול של פתרון קולואיד. דילול הפתרון יותר מדי יפחית את מספר חרוזים שבני זוג להחליק את המכסה...

האינטראקציה המכנית של תא חי עם הסביבה המקומית שלה בדרך כלל נחקרה באמצעות ג&#39;לים הרשות הפלסטינית. מצעים אלה מסתמכים על פרוטוקול פשוט, מאופיין היטב שהוקם על ידי דמבו וואנג ב -1997 1. אחד היתרונות העיקריים של מצעים אלו הוא שהנוקשות שלהם עשויות להיות מכוונת על ידי שינוי הריכוזים של רכיבים ספציפיים של פתרון ג&#39;ל. זה מספק פלטפורמה רצויה ללמוד אינטראקציה של תאים עם סביבה של קשיחויות שונות. כאשר ג&#39;לי הרשות מצופה במטריצה ​​תאית חלבונים (ECM), תאים לדבוק, יצירת כוח. כתוצאה מכוח התא, ג&#39;ל מעווה כגוף אלסטי. עיוות זה תלויה בגודלו של הכח המופעל על ידי התאים ותכונות אלסטיות של ג&#39;ל. מחקרים שונים מועסקים ג&#39;לי הרשות הפלסטינית לחקור כוחות מתיחה סלולריים. בוריאציה אחת של ייצור ג&#39;ל הרשות הפלסטינית, microspheres ניאון (חרוזים) מוטבע throughout ג&#39;ל לכמת כוחות מתיחת תא על ג&#39;לים של קשיחויות שונות 2. במועד יישום כוח התא, חרוזים לעקור מהמיקום הראשוני שלהם בעקבות עיוות ג&#39;ל. שדה העיוות נמדד מהתקות חרוז בודדות. שדה עיוות זה מנוצל עם תיאורית הגמישות ותכונות האלסטיות של ג&#39;ל כדי לחשב את כוחות המתיחה. מדידות אלה מספקים תובנה לגבי הדרך בה התאים באופן מכאני לחוש וליצור אינטראקציה עם microenvironment המקומי שלהם 3. בפרוטוקולים של הרשות הפלסטינית בשימוש נרחב הרבה ייצור ג&#39;ל, חרוזים מתערבבים לאורך ג&#39;ל הרשות הפלסטינית במצב הנוזלי, unpolymerized. ג&#39;ל רשות polymerized מלא מכיל חרוזי ניאון לאורך כל הנפח שלה. בחישוב כוחות מתיחת תא, חרוזים ביותר בקרבת פני השטח ג&#39;ל (ממשק תא מצע) נמצאים תחת פיקוח. ההתקות של חרוזים אלה הניחו להתרחש על פני השטח תרבית תאים לפשטות בcalculatio הכוחn. המיקום בפועל של חרוזים בתוך העומק של ג&#39;ל התעלם. עם זאת, במדיום אלסטי (כגון ג&#39;ל הרשות הפלסטינית), חרוז קרוב יותר לנקודה של הפעלת כוח יהיה להעביר יותר מחרוז שהוא רחוק יותר מהנקודה. לפיכך, טיפול בתזוזה של נקודה (במיקום חרוז) דיסטלי מפני שטח שכבתוצאות המשטח בהערכה נמוכה מדי של tractions הסלולרי. מידת השגיאה תלויה במרחק של חרוז מהמשטח. השגיאה לא ניתנת לביצוע ללא הידיעה של המיקום של חרוז. הצורך בשיטה פשוטה להגביל את חרוזים מאוד קרובים לפני שטח תרבית תאים טופל על ידי כמה טכניקות. דרך אחת היא להגדיל את הצפיפות של חרוזים לאורך כל ג&#39;ל כזה שיש מספר מספיק של חרוזים במישור המוקד העליון למדוד תנועה מאוד קרוב לפני השטח. טכניקה נוספת כרוכה בבניית חדר הדמיה confocal הדמיה תא חי, כך שהאור מרק חרוזים במטוס העליון ביותר מוקדי נאספו 4. שיטה אחרת כרוכה כיסתה שכבה דקה מאוד של ג&#39;ל הרשות הפלסטינית המכיל חרוזים על גבי ג&#39;ל polymerized כבר בלי חרוזים 5. חסרון של כל אחד מטכניקות אלה הוא כי המיקום המדויק של חרוזים בתוך הג&#39;ל אינו ידוע. זה מציג שגיאה בחישוב של שדה התזוזה של חרוזים, ובכך החישוב של כוחות התא. טכניקה נוספת כרוכה נטיה של חרוזים למשטח העליון של ג&#39;ל הרשות הפלסטינית כבר polymerized באמצעות Sulfo-SANPAH 6. טכניקה זו מבטיחה את חרוזים הם אכן רק על החלק העליון של ג&#39;ל הרשות הפלסטינית, אך שבה הם משובצים בעומק של ג&#39;ל המידה אינה ידועה. זה עלול ליצור טופוגרפיה מקומית לתאים, אשר יכול לשנות את התנהגות תא, כמו עבודות קודמות הציעו כי תאים יכולים לחוש כמה מיקרונים כוח משם 7. לאחרונה, טכניקה עבור דפוסי ג&#39;לי הרשות הפלסטינית בקוטר 1 מיקרומטר fסמני נקודת פיברונקטין luorescent במערך מוסדר הוקם 8. במקרה זה, את העומק של סמני הניאון ידוע, והוא במהות אפס, כדפוס פיברונקטין מודפס בעקיפין על פני השטח ג&#39;ל. עם זאת, שיטה זו אינה מספקת סביבה מתמשכת שבו תאים יכולים לצרף, כחלבון ECM מוגבל ל1 מיקרומטר נקודות קוטר. שיטה לשילוב מלא של חרוזים גשש בתוך ג&#39;לי הרשות הפלסטינית ורתק אותם למיקום ידוע מאוד קרובים לפני השטח עדיין לא הוקמה. כאן, אנו מפתחים טכניקה להגבלה תת מיקרומטר לחרוזי ניאון קוטר מיקרומטר למישור מוקד מאוד קרוב לפני שטח תרבית תאים בתוך ג&#39;ל הרשות הפלסטינית. ג&#39;ל הוא נרפא בדרך כלל על ידי הרבדה פתרון ג&#39;ל הנוזלי unpolymerized בין שני לוחות זכוכית. אחד מהלוחות הוא פונקציונליות, כך שג&#39;ל חזק דבק בו. האחרים הוא unfunctionalized והוא הוסר לאחר ריפוי ג&#39;ל. אנו לשנות זכוכית נשלפת זה surface על ידי ציפויה בשכבה של חרוזים. על הרבדה ג&#39;ל הנוזלי בין פונקציונליות ומשטח זכוכית חרוז מצופה, העברת חרוזים לג&#39;ל בזמן שהוא הריפוי. זה מגביל את המרחק של האינטגרציה &quot;חרוזים לתוך הג&#39;ל בתוך 1.6 מיקרומטר של פני השטח. הזכוכית תחתון מנות פטרי משמשות כמשטח חסיד שבג&#39;ל הוא נרפא. כדי ליצור משטח ג&#39;ל עליון שטוח במהלך פילמור, להחליק את מכסה זכוכית עגולה משמש לכריך ג&#39;ל עם צלחת פטרי הזכוכית תחתונה. לפני ייצור ג&#39;ל, להחליק את מכסה זכוכית העליון מצופה בפולי-D-ליזין (PDL), מניב תשלום משטח חיובי. PDL הוא התפוצץ עם אוויר דחוס, ופתרון של חרוזים במים מופקד על המכסה מחליק. אנו מנצלים microbeads ניאון carboxylated, אשר נושא מטען שלילי, וליצור אינטראקציה עם משטח מטען החשמלי החיובי שנוצר על ידי טיפול עם PDL. לאחר פיצוץ פתרון חרוז את coverslip עם אוויר דחוס, שכבה יחידה שלחרוזים נשאר יחד אלקטרוסטטי ללהחליק את המכסה היבשה. ציפוי PDL אינו משפיע על הדביקות של הזכוכית על פני השטח ג&#39;ל, כמו שקופיות הזכוכית אינן פגומות והוסר מג&#39;ל הרשות הפלסטינית שלם באופן מלא. צלחות פטרי הזכוכית תחתונה עשויות חסיד על ידי טיפול עם 97% 3-aminopropyl-trimethoxysliane וglutaraldehyde 0.5%. ג&#39;לים של הרשות הפלסטינית קשיחויות הרצויות נוצרים על ידי ערבוב ריכוזים מתאימים של bisacrylamide וacrylamide באמצעות הליך סטנדרטי 9. טיפה של פתרון ג&#39;ל היא pipetted על צלחת פטרי הזכוכית תחתונה. להחליק את מכסה זכוכית המכילים חרוזים משמש לכריך ג&#39;ל עם צלחת פטרי. כאשר ג&#39;ל הוא נרפא, להחליק את המכסה העליון הוסר עוזב את חרוזים משובצים בג&#39;ל הרשות הפלסטינית בתוך 1.6 מיקרומטר מהמשטח.

<table><tbody><tr><td colspan="4"><חזק>ריאגנטים</חזקים></td></tr><tr><td>97% 3-אמינופרופיל-טרימתוקסיסליאן (APTES)</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>281778</td><td></td></tr><tr><td>70% גלוטראלדהיד</td><td>פוליסיינס, בע"מ.</td><td>111-30-8</td><td></td></tr><tr><td>1 M תמיסת חיץ HEPES</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>83264</td><td></td></tr><tr><td>40% אקרילאמיד</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>A4058</td><td></td></tr><tr><td>2% ביסקרילאמיד</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>M1533</td><td></td></tr><tr><td>0.1 ומיקרו; m מיקרוספירות פלואורסצנטיות (mCherry)</td> <td>Invitrogen</td><td>F8801</td><td></td></tr><tr><td>פיברונקטין, אנושי, 1 מ"ג</td><td>BD Biosciences</td><td>354008</td><td></td></tr><tr><td>אמוניום פרסולפט</td><td>Bio-RAD</td><td>161-0700</td><td></td></tr><tr><td>טטרמתילאתילנדיאמין (TEMED)</td> <td>Bio-RAD</td><td>161-0801</td><td></td></tr><tr><td>פולי-D-ליזין</td><td>Millipore</td><td>A-003-E</td><td></td></tr><tr><td>1-אתיל-3-[3-דימתיל-אמינופרופיל]קרבודימיד הידרוכלוריד (EDC)&nbsp;</td><td>Thermo Scientific</td><td>22980</td><td></td></tr><tr><td>N-hydroxysulfosuccinimide (NHS)</td><td>Thermo Scientific</td><td>24500</td><td></td></tr><tr><td>0.05% Trypsin-EDTA (1X)</td><td>Life Technologies</td><td>25300-054</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S9888</td><td></td></tr><tr><td>חומצה אקרילית&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>147230</td><td></td></tr><tr><td>גליצרול</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G7757</td><td></td></tr><tr><td>2-(N-morpholino)חומצה אתנסולפונית (MES)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M3671</td><td></td></tr><tr><td colspan="4" ><חזק>חומרים</חזק></td></tr><tr><td>35 מ"מ צלחת תחתית מזכוכית עם 14 מ"מ מיקרו-באר #1 כיסוי זכוכית</td><td>במבחנה</td><td>מדעית D35-14-1-N</td><td></td></tr><tr><td>כיסוי זכוכית, קוטר 12 מ"מ. </td><td>טד פלה, בע"מ</td><td>ברקוד 26023</td><td></td></tr></tbody></table>

שיטה חדשה ללוקליזציה חרוזי ניאון כתב סמוך לפני שטח תרבית תאים לגרירה מיקרוסקופית כוח

A Novel Method for Localizing Reporter Fluorescent Beads Near the Cell Culture Surface for Traction Force Microscopy

ג&#39;לי הרשות הפלסטינית כבר מזמן משמש כפלטפורמה ללימודי כוחות מתיחת תא בשל הקלות של זיוף ואת היכולת לכוון תכונות האלסטיות שלהם. כאשר המצע מצופה בחלבון מטריצת החוץ תאי, תאים לדבוק בג&#39;ל ולהחיל כוחות, גורמים לג&#39;ל כדי לעוות. העיוות תלויה במתיחת התא ותכונות אלסטיות של ג&#39;ל. אם שדה העיוות של פני השטח ידוע, מתיחת פני השטח יכולה להיות מחושבת באמצעות תיאורית הגמישות. עיוות ג&#39;ל נמדדה בדרך כלל על ידי הטבעת חרוזים סמן פלואורסצנטי אחיד לתוך הג&#39;ל. הבדיקות לעקור כג&#39;ל מעווה. הבדיקות סמוך לפני השטח של ג&#39;ל מתבצעות מעקב. ההתקות שדווחו על ידי בדיקות אלה נחשבות התקות משטח. מעמקיהם מפני השטח הם התעלמו. הנחה זו מציגה שגיאה בהערכות כוח המתיחה. למדידה מדויקת של כוחות התא, זה קריטי למיקומו של חרוזים להיות ידוע. פיתחנוטכניקה המשתמשת בכימיה פשוטה להגביל את חרוזים סמן פלואורסצנטי, 0.1 ו1 מיקרומטר בקוטר, בג&#39;לים הרשות הפלסטינית, תוך 1.6 מיקרומטר של פני השטח. אנו מעיל coverslip עם פולי-D-ליזין (PDL) וחרוזי ניאון. פתרון ג&#39;ל הרשות הפלסטינית הוא דחוק אז בין coverslip ומשטח חסיד. חרוזי הניאון להעביר לפתרון ג&#39;ל במהלך ריפוי. לאחר פילמור, ג&#39;ל הרשות הפלסטינית מכיל חרוזי ניאון בקרבת מטוס אל פני השטח ג&#39;ל.

ההדמיה confocal שימשה כדי לקבוע שהחרוזים אכן היו מתחת לפני שטח ג'ל ולכמת את מיקומם המדויק בתוך עומק ג'ל. חרוזי ניאון של אורך גל שונה מאלה שבתוך הג'ל הורשו להתיישב על פני השטח, ואת המרחק בין חלקיקי ניאון המשובצים ואלה על פני השטח היה מחושב באמצעות אלגוריתם זיהוי centroid. המיקום של חרוז על פני השטח ג'ל משמש כנקודת התייחסות למשטח העליון של תאים להפעיל כוח על דבקות אל פני השטח שבו ג'ל. סכמטי של שני התרחישים נחשבים (חרוזים ירוקים בג'ל עם חרוזים אדומים על פני השטח, ולהיפך) מוצג <strong...

טכניקות מסורתיות לבודת ג&#39;ל polyacrylamide (PA) המכיל בדיקות ניאון כרוכות הרבדה ג&#39;ל בין משטח חסיד ושקופיות זכוכית. כאן, אנו מראים כי ציפוי שקופית זו עם פולי-D-ליזין (PDL) ובדיקות ניאון מתאים את הבדיקות לבתוך 1.6 מיקרומטר ממשטח ג&#39;ל.

PA gels have long been used as a platform to study cell traction forces due to ease of fabrication and the ability to tune their elastic properties. When ...

המטרה הכוללת של הליך זה היא לייצר ג'ל פולי אקרילאמיד או PA לתרבית תאים עם מיקרוספירות פלואורסצנטיות המוטבעות קרוב מאוד למשטח הג'ל. זה מושג על ידי פונקציונליזציה ראשונה של החלקות כיסוי זכוכית עם פולי D ליזין. השלב השני הוא ציפוי החלקות כיסוי הזכוכית בתמיסה המכילה מיקרוספירות פלורסנט.ג'ל ה-PA הבא מנוסח על ידי ערבוב ריכוזים מתאימים של ביס, אקרילאמיד ואקרילאמיד, ודחוס בין משטח תחתון לצד הפונקציונלי של החלקות כיסוי הזכוכית. השלב האחרון הוא פונקציונליזציה של הג'ל עם חלבון מטריצה חוץ-תאי ותאי תרבית על פני הג'ל. בסופו של דבר, מיקרוסקופ כוח משיכה משמש למדידת כוחות מכניים המופעלים על ידי תאים כתוצאה מעיוות מצע המושרה על ידי תאים.היתרון העיקרי של טכניקה זו על פני שיטות קיימות, כגון ייצור PHL מסורתי, הוא שהיא ממקמת מיקרוספירות פלואורסצנטיות למיקום ידוע בעומק הג'ל, מה שמאפשר חישוב מדויק יותר של כוחות המתיחה התאית. הדגמה חזותית של שיטה זו היא קריטית שכן יש לנקוט בריפוי מרחבי בעת פונקציונליזציה של החלקות כיסוי הזכוכית על מנת להבטיח שסיביות הקרינה יעברו כראוי למקום הראשון של PHL. כיסוי זכוכית שניקה בעבר מחליק על משטח מגורד כך שהם לא נוגעים.כדי להקל על האינטראקציה עם החלקות הכיסוי, יש לצפות את כל שטח הכיסוי ב-0.1 מיליגרם למיליליטר פולי D ליזין למשך שעה. במהלך תקופה זו, בצע דילול של 1 עד 10,000 של תמיסת הקולואיד בקוטר 0.1 מיקרומטר. מיקרוספירות פלואורסצנטיות אדומות עם מים נטולי יונים להשגת צפיפות חלקיקים של כמיקרוספירה אחת לכל 20 מיקרון רבוע על פני הג'ל.מניחים את התמיסה המדוללת באמבט מים קולי למשך 30 דקות. לאחר שעה, השתמשו בפינצטה כדי להרים בזהירות כל החלקה של הכיסוי ולייבש באוויר. ואז החזירו את החלקות הכיסוי היבש למשטח המגורר.לאחר הסרת תמיסת הקולואיד המדוללת מהאמבט האולטראסוני, פיפטה 150 מיקרוליטר מהתמיסה על כל החלקת כיסוי. לאחר 10 דקות, השתמשו בפינצטה כדי להרים בזהירות כל החלקה על הכיסוי ולייבש באוויר. לאחר שהכיסוי היבש הוחזר למשטח המדורג, אחסן אותם בחושך עד שהם מוכנים לשימוש.לאחר מכן, הניחו את המספר הרצוי של כלי פטרי תחתית זכוכית על משטח ישר במכסה אדים כימי. מכסים את חלק הזכוכית של כל צלחת פטרי. באר מיקרו עם 97% משלושה אמינו פרופיל טרימתיל למשך שבע דקות להפעלה כימית.לאחר שבע דקות, מלאו את צלחת הפטרי במים נטולי יונים והשליכו את התמיסה למיכל פסולת. מכסים בזהירות את חלק הזכוכית של כל צלחת פטרי. ובכן עם תמיסת 0.5% גלוטרלדהיד שהוכנה בעבר למשך 30 דקות.לאחר 30 דקות, מלאו את צלחת הפטרי במים נטולי יונים והשליכו אותה למיכל פסולת כדי לשטוף ולהסיר את עור הגלוטרלדהיד. לפני ערבוב הרכיבים של תמיסת הג'ל פולי אקרילאמיד, העבר את מגלשות הזכוכית הפונקציונליות לתוך מכסה האדים הכימי כך שיהיו נגישים בקלות, מה שמאפשר סנדוויץ' מהיר של הג'ל עם כלי הפטרי התחתונים מזכוכית. לאחר ערבוב תמיסת הג'ל בצינור צנטריפוגה של 15 מיליליטר מערבבים 40% ביס אקרילאמיד, 2% אקרילאמיד וחומצה אקרילית ברצף מיידי.כדי להשיג את גמישות המטריצה הרצויה, הוסף 100 מילי-מולרי HEPs, 10% אמוניום לסולפט, וחבור בכמויות המתאימות לגמישות המטריצה הרצויה. להשלמת תמיסת הג'ל, פיפטה מיד 15 מיקרוליטר של תמיסת ג'ל על מרכז חלק הזכוכית של כלי הפטרי. לאחר הרמת פתק כיסוי זכוכית פונקציונלי עם פינצטה, הפוך אותו כך שחרוזי הפלואורסצנט יהיו בצד ויוצרים מגע עם תמיסת הג'ל.לאחר מכן הנח את החלקת הכיסוי בעדינות על גבי ג'ל הפולי אקרילאמיד הנוזלי כעת כך שהצד הפונקציונלי נמצא במגע עם הג'ל. לאחר מכן, הפוך את כל צלחות הפטרי כדי לסייע בהימנעות מהשפעות הכבידה על ננו-חלקיקים פלואורסצנטיים. פילמור לרמות נמוכות יותר של ג'ל הפולי אקרילאמיד.לאחר פילמור, הופכים את צלחות הפטרי בחזרה וממלאים אותן ב-BS. צור בזהירות מגע עם חלק הזכוכית של צלחת הפטרי וקווי המתאר של החלקת הכיסוי באמצעות פינצטה כדי לגרד את היקף החלקת הכיסוי. לאחר מספר מחזורי גירוד. הסר את פתק הכיסוי והשליך אותו למיכל פסולת חד מתאים.לאחר הסרת כל החלקות הכיסוי, הניחו את מכסה צלחת הפטרי על כל צלחת ואחסנו בארבע מעלות צלזיוס. לאחר שג'לי הפולי אקרילאמיד חמים לטמפרטורת החדר, השתמש במשאבת ואקום במכסה המנוע הביולוגי כדי להסיר את כל ה-PBS מכלי הזכוכית התחתונים המכילים את הג'ל פיפטה שהוכנה בעבר על כל ג'ל כך שהג'ל שקוע לחלוטין. לאחר הדגירה בטמפרטורת החדר למשך שעה לפחות, הוסיפו 150 עד 250 מיקרוליטר של תמיסת H-S-E-D-C שהוכנה בעבר כדי לכסות את משטח הג'ל ולמלא היטב את תחתית הזכוכית של צלחת הפטרי.לאחר מכן דגרו את הג'לים בטמפרטורת החדר למשך 30 דקות בחושך. לאחר הסרת תמיסת N-H-S-E-D-C בוואקום, הוסף 150 מיקרוליטר של תמיסת פיברונקטין שהוכנה בעבר לכל ג'ל. שוב, דגרו בטמפרטורת החדר למשך 35 דקות כדי לאפשר הצמדה של פיברונקטין.בשלב זה, יש לחמם את המדיה הסלולרית PBS וטריפסין ל-37 מעלות צלזיוס באמבט מים. שוטפים את הג'לים חמש פעמים במים סטריליים נטולי יונים. שואבים את המים בין השטיפות, מכסים את הג'לים ומשאירים אותם במכסה המנוע.הוסף מיליליטר אחד של טריפסין לכל 25 סנטימטרים רבועים לבקבוק המכיל את התאים. לאחר הרמת התאים מהבקבוק, יש לדלל את הטריפסין במדיה סלולרית. לאחר מכן ספרו את התאים באמצעות ציטומטר המו המבוסס על שטח הפנים של הג'ל.קבע את מספר התאים הנדרש לכל ג'ל עבור צפיפות ישיבה סופית של תא של 3000 תאים לסנטימטר רבוע לדלל או לרכז את התרחיף כך ש-150 מיקרוליטר מתערובת המדיה התאית יכילו מספר תאים זה. לאחר מכן Eloqua אחד של 50 מיקרוליטר מתרחיף התא על כל ג'ל. לאחר המקום הזה, צלחות הפטרי המכילות תאים באינקובטור למשך 30 דקות.לאחר הוצאת כלי הפטרי בזהירות מהחממה, מלאו את שארית צלחת הפטרי בכשני מיליליטר מדיה כך שפני המנה שקועים לחלוטין. החזירו את צלחות הפטרי לחממה עד לרכישת התמונה. כאשר מכינים להדמיה, הניחו את אחת מצלחות הפטרי בעדינות על במת המיקרוסקופ.לאחר הסרת מכסה צלחת הפטרי להדמיית DIC, אתר תא בודד וצלם תמונת סטילס אחת של התא ב-DIC מבלי להזיז את שלב המיקרוסקופ. העבר את מצב ההדמיה לפלואורסצנטיות. התמקדו במיקרוספירות הפלואורסצנטיות והקליטו תמונה של המיקרוספרות.הסר בזהירות את המדיה הסלולרית מצלחת הפטרי עם הפיפטה והוסף 0.05% טריפסין EDTA. התמקדו בתמונת ה-DIC כדי להראות את הג'ל שממנו התא התנתק כעת. לאחר מכן דמו את המיקרוספירות מתחת לתא לאחר שהתאים התנתקו.נעשה שימוש בהדמיה קונפוקלית כדי לקבוע שהחרוזים נמצאים מתחת למשטח הג'ל וכדי לכמת את מיקומם המדויק, חרוזים פלואורסצנטיים בגודל ואורך גל שונים מאלה שבתוך הג'ל הורשו להתיישב על פני השטח. מיקום החרוזים המיושבים משמש כהתייחסות למשטח העליון של הג'ל שבו התאים מפעילים כוח על ההדבקה. לאחר הדמיה קונפוקלית, חושב המרחק בין הננו-חלקיקים הפלואורסצנטיים המוטבעים לאלה שעל פני השטח.מרחק זה קבע את העומק המדויק של החרוזים בתוך הג'ל. מוצג כאן ההתפלגות המרחבית של החרוזים והנוף המוקרן על מישור ה-IZ. הסולם מספק את עומק כל החרוזים ממשטח הג'ל.העומק הממוצע של חרוזים של 0.1 מיקרון הוא 619 ננומטר, 467 ננומטר, 278 ננומטר עבור ג'לים פולי אקרילאמיד של קשיחות, 10 ו-40 קילופסקל בהתאמה. העומקים המקבילים לחרוזים בקוטר מיקרון אחד הם מינוס 20 ננומטר בג'לים של 40 קילופסקל, 12 ננומטר בג'לים של 10 ג'לים ו-1,255 ננומטר בג'לים של קילופסקל אחד. עומק החרוזים המפוזרים בג'ל נמדד והושווה לעומקים.באמצעות הטכניקה שהוצגה. שונות פיזור החרוזים בעומק ג'ל פולי אקרילאמיד בשיטות ייצור מסורתיות מוצגת כאן. שדה התזוזה של תא פיברובלסטים ושכבת חרוזים פלואורסצנטיים מתאימה מוצגים כאן.חרוזים ליד פריפריה של התמונה נראים מעט לא ממוקדים, וזה אפקט אופטי בשל מטרת הטבילה במים. עם הוספת טריפסין, התא משתחרר מפני השטח וכתוצאה מכך משטח הג'ל המעוות של פולי אקרילאמיד חוזר למצבו המקורי. לאחר השליטה, ניתן לבצע טכניקת ייצור ופונקציונליזציה של PHL תוך שש שעות אם היא מבוצעת כראוי.לאחר צפייה בסרטון זה, אתה אמור להבין היטב כיצד לייצר ג'לים פולי אקרילאמיד עם מיקרוספירות פלואורסצנטיות, הממוקמות במיקום ידוע בעומק הג'ל ליד פני השטח של תרבית התאים. לחישוב מדויק יותר של כוחות המתיחה של התאים.

a-novel-method-for-localizing-reporter-fluorescent-beads-near-cell

Research

JoVE Journal

Bioengineering

הנדסה ביולוגית

סרטון זה מתאר את בדיקת מיקרוסקופ כוח המתיחה. הבדיקה קובעת את המתיחה התאית של תאי סרטן המעי הגס האנושי על המטריצה החוץ תאית הקיימת על הידרוג'ל אלסטי רך בעל חרוזים פלואורסצנטיים משובצים. התזוזה המתקבלת של חרוזים פלואורסצנטיים נמדדת באמצעות תוכנה מתאימה.

בדיקת ציטומטריית מתיחה: שיטה לכימות כוח המתיחה המופעל על ידי תאים סרטניים ב- ECM

סרטון זה מדגים את השימוש בספקטרוסקופיית תנודות פלואורסצנטיות כדי לזהות את האינטראקציה בין חלבוני פני התא במגעים בין תאי התא. על ידי ביטוי קולטן ההידבקות הטרנסממברנה של עניין המסומן בחלבון פלואורסצנטי וערבוב שתי אוכלוסיות תאים שונות המכילות שתי תוויות פלואורסצנטיות מופרדות ספקטרלית, האינטראקציה הטרנסית בין קולטנים של שני תאים שכנים בעלי פלואורסצנטיות בצבעים שונים מוערכת באמצעות מתאם צולב בתנודות של עוצמת הפלואורסצנטיות.

ספקטרוסקופיית תנודות פלואורסצנטיות לחקר אינטראקציה של חלבונים במגעים עם תאים

אנו מתארים טכניקה למדידה בו-זמנית של קינטיקה של קשירת קולטן-ליגנד יחיד מווסתת כוח והדמיה בזמן אמת של איתות סידן בלימפוציט T יחיד.

הקרינה Biomembrane חיל Probe: Quantitation במקביל של קינטיקס קולטן ליגנד ומושרה כריכת איתות תאיים בתא בודד

הידבקויות פני התא הם מרכזי mechanotransduction, כפי שהם לשדר מתח מכני ליזום את מסלולי איתות מעורבים הומאוסטזיס ופיתוח רקמות. כאן, אנו מציגים פרוטוקול לנתח את התהליכים הביוכימיים אשר מופעלים בתגובה מתח, באמצעות microbeads מגנטי מצופה ליגנד ויישום כוח לקולטנים הידבקות.

ניתוח Cell Surface שיפוץ הדבקה בתגובה מתח מכני באמצעות חרוזים מגנטיים

כאן, אנו מציגים פרוטוקול לשימוש בו זמנית של פורסטר תהודה אנרגיה מבוססת על העברת מתח חיישנים שימדדו עומס חלבון ושחזור פלורסצנטיות לאחר photobleaching למדוד דינמיקה חלבון המאפשר מדידת כוח רגיש דינמיקה חלבונים בתאים חיים.

מדידה של דינמיקה רגישים ל"כוח הפזורים חלבונים בתאים חיים באמצעות שילוב של טכניקות פלורסנט

פרוטוקול זה מספק הוראות להטמעת ליתופי מולטיפוטון כדי להמציא מערכים תלת-ממדיים של סמנים fiducial פלורסנט מוטבע פולי (אתילן גליקול) מבוססי הידרוג לשימוש כמו ללא התייחסות, כוח המתיחה מיקרוסקופ פלטפורמות. באמצעות הוראות אלה, מדידה של זן חומר תלת-ממד וחישוב של תיחות הסלולר הוא פשוט כדי לקדם תפוקה גבוהה כוח המתיחה מדידות.

ייצור ויישום של פלטפורמת מיקרוסקופית כוח המתיחה ללא התייחסות

הגירה תא קולקטיבי בפיתוח, ריפוי הפצע, וגרורות סרטן מונחה לעתים קרובות על ידי מעברי הצבע של גורמי גדילה או מולקולות איתות. המתואר כאן היא מערכת ניסיונית המשלבת מיקרוסקופ המתיחה עם מערכת microflu, והפגנה של איך לכמת את המכניקה של הגירה קולקטיבית תחת הדרגתי הביוכימי.

מיקרוסקופ גרירה משולב עם מיקרופלואידיקה עבור הגירה קולקטיבית כימוטקטיק

כאן אנו מציגים פרוטוקול המשמש לביצוע ניסויי מיקרוסקופ כוח גרירה על תאי B. אנו מתארים את הכנת ג'לים פוליקרילאמיד רכים ואת הפונקציונליזציה שלהם, כמו גם רכישת נתונים במיקרוסקופ וסיכום של ניתוח נתונים.

מיקרוסקופ כוח מתיחה ללמוד B לימפוציטים הפעלת

פרוטוקול זה מציג את ההליכים הניסיוניים לביצוע טביעת הרגל של הידבקות כדי לדמיין את אירועי ההדבקה במהלך הידבקות מהירה של תאים.

הדמיה הידבקות מולקולרית בתא מתגלגל על ידי הידבקות טביעת רגל אסאי

מיקרוסקופיה של ליטוגרפיה וכוח המתיחה של כמעט UV משולבות כדי למדוד כוחות תאיים על הידרוג'לים מיקרו-מרופדים. שחרור ממוקד המושרה באור של תאים בודדים מאפשר מספר גבוה של מדידות באותה דגימה.

שליטה בהידבקות תאים באמצעות טכניקות דפוס הידרוג'ל ליישומים במיקרוסקופיה של כוח המתיחה

כדי להתקדם, קונוסים צמיחה חייבים להפעיל כוחות משיכה נגד הסביבה החיצונית. דור כוחות המתיחה תלוי בדינמיקת אקטין ובצימוד מצמד. המחקר הנוכחי מתאר שיטות לניתוח דינמיקת אקטין, צימוד מצמד וכוחות משיכה להתקדמות חרוט הצמיחה.

ניתוחים של אקטין דינמיקה, מצמד צימוד וכוח המתיחה לקידום קונוס צמיחה

למד שיטה חדשה ללוקליזציה של חרוזי ניאון בג'ל פוליאקרילאמיד לקרבת פני השטח. השיטה משפרת מדידות מיקרוסקופיית כוח גרירה בתרביות תאים.

שיטה חדשה ללוקליזציה חרוזי ניאון כתב סמוך לפני שטח תרבית תאים לגרירה מיקרוסקופית כוח

גלה סרטונים נוספים