הזמנת תאים בודדים עוברים יחיד מאסר 3D: התקן חדש עבור הקרנת תוכן גבוהה

המטרה הכוללת של הניסוי הבא היא להתבונן במורפולוגיה ובדינמיקה של אברונים תאיים על מערך של מיקרו-חללים המחקים את הסביבה התלת-ממדית שנתקלים בה בתנאים פיזיולוגיים. עבור תאים עם קירות קשיחים, כגון שמרי ביקוע, חללים יכולים לארגן ולכוון מבנים תאיים. זה מושג על ידי ייצור תחילה של מערך של עמודי PDMS ממאסטר כדי להשיג מערך של מיקרו-חללים PDMS, המכונים כוסות ביצה, על ידי יציקת העתק.

כשלב שני, כוסות הביצים מתפקדות עם חלבונים של המטריצה החוץ-תאית ומוכנסות לצינור עם חתיכת פלסטיק גלילית בהתאמה אישית, התומכת בדגימת המיקרו-חלל ומאפשרת החדרת תאי יונקים בודדים על כל אחד מהמיקרו-חללים. לאחר מכן, כוסות הביצים המלאות בתאים מוסרות ומודגרות עם התרופה או התרכובת המעניינת על מנת לחקור את הפנוטיפ והתהליכים הדינמיים של תאים בכליאה תלת מימדית. מתקבלות תוצאות המראות הבדלים בפנוטיפ התאים ובמבנים דינמיים חדשים שנצפו בהשוואה למבחני מבחנה דו-ממדיים סטנדרטיים המבוססים על כיוון התאים.

היתרון העיקרי של טכניקה זו על פני שיטות קיימות, כמו מבחני תרבית תאים דו-ממדיים סטנדרטיים, הוא שתאי יונקים בכוסות ביצים חווים סביבה תלת מימדית הדומה למיקרו-סביבות לוגיות אך מסודרים בדרגה מסודרת וסטנדרטית. סדר וכיוון הם גם שיפורים משמעותיים במקרה של שמרי ביקוע. שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלות מפתח בתחום שלד התאים וגילוי תרופות, כגון זיהוי תרופה חדשה ואנטי סרטנית עם סינון תוכן גבוה.

ההשלכות של טכניקה זו משתרעות על אבחון של מחלות רב-גורמיות כמו סרטן, מכיוון שניתן לבצע ולנתח בקלות בדיקות סקר תרופות באמצעות כוסות ביצים, מה שהופך את השיטה הזו למעניינת במיוחד עבור רפואה מותאמת אישית. שיטה זו יכולה לספק מפתח פנימי למבנים ודינמיקה מאורגנים בתאי יונקים בודדים ותאי שמרים ביקוע, וניתן ליישם אותה גם לארגון מחקר, פיתוח עוברים כגון C.elegans ו-ri-so-flu-a. בפרוטוקול זה, מערך של מיקרו-חללים או כוסות ביצים מעוצב על גבי שכבת פולידימתילסילוקסן או PDMS המודבקת על החלקת כיסוי על ידי יציקת העתק.

השלב הראשון הוא ייצור המאסטר, שלא יוצג, אך מתואר בפרוטוקול הטקסט. לאחר יצירת המאסטר, השלב הבא הוא לייצר את העתק ה-PDMS. בשפופרת של 50 מיליליטר, מערבבים היטב את המקשר הצולב ואת הפרה-פולימר ביחס משקל למשקל של אחד עד 10 או נפח לנפח בסך הכל 30 גרם.

צנטריפוגה את הצינור ב -1, 800 פעמים גרם למשך חמש דקות להסרת בועות אוויר. זרוק בעדינות את ה-PDMS על גבי המאסטר. אם מופיעות בועות, הסר את התערובת.

מכניסים את הדגימה לתנור בחום של 65 מעלות צלזיוס למשך ארבע שעות. לאחר ריפוי ה-PDMS, השתמש באזמל כדי לחתוך בעדינות את אזור העניין של כסנטימטר רבוע אחד, הכולל כ-10 עד 5 מיקרו-חללים, או כוסות ביצים. קלף את חותמת ה-PDMS בעדינות.

כדי להתחיל בהליך של יציקת העתק, הפעל את חותמת ה-PDMS על ידי טיפול בפלזמת חמצן למשך 30 שניות. אחסן את ה-Activated stamp באופן זמני בצלחת פטרי סגורה כדי למנוע שקיעת אבק. בעבודה במכסה אדים, הנח את חותמת ה- PDMS המופעלת כשהצד כשהמבנים פונים כלפי מעלה או הפוך בצלחת פטרי ליד מכסה של 15 מיליליטר.

מלאו את הפקק ב-200 מיקרוליטר טרימתילכלורוסילן. סוגרים את צלחת הפטרי, ונותנים לבול להמליח במשך שבע דקות. הנח את חותמת ה-PDMS על ציפוי הסיבוב כשהמבנים הפוכים.

שים טיפה קטנה של PDMS נוזלי על גבי המבנים. סובב מעיל ב-1500 סל"ד למשך 30 שניות כדי להניח שכבה דקה של PDMS על גבי המבנים. הכניסו את ה-stamp לתנור בחום של 65 מעלות צלזיוס למשך ארבע שעות כדי לרפא את שכבת ה-PDMS המצופה בספין שהושקעה.

לאחר מכן, הפעל את שכבת ה-PDMS הדקה על ידי הנחת חותמת ה-PDMS הפוכה יחד עם כיסוי זכוכית במנקה פלזמה חמצן למשך 30 שניות. הנח מיד את החותמת במגע עם תלוש מכסה הזכוכית ולחץ בעדינות סביב פני הבול בעזרת פינצטה להדבקה. לאחר מכן, שמור על לחץ קבוע על גבי החותמת למשך כ-10 שניות.

30 דקות לאחר מכן, מקלפים בעדינות את החותמת מהחלקה על מנת לשחרר את כוסות הביצים. היזהר מאוד לא לשבור את הדגימה. שוטפים היטב את כוסות הביצים באתנול ומייבשים.

אם כוסות ביצי PDMS אינן על החלקת מכסה הזכוכית ומנותקות במהלך שלב הסרת ההצמדה, שקול להתאים את ההגדרות של מנקה הפלזמה והפעל מחדש את ההליך ליציקת העתק. כדי להקל על המניפולציה של הדגימה מאוחר יותר, מומלץ להדביק חתיכה קטנה של PDMS מרפא בקצה החלקת הכיסוי. במקרה של תאי יונקים המוצגים בסרטון זה, יש לתפקד את משטח ה-PDMS עם חלבוני הידבקות של המטריצה החוץ-תאית.

הידרופיל את כוסות הביצים במנקה פלזמת החמצן למשך 30 שניות. לאחר מכן, יש לעקר את כוסות הביצים באור אולטרה סגול למשך חמש דקות. הפקידו טיפה קטנה של תמיסת פיברונקטין כדי לכסות את כל שטח הביצים, ודגרו למשך שעה בטמפרטורת החדר.

הגן על הדגימה מפני ייבוש. שטפו בעדינות את כוסות הביצים עם כמיליליטר PBS, בעזרת פיפטה מפלסטיק. חזור על הפעולה בסך הכל שלוש פעמים.

לאחר מכן, הניחו חתיכת פלסטיק גלילית בהתאמה אישית לצינור של 50 מיליליטר. הוסף 13 מיליליטר של מדיום תרבית תאים לצינור. המדיום צריך להגיע לפחות שני סנטימטרים מעל החלק הגלילי כדי להבטיח טבילה מוחלטת של הדגימה.

בעזרת פינצטה חדה וישרות כדי להחזיק את הדגימה בידית ה-PDMS, הנח בזהירות את כוסות הביצים בתוך הצינור, לחץ בעדינות על החלקת הכיסוי עד שהיא מונחת על גבי הצד העליון של חתיכת הפלסטיק וטבולה במלואה. יש לתרבית את התאים שיוכנסו לכוסות הביצים למפגש של 80 עד 100% ולהשעות אותם מחדש בחמישה מיליליטר של מדיום תרבית. פיפטה 200 מיקרוליטר של תאים על גבי כוסות הביצים, מפילה תאים מרוכזים ככל האפשר על גבי כוסות הביצים, אך נמנעת ממגע פיזי.

זה ימנע שבירה ו/או נזק של הדגימה. צנטריפוגה את צינור 50 מיליליטר ב -1, 800 פעמים גרם למשך שתי דקות. פיפטה עוד 200 מיקרוליטר תאים על גבי כוסות הביצים וצנטריפוגה שוב ב -1, 800 פעמים גרם למשך שתי דקות.

חזור על הפעולה שלוש פעמים בסך הכל על מנת למטב את אחוז המילוי. לאחר הצנטריפוגה האחרונה, בדוק את אחוז המילוי של כוסות הביצים במיקרוסקופ. בעזרת הפינצטה כדי להחזיק את ידית ה-PDMS, הוציאו את הדגימה בזהירות מהצינור מבלי להפריע לתאים בכוסות הביצים, והניחו את הדגימה בצלחת פטרי עם מדיום.

כדי להסיר את התאים העודפים שאינם נמצאים בכוסות הביצים, יש לשטוף על ידי פיפטינג עדין למעלה ולמטה שלוש פעמים ליד כל צד של מערך המיקרו-מבנה. לבסוף, החלף את המדיום במדיום טרי כדי להסיר תאים שאינם מחוברים. כדי לצפות באברונים תאיים קבועים, הניחו את כוסות הביצים עם דגימה קבועה על הבמה של מיקרוסקופ הפוך אפיפלואורסצנטי ובחרו את מטרת השמן פי 60.

בדוגמה זו, הדגימה היא פיברובלסטים NIH 3T3, שבהם הוכתמו מנגנון גולגי, הגרעין וסיבי האקטין. התמקדו בזהירות באמצעות אור שדה בהיר עד שכוסות הביצה והתאים נמצאים במישור התצפית. בחר ומקד את אזור העניין והתחל את לכידת התמונה.

התחל הליך זה על ידי הנחת כוסות הביצים למחזיק מיקרוסקופ ומילויו במיליליטר אחד של מדיום תרבית תאים 10% FCS L15. התקן את המחזיק על במת המיקרוסקופ. כדי למנוע אידוי, הניחו מכסה זכוכית על גבי המחזיק.

התבונן בתאים עם מיקרוסקופ הפוך אפיפלואורסצנטי המצויד במטרת שמן פי 60. דוגמה זו משתמשת בתאי HeLa המבטאים מיוזין ואקטין מתויגים פלואורסצנטית, שתי מולקולות מפתח המעורבות בסגירת הטבעת הציטוקינטית במהלך המיטוזה. בחר את אזור העניין וחפש טבעת ציטוקינטית, באמצעות ערוץ GFP או ערוץ טקסס אדום.

התמקד בצורה מדויקת. הפעל את הרכישה האוטומטית בשני הערוצים עד שהטבעת נסגרת לחלוטין. סריקת תמונות מיקרוסקופ אלקטרונים של כוסות ביצים מראות שצורתן וגודלן סדירים מאוד.

עבור תאים עם קירות קשיחים כמו שמרי ביקוע, כוסות הביצה יכולות לכוון את הטבעת הציטוקינטית. עבור תאי יונקים, השוואה בין תאים על כוסות ביצים תלת מימדיות ומשטחים שטוחים דו-ממדיים מגלה כי הראשונים יוצרים מערך מסודר עם הפנוטיפ ההומוגני דמוי הכדור, בעוד שהאחרונים מראים מורפולוגיה לא מסודרת והטרוגנית. תאים על גביעי ביצים מראים גם ירידה במספר סיבי הלחץ, כפי שמעיד מספר ההשפעה הצנועה של הטיפול בבלביסטטין.

מנגנון גולגי בתרביות דו-ממדיות מראה בדרך כלל פנוטיפ מורחב, בעוד שבכוסות ביצים הוא מראה פנוטיפ דחוס יותר. זה אושר על ידי כימות של הפנוטיפים של גולגי. לבסוף, על משטחים דו-ממדיים, גרעין התא מכוון באופן אקראי, בעוד שבכוסות ביצים, הוא מכוון אורתוגונלית במישור ה-xy, הן בתאים מסוג בר והן בתאים שטופלו בבלביסטטין.

קביעת ערכי כדוריות הגרעין מגלה כי כוסות הביצה אינן משפיעות על הכדוריות הרגילה של גרעין התא. עם זאת, ההבדל בין תאים מסוג בר לתאים שטופלו בבלביסטטין על גביעי ביצים מצביע על כך שכוסות הביצים חושפות השפעה אמיתית של התרופה המוסווית בדו-ממד. מחקרי תאים חיים באמצעות כוסות ביצים מאפשרים לזהות תהליכים פעילים חדשים, שאינם נראים בתרביות סטנדרטיות.

לדוגמא, הצטברות תקופתית של מיוזין הנעה באופן רדיאלי כאשר הטבעת הציטוקינטית נסגרת במהלך המיטוזה נצפו בתאי HeLa. לאחר השליטה, ניתן להכין את כוסות הביצים מהעתק תוך פחות משש שעות, ומילוי התאים יכול להיעשות תוך כ-15 דקות. בזמן הניסיון בתהליך זה, חשוב שיהיה את גודל כוסות הביציות לתאים הנחקרים.

ניתן להתאים הליך זה לפלטפורמות סינון תוכן גבוה בחברות תרופות לפעילויות סינון המוניות וגם במבחני אבחון מותאמים אישית של מטופלים בהערכת טיפולים ספציפיים בודדים. לאחר צפייה בסרטון זה, אתה אמור להבין היטב כיצד לייצר ולהשתמש במיקרו-חללים של כוסות הביצים. כוסות הביצים מתקננות ויוצרות סדר במגוון מערכות דומות, החל מתאים בודדים ללא דפנות, כגון תאי יונקים, ועד למערכת עם דפנות, כגון שמרים ועובר.