Name: באמצעות assay הכיסוי למדוד את הייצור בקטריאלי ורגישות לדלקת הריאות Bacteriocins איכותי (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-09-30T15:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 5 s
Description: למדו לבצע assay כיסוי אופטימלי לחקר פעילות בקטריוצינים ב-Streptococcus pneumoniae. השיטה מאפשרת אפיון מהיר של פעילות אנטימיקרוביאלית, חסינות וזיהוי פפטידי קוורום סנסינג במחקר מיקרוביולוגי.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

עבודה זו נתמכה על ידי פרס המחקר של אליזבת א. קנדי.

.1 הכנת הזנים מפיק <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Streak זן דלקת ריאות להיבדק לייצור bacteriocin על 5% צלחת אגר סויה tryptic דם כבשים ממניות מקפיא -80 מעלות צלזיוס. הערה: השימוש בצלחות דם לצמיחה ראשונית של הזן להיבדק לעיכוב מגדיל מאוד את שחזור של assay. בנוסף, זנים שאינן דלקת ריאות אחרות המייצרים bacteriocins ניתן להשתמש למרות שתנאי גידול, ייתכן שיצטרכו להיות שונה לאורגניזם ספציפי. יש לנו להשתמש mitis Streptococcus וקטיס Lactococcus בassay הכיסוי בהצלחה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה את הצלחת למשך הלילה (O / N) על 37 מעלות צלזיוס עם 5% CO 2. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר הדגירה של זן המפיק, להכין הצלחת אגר סויה tryptic (TSA) על ידי pipetting 3,000 4,000 יחידות של קטלאז על צלחות המכילות 25 מ&quot;ל של TSA ולהפיץ את פתרון קטלאז באמצעות חרוזים זכוכית סטרילית. בואו יבש הצלחת במשך כ10 דקות תחתארון בטיחות ביולוגי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאסוף כמות נראית לעין של חיידקים על קצה פיפטה. לדקור את קצה פיפטה לתוך צלחת TSA המיובש. הערה: יותר מ מתח מפיק אחד יכולה להיות נדקרת לתוך צלחת TSA יחידה. חשוב חלל את הדקירות, כך שהילות וכתוצאה מכך אינן חופפות. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> במידת האפשר, כולל ידוע bacteriocin מפיק כביקורת חיובית ולהתאמץ כדי לשמש בשכבה כביקורת שלילית. הערה: בקרות חיוביות ושליליות הן כבר פורסמו בעבר, והם זמינים לפי בקשה 10. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה צלחת TSA מכיל דקירות מרובות על 37 מעלות צלזיוס עם 5% CO 2 למשך 6 שעות. </li></ol> 2 מניות גליצרול ביצוע של הזנים הכיסוי <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן מניות גליצרול (תרבויות גדלו שלב אמצע מעריכי ואז מאוחסנות ב-80 מעלות צלזיוס לאחר התוספת של גליצרול) לפני היום של assay הכיסוי. לחסן 5-10 מושבות של str דלקת הריאותעין להיבדק לרגישות או הפרשת פרומון במדיום טוד יואיט עם שמרי 0.5% תמצית (THY). הערה: בנייה של כתבים מושרה BlpC כבר תוארה בעבר 2 וזנים זמינים לפי בקשה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה 5-10 מושבות בצינורות זכוכית עם 5 מ&quot;ל של THY עם מכסים סגורים היטב באמבט מים 37 מעלות צלזיוס בלי לרעוד. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה תרבויות על 37 מעלות צלזיוס עד שהם מגיעים OD 620 של 0.3-0.5. הערה: זה ייקח כ 4-5 שעות בהתאם לזן המשמש. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעדינות להפוך את הצינור כמה פעמים לפני מדידת OD. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אם הניסוי לא ניתן לבצע באותו היום או הזן ישמש פעמים רבות בעתיד, להפוך את מניות גליצרול ולחדש את הניסוי במועד מאוחר יותר. עבור מניות גליצרול, להוסיף גליצרול לתרבויות לריכוז סופי של 20%. תרבויות Aliquot לתוך צינורות 1.5 מ&quot;ל microcentrifuge ולאחסן ב -80 מעלות צלזיוס. הערה: דוגמאות יכולות להיות שלהנמצאת בבמשך חודשים ב-80 מעלות צלזיוס. אם לא עושה מניות גליצרול, להשתמש דגימות ישירות לassay כיסוי. </li></ol> 3 הכיסוי Assay <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> רק לפני כיסוי יישום, לערבב את מרכיבי הכיסוי. בצינור חרוטי 15 מ&quot;ל, להוסיף 5 מ&quot;ל שלך, 3,000-4,000 U של קטלאז, ו200 μl של תרבות מרק מתח כיסוי שגם גדלה באותו יום או מניית גליצרול של התרבות שהיה מופשר בטמפרטורת חדר. אם אתם משתמשים בזן הכתב, להוסיף 50 μl של X-gal (40 מ&quot;ג / מ&quot;ל) לתערובת הכיסוי. השתמש בצינור חרוטי אחד לכל צלחת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאזן תערובת כיסוי בטמפרטורת חדר לפני תוספת של TSA המותך. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את צלחת TSA עם מתח נדקר מחממה. ממסים TSA המוצק במיקרוגל ולשמור על 55 ° C אמבט מים עד מוכן לשימוש. הוסף 3 מ&quot;ל של TSA המותך עם אגר 1.5% מקורר 55 ° C כדי כיסוי תערובת. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מכין את תערובת הכיסוי מייד לפני pipetting, התערובת תתחיל לחזק מאודבמהירות. הערה: אם השכבה מתחילה לבסס לפני הציפוי, התוצאות תהיה uninterpretable. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מערבבים את תערובת הכיסוי על ידי pipetting מעלה ומטה מספר פעמים עם 5 מ&quot;ל pipet נזהר שלא להכניס בועות לתוך התערובת. לאט לאט פיפטה תערובת כיסוי ישירות על צלחת TSA נדקרה. שמור את הצלחת על המעבדתיים למאפשרות אגר להקשיח כמה דקות. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אל תסובב את הצלחת כדי לפזר את תערובת הכיסוי, זה ימשוך צמיחה מהתרבות נדקרה לכיסוי. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בזהירות להניח צלחת TSA עם כיסוי ל37 חממת ° C המכילה 5% CO 2 O / N (כ 16-18 לשעה). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שים לב ללוחות לאחר צמיחת הלילה. הצלחות צריכה להראות אטום מצמיחה של זן הכיסוי למעט באזורים שבם איתות עיכוב או פרומון התרחשה. אלה יופיעו כאזורי או ברורים או כחולים סביב המתח נדקר, בהתאמה. שים לב: למרות measurements של הקוטר של קרחת יער כחול או יכול להיות שנקבע להערכה כמותית, הבדלים בקוטר יכולים גם משתנים בהתאם לכמות חיידקים שנדקרה לתוך הצלחת. Assay הכיסוי הוא assay איכותי, כל הערכה כמותית יש לפרש בזהירות. כל סליקה גלויה בהשוואה לביקורת השלילית נחשבת כפעילות. </li></ol>

<ol><li>Dawid, S., Roche, A. M., Weiser, J. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+blp+bacteriocins+of+Streptococcus+pneumoniae+mediate+intraspecies+competition+both+in+vitro+and+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Infect+Immun%22%5BJournal%5D)">The blp bacteriocins of Streptococcus pneumoniae mediate intraspecies competition both in vitro and in vivo.</a> Infect Immun. 75 (1), 443-451 (2007).</li>
<li>Sawa, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+characterization+of+enterocin+W%2C+a+novel+two-peptide+lantibiotic+produced+by+Enterococcus+faecalis+NKR-4-1%5BTitle%5D)+AND+%22Appl+Environ+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Isolation and characterization of enterocin W, a novel two-peptide lantibiotic produced by Enterococcus faecalis NKR-4-1.</a> Appl Environ Microbiol. 78 (3), 900-903 (2012).</li>
<li>Kochan, T. J., Dawid, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+HtrA+protease+of+Streptococcus+pneumoniae+controls+density-dependent+stimulation+of+the+bacteriocin+blp+locus+via+disruption+of+pheromone+secretion%5BTitle%5D)+AND+%22J+Bacteriol%22%5BJournal%5D)">The HtrA protease of Streptococcus pneumoniae controls density-dependent stimulation of the bacteriocin blp locus via disruption of pheromone secretion.</a> J Bacteriol. 195 (7), 1561-1572 (2013).</li>
<li>Lux, T., Nuhn, M., Hakenbeck, R., Reichmann, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diversity+of+bacteriocins+and+activity+spectrum+in+Streptococcus+pneumoniae%5BTitle%5D)+AND+%22J+Bacteriol%22%5BJournal%5D)">Diversity of bacteriocins and activity spectrum in Streptococcus pneumoniae.</a> J Bacteriol. 189 (21), 7741-7751 (2007).</li>
<li>Reichmann, P., Hakenbeck, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Allelic+variation+in+a+peptide-inducible+two-component+system+of+Streptococcus+pneumoniae%5BTitle%5D)+AND+%22FEMS+Microbiol+Lett%22%5BJournal%5D)">Allelic variation in a peptide-inducible two-component system of Streptococcus pneumoniae.</a> FEMS Microbiol Lett. 190 (2), 231-236 (2000).</li>
<li>Saizieu, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microarray-based+identification+of+a+novel+Streptococcus+pneumoniae+regulon+controlled+by+an+autoinduced+peptide%5BTitle%5D)+AND+%22J+Bacteriol%22%5BJournal%5D)">Microarray-based identification of a novel Streptococcus pneumoniae regulon controlled by an autoinduced peptide.</a> J Bacteriol. 182 (17), 4696-4703 (2000).</li>
<li>Barbour, A., Philip, K., Muniandy, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enhanced+production%2C+purification%2C+characterization+and+mechanism+of+action+of+salivaricin+9+lantibiotic+produced+by+Streptococcus+salivarius+NU10%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Enhanced production, purification, characterization and mechanism of action of salivaricin 9 lantibiotic produced by Streptococcus salivarius NU10.</a> PLoS One. 8 (10), 77751(2013).</li>
<li>Wladyka, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation%2C+biochemical+characterization%2C+and+cloning+of+a+bacteriocin+from+the+poultry-associated+Staphylococcus+aureus+strain+CH-91%5BTitle%5D)+AND+%22Appl+Microbiol+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Isolation, biochemical characterization, and cloning of a bacteriocin from the poultry-associated Staphylococcus aureus strain CH-91.</a> Appl Microbiol Biotechnol. 97 (16), 7229-7239 (2013).</li>
<li>Shea, E. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bactofencin+a%2C+a+new+type+of+cationic+bacteriocin+with+unusual+immunity%5BTitle%5D)+AND+%22%22%5BJournal%5D)">Bactofencin a, a new type of cationic bacteriocin with unusual immunity.</a> 4 (6), 00498-00413 (2013).</li>
<li>Son, M. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Conserved+mutations+in+the+pneumococcal+bacteriocin+transporter+gene%2C+blpA%2C+result+in+a+complex+population+consisting+of+producers+and+cheaters%5BTitle%5D)+AND+%22MBio%22%5BJournal%5D)">Conserved mutations in the pneumococcal bacteriocin transporter gene, blpA, result in a complex population consisting of producers and cheaters.</a> MBio. 2 (5), (2011).</li>
<li>Kochan, T. J., Dawid, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+HtrA+protease+of+Streptococcus+pneumoniae+controls+density-dependent+stimulation+of+the+bacteriocin+blp+locus+via+disruption+of+pheromone+secretion%5BTitle%5D)+AND+%22J+Bacteriol%22%5BJournal%5D)">The HtrA protease of Streptococcus pneumoniae controls density-dependent stimulation of the bacteriocin blp locus via disruption of pheromone secretion.</a> J Bacteriol. 195, 1561-1572 (2013).</li>
<li>Widdick, D. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cloning+and+engineering+of+the+cinnamycin+biosynthetic+gene+cluster+from+Streptomyces+cinnamoneus+cinnamoneus+DSM+40005%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Cloning and engineering of the cinnamycin biosynthetic gene cluster from Streptomyces cinnamoneus cinnamoneus DSM 40005.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 100 (7), 4316-4321 (2003).</li>
<li>Begley, M., Cotter, P. D., Hill, C., Ross, R. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+a+novel+two-peptide+lantibiotic%2C+lichenicidin%2C+following+rational+genome+mining+for+LanM+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Appl+Environ+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Identification of a novel two-peptide lantibiotic, lichenicidin, following rational genome mining for LanM proteins.</a> Appl Environ Microbiol. 75 (17), 5451-5460 (2009).</li>
</ol>

למחברים אין מה לחשוף.

assay הכיסוי זוהי דרך מהירה כדי לקבוע את הטווח של פעילות עבור יצרני bacteriocin ולהפגין אינטראקציות תחרותיות שעלולות להתרחש בין זני דלקת ריאות. Assay הכיסוי יכול להיות מותאם לשימוש עבור הקרנת זנים מרובים לייצור bacteriocin על צלחת אחת. יש לנו הוקרנו בהצלחה אוספי מתח גדולים עם assay זה על ידי שימוש במשכפל 48 פינים לחסן צלחות SBA ממחצית מצלחת 96 היטב. לאחר דגירה הלילה, צמיחה מועברת לצלחת TSA באמצעות המשכפל ופירסינג המשטח אגר של הצלחת עם הסיכות של המשכפל. <p class="jove_content" ...

Streptococcus pneumoniae, קולוניאלי משותפת של קהילת polymicrobial של לוע האף, הוא מסוגל להתחרות עם pneumococci אחר ומינים קרובים באמצעות הייצור של פפטידים מיקרוביאלית מיוצרים bacterially (bacteriocins). כל זן דלקת ריאות באופן מלא רצף שנבחן עד היום מכיל גרסה של מוקד acteriocin- ב אייק l eptide עמ &#39;, BLP. ייצור Bacteriocin ידי pneumococcus הודגם להיות חשוב בתוצאות הן במבחנה בתחרות vivo 1-4. דינמיקה תחרותית מושפעת מהביטוי של bacteriocins המגוון יחד עם חלבוני חסינותו מקור בתגובה לפרומון פפטיד ספציפי. אינדוקציה של מוקד BLP נשלטת על ידי מערכת חישת מניין שבו פרומון פפטיד, BlpC, נקשר לקינאז החיישן, BlpH, ויוזם מפל איתות וכתוצאה מכךשעתוק של 5,6 מוקד BLP. ישנם ארבע וריאציות allelic של BlpC שכל נקשרים לBlpH המקור שלה 6. לתא כדי לשרוד את ההשפעות של bacteriocin משלו, הגנים המקודדים את חלבוני חסינותו מקור מתועתקים באותו אופרון ככל אחד מהגנים bacteriocin. הרג מתרחש אם זן מתחרה הוא לא מסוגל upregulate מוקד BLP בתגובה לפרומון אקסוגניים או, אם הזן חסר את גן החסינות הספציפי הנדרש להגנה. המורכב טרנספורטר, BlpAB נדרש להפרשה והעיבוד של פרומון פפטיד ופפטידים bacteriocin 2,4. לאחרונה, הוכח שחלק משמעותי מזני דלקת ריאות הם &quot;רמאים&quot;, כלומר יש להם מוטציה שמורה בגן blpA אשר הופך אותם מסוגל להפריש פרומונים וbacteriocins 1,2. זנים אלה מסוגלים להגיב לBlpC אקסוגניים 2 מופרש על ידי צהלהזנים משעממים המאפשרים הייצור של חלבוני חסינות. אמנם, הכנות גולמי של bacteriocins מsupernatants ניתן להכין מזני מפיק באמצעות צעדי שיטות ביוכימיות להשגת טוהר, גישה זו אינה שימושית לסינון אוסף גדולה של בידודים ואם רמת ביטוי bacteriocin היא נמוכה בתרבויות מרק גדל 2,7- 9. Assay הכיסוי משמש כדרך מהירה כדי לחקור את הדינמיקה התחרותית בין זנים שעלולים להתקיים במבחנה. לשם כך, מתח דלקת ריאות הוא על צלחת אגר ואפשרו לגדול כדי להשיג ריכוזי חיידקים מקומיים מספיקים לאינדוקציה של מוקד BLP-מחוסן מראש. זן שני הוא מחוסן אז לפתרון אגר רך מותך אשר לאחר מכן מיושם על זן מחוסן מראש לבדיקת רגישות. כדי להעריך את הפעילות של מוקד BLP (עצמאית של פעילות מעכבת), יכולים להיות מעולף זנים בסדרה של הרי זני כתב BlpC שתוארו קודם לכן. זנים אלו נבנו כדי להכיל אחד משלושה אללים blpH שונים שמגיבים לשלושה פרומונים BlpC הנפוצים ביותר מופרשים על ידי pneumococci. יש לי זני כתב גן lacZ משולב שנמצא תחת השליטה של אמרגן תלוי BlpH ולבצע מחיקה בגן blpC המונע גירוי עצמי 10,11.

<table><tbody><tr><td>אגר סויה טריפטיקז עם 5% דם כבשים</td><td>פישר</td><td>B21261X</td><td>לגידול מתרביות מקפיא</td></tr><tr><td>קטלאז</td><td>סיגמא</td><td>C100-500 מ"ג</td><td>4,741 יחידות לצלחת</td></tr><tr><td>מרק טוד יואיט + תמצית שמרים (THY)</td> <td>פישר</td><td>DF0492-17-6&nbsp;</td><td>30 גרם THB, 5 גרם תמצית שמרים, 1 ליטר ddH2O אוטוקלאב</td></tr><tr><td>מרק סויה טריפטיקז + צלחות אגר (TSA)</td><td>פישר</td><td>B11768&nbsp;</td><td>30 גרם TS, 15 גרם אגר, 1 ליטר ddH2O אוטוקלאב</td></tr><tr><td>5-bromo-4-chloro-3-indolyl &beta;-D-galactopyranoside (X-gal)</td><td>Sigma</td><td>B4252-50MG</td><td>מתמוסס בצלחות פטרי דימתילפורממיד</td></tr><tr><td>ספקטרופומטר</td><td></td><td></td> פישר FB0875712 <td>מודד את ה-OD620 של תרביות</td></tr><tr><td></td><td></td><td></td> 37 &deg;<td></td></tr><tr><td> אמבט</td><td></td><td></td><td></td>מים C</tr><tr><td>37 מעלות; אינקובטור C עם צינור</td> חרוטי 5% CO2 <td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>15 מ"ל</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

באמצעות assay הכיסוי למדוד את הייצור בקטריאלי ורגישות לדלקת הריאות bacteriocins איכותי

Using the Overlay Assay to Qualitatively Measure Bacterial Production of and Sensitivity to Pneumococcal Bacteriocins

Streptococcus pneumoniae מתיישב בקהילה הפולימיקרוביאלית המגוונת ביותר של הלוע האף, שם עליו להתחרות באורגניזמים תושבים. הראינו שפפטידים אנטי-מיקרוביאליים (בקטריוצינים המיוצרים על ידי חיידקים) מכתיבים את התוצאה של האינטראקציות התחרותיות האלה. כל זני הפנאומוקוק ברצף מלא מכילים לוקוס bacteriocin-l ike peptide (blp). לוקוס ה-blp מקודד למגוון של בקטריוצינים מגוונים ולכל הרכיבים השמורים ביותר הדרושים לוויסות שלהם, עיבודם והפרשתם. מגוון הבקטריוצינים המצויים באזור חסינות הבקטריוצין (BIR) של הלוקוס הוא תורם עיקרי לתחרות פנאומוקוקית. יחד עם הבקטריוצינים נמצאים גנים של חסינות ב-BIR והם נחוצים כדי להגן על התא המייצר מפני ההשפעות של הבקטריוצין שלו. בדיקת שכבת העל היא שיטה מהירה לבחינת מספר רב של זנים לאינטראקציות תחרותיות המתווכות על ידי בקטריוצינים. בדיקת שכבת העל מאפשרת גם אפיון של חסינות ספציפית לבקטריוצין, וזיהוי פפטידים לחישת מניין מופרשים. הבדיקה מתבצעת על ידי חיסון מקדים של צלחת אגר עם זן שייבדק לייצור בקטריוצין ואחריו מריחת שכבת אגר רכה המכילה זן שייבדק לרגישות לבקטריוצין. אזור פינוי המקיף את הדקירה מצביע על כך שזן הכיסוי רגיש לבקטריוצינים המיוצרים על ידי הזן שחוסן. אם לא נצפה אזור פינוי, או שזן הכיסוי חסין מפני הבקטריוצינים המיוצרים או שהזן שחוסן מראש אינו מייצר בקטריוצינים כדי לקבוע אם לוקוס ה-blp מתפקד בזן נתון, ניתן להתאים את בדיקת הכיסוי כדי להעריך הפרשת פרומון פפטיד על ידי הזן שחוסן. במקרה זה, נעשה שימוש בסדרה של ארבעה זני lacZ-reporter עם ספציפיות פרומון שונה בשכבת-העל.

ישנן שתי תוצאות אפשריות בassay הכיסוי. זה צריך להיות אפשרי לראות צמיחה של הזן נדקר לאחר דגירה הלילה. באיור 1 א, מתח הכיסוי רגיש לbacteriocins שיופקו. אזור של פינוי יכול להיות דמיין המקיף את המתח נדקר. בנוסף, מתערבל של המתח נדקר לתוך תערובת הכיסוי אפשרי ושניתן לראות באיור 1 א. באיור 1 ב, מתח הכיסוי אינו חסין מפני bacteriocins שמופרש כאמור על ידי היעדר הילה המקיפה את הדקירה. אפשר גם שהמתח נדקר לא מפריש bacteriocins. עבור assay האיתות, שתי תוצאות שונ...

התחרות בסטרפטוקוקוס פנאומוניה מתווכת על ידי בקטריוצין, פפטידים אנטי-מיקרוביאליים קטנים עם פעילות מעכבת כלפי פנאומוקוק ומינים קשורים אחרים. כאן אנו מתארים בדיקת שכבת-על חיידקית אופטימלית המאפשרת אפיון של פעילות בקטריוצין וספקטרום מעכב, חסינות ספציפית לבקטריוצין וזיהוי פפטידים לחישת מניין מופרשים.

באמצעות assay הכיסוי למדוד את הייצור בקטריאלי ורגישות לדלקת הריאות Bacteriocins איכותי

Streptococcus pneumoniae colonizes the highly diverse polymicrobial community of the nasopharynx where it must compete with resident organisms.  We have ...

המטרה הכוללת של הליך זה היא לדמיין את החיידקים ואת הפעילות של דלקת ריאות סטרפטוקוקוס באמצעות מבחן השכבה. זה מושג על ידי דקירה ראשונה של זן היצרן על צלחת TSA. בשלב השני, מכינים את תערובת המתח העליונה ולאחר מכן מזרימים אותה לאט על צלחת ה-TSA המכילה את זן היצרן המדורג.בשלב האחרון מעריכים את פעילות החיידקים. בסופו של דבר, ניתן להשתמש בבדיקת הכיסוי כדי להראות חוסר פעילות של חיידקים או ייצור פרומון על ידי הזן הנדקר המעניין. היתרון העיקרי של טכניקה זו על פני שיטות קיימות כמו טיהור ישיר של חיידקים, הוא ששיטה זו היא דרך מהירה לבסס מגוון של חיידקים, חוסר פעילות, ולסנן זנים מרובים עבור חיידקים בייצור.תדגים את ההליך נטלי מרצ'ק, סטודנטית לתואר שני במעבדה שלי כדי להכין את החיידקים ביצרן, התחילו בפס של זן הפנאומוקוק המעניין על צלחת TSA של 5% דם כבשים, ודגרו את הצלחת למשך הלילה ב-37 מעלות צלזיוס ב-5% פחמן דו חמצני. למחרת בבוקר פיפטה 3000 עד 4,000 יחידות של זרזים על צלחות המכילות 25 מיליליטר TSA, והשתמש בחרוזי זכוכית סטריליים כדי לפזר את הזרזים על פני הצלחות. לאחר שנתנו לצלחות להתייבש במשך כ-10 דקות מתחת לארון בטיחות ביולוגי, אספו כמות גלויה של חיידקים על קצה פיפטה ודקרו את קצה הפיפטה לתוך צלחת ה-TSA המיובשת.במידת האפשר, כלול יצרן חטא חיידקים ידוע כבקרה חיובית ואת הזן שישמש בשכבת העל כבקרה שלילית, תוך מתן מרווח מספיק בין הדקירות כך שהילות הגידול לא יחפפו. לאחר מכן דגרו את תרביות הדקירה בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס עם 5% פחמן דו חמצני במשך שש שעות ביום שלפני בדיקת הכיסוי לחסן חמש עד 10 מושבות של זן הפנאומוקוק שייבדקו בצינורות זכוכית המכילים חמישה מיליליטר של מדיום THY המכיל 0.5% תמצית שמרים. לאחר מכן סגרו את המכסים של תרביות זן הגליצרול הללו ודגרו אותם באמבט מים של 37 מעלות צלזיוס מבלי לרעוד.לאחר ארבע עד חמש שעות, הפוך בעדינות את הצינורות כמה פעמים ולאחר מכן מדוד את ה-od. כאשר התרביות הגיעו ל-OD 2 60 של 0.3 עד 0.5, הוסיפו גליצרול לריכוז סופי של 20% ואז העבירו את התרביות לצינורות מיקרו צנטריפוגות של 1.5 מיליליטר, ואחסנו את הצינורות במינוס 80 מעלות צלזיוס. למחרת בבוקר יש להפשיר כמות גדולה של ציר גליצרול בטמפרטורת החדר.לאחר מכן, רגע לפני יישום הכיסוי, מערבבים חמישה מיליליטר של THY 3000 עד 4,000 יחידות זרז ו-200 מיקרוליטר ממלאי הגליצרול בצינור חרוטי של 15 מיליליטר. עבור זני חיידקים מדווחים מוסיפים 50 מיקרוליטר Xcel לתערובת הכיסוי באמצעות צינור חרוטי אחד לכל צלחת. מניחים את תערובת הכיסוי בטמפרטורת החדר בזמן שהתערובת מאזנת ממיסים TSA מוצק במיקרוגל, ואז מניחים אותה באמבט מים של 55 מעלות צלזיוס.כאשר ה- TSA המומס התקרר ל -55 מעלות צלזיוס, הוסף במהירות שלושה מיליליטר של ה- TSA לתערובת הכיסוי ופיפטה למעלה ולמטה מספר פעמים עם פיפטה של חמישה מיליליטר. הקפידו לא להכניס בועות, ואז פיפטו לאט את תערובת הכיסוי ישירות על צלחת ה-TSA הדקורה. לאחר מספר דקות כאשר הצלחת התקשתה ומבלי לסובב את הצלחת, הנח בזהירות את תרבות הדקירה המונחת בחזרה לחממה לתרבות לילה.למחרת בבוקר צפו בגידול הלילה. הלוחות צריכים להיראות אטומים מצמיחת זן הכיסוי, למעט באזורים שבהם התרחש עיכוב או איתות פרומון. ישנן שתי תוצאות אפשריות לבדיקת שכבת-העל בניסוי מייצג זה.לאחר תרבית לילה, נצפה אזור פינוי סביב הזן שנדקר, מה שמצביע על כך שזן כיסוי זה רגיש לחטאים של החיידקים המיוצרים. שימו לב גם למערבולת של הזן הנדקר לתוך תערובת השכבה. בניסוי זה, זן הכיסוי היה חסין מפני הפרשת החיידק כפי שעולה מהיעדר הילה סביב הדקירה.ייתכן גם שהזן הנדקר אינו מפריש בקטרין לבדיקת האיתות. שתי תוצאות שונות אפשריות. בניסוי זה, הזן הנדקר הפריש פרומון שקיים אינטראקציה עם ההיסטידין קינאז של זן הכיסוי כפי שנצפה על ידי האזור הכחול המציין את פירוק ה-xal בתמונה זו.אם הפרומון אינו מפעיל את השעתוק של לוקוס ה-BLP בזן המדווח, או אם הזן הנדקר אינו מפריש פרומון, התמוטטות סולם X לא תתרחש כפי שנצפה בתמונה זו בעקבות הליך זה. ניתן לבצע שיטות אחרות כמו ניתוח מוטציות או ריצוף כדי לענות על שאלות נוספות כמו האם פעילות מעכבת ניכרת כלשהי מיוחסת למיקום BLP או חוסר פעילות כתוצאה ממוטציה בגן הטרנספורטר.

using-overlay-assay-to-qualitatively-measure-bacterial-production

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

אימונולוגיה וזיהומים

מקור: Hockett, K. L., ו-Baltrus, D. A. שימוש בטכניקת שכבת האגר הרכה לסינון תרכובות מעכבות שנוצרות על ידי חיידקים. J. Vis. Exp. (2017)הסרטון הזה מדגים את ההליך לזיהוי הריגה מתווכת בקטריוצין על ידי זיהוי סופרנטנט מזן תורם שנגרם על ידי אנטיביוטיקה על שכבת אגר רכה המכילה זן בדיקה. אזורים נקיים שנוצרים לאחר הדגירה מעידים על עיכוב חיידקים.

מבחן שכבת אגר רכה לזיהוי הרג בתיווך בקטריוצין ב-Pseudomonas syringae

סרטון זה מדגים זיהוי של חיידקי חומצה לקטית מייצרי בקטריוצין שמקורם בחומר צואתי של עכברים. הבדיקה קובעת את הפעילות האנטי-מיקרוביאלית של בקטריוצין על זני חיידקים ספציפיים.

הערכת הפוטנציאל האנטי-מיקרוביאלי של חיידקי צואה מורין מייצרי חיידקים מבודדים

אנו מתארים שיטה למעקב אחר קרע endomembrane שהושרו על ידי החיידקים תוך...

מידות תא יחיד של קרע vacuolar נגרמים על ידי פתוגנים תאיים

טכניקה זו מספקת שיטה לקצור, לנרמל ולכמת צמיחה תאית של חיידקים פתוגנים כי הם מראש מעובדים בתאי פונדקאי protozoan טבעיים לפני הזיהומים של תאי יונקים. שיטה זו יכולה להיות שונה כדי להתאים מגוון רחב של תאי מארח לבמה יחול כמו גם סוגי תאי היעד.

זיהומים של תאי יונקים צייתנים עם חיידקי protozoan דרוך-

שלא כמו שראה לאאוקריוטים, יש מיעוט מחקרים ששלילת קוטביות קרום פירוט וריכוז יונים שינויים בחיידקים, כגודלם הקטן בעיקר הופך את השיטות מקובלות של מדידה קשה. כאן, אנו פרוטוקולי פרט לניטור אירועים כאלה בפתוגן גראם חיובית המשמעותי Streptococcus pneumoniae תוך שימוש בטכניקות הקרינה.

ניטור שינויים בממברנה קוטביות, ממברנה יושרה, וריכוזי יון תאיים ב<em&gt; Streptococcus pneumoniae</em&gt; שימוש צבעי ניאון

במבחנה יכולים לשמש מבחני דבקות ללמוד את הקובץ המצורף של Streptococcus pneumoniae לאפיתל monolayers תא ולחקור התערבויות פוטנציאליות כגון השימוש בפרוביוטיקה לעיכוב קולוניזציה ריאות.

חוקר את ההשפעות של פרוביוטיקה על דלקת ריאות התיישבות שימוש<em&gt; במבחנה</em&gt; Assay דבקות

מבחני פלאק הם תקן הזהב לכימות ויראלי, תוך שימוש בשכבות לכידה על חד-שכבות תאיות מארחות כדי לקבוע טיטרים ויראליים. בעוד שבאופן מסורתי נעשה שימוש בשכבות-על שונות למחצה, כאן אנו מדגימים טכניקות פלאק המשווים שכבות-על מוצקות למחצה לתאית מיקרו-קריסטלית נוזלית חדשה בקרב מספר משפחות של נגיפים.

קביעת ריכוז נגיפית באמצעות לוחית מבחני: מערכות כיסוי שימוש מסורתיות וחדשני

ניתן להשתמש בבדיקת עיכוב הגדילה הנדחית כדי להעריך את השפעת התחרות על ידי חיידק מבודד אחד על אחר. עיכוב מכומת על ידי מדידת אזור הפינוי סביב המבודד המייצר מעכב, או מוערך באופן איכותי על ידי קביעת היקף העיכוב הנראה לעין.

צמיחה נדחית Assay העיכוב לכמת את ההשפעה של antimicrobials הנגזר חיידקים על תחרות

אנו מתארים שיטה פשוטה לסינון תרביות חיידקים לייצור תרכובות מעכבות כלפי חיידקים אחרים.

השימוש בטכניקת הכיסוי הרך-אגר למסך תרכובות מעכבות הופקו bacterially

שיטת ההרג הזה opsonophagocytic משמש כדי להשוות את היכולת של תאים חיסוניים phagocytic להגיב ולהרוג חיידקים בהתבסס על טיפולים שונים ו/או תנאים. באופן קלאסי, assay הזה משמש תקן זהב להערכת אפקטור פונקציות של נוגדנים שהועלו נגד חיידק בשם opsonin.

Opsonophagocytic הריגה הנועד להעריך תגובות אימונולוגי נגד פתוגנים חיידקיים

האינטראקציה עם התרבות המשותף המוצגת בפרוטוקול זה היא זולה, תפוקה גבוהה ופשוטה. ניתן להשתמש בתנאים אלה כדי להתבונן באינטראקציות מיקרוביאלית בתרבות המשותף, לזהות דפוסי אינטראקציה, ולאפיין את הפוטנציאל המעונה של מאמץ מחיידקים של התעניינות במחלות אנושיות וסביבתיות.

התפוקה הגבוהה-שיתוף תרבות החברה לחקירת אינטראקציות מחיידקים

למדו לבצע assay כיסוי אופטימלי לחקר פעילות בקטריוצינים ב-Streptococcus pneumoniae. השיטה מאפשרת אפיון מהיר של פעילות אנטימיקרוביאלית, חסינות וזיהוי פפטידי קוורום סנסינג במחקר מיקרוביולוגי.

באמצעות assay הכיסוי למדוד את הייצור בקטריאלי ורגישות לדלקת הריאות Bacteriocins איכותי

גלה סרטונים נוספים