Name: הארה תהודת אנרגיה העבר לחקר שינויי קונפורמציה בחלבונים בממברנה שבאו לידי ביטוי בתאי יונקים (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-09-16T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 31 s
Description: למד שיטת LRET משופרת לחקר שינויי קונפורמציה בחלבוני ממברנה בתאי יונקים. השיטה מאפשרת מדידה בזמן אמת ללא צורך בטיהור החלבונים מראש.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

עבודה זו נתמכה על ידי המכון הלאומי לבריאות גרנט GM094246, איגוד לב האמריקאי גרנט 11GRNT7890004, והקרן הלאומי למדע גרנט MCB-1,110,501.

.1 צור Construct המכיל את החלבון של ריבית לשכפל את הגן המבטא את החלבון של עניין לתוך וקטור מתאים. וקטורי שימוש כגון סדרת pcDNA או pRK5 כפי שהם מתאימים גם לביטוי במערכות יונקים כמו תאי HEK293 וCHO. .2 בחרו את האתרים בחלבון שתויג עם fluorophores <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בחרו אתרי תיוג כי הם מסוגלים לשקף את שינויי קונפורמציה אפשריים בתוך החלבון. במידת האפשר, להשתמש במבנה הגבישי של החלבון או של חלבון הומולוגי כדי לסייע להפוך קביעה זו. אם אין מבנה הגבישי זמין, להשתמש בתוכנה באינטרנט כדי לחזות את המבנה האפשרי של החלבון ולכן תקבל תובנה האתרים מתאימים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בחר שאריות כך שהרשתות בצד של השאריות שנבחרו הן משטח חשוף ונגיש לfluorophores כך שיכול להיות שכותרתו החלבון. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בחר שאריות שאינם קריטיים לתפקוד חלבון, לאתרים לדוגמה, שאינם מעורבים ביגנד המחייב. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בהחדרת המוטציה ציסטאין, לתת העדפה לאתרים הדומים, למשל סרין, שיגרמו הפרעה מינימאלית למבנה החלבון. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר בחירת אתרי התיוג, לעשות מוטציות על מנת להבטיח כי החלבון נותן רק LRET מאתרים המיועדים אלה. להשתמש בפרוטוקולים מכוונים mutagenesis אתר סטנדרטיים להשתנות משם cysteines אינו מלוכדות דיסולפיד שעלול להיקשר לmaleimide מצומדות- תגי ניאון. אל להשתנות משם cysteines מלוכדות דיסולפיד ו, cysteines החופשי קבר שכן הם לא צריכים להגיב בצבעי ניאון בצורה המקופלת של החלבון. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להציג את שאריות ציסטאין באתרים הרצויים על ידי ביצוע מוטציות נקודה תוך שימוש בפרוטוקולים מכוון mutagenesis אתר סטנדרטיים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כולל אתר מחשוף פרוטאז שיכול דווקא לדבוק את אחד cysteines מהחלבון. אםרצף חלבון מאפשר את זה, להציג את האתר על ידי שמרני מוטציה החלבון יש תרומבין (רצף הכרת LVPRGS) או פקטור Xa (IDGR רצף הכרה או IEGR) רצף ליד ציסטאין הציג ונגיש לפרוטאז מחשוף; אחרת רצף tetra- או Hexa-peptide עשוי להיות מוכנס בכללותה. בחר האתר באופן שעם מחשוף אחד cysteines הציג מנתק משאר החלבונים במקרים מסוימים, זה עשוי לדרוש שני אתרי מחשוף איגוף ציסטאין מוטציה. </li></ol> .3 מבחן הביטוי ופונקציונאלי של החלבון <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לבצע כתם מערבי כדי לאשר ביטוי של החלבון שעבר מוטציה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בצע assay פונקציונלי של החלבון על מנת להבטיח כי המוטציות שינו את תפקוד החלבון אך במידה מועטת, אם בכלל, כדי להימנע מלימוד שינויי קונפורמציה של חלבונים לא מתפקדים. הערה: מאחר שיש לי כל החלבונים פונקציות שונות, אין f אחת assay unctional המשמש במיוחד עבור LRET; עם זאת, כמה דוגמאות של מבחני תפקודיים כוללות מבחני אנזים פעילות אנזימים, מבחני מחייב ליגנד לקולטנים, ומחקרי אלקטרופיזיולוגיה לתעלות יונים. </li></ol> .4 בחר fluorophores כדי לשמש fluorophores בחר, על בסיס מגוון המרחק הצפוי הנמדד כך שהטווח הוא בין 0.5-1x R 0 של זוג fluorophore. הערה: זה מאפשר לחיסור קל יותר של הרקע, שבו יש בדרך כלל חיים ארוכים הרבה יותר. לדוגמא, אם טווח המרחק הצפוי נמדדים הוא סביב 35 Å, זוג fluorophore מתאים לשימוש יהיה chelate terbium כתורם וAlexa 594 כacceptor, כי R 0 לזוג הזה הוא 53 A (טבלת 1). .5 הגעה החלבון על ידי זמני transfecting הסכום הנדרש של תאי יונקים ntent "&gt; זמני transfect החלבון של עניין לתוך תאי יונקים בחרו משתמשים באחת מריאגנטים transfection הנפוצים בדרך כלל, להשתמש בארבע מנות 10 ס"מ לכל ניסוי LRET לשורות תאי HEK וCHO;. עם זאת, סכום זה עשוי להשתנות בהתאם לביטוי חלבון , יציבות, וכו '. אפשר התאים לבטא החלבון ל36-48 שעות לפני הקציר. .6 לייבל החלבונים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ניתוק תאים מצלחת התרבות. ניתוק תאי HEK פשוט על ידי pipetting חיץ נגד תחתית הצלחת. ניתוק תאי CHO עם מגרד תא, שטף את התקשורת עם חיץ תאי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאסוף את התאים על ידי צנטריפוגה ב1,100 XG במשך 3 דקות. השתמש באותן הגדרות צנטריפוגות אלה לאיסוף תאים לאחר תיוג, כמו גם לאחר שטיפות שלאחר מכן. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להשעות תאי 3 מ"ל של חיץ תאי, ולאחר מכן להוסיף fluorophores תורם acceptor בכמויות equimolar עד לריכוז סופי של 100-300 ננומטר. דגירה על f מסובביאו שעה 1 בRT. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שטוף תאים אלה שכותרת 3-4x עם חיץ תאי כדי להסיר fluorophores מאוגד, אז להשעות את התאים האלה במאגר תאי (בדרך כלל 2 מ"ל) למדידות LRET. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כביקורת, תווית קבוצה של תאים עם fluorophore רק תורם (chelate terbium) נפרדת ללא תוספת של כל fluorophore acceptor. הערה: נתונים מניסויי תורם בלבד אלה הוא הכרחיים כדי להשלים את הניתוח. ניתן לעשות ניסויים אלה על זהים או שונים ימים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שוב, מבצע אימות פונקציונלית, הפעם עם חלבון שעבר מוטציה שכותרתו, כתהליך התיוג יכול גם להפריע לתפקוד בהתאם לאתר המשמש לתיוג. הערה: ניתן לעשות ניסויים אלה על זהים או שונים ימים. </li></ol> .7 הגדרת ניסוי LRET <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים את תאי resuspended בקובט קוורץ עם נפח מינימאלי של 1 מ"ל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפעל את המחשב ואת המכשיר ולהתאים את הפרמטרים של datתכנית רכישה בהתאם. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קבע את אורך גל העירור לטווח הספיגה של fluorophore התורם (330-340 ננומטר עובד היטב עבור chelate terbium). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קבע את אורך גל הפליטה כראוי, תוך התחשבות כי פליטת acceptor משתנה על בסיס acceptor משמש. חשוב לציין, בחר באורך גל זיהוי המודד רק פליטת acceptor ואינו כולל כל לדמם דרך מהפליטה של ​​התורם. לדוגמא, השתמש באורך גל של 565 ננומטר עבור Alexa 555 כלוח acceptor 1. עבור מדידות תורם בלבד, שבו חלבון שכותרתו רק עם תורם אך ללא acceptor, להשתמש באורך גל של 545 ננומטר למדידת פליטת chelate terbium. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הגדר את האורך של גילוי פליטה להיות לפחות שלוש פעמים בחייו LRET הצפויים להבטיח שרכיב ארוך חיים לא יחסר. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לבצע הסריקה. האם לפחות שלוש סריקות של 99 מטאטא כדי להבטיח עקביות של תוצאות. להציל את התוצאות דואר כקובץ טקסט (* txt). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי למדוד שינויי קונפורמציה של חלבונים בכל קשורים לתנאים שונים (כגון תוספת של ליגנד), לשנות את התנאים האלה ושוב לבצע לפחות שלוש סריקות של 99 מטאטא כל על אותו המדגם תחת מצב חדש זה. אם בוחנים את ההשפעות של גלוטמט בקונפורמציה של קולטני גלוטמט, למשל, להוסיף גלוטמט עד 1 מ"מ לאותו המדגם שנסרק בשלב 7.3, ולאחר מכן לסרוק שוב. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להוסיף עד חמש יחידות של פרוטאז המתאים ולקחת סריקות ללא הרף עד המחשוף הוא מלא ולא חלה שינוי נוסף הוא לראות את החיים במשך שלוש סריקות רצופות. בדרך כלל, מחשוף יושלם בתוך שנים עד 3 שעות. אם אתר מחשוף פקטור Xa משמש למחשוף פרוטאז, למשל, להוסיף 3 μl של פקטור Xa למדגם, ולסרוק כל 30 דקות ל3 שעות. </li></ol> .8 לנתח נתונים המתקבלים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פתח את התוכנה לניתוח נתונים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> טען את החיים הקרינהנתונים באמצעות ASCII היבוא כדי לפתוח את קבצי טקסט. לטעון את כל משכפל כמו גם מדידות רקע הסופיות, לתוך קובץ אחד. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ממוצע הנתונים מכל הסריקות לכל תנאי ניסוי כדי לקבל את הנתונים הסופיים. לשם כך, סמן את העמודות המכילות מחקרים הבודדים, לאחר מכן, תחת תפריט נתונים בשורת התפריטים, לחץ על סטטיסטיקה על שורות כדי להציג את העוצמות ממוצעת הקרינה מהניסויים, כמו גם סטיית התקן ושגיאה סטנדרטית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עלילה הערכים הממוצע כגרף קו עם עוצמת הקרינה על ציר Y והחיים בהמייקר על ציר X כדי ליצור עקומה שמייצגת את חייו של הפליטה רגישה של acceptor. לשנות את ציר Y של המזימה בקנה מידה יומן, כדי לאפשר הדמיה טובה יותר של נתונים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חזור על שלב 8.3 על נתוני מדידת רקע, עם ממוצע של הסריקות הסופיות שמראות חפיפה המציין מחשוף מלא. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להציג את נתוני רקע הממוצעים עלאותה חלקה שמכילה את הנתונים גולמיים בממוצע. לשם כך, פתח את תיבת הדו שיח בקרת השכבה נמצאה תחת תפריט מגרש. לאחר מכן, להעביר את הנתונים המכילים את הרקע מתכוונים לרשימה של תוכן שכבה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> יישר את נתוני רקע הממוצעים לנתונים הגולמיים הממוצעים. לשם כך, השתמש בפונקציה מתמטית פשוטה תחת תפריט המתמטיקה להכפיל או לחלק את נתוני רקע כנדרש עד סוף הזנב של הרקע חופף עם הזנב של נתונים הגולמיים. הערה: בסופו של דבר זנב זה, כל החיים מהחלבון של עניין צריך כבר נרקבה משם לגמרי; מה מיושר הוא פשוט הווה אות הרקע הן לפני והן אחרי מחשוף פרוטאז. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להחסיר אות הרקע מיושרת מאות LRET הגלם הראשונית, שוב באמצעות הפונקציה מתמטית פשוטה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להתאים את הנתונים לדעיכה מעריכית (Exponentials בודד או מרובה, בהתאם לאתרים ועיצוב ניסיוני). <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הגדר את גבול ההתחלה להתקנה להתחיל לאחר תוםשל דופק הלייזר. השתמש באותו startpoint זה עבור כל אביזרים העקום שלאחר מכן. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בתיבת הדו שיח בחר התאמת הפונקציה, בחר דעיכה מעריכית כדי להתאים לכל החיים למשוואה לדעיכה מעריכית יחידה הבאה: <img alt="משוואה 4" fo:content-width="2in" src="/files/ftp_upload/51895/51895eq4.jpg" width="200"> משוואה. 4 שם, y מייצג את עוצמת הקרינה, y 0 מייצג את עוצמת הרקע בשל רעש מהמערכת, 1 היא עוצמת האות, t הוא לכל החיים הקרינה, x הוא הזמן, וx 0 הוא הזמן לקזז. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תקן x 0 עד 0, להתחיל פונקצית ההתאמה, ולהתאים את הנתונים. הערה: אם הניסוי נועד לי אות רק מזוג אחד של אתרים, את הנתונים המתקבלים בקלות צריכים להיות בכושר על ידי דעיכה מעריכית יחידה 8. השייר של הכושר הוא שיטה טובה כדי לקבוע את הטוב בכושר ואם חיים ריקבון נוספים הם required. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש בתקופות החיים המתקבלים מנתונים כדי לחשב את המרחק בין fluorophores באמצעות משוואת פורסטר (סידור מחדש של משוואות 1 ו -2 לעיל): <img alt="משוואה 5" fo:content-width="2in" src="/files/ftp_upload/51895/51895eq5.jpg" width="200"> משוואה. 5 הערה: כל המשתנים הם כאמור לעיל עם τ DA לאחר שנמדד כחי פליטת acceptor רגישים. ניתן למצוא פרטים נוספים ודוגמאות על מדידות של R 0 ו R במקום אחר 7,9,10. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חזור על ניתוח הניסוי ונתונים לפחות שלוש פעמים כדי להבטיח שחזור. חוסר עקביות בין חזרות בודדות באותה המדידה מעמידה בסימן שאל את תוקפו של נתונים; להשתמש ניסויי שליטה נוספים או חזרות. לחשב טעויות במדידה באמצעות המחשבון החופשי גוסטב ניתוח שגיאה (שפותח על ידי ד"ר תומס הובר) או מערכת דומה שמפיץ את השגיאה בהמתאים של הפעם בחיים. </li></ol>

<ol><li>Selvin, P. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Principles+and+biophysical+applications+of+lanthanide-based+probes%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Biophysics+and+Biomolecular+Structure%22%5BJournal%5D)">Principles and biophysical applications of lanthanide-based probes.</a> Annual Review of Biophysics and Biomolecular Structure. 31, 275-302 (2002).</li>
<li>Stryer, L., Haugland, R. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Energy+transfer%3A+a+spectroscopic+ruler%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Energy transfer: a spectroscopic ruler.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 58, 719-726 (1967).</li>
<li>Stryer, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescence+energy+transfer+as+a+spectroscopic+ruler%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Fluorescence energy transfer as a spectroscopic ruler.</a> Annual Review of Biochemistry. 47, 819-846 (1978).</li>
<li>Selvin, P. R., Hearst, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Luminescence+energy+transfer+using+a+terbium+chelate%3A+improvements+on+fluorescence+energy+transfer%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Luminescence energy transfer using a terbium chelate: improvements on fluorescence energy transfer.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 91, 10024-10028 (1994).</li>
<li>Chen, J., Selvin, P. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Thiol-reactive+luminescent+chelates+of+terbium+and+europium%5BTitle%5D)+AND+%22Bioconjugate+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Thiol-reactive luminescent chelates of terbium and europium.</a> Bioconjugate Chemistry. 10, 311-315 (1999).</li>
<li>Ge, P., Selvin, P. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Thiol-reactive+luminescent+lanthanide+chelates%3A+part+2%5BTitle%5D)+AND+%22Bioconjugate+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Thiol-reactive luminescent lanthanide chelates: part 2.</a> Bioconjugate Chemistry. 14, 870-876 (2003).</li>
<li>Gonzalez, J., Rambhadran, A., Du, M., Jayaraman, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((LRET+investigations+of+conformational+changes+in+the+ligand+binding+domain+of+a+functional+AMPA+receptor%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">LRET investigations of conformational changes in the ligand binding domain of a functional AMPA receptor.</a> Biochemistry. 47, 10027-10032 (2008).</li>
<li>Ramaswamy, S. S., Maclean, D. M., Gorfe, A. A., Jayaraman, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proton+mediated+conformational+changes+in+an+Acid+Sensing+Ion+Channel%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Bio.+Chem%22%5BJournal%5D)">Proton mediated conformational changes in an Acid Sensing Ion Channel.</a> J. Bio. Chem. 288, (2013).</li>
<li>Rambhadran, A., Gonzalez, J., Jayaraman, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Conformational+changes+at+the+agonist+binding+domain+of+the+N-methyl-D-aspartic+acid+receptor%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Conformational changes at the agonist binding domain of the N-methyl-D-aspartic acid receptor.</a> The Journal of Biological Chemistry. 286, 16953-16957 (2011).</li>
<li>Rambhadran, A., Gonzalez, J., Jayaraman, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Subunit+arrangement+in+N-methyl-D-aspartate+%28NMDA%29+receptors%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Subunit arrangement in N-methyl-D-aspartate (NMDA) receptors.</a> The Journal of Biological Chemistry. 285, 15296-15301 (2010).</li>
<li>Kokko, T., Kokko, L., Soukka, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Terbium%28III%29+chelate+as+an+efficient+donor+for+multiple-wavelength+fluorescent+acceptors%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Fluorescence%22%5BJournal%5D)">Terbium(III) chelate as an efficient donor for multiple-wavelength fluorescent acceptors.</a> Journal of Fluorescence. 19, 159-164 (2009).</li>
</ol>

יש לי המחברים אין לחשוף.

LRET היא טכניקה רבת עוצמה המאפשרת למדענים למדוד מרחקים בין תחומים בתוך חלבון יחיד, כמו גם בין תת יחידות בחלבון Multimeric. ככזה, LRET הוא מתאים היטב לבחינת השינויים ודינמיקת קונפורמציה של חלבונים או מקרומולקולות אחרות. הפרוטוקול הנ&quot;ל צריך לאפשר מעבדה מצוידת כראוי כדי לבחון ההשערות שלהם בקלות; עם זאת, יש הרבה מקורות נפוצים של שגיאה שעלולה להטריד את החוקר החדש. אם אות LRET קטנה או לא נראית, יש לבדוק תחילה את הגדרות אורך הגל המשמשות. עירור צריך להיות בטווח הספיגה של terbium (330...

העברת הארה תהודת אנרגיה (LRET) היא נגזרת של טכניקת העברה ידועה פלואורסצנטי תהודת אנרגיה (סריג) 1. בדומה לסריג, LRET ניתן להשתמש כדי למדוד מרחקים ושינויי מרחק בין fluorophores תורם acceptor המצורף לאתרים ספציפיים על החלבון של עניין בטווח של 10-100 Å 1-3. העקרונות של LRET דומים גם הם לסריג שבהעברת אנרגיית התהודה מתרחש בין שני fluorophores הפרוקסימלי כאשר ספקטרום הפליטה של ​​fluorophore התורם חופף עם ספקטרום הספיגה של fluorophore acceptor. היעילות של העברה זו קשורה למרחק בין שני fluorophores על ידי המשוואה הבאה: <img alt="משוואת 1" fo:content-width="1.2in" src="/files/ftp_upload/51895/51895eq1.jpg" width="120"> משוואה. 1 כאשר R הוא המרחק בין שני fluorophores, E הוא את היעילות של enהעברת ergy, וR 0, שיידון להלן, הוא רדיוס פורסטר לזוג fluorophore, כלומר המרחק שבו יעילות של העברה היא חצי מקסימאלי. ממשוואה זו, ניתן לראות את היעילות הקשור לסדר הגודל של המרחק בחזקה השישית ההפוכה 1. זה תלות זו הפוכה שישי כוח המאפשרת לסריג ומדידות LRET להיות רגישים להפליא אפילו לשינויי מרחק קטנים כאשר ליד R 0 של זוג סריג. היכולת לתייג באופן ספציפי אתרים הרצויים בחלבונים או מקרומולקולות אחרות מאפשרת לאדם לנצל את רגישות זו כדי לעקוב אחר שינויי קונפורמציה. בהשוואה לסריג, אשר עושה שימוש במולקולות צבען אורגניים קונבנציונליות, LRET מציע יתרונות נוספים. בLRET, במקום להשתמש בצבע אורגני כfluorophore התורם, קטיון סדרת lanthanide, בדרך כלל Tb 3 + או האיחוד האירופי 3 +, משמש 1,4-6. Fluorophores שנופל under קטגוריה זו, למשל, chelate terbium, הם גם מאוד תכליתיים בכך שהם יכולים להיות בשימוש עם מגוון רחב של fluorophores acceptor. גמישות זו מתאפשרת בגלל ספקטרום הפליטה של ​​lanthanides chelated להכיל פסגות פליטה חדות מרובות, המאפשר למין יחיד של fluorophore תורם לשימוש עם אחד ממגוון רחב של fluorophores acceptor. לפיכך, פליטת acceptor רגישה יכולה להיות מזוהה ללא כל חשש של זיהום לדמם דרך מפליטת תורם 5. הנסיין בוחר את acceptor הספציפי המבוסס על המרחק הצפוי בין שני fluorophores (איור 1 ולוח 1). בfluorophores lanthanide chelated אלה, יון מתכת chelated על ידי מולקולה המכילה קבוצת אנטנה שממגרת את lanthanide בדרך כלל גרוע, סופג לעירור, כמו גם קבוצה פונקציונלית bioreactive לקשור יון לקבוצה פונקציונלית ספציפית על מקרומולקולה 1, 5,6. Oncדואר נרגש, lanthanides להירגע למדינת הקרקע באמצעות שחרורו של פוטונים עם קצב דעיכה בטווח אלפית השנייה. בגלל הריקבון אינו הרפיה גופייה לגופייה ולא הרפיה שלישייה לגופייה, הפליטה של פוטונים לא יכולה כראוי להיקרא הקרינה או זרחני, אבל הוא יותר מכונה הארה 1 כראוי. הדעיכה של הארה lanthanide הארוכה מאוד עוזרת במדידות לכל החיים. מדידות חיים לאחר מכן ניתן להשתמש כדי לקבוע את יעילות באמצעות הקשר הבא: <img alt="משוואה 2" fo:content-width="1.2in" src="/files/ftp_upload/51895/51895eq2.jpg" width="120"> משוואה. 2 שם, E היא את היעילות של העברה, τ D הוא את חייו של התורם (lanthanide chelated) כאשר אינם משתתף בהעברת אנרגיה, וτ DA הוא את חייו של התורם בעת ההשתתפות בהעברת אנרגיה עם acceptor. עם LRET, DA τ יכול אלכך יימדד כחייו של פליטת acceptor רגיש משום שחייו של terbium הוא כל כך הרבה יותר גדול מfluorophore acceptor אורגני. Acceptor פולט עם אותו החיים כעירור (lanthanide התורם) ההסתה שלה, וכל תרומה לכל החיים מחי הקרינה הפנימית של acceptor עצמו היא יחסית זניחה. על ידי מדידת הפליטה רגישה ולא פליטת תורם, אנחנו גם מבטלים את הצורך להבטיח תיוג ב1 בדיוק: 1 יחס של תורם לacceptor. חלבון במקום יכול להיות מתויג בו זמנית עם שני acceptor וfluorophores תורם. אוכלוסיית שכותרת הטרוגני תגרום, אבל חלבוני שכותרתו כפול של תורם לא פולטים באורך גל acceptor וחלבוני שכותרתו הכפול acceptor לא יהיו נרגשים. יתר על כן, המרחק בין fluorophores צריך להיות זהה, ללא קשר לציסטאין אתר fluorophore ניתנו מתחבר ל, במיוחד בעת השימוש בlanthanides איזוטרופיים כתורם, כך לביתד כדי לציין אתר נתון לקבל גם התורם או acceptor הוא מיותר. עוצמת עשויה להיות מושפעת עם אוכלוסייה הטרוגנית, אבל עדיין צריכה להיות יותר מהדרוש כדי להתגלות. בעת תכנון ניסויים, הבחירה של fluorophores צריכה להיות מוכתבת על ידי ערך R 0 של הזוג, כמו גם את טווח המרחק הצפוי נמדדים. ערך R 0 מוגדר על ידי המשוואה הבאה: <img alt="משוואה 3" fo:content-width="2.5in" src="/files/ftp_upload/51895/51895eq3.jpg" width="250"> משוואה. 3 שבו, R 0 הוא הרדיוס פורסטר באנגסטרם, κ 2 הוא גורם האורינטציה בין שני הצבעים (בדרך כלל ההנחה היא להיות 2/3), φ D הוא התשואה הקוונטי של התורם, J היא החפיפה ספקטרלית נפרד בין התורם של ספקטרום פליטה וספקטרום הספיגה של acceptor בM - 1-1 סנטימטר 4 ננומטר, וn הוא מקדמת השבירה של המדיום 1. המעבדה שלנו הוסיפה שינוי לטכניקת LRET הקונבנציונלית על ידי החדרת אתר הכרת פרוטאז בין אתרי תווית תורם ונוטל על החלבון שנחקר. שינוי זה מאפשר לחקירה במערכות מטוהרת שאינן כגון תאי יונקים כל 7. טכניקה זו שימושית במיוחד בעת שימוש בcysteines כאתרים לתיוג, שכן בתהליך של תיוג עם צבעי maleimide מצומדות- אשר נקלטים על ידי קבוצות sulfhydryl ציסטאין, חלבונים אחרים בתאים שיש לי cysteines גם מסומנים. עם זאת, על ידי הכללת אתרי מחשוף פרוטאז על החלבון של עניין ומדידת תקופות חיים לפני ואחרי המחשוף, הנסיין יכול כמותית להחסיר אות הרקע לאחר מחשוף פרוטאז מאות הגלם. חיסור זה מבודד את האות הספציפית הנובעת מהחלבון של עניין (איוריור 2). באמצעות השינוי שתואר לעיל, LRET ניתן להשתמש כדי למדוד את מרחק שינויים בין תורם chelate terbium והבדיקה נוטלים על חלבון, וכך לעקוב אחר שינויי קונפורמציה במצב הפיזיולוגי הקרוב של החלבון ללא הדרישה לטיהור. <img alt="איור 1" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51895/51895fig1highres.jpg" width="500"> איור 1.The קליטה וספקטרום פליטה של terbium chelated בשחור, כמו גם acceptor נציג, Alexa 488, באדום. שים לב פסגות פליטה מרובות ומגוון החד, צר פליטה עבור כל שיא של chelate terbium. דפוס זה מאפשר לterbium לשימוש עם מגוון רחב של fluorophores acceptor ומאפשר המדידה של פליטה רגיש בתוך אלה טווחים בי terbium לא מראה פליטה. שיא הפליטה של ​​Terbium ב486 ננומטר חופף היטב עם שיא bsorption של Alexa 488, המאפשר העברת אנרגיית התהודה להתרחש בין שני fluorophores. אורך גל של 515 ננומטר הוא בחירה מצוינת לגילוי פליטה רגיש לזוג הזה כפי שהוא בעמק שבין פסגות פליטת terbium, ודי קרוב של Alexa 488 שיא פליטה של ​​520 ננומטר. שים לב כי ננומטר להיות ליד שיא acceptor, אם כי רצוי, אינו נדרש-565 הוא עדיין מסוגל לזהות פליטת Alexa 488 בלי גם גילוי פליטת terbium. <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="374" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr height="27"><td height="27" style="height:27px;width:147px;"> Acceptor Fluorophore </td><td style="width:45px;"> R 0 (א) </td><td style="width:183px;"> פליטת גל (ננומטר) </td></tr><tr height="23"><td height="23" style="height:23px;width:147px;"> Atto 465 </td><td align="right" style="width:45px;"> 36 </td>3px; "&gt; 508 </tr><tr height="22"><td height="22" style="height:22px;width:147px;"> והעמסת </td><td align="right" style="width:45px;"> 45 </td><td align="right" style="width:183px;"> 515 </td></tr><tr height="22"><td height="22" style="height:22px;width:147px;"> Alexa 488 </td><td align="right" style="width:45px;"> 46 </td><td align="right" style="width:183px;"> 515 </td></tr><tr height="22"><td height="22" style="height:22px;width:147px;"> Alexa 680 </td><td align="right" style="width:45px;"> 52 </td><td align="right" style="width:183px;"> 700 </td></tr><tr height="22"><td height="22" style="height:22px;width:147px;"> Alexa 594 </td><td align="right" style="width:45px;"> 53 </td><td align="right" style="width:183px;"> 630 </td></tr><tr height="22"><td height="22" style="height:22px;width:147px;"> Alexa 555 </td><td align="right" style="width:45px;"> 65 </td><td align="right" style="width:183px;"> 565 </td></tr><trheight height="22" style="height:22px;width:147px;"> Cy3 <td align="right" style="width:45px;"> 65 </td><td align="right" style="width:183px;"> 575 </td></trheight></tbody></table> טבלת 1 רשימה של fluorophores acceptor הנפוץ לLRET באמצעות chelate terbium כתורם 11. 0 ערכי R נמדדו כאשר התורם acceptor צורפו לתחום מחייב אגוניסט המסיס של קולטני AMPA. הוא אידיאלי כדי למדוד את ערך R 0 שוב לנחקרת כל מערכת חדשה. <img alt="איור 2" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51895/51895fig2highres.jpg" width="500"> איור 2 סקירה כללית של שיטת LRET הציגה. () קולטן AMPA הוא חלבון קרום שעובר שינויי קונפורמציה על הכריכה ליגנד. ליגנד דו בצורת הצדפהתחום nding הוא הקיף כאן באדום. (ב) תחום מחייב ליגנד של AMPA כאשר אינם מחויבת לחלבון קיים בקונפורמציה פתוחה (משמאל). כאשר חייב יגנד גלוטמט, החלבון סוגר סביב יגנד (מימין). על ידי הצבת fluorophores באתרים הראייתית על LBD, טיבו של שינוי קונפורמציה זו ניתן לראות את המרחק בין שינויי fluorophores, אז שישפיעו על כל החיים הקרינה. (ג) כאשר כל תאי תיוג, תיוג של שני החלבון של עניין, כמו גם חלבוני קרום רקע עלול להתרחש (משמאל). לאחר מחשוף פרוטאז, אות LRET מהחלבון של עניין תיעלם עקב השחרור של בר מסיס, עוזב אות רקע שלם (מימין). אות רקע אז זה יכול להיות מופחתים אות הגלם.

<table><tbody><tr><td>LanthaScreen Thiol תגובתי Tb Chelate</td><td>Life Technologies</td><td>PV3579</td><td></td></tr><tr><td>מקבל fluorophore-Fluorescein-5-Maleimide</td><td>Life Technologies&nbsp;</td><td>F-150</td><td>בחירת המקבל תלויה בניסוי הספציפי</td></tr><tr><td>Accept fluorophore-Alexa Fluor 488 C5 Maleimide</td><td>Life Technologies&nbsp;</td><td>A-10254</td><td>בחירת המקבל תלויה בניסוי הספציפי</td></tr><tr><td>Accept fluorophore-Alexa Fluor 555 C2 Maleimide</td><td>Life Technologies&nbsp;</td><td>A-20346</td><td>בחירת המקבל תלויה בניסוי הספציפי</td></tr><tr><td>Accept fluorophore-Alexa Fluor 594 C5 Maleimide</td><td>Life Technologies&nbsp;</td><td>A-10256</td><td>בחירת המקבל תלויה בניסוי הספציפי</td></tr><tr><td>Accept fluorophore-Alexa Fluor 680 C2 Maleimide</td><td>Life Technologies&nbsp;</td><td>A-20344</td><td>בחירת המקבל תלויה בניסוי הספציפי</td></tr><tr><td>QuantaMaster 3-SS</td><td>Photon Technology International</td><td></td><td>Spectrofluorometer היה צריך להיות עירור פועם עם היכולת למדוד תקופות חיים בטווח אלפיות השנייה</td></tr><tr><td>FluoreScan 2.0</td><td>Photon Technology International</td><td></td><td>Data Acquisition Software המשמשת בכתב היד. תוכנה המסופקת עם מכשיר פלואורסצנטי</td></tr><tr><td>Origin 8.6</td><td>OriginLab</td><td></td><td>Origin היא תוכנת ניתוח הנתונים המשמשת בפרוטוקול. יכול להשתמש בתוכנות ניתוח נתונים דומות אחרות</td></tr><tr><td>Quartz cuvette</td><td>Starna Cells, Inc</td><td>3-Q-10</td><td></td></tr><tr><td>Stir bar&nbsp;</td><td>מוצרי בל-ארט</td><td>F37119-0007</td><td>משמש בקובט כדי לשמור על תאים בתרחיף. יכול להשתמש בכל מוט ערבוב שמתאים לקובט</td></tr></tbody></table>

הארה תהודת אנרגיה העבר לחקר שינויי קונפורמציה בחלבונים בממברנה שבאו לידי ביטוי בתאי יונקים

Luminescence Resonance Energy Transfer to Study Conformational Changes in Membrane Proteins Expressed in Mammalian Cells

העברת הארה תהודת אנרגיה, או LRET, היא טכניקה רבת עוצמה המשמשת למדידת מרחקים בין שני אתרים בחלבונים בטווח המרחק של 10-100 א. על ידי מדידת המרחקים בתנאי ligated שונים, שינויי קונפורמציה של החלבונים ניתן להעריך בקלות. עם LRET, lanthanide, terbium לרוב chelated, משמש כfluorophore התורם, מעניק יתרונות כגון חיים ארוכים יותר תורמות בלבד פליטה, את הגמישות להשתמש fluorophores acceptor מרובה, ואת ההזדמנות כדי לזהות פליטת acceptor רגיש כדרך קלה כדי למדוד העברת אנרגיה ללא הסיכון של גם איתור אות תורם בלבד. כאן, אנו מתארים שיטה לשימוש LRET על חלבוני קרום הביע וassayed על פני השטח של תאי יונקים ללא פגע. אנחנו מציגים את אתר מחשוף פרוטאז בין זוג fluorophore LRET. לאחר קבלת אות LRET המקורית, מחשוף באתר זה מסיר את אות LRET הספציפי מהחלבון שלעניין ומאפשר לנו להפחית את אות הרקע שנשארה לאחר מחשוף כמותית. שיטה זו מאפשרת ליותר מבחינה פיזיולוגית מדידות רלוונטיות להתבצע ללא הצורך בטיהור של חלבון.

מדידה LRET מוצלחת עם תורם lanthanide צריכה תורם חיים רק בטווח הזמן אלפית השנייה. חיים שלמים של פליטת LRET רגיש לחלבון שכותרתו עם התורם וacceptor יהיו בעיקר קצרים יותר, עם חיים בטווח המיקרו לאחר חיסור רקע איור 3. פרוטאז תוצאות מחשוף בגידול בחיים שצריכות להיות יציבים לאורך זמן ( כלומר שינוי כבר לא), שהראה כי מחשוף פרוטאז הוא איור שלם 4. אם אות LRET מגיע מרק סט אחד של אתרים, לכל החיים וכתוצאה מכך הפליטה לאחר הפחתת הרקע צריכי...

אנו מתארים כאן שיטת ההעברה השתפרה הארת תהודת אנרגיה (LRET) שבו אנחנו מציגים את אתר מחשוף פרוטאז בין אתרי fluorophore תורם acceptor. שינוי זה מאפשר לנו להשיג אותות LRET ספציפיים הנובעים מחלבונים קרום של עניין, המאפשרים המחקר של חלבונים בממברנה ללא טיהור חלבון.

Luminescence Resonance Energy Transfer, or LRET, is a powerful technique used to measure distances between two sites in proteins within the distance range ...

המטרה הכוללת של הניסוי הבא היא למדוד את השינויים המאשרים בחלבוני הממברנה במצבם הפיזיולוגי. זה מושג על ידי תיוג ספציפי לאתר של חלבוני ממברנה כדי למדוד את אורך חיי ה-LRE שלהם, ובכך את המרחק בין שני האתרים. כשלב שני, מתווסף ליגנד הגורם לשינוי אישור שניתן למדוד.לאחר מכן, מוסיפים את הפרוטאז המתאים כדי לבקע את אחת מארבע הקומות ולקבל את אות הרקע. בסופו של דבר, ניתן למדוד את השינוי באורך החיים הקרינה מהעברת האנרגיה של התושבים שנוצרו כדי למדוד את השינויים המאשרים המתרחשים במבנה החלבון. היתרון העיקרי של טכניקה זו על פני שיטות קיימות כמו X אקסטרה קריסטלוגרפיה, הוא שבשיטה זו אנו יכולים למדוד את השינויים הדינמיים של חלבונים במצבם הפיזיולוגי.למרות ששיטה זו יכולה לספק תובנות לגבי קולטני לידה אינוטרופיים או תעלות יונים של חישת אסאי, ניתן ליישם אותה גם על סוגים אחרים של חלבונים כמו קולטני NICO. אנו הולכים להראות את הטכניקה של זוהר ומתח והעברת אנרגיה, במיוחד בהקשר של חקר שינויים מאשרים של חלבוני ממברנה בתאי יונקים. התלמידים שלי, דינו וסווארה סוואמי, ידגימו את ההליך לפני תחילת הניסוי.חשוב לבחור אתרי תיוג המסוגלים לשקף את השינויים הקונפורמטיביים האפשריים בתוך החלבון. במידת האפשר, השתמש במבנה גבישי של החלבון או של חלבון הומולוגי כדי לסייע בקביעה זו. בחר שאריות כך שהשרשראות הצדדיות של השאריות שנבחרו יהיו חשופות לפני השטח ונגישות לארבע הפלואור, כך שניתן יהיה לסמן את החלבון.כלול אתר מחשוף פרוטאז שיכול לבקע באופן ספציפי את אחד הציסטינים מהחלבון אם רצף החלבון מאפשר זאת. הציגו אתר על ידי מוטציה שמרנית של החלבון כך שיהיה לו תרומבין או פקטור 10, רצף ליד הציסטין שהוכנס ונגיש למחשוף פרוטאז. בחר אתר כך שעם המחשוף אחד הציסטינים שהוכנסו יתנתק משאר החלבון.במקרים מסוימים, זה עשוי לדרוש שני אתרי מחשוף לצד ציסטין שעבר מוטציה. בחר את ארבע הקומות על סמך טווח המרחק הצפוי הנמדד, כך שהטווח הוא בין 0.5 לאחד כפול אפס R של זוג ארבע הקומות. זה מאפשר חיסור קל יותר של הרקע, שבדרך כלל יש לו אורך חיים ארוך בהרבה לטווח של כ-35 אנגסטרומים וזוג קומה ארבע מתאים יהיה tur chelate כתורם ואלקסה 5 94 כמקבל עם R אפס של 53 אנגסטרומים.לאחר בחירת החלבון המעניין, נתק את תאי ה-HEK על ידי פיפטינג בתחתית המנה. לאחר מכן סובב את התאים והשהה מחדש את הגלולה בשלושה מיליליטר של מאגר חוץ-תאי. לאחר מכן, דגרו על התאים בתורם וקבלו את רצפתם.ארבע בכמויות שוות ערך עד לריכוז סופי של 100 עד 300 ננו-מולרי על מסובב למשך שעה בטמפרטורת החדר. לאחר התיוג, שטפו את התאים שלוש עד ארבע פעמים עם מאגר חוץ-תאי כדי להסיר כל פלואור לא קשור ולהשעות מחדש את הגלולה בשני מיליליטר של מאגר חוץ-תאי טרי. כדי למדוד את ה-lre של התאים, העבירו את תרחיף התא לתוך קוורץ עם נפח מינימלי של מיליליטר אחד, והגדירו את אורך גל העירור של הספקטרומטר הפוטו-לומינסנט לטווח הספיגה של התורם פלואורו ארבע.הגדר את אורך גל הפליטה בהתאם. לאחר מכן הגדר את אורך זיהוי הפליטה לפחות פי שלושה מאורך החיים הצפוי של LRE כדי להבטיח שרכיב בעל אורך חיים ארוך לא יתפספס ובצע לפחות שלוש סריקות של 99 סריקות כדי להבטיח תוצאות עקביות. שמור את התוצאות כקובץ טקסט, ולאחר מכן למדוד את השינויים המאשרים של חלבון בתגובה להוספת ליגנד.הוסף את הליגנד ובצע לפחות שלוש סריקות של 99 סריקות כל אחת על אותה דגימה בתנאי חדש זה. לאחר מכן הוסיפו עד חמש יחידות של הפרוטאז המתאים. סריקה רציפה עד להשלמת המחשוף ולא נראה שינוי נוסף במהלך החיים במשך שלוש סריקות רצופות, כשעתיים-שלוש לניתוח נתוני ה-LRE.התחל בהגדרת הערכים הממוצעים כגרף קו עם עוצמת הקרינה על ציר Y ואורך החיים במיקרו-שניות על ציר x כדי ליצור עקומה המייצגת את אורך החיים של הפליטה הרגישה של המקבל. שנה את ציר ה-Y של העלילה לסולם לוג. לאחר מכן, תחת תפריט העלילה, פתח את תיבת הדו-שיח של בקרת השכבות והעבר את הנתונים המכילים את ממוצע הרקע לרשימת תוכן השכבה.לאחר מכן, תחת תפריט המתמטיקה, השתמש בפונקציה המתמטית הפשוטה כדי להכפיל או לחלק את נתוני הרקע לפי הצורך עד שקצה הזנב של הרקע חופף לקצה הזנב של הנתונים הגולמיים, ומשאיר את אות הרקע נוכח לפני ואחרי מחשוף החלבון. לאחר מכן השתמש שוב בפונקציה המתמטית הפשוטה כדי להחסיר את אות הרקע המיושר מאות ה-LRE הגולמי הראשוני ולהתאים את הנתונים לדעיכה מעריכית. הגדר את גבול ההתחלה להתאמה שתתחיל לאחר סיום דופק הלייזר.לאחר מכן, בתיבת הדו-שיח בחירת פונקציית התאמה, בחר דעיכה מעריכית כך שתתאים את משך החיים למשוואה עבור דעיכה מעריכית יחידה. כאשר Y מייצג את עוצמת הקרינה, Y אפס מייצג את עוצמת הרקע עקב רעש מהמערכת. A אחד הוא עוצמת האות, T הוא אורך החיים הקרינה, X הוא הזמן, ו-X אפס הוא היסט הזמן.לבסוף, תקן X אפס לאפס. הפעל את פונקציית ההתאמה והתאם את הנתונים באמצעות משכי החיים המתקבלים מהנתונים. השתמש במשוואת היערנות כדי לחשב את המרחק בין ארבע הקומות.מדידת LRE מוצלחת עם תורם להאן צריכה להיות בעלת אורך חיים של תורם בלבד בטווח הזמן של אלפית השנייה. בעת מדידת שינויים מאשרים, אות ה-LRE הספציפי צריך להראות שינוי באורך החיים מחוץ לשגיאת המדידה, אשר לאחר מכן ניתן לחשב על ידי התפשטות השגיאות הקשורות להתאמת תקופות החיים. אורך החיים של פליטת LRE רגישה עבור החלבון המסומן הן אצל התורם והן אצל המקבל יהיה קצר משמעותית עם אורך חיים בטווח אלפיות השנייה.לאחר רקע, חיסור, מחשוף פרוטאז מביא לעלייה באורך החיים שאמורה להיות יציבה עם הזמן, מה שמעיד על כך שמחשוף הפרוטאז הושלם. אם אות ה-LRE מגיע מקבוצה אחת בלבד של אתרים, אורך חיי הפליטה המתקבל לאחר חיסור הרקע אמור לתת אורך חיים אקספוננציאלי יחיד. לאחר שליטה, ניתן להשלים טכניקה זו תוך ארבע עד חמש שעות אם מבוצעת כראוי.בזמן ניסיון הליך זה, חשוב לעקוב אחר הפרמטרים, אורכי הגל ומהירות הסטרואידים לאחר פיתוחו. טכניקה זו סללה את הדרך לחקר שינויים קונפורמטיביים בחלבוני הממברנה במצבם הנוירופיזיולוגי.

luminescence-resonance-energy-transfer-to-study-conformational

Research

JoVE Journal

Bioengineering

הנדסה ביולוגית

נתאר שיטה אשר מודד את קינטיקה של תחבורה יון של חלבונים בממברנה לצד ניתוח אתר ספציפי של שינויים קונפורמציה באמצעות הקרינה על תאים בודדים. טכניקה זו ניתנת להתאמה תעלות יונים, מובילי משאבות יונים יכול להיות מנוצל כדי לקבוע מגבלות המרחק בין יחידות משנה חלבון.

בחינת Dynamics קונפורמציה של חלבונים בממברנה באתרו עם תיוג, האתר מכוון פלואורסצנטי

אנו מתארים את גישות ההדמיה אנו משתמשים כדי לחקור את ההפצה וניידות של חלבוני ניאון transfected תושב בreticulum endoplasmic (ER) באמצעות confocal ההדמיה של תאי חיים. אנחנו גם ultrastructurally לנתח את ההשפעה של הביטוי שלהם על הארכיטקטורה של תא subcellular זה.

ויזואליזציה של תחומי משנה reticulum endoplasmic בתאים בתרבית

אינטראקציות בין החלבונים הן יסוד לכל התהליכים התאיים. באמצעות העברת פליטת אור התהודה אנרגיה, את האינטראקציה בין זוג החלבונים יכולה להיות במעקב בתאים חיים ובזמן אמת. יתר על כן, ההשפעות של מוטציות שעלולים להיות פתוגניים ניתן להעריך.

חוקר חלבונים אינטראקציות בתאים חיים באמצעות העברת פליטת אור התהודה אנרגיה

אנו מתארים טכניקה למדידה בו-זמנית של קינטיקה של קשירת קולטן-ליגנד יחיד מווסתת כוח והדמיה בזמן אמת של איתות סידן בלימפוציט T יחיד.

הקרינה Biomembrane חיל Probe: Quantitation במקביל של קינטיקס קולטן ליגנד ומושרה כריכת איתות תאיים בתא בודד

תיוג תחום תאי של חלבון הממברנה עם fluorophore pH רגיש, superecliptic pHluorin (ספטמבר), מאפשר לוקליזציה, ביטוי subcellular, וסחר שייקבע. הדמיה ספטמבר- שכותרתו חלבונים עם מיקרוסקופ פלואורסצנטי השתקפות פנימית מוחלטת (TIRFM) מאפשרת כימות של רמות חלבון בקרום ER ו פלזמה הפריפריה.

ניצול רצפטורים-tagged pHluorin לפקח subcellular לוקליזציה וסחר

אינטראקציות חלבון-חלבון קריטי עבור מערכות ביולוגיות, מחקרים של קינטיקה איגוד לספק תובנות הדינמיקה והתפקוד של מתחמי חלבון. אנו מתארים שיטה מכמת את הפרמטרים קינטי של חלבון מורכב באמצעות קרינה פלואורסצנטית והעברת אנרגיה תהודה הטכניקה זרימה עצר.

שימוש בהעברת אנרגיה פלורסצנטיות תהודה חוץ גופית ללמוד את הדינמיקה של חלבון מתחמי בקנה מידה הזמן אלפיות השנייה

העברת אנרגיה פלואורסצנטית של מולקולה בודדת היא שיטה העוקבת אחר הדינמיקה של ה- tRNA במהלך סינתזת חלבונים ריבוזומליים. על ידי מעקב אחר ריבוזומים בודדים, זוהו אוכלוסיות לאהומוגניות, אשר שופכים אור על מנגנונים. שיטה זו יכולה לשמש כדי לעקוב אחר שינויים קונפורמציה ביולוגית באופן כללי כדי לחשוף קשרי גומלין דינמיים-פונקציה במערכות ביולוגיות מורכבות רבות אחרות. שיטות מולקולה בודדת יכולות לבחון צעדים מגבילים שאינם בקצב ומתווכים מרכזיים מאוכלסים נמוך, שאינם נגישים בשיטות הרכב קונבנציונליות בשל האפקט...

מולקולה בודדת פלואורסצנטית העברת אנרגיה מחקר של סינתזת חלבון ריבוזום

אנו מציגים תהליך עבודה ניסיוני של פרוטוקול וניתוח נתונים לביצוע פלואורסצנטיות צולבת של תאים חיים (FCCS) בשילוב עם העברת אנרגיה תהודה של Förster (FRET) כדי לחקור דינמיקה של קולטני ממברנה בתאים חיים באמצעות טכניקות תיוג פלואורסצנטיות מודרניות.

ספקטרוסקופיית פלואורסצנטיות כפולה לחקר אינטראקציה בין חלבון לחלבון ודינמיקת חלבונים בתאים חיים

המחקר מפרט את המתודולוגיה של מיפוי FRET כולל בחירת אתרי תיוג, בחירת צבעים, רכישה וניתוח נתונים. מתודולוגיה זו יעילה בקביעת אתרי קשירה, שינויים קונפורמיים ותנועות דינמיות במערכות חלבונים, והיא שימושית ביותר אם היא מבוצעת בשילוב עם מידע מבני תלת-ממדי קיים.

מיפוי העברת אנרגיית תהודה של Förster: מתודולוגיה חדשה להבהרת תכונות מבניות גלובליות

מחקר זה מציג הליך מפורט לביצוע ניסויים של העברת אנרגיה בתהודה פלואורסצנטית של מולקולה בודדת (smFRET) על קולטנים מצומדים לחלבון G (GPCRs) באמצעות תיוג ספציפי לאתר באמצעות שילוב חומצות אמינו לא טבעיות (UAA). הפרוטוקול מספק מדריך שלב אחר שלב להכנת דגימות smFRET, ניסויים וניתוח נתונים.

הדמיה של הדינמיקה הקונפורמציונית של קולטני ממברנה באמצעות FRET של מולקולה בודדת

פרוטוקול זה מתאר בדיקה מבוססת BRET למדידת האינטראקציות של קינאז CRAF עם 14-3-3 חלבונים בתאים חיים. הפרוטוקול מתאר שלבים להכנת התאים, קריאת פליטות BRET וניתוח נתונים. מוצגת גם תוצאה לדוגמה עם זיהוי בקרות מתאימות ופתרון בעיות עבור מיטוב מבחן.

Bioluminescence Resonance Energy Transfer (BRET) - בדיקה מבוססת למדידת אינטראקציות של CRAF עם 14-3-3 חלבונים בתאים חיים

למד שיטת LRET משופרת לחקר שינויי קונפורמציה בחלבוני ממברנה בתאי יונקים. השיטה מאפשרת מדידה בזמן אמת ללא צורך בטיהור החלבונים מראש.

הארה תהודת אנרגיה העבר לחקר שינויי קונפורמציה בחלבונים בממברנה שבאו לידי ביטוי בתאי יונקים

גלה סרטונים נוספים