Name: הכנת Synaptic פלזמה ממברנה וחלבוני צפיפות Postsynaptic באמצעות שיפוע סוכרוז רציף (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-09-03T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 6 s
Description: למד שיטת הפרדה תת-תאית של רקמת מוח באמצעות שיפוע סוכרוז רציף לאנריץ' חלבוני ממברנה סינפטית וצפיפות פוסט-סינפטית. טכניקה זו מאפשרת ניתוח שינויים ברמות חלבונים סינפטיים באמצעות Western blot ומספקת בסיס למחקר תפקוד עצבי.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

המחברים מודים לד"ר מייק אהלרס ולחברי המעבדה שלו על שהדגימו במקור את הפרוטוקול לפיצול תת-תאי של ממברנות פלזמה סינפטיות. אנו מודים גם לוונדי הורספול על ניהול מושבות העכברים. עבודה זו נתמכה על ידי מענקי תפעול מ-CIHR (AJR ו-AS).

הפרוטוקול הבא תואם את ההנחיות של המועצה הקנדית לטיפול בבעלי חיים ואושר על ידי הפקולטה לרפואה וטיפול בבעלי חיים ועדת רוקחות באוניברסיטת טורונטו. .1 הכינו חובה ריאגנטים כפי שהיא מתוארת בטבלה 1 <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוספת פרוטאז וphosphatase (במידת צורך) מעכבים לכל פתרונות, מאגרי סוכרוז וDDH 2 O בריכוזים המפורטים בטבלה 1. חשוב: בצע את כל השלבים על 4 מעלות צלזיוס וטרום מגניב כל חומרים כימיים והציוד לפני תחילת הניסוי. לייבל כל הצינורות, כולל צינורות ultracentrifuge, עם סמן קבוע. </li></ol> .2 Dissection של מוח האזור המתאים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להקריב בעלי החיים על ידי עקירה או עריפת ראש בצוואר הרחם. בית ולהרדים חיות בהתאם למדיניות מוסדית וממשלתית בטיפול בבעלי חיים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מהירות להסיר את המוח דואר מהגולגולת ומניחים על בלוק נתיחה מצונן. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לנתח את האזור במוח המתאים מרקמות טריות והמשך לשלב 3. </li></ol> Homogenization רקמות .3 עם זכוכית הטפלון Homogenizer מנוע מונע <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הנח 50-100 מ&quot;ג (לSPM), או 100-200 מ&quot;ג (לPSD) של הרקמה גזור בצינור פוליפרופילן 13 מ&quot;ל שכותרת המכיל 4 מ&quot;ל של תמיסת סוכרוז 0.32 HEPES שנאגר M. להעביר את המדגם למטחנה / homogenizer רקמת זכוכית טפלון מחודד 15 מ&quot;ל, להגדיר את כונן מנוע ל900 סל&quot;ד (הגדרת 7) וhomogenize המדגם עם 12 משיכות במשך תקופה 30 שניות. השתמש homogenizer זכוכית טפלון שונה בין דגימות, או לשטוף את homogenizer עם מים מזוקקים קרים בין דגימות ולנגב יבשים עם Kimwipe. הערה: עד 4 גרם של רקמה ניתן הומוגני ב4 מ&quot;ל של תמיסת סוכרוז 0.32 HEPES שנאגר M, עם זאת רצוי להשתמש בפחות רקמה כדי להבטיח חלוקה נכונה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העבר את המדגם הומוגני בחזרה to באותו צינור פוליפרופילן 13 מ&quot;ל. מילואים של homogenate וחנות 100 μl ב-80 ° C לכימות חלבון שלאחר מכן וניתוח כתם מערבי בסך הכל חלק קטן חלבון. </li></ol> .4 מהירות נמוכה צנטריפוגה להסיר חלק הגרעיני (תשואות Supernatant S1) <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צנטריפוגה homogenate בהרוטור זווית קבועה ב900 XG 10 דקות ב 4 ° C. מעבירים את supernatant (S1) לחדש, שכותרתו 13 צינור מ&quot;ל וresuspend גלולה שבריר הגרעיני (P1) ב500 μl של 0.32 סוכרוז HEPES שנאגר M. הערה: החלק (P1) יכול להיות מאוחסן על -80 מעלות צלזיוס ומשמש לניתוח כתם מערבי של השבר הגרעיני. </li></ol> .5 העשרה של חלק הגולמי Synaptosomal (תשואות גלולה P2) <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צנטריפוגה supernatant (S1) ב 10,000 XG במשך 15 דקות ב 4 ° C.. הסר את supernatant (S2) ובמילואים 500 μl בצינור microcentrifuge לאחסן ב-80 ° C לקוואנט חלבון שלאחר מכןification וניתוח כתם מערבי של cytosolic / חלק קרום האור. Resuspend גלולה שנותר synaptosomal הגולמי שבריר (P2) ב1 מ&quot;ל של תמיסת סוכרוז HEPES שנאגר 0.32 M ולאחר מכן להוסיף עוד פתרון סוכרוז HEPES שנאגר 3 מ&quot;ל של 0.32 M. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צנטריפוגה ב g x 10,000 ל15 דקות ב 4 ° C.. הסר את supernatant (S2 &#39;) וμl 500 מילואים בצינור microcentrifuge לאחסן ב-80 ° C לכימות חלבון שלאחר מכן וניתוח כתם המערבי של cytosolic / חלק קרום האור. להציל את כדור synaptosomal הגולמי שטף (P2 &#39;) בצינור פוליפרופילן. </li></ol> .6 Lysing (Hypoosmotic הלם) של חלק הגולמי Synaptosomal <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Lyse גלולה synaptosomal הגולמי (P2 &#39;) בצינור פוליפרופילן על ידי resuspending זה ב 1 מ&quot;ל של DDH 2 O. להוסיף עוד 3 מ&quot;ל של DDH 2 O, להעביר לhomogenizer רקמת זכוכית טפלון, וhomogenize ביד עם 3 משיכות. הערה: חשובלבצע שלב זה במהירות אפשרית ובמהירות המשך לשלב 6.2. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העברת דגימות מhomogenizer בחזרה לתוך צינור פוליפרופילן 13 מ&quot;ל ובמהירות להתאים את המדגם חזרה ל4 HEPES מ&quot;מ עם 16 μl של 1 פתרון M HEPES, להפוך לערבב. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> סובב דגימות על 4 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות כדי להבטיח lysing מלא. </li></ol> .7 העשרה של חלק Synaptosomal ממברנה (P3) <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צנטריפוגה ב g x 25,000 עבור 20 דקות ב 4 ° C.. הסר את supernatant הגולמי לפוחי שבריר (S3) ולהזמין אותו בצינור 5 מ&quot;ל לאחסון ב-80 ° C לכימות חלבון שלאחר מכן וניתוח כתם מערבי. Resuspend חלק קרום synaptosomal (P3) ב 1 מ&quot;ל של תמיסת סוכרוז 0.32 HEPES שנאגר M. </li></ol> .8 הכנת רציף סוכרוז Gradient <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Pipet בדיוק 3.5 מ&quot;ל של תמיסת סוכרוז HEPES שנאגר 1.2 M ובדיוק 3.0 מ&quot;ל כל אחד מ1.0 M ו0.8 M HEPEתמיסת סוכרוז נאגר S לתוך נפרד 6 מ&quot;ל הצמד צינורות כובע. הערה: זה נעשה מראש למדוד את ההיקפים של המאגרים הנמצאים בשימוש על מנת להפוך את שיפוע סוכרוז. מדידה מדויקת של הכמויות חשוב לוודא שהשיפועים וכתוצאה מכך יהיו מאוזנת לultracentrifugation. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> באמצעות pipet פסטר זכוכית ונורה, להעביר 1.2 M-נאגר HEPES תמיסת סוכרוז ל12 מ&quot;ל צינור ultracentrifuge polyallomer. שכבה בזהירות את תמיסת סוכרוז HEPES שנאגר 1.0 M על גבי תמיסת סוכרוז HEPES שנאגר 1.2 M. לבסוף, שכבת תמיסת סוכרוז HEPES שנאגר 0.8 M על גבי תמיסת סוכרוז HEPES שנאגר 1.0 M. השתמש pipet פסטר טרי עבור כל תמיסת סוכרוז ודואג שלא להפריע את שיפוע סוכרוז. תנודות ממערבולת ספסל או microcentrifuge יפריעו את השלמות של השיפוע. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> באמצעות pipet פסטר, שכבת שבריר synaptosomal resuspended הקרום (P3) על גבי שיפוע סוכרוז רציף מוכן.ודא שההדרגות מאוזנת במשקלם בתוך הדלי של הרוטור דלי מתנדנד. אם הדליים אינם מאוזנים, להשתמש pipet P200 להוסיף בזהירות 0.32 סוכרוז HEPES שנאגר M לחלק העליון של השיפוע ולאזן את דליי הרוטור. </li></ol> .9 פלזמה של Synaptic פלזמה ממברנה (SPM) <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Ultracentrifuge ברוטור מתנדנד דלי ב150,000 XG לשעה 2 ב 4 ° C.. מוציא בזהירות את שיפועי סוכרוז מדליי ultracentrifuge. באמצעות מחט G 18 ומזרק 1 מ&quot;ל, לנקב את הצינור בחלק התחתון של שלבי הביניים פתרון סוכרוז HEPES שנאגר 1.0 M / M 1.2 ולמשוך את השכבה הסינפטית קרום פלזמה (SPM). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> רשום לעצמך את עוצמת הקול שכל דגימת SPM תופסת במזרק 1 מ&quot;ל. מניחים את שכבת SPM שנאסף בצינורות ultracentrifuge עבה קיר 3.5 מ&quot;ל, להוסיף בדיוק 2.5 כרכים של 4 HEPES מ&quot;מ כדי להתאים את ריכוז סוכרוז מ1.2 M ל0.32 מ &#39;ברגע שכל דגימה הייתה להתאיםed ל0.32 M סוכרוז, לאזן את הצינורות עם 0.32 תמיסת סוכרוז HEPES שנאגר M. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Ultracentrifuge בהרוטור זווית קבוע ב200,000 XG ל30 דקות ב 4 ° C. להסיר ולסלק supernatant. Resuspend גלולה קרום פלזמה הסינפטי (SPM) ב300 μl של 50 פתרון HEPES מ&quot;מ / 2 מ&quot;מ EDTA. דגימות חנות ב -80 ° C עד המשמשות למערביות סופג. </li></ol> 10. הכנת חלק צפיפות Postsynaptic (PSD) <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להפשיר דגימות SPM על קרח. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בצע פתרון של 0.54% טריטון X-100 ב50 פתרון HEPES מ&quot;מ / 2 מ&quot;מ EDTA. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בצינור 5 מ&quot;ל קלקר, לשלב 2.7 מ&quot;ל של-100 X / שבריר טריטון HEPES / פתרון EDTA ו300 μl SPM ולסובב את המדגם עבור 15 דקות ב 4 ° C </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העברת דגימות ל3.5 מ&quot;ל צינורות ultracentrifuge עבה קיר ודגימות צנטריפוגות ב XG 32,000 עבור 20 דקות ב 4 ° C.. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שומרים לעצמנו את supernatant (טריטון X-100 חלק מסיס [TS]) ולאחסן ב -80; ° C. הערה: בשלב זה, את הכדור מייצג את החלק היחסי &quot;PSD-1T&quot;. טיפול שני עם חומר ניקוי יהיה לייצר חלק &quot;PSD-2T&quot;. אם חלק PSD-1T הוא רצוי, המשך לשלב 10.6. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי לייצר חלק PSD-2T, resuspend גלולה ב 3 מ&quot;ל של .0.5% טריטון X-100 ב50 HEPES מ&quot;מ / 2 פתרון mM EDTA. סובב דגימות ל15 דקות ב 4 ° C.. צנטריפוגה דגימות 32,000 XG ל20 דקות ב 4 ° C והמשיכו לשלב 10.6. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בטל supernatant וresuspend גלולה postsynaptic (PSD) ב50 פתרון HEPES מ&quot;מ / 2 מ&quot;מ EDTA. הערה: resuspension הנפח עשוי להיות תלוי בגודל של גלולה; נפח של 50-75 μl מומלץ. בגלל חלק PSD הוא חלק חומר ניקוי מסיס, זה לעתים קרובות יש צורך להוסיף 1-2 μl של .0.5% SDS כדי לאפשר resuspension של חלבון מלא. דגימות חנות ב -80 ° C עד המשמשות למערביות סופג. </li></ol>

<ol><li>Delint-Ramirez, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+composition+of+NMDA+receptor+signaling+complexes+differs+between+membrane+subdomains+and+is+modulated+by+PSD-95+and+PSD-93%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Neuroscience+%3A+the+Official+Journal+of+the+Society+for+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">In vivo composition of NMDA receptor signaling complexes differs between membrane subdomains and is modulated by PSD-95 and PSD-93.</a> The Journal of Neuroscience : the Official Journal of the Society for Neuroscience. 30, 8162-8170 (2010).</li>
<li>Wang, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+psychiatric+disease+risk+factors+DISC1+and+TNIK+interact+to+regulate+synapse+composition+and+function%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Psychiatry%22%5BJournal%5D)">The psychiatric disease risk factors DISC1 and TNIK interact to regulate synapse composition and function.</a> Mol Psychiatry. 16, (2010).</li>
<li>Ehlers, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reinsertion+or+degradation+of+AMPA+receptors+determined+by+activity-dependent+endocytic+sorting%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Reinsertion or degradation of AMPA receptors determined by activity-dependent endocytic sorting.</a> Neuron. 28, 511-525 (2000).</li>
<li>Tomita, S., Fukata, M., Nicoll, R. A., Bredt, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamic+interaction+of+stargazin-like+TARPs+with+cycling+AMPA+receptors+at+synapses%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Dynamic interaction of stargazin-like TARPs with cycling AMPA receptors at synapses.</a> Science. 303, 1508-1511 (2004).</li>
<li>Ehlers, M. D., Heine, M., Groc, L., Lee, M. C., Choquet, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diffusional+trapping+of+GluR1+AMPA+receptors+by+input-specific+synaptic+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Diffusional trapping of GluR1 AMPA receptors by input-specific synaptic activity.</a> Neuron. 54, 447-460 (2007).</li>
<li>Bats, C., Groc, L., Choquet, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+interaction+between+Stargazin+and+PSD-95+regulates+AMPA+receptor+surface+trafficking%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">The interaction between Stargazin and PSD-95 regulates AMPA receptor surface trafficking.</a> Neuron. 53, 719-734 (2007).</li>
<li>Ehlers, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Activity+level+controls+postsynaptic+composition+and+signaling+via+the+ubiquitin-proteasome+system%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Activity level controls postsynaptic composition and signaling via the ubiquitin-proteasome system.</a> Nat Neurosci. 6, 231-242 (2003).</li>
<li>Cartier, E. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+biochemical+and+functional+protein+complex+involving+dopamine+synthesis+and+transport+into+synaptic+vesicles%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">A biochemical and functional protein complex involving dopamine synthesis and transport into synaptic vesicles.</a> J Biol Chem. 285, 1957-1966 (2010).</li>
<li>Rodriguez de Lores, A., Alberici, M., De Robertis, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ultrastructural+and+enzymic+studies+of+cholinergic+and+non-cholinergic+synaptic+membranes+isolated+from+brain+cortex%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neurochemistry%22%5BJournal%5D)">Ultrastructural and enzymic studies of cholinergic and non-cholinergic synaptic membranes isolated from brain cortex.</a> Journal of Neurochemistry. 14, 215-225 (1967).</li>
<li>Gray, E. G., Whittaker, V. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+isolation+of+nerve+endings+from+brain%3A+an+electron-microscopic+study+of+cell+fragments+derived+by+homogenization+and+centrifugation%5BTitle%5D)+AND+%22J+Anat%22%5BJournal%5D)">The isolation of nerve endings from brain: an electron-microscopic study of cell fragments derived by homogenization and centrifugation.</a> J Anat. 96, 79-88 (1962).</li>
<li>Cotman, C. W., Taylor, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+structural+studies+on+synaptic+complexes+from+rat+brain%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Isolation and structural studies on synaptic complexes from rat brain.</a> J Cell Biol. 55, 696-711 (1972).</li>
<li>Cotman, C. W., Banker, G., Churchill, L., Taylor, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+postsynaptic+densities+from+rat+brain%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Isolation of postsynaptic densities from rat brain.</a> The Journal of Cell Biology. 63, 441-455 (1974).</li>
<li>Carlin, R. K., Grab, D. J., Cohen, R. S., Siekevitz, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+characterization+of+postsynaptic+densities+from+various+brain+regions%3A+enrichment+of+different+types+of+postsynaptic+densities%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Isolation and characterization of postsynaptic densities from various brain regions: enrichment of different types of postsynaptic densities.</a> The Journal of Cell Biology. 86, 831-845 (1980).</li>
<li>Jones, D. H., Matus, A. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+synaptic+plasma+membrane+from+brain+by+combined+flotation-sedimentation+density+gradient+centrifugation%5BTitle%5D)+AND+%22Biochim+Biophys+Acta%22%5BJournal%5D)">Isolation of synaptic plasma membrane from brain by combined flotation-sedimentation density gradient centrifugation.</a> Biochim Biophys Acta. 356, 276-287 (1974).</li>
<li>Kennedy, M. B., Bennett, M. K., Erondu, N. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biochemical+and+immunochemical+evidence+that+the+%22major+postsynaptic+density+protein%22+is+a+subunit+of+a+calmodulin-dependent+protein+kinase%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Biochemical and immunochemical evidence that the "major postsynaptic density protein" is a subunit of a calmodulin-dependent protein kinase.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 80, 7357-7361 (1983).</li>
<li>Moon, I. S., Apperson, M. L., Kennedy, M. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+major+tyrosine-phosphorylated+protein+in+the+postsynaptic+density+fraction+is+N-methyl-D-aspartate+receptor+subunit+2B%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">The major tyrosine-phosphorylated protein in the postsynaptic density fraction is N-methyl-D-aspartate receptor subunit 2B.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 91, 3954-3958 (1994).</li>
<li>Cho, K. O., Hunt, C. A., Kennedy, M. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+rat+brain+postsynaptic+density+fraction+contains+a+homolog+of+the+Drosophila+discs-large+tumor+suppressor+protein%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">The rat brain postsynaptic density fraction contains a homolog of the Drosophila discs-large tumor suppressor protein.</a> Neuron. 9, 929-942 (1992).</li>
<li>Salahpour, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Increased+amphetamine-induced+hyperactivity+and+reward+in+mice+overexpressing+the+dopamine+transporter%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Increased amphetamine-induced hyperactivity and reward in mice overexpressing the dopamine transporter.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 105, 4405-4410 (2008).</li>
<li>Ma, D. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neuronal+activity-induced+Gadd45b+promotes+epigenetic+DNA+demethylation+and+adult+neurogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Neuronal activity-induced Gadd45b promotes epigenetic DNA demethylation and adult neurogenesis.</a> Science. 323, 1074-1077 (2009).</li>
<li>Budreck, E. C., Scheiffele, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neuroligin-3+is+a+neuronal+adhesion+protein+at+GABAergic+and+glutamatergic+synapses%5BTitle%5D)+AND+%22The+European+Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Neuroligin-3 is a neuronal adhesion protein at GABAergic and glutamatergic synapses.</a> The European Journal of Neuroscience. 26, 1738-1748 (2007).</li>
<li>Wu, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Arc%2FArg3.1+regulates+an+endosomal+pathway+essential+for+activity-dependent+beta-amyloid+generation%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Arc/Arg3.1 regulates an endosomal pathway essential for activity-dependent beta-amyloid generation.</a> Cell. 147, 615-628 (2011).</li>
<li>Huttner, W. B., Schiebler, W., Greengard, P., De Camilli, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synapsin+I+%28protein+I%29%2C+a+nerve+terminal-specific+phosphoprotein.+III.+Its+association+with+synaptic+vesicles+studied+in+a+highly+purified+synaptic+vesicle+preparation%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Synapsin I (protein I), a nerve terminal-specific phosphoprotein. III. Its association with synaptic vesicles studied in a highly purified synaptic vesicle preparation.</a> J Cell Biol. 96, 1374-1388 (1983).</li>
<li>Nagy, A., Baker, R. R., Morris, S. J., Whittaker, V. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+preparation+and+characterization+of+synaptic+vesicles+of+high+purity%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Res%22%5BJournal%5D)">The preparation and characterization of synaptic vesicles of high purity.</a> Brain Res. 109, 285-309 (1976).</li>
<li>Cheng, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Relative+and+absolute+quantification+of+postsynaptic+density+proteome+isolated+from+rat+forebrain+and+cerebellum%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+%26+Cellular+Proteomics+%3A+MCP%22%5BJournal%5D)">Relative and absolute quantification of postsynaptic density proteome isolated from rat forebrain and cerebellum.</a> Molecular & Cellular Proteomics : MCP. 5, 1158-1170 (2006).</li>
<li>Sheng, M., Hoogenraad, C. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+postsynaptic+architecture+of+excitatory+synapses%3A+a+more+quantitative+view%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Biochem%22%5BJournal%5D)">The postsynaptic architecture of excitatory synapses: a more quantitative view.</a> Annu Rev Biochem. 76, 823-847 (2007).</li>
<li>Sambrook, J., Fritsch, E. F., Maniatis, T. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aSambrook%2C+J+%22Molecular+cloning+%3A+a+Laboratory+Manual%22">Molecular cloning : a Laboratory Manual</a>. , 2nd ed, Cold Spring Harbor Laboratory Press. (1989).</li>
<li>Eggena, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+histone+H1+as+a+cognate+antigen+of+the+ulcerative+colitis-associated+marker+antibody+pANCA%5BTitle%5D)+AND+%22J+Autoimmun%22%5BJournal%5D)">Identification of histone H1 as a cognate antigen of the ulcerative colitis-associated marker antibody pANCA.</a> J Autoimmun. 14, 83-97 (2000).</li>
<li>Salahpour, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Homodimerization+of+the+beta2-adrenergic+receptor+as+a+prerequisite+for+cell+surface+targeting%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Homodimerization of the beta2-adrenergic receptor as a prerequisite for cell surface targeting.</a> J Biol Chem. 279, 33390-33397 (2004).</li>
<li>Bernocco, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sequential+detergent+fractionation+of+primary+neurons+for+proteomics+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Proteomics%22%5BJournal%5D)">Sequential detergent fractionation of primary neurons for proteomics studies.</a> Proteomics. 8, 930-938 (2008).</li>
<li>Grunewald, T. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nuclear+localization+and+cytosolic+overexpression+of+LASP-1+correlates+with+tumor+size+and+nodal-positivity+of+human+breast+carcinoma%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Cancer%22%5BJournal%5D)">Nuclear localization and cytosolic overexpression of LASP-1 correlates with tumor size and nodal-positivity of human breast carcinoma.</a> BMC Cancer. 7, 198(2007).</li>
<li>Heimann, K., Percival, J. M., Weinberger, R., Gunning, P., Stow, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Specific+isoforms+of+actin-binding+proteins+on+distinct+populations+of+Golgi-derived+vesicles%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Specific isoforms of actin-binding proteins on distinct populations of Golgi-derived vesicles.</a> J Biol Chem. 274, 10743-10750 (1999).</li>
<li>Neff, R. A. 3rd, Gomez-Varela, D., Fernandes, C. C., Berg, D. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Postsynaptic+scaffolds+for+nicotinic+receptors+on+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Pharmacol+Sin%22%5BJournal%5D)">Postsynaptic scaffolds for nicotinic receptors on neurons.</a> Acta Pharmacol Sin. 30, 694-701 (2009).</li>
<li>Cella, N., Cornejo-Uribe, R. R., Montes, G. S., Hynes, N. E., Chammas, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+lysosomal-associated+membrane+protein+LAMP-1+is+a+novel+differentiation+marker+for+HC11+mouse+mammary+epithelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Differentiation%22%5BJournal%5D)">The lysosomal-associated membrane protein LAMP-1 is a novel differentiation marker for HC11 mouse mammary epithelial cells.</a> Differentiation. 61, 113-120 (1996).</li>
<li>Otera, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Peroxisomal+targeting+signal+receptor+Pex5p+interacts+with+cargoes+and+import+machinery+components+in+a+spatiotemporally+differentiated+manner%3A+conserved+Pex5p+WXXXF%2FY+motifs+are+critical+for+matrix+protein+import%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Peroxisomal targeting signal receptor Pex5p interacts with cargoes and import machinery components in a spatiotemporally differentiated manner: conserved Pex5p WXXXF/Y motifs are critical for matrix protein import.</a> Mol Cell Biol. 22, 1639-1655 (2002).</li>
<li>Goubaeva, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cardiac+mitochondrial+connexin+43+regulates+apoptosis%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem+Biophys+Res+Commun%22%5BJournal%5D)">Cardiac mitochondrial connexin 43 regulates apoptosis.</a> Biochem Biophys Res Commun. 352, 97-103 (2007).</li>
<li>Lamers, K. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+S-100B%2C+neuron-specific+enolase+%28NSE%29%2C+myelin+basic+protein+%28MBP%29+and+glial+fibrillary+acidic+protein+%28GFAP%29+in+cerebrospinal+fluid+%28CSF%29+and+blood+of+neurological+patients%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Res+Bull%22%5BJournal%5D)">Protein S-100B, neuron-specific enolase (NSE), myelin basic protein (MBP) and glial fibrillary acidic protein (GFAP) in cerebrospinal fluid (CSF) and blood of neurological patients.</a> Brain Res Bull. 61, 261-264 (2003).</li>
<li>Arunachalam, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Munc18-1+is+critical+for+plasma+membrane+localization+of+syntaxin1+but+not+of+SNAP-25+in+PC12+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Biol+Cell%22%5BJournal%5D)">Munc18-1 is critical for plasma membrane localization of syntaxin1 but not of SNAP-25 in PC12 cells.</a> Mol Biol Cell. 19, 722-734 (2008).</li>
<li>Brandstatter, J. H., Fletcher, E. L., Garner, C. C., Gundelfinger, E. D., Wassle, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+expression+of+the+presynaptic+cytomatrix+protein+bassoon+among+ribbon+synapses+in+the+mammalian+retina%5BTitle%5D)+AND+%22Eur+J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Differential expression of the presynaptic cytomatrix protein bassoon among ribbon synapses in the mammalian retina.</a> Eur J Neurosci. 11, 3683-3693 (1999).</li>
</ol>

למחברים אין ניגודי אינטרסים לחשוף.

יש כמה שלבים בהליך שהם קריטיים לתוצאה מוצלחת. בשלב 3, חשובה שמידת הומוגניות עקבית מושגת עבור כל דגימה. כאשר מאחד רקמה עם homogenizer המנוע מונע, מהירות קבועה משמשת לא רק לסיבוב של העלי, אלא גם עם מספר משיכות. זמן הדגירה בהלם אוסמוטי צריך להיות מדויק, שכן יצירת הומוגניות או דגירה ממושכת בפתרון hypotonic תהיה lyse מיטוכונדריה ולזהם את מדגם SPM. עוד צעד קריטי בהכנה של חומרים כימיים, במיוחד פתרונות סוכרוז; אם molarit...

נוירונים לתקשר באמצעות סינפסות, ואיכות תקשורת זה מוסדרת במידה רבה על ידי שינויים בהרכב החלבונים בסינפסה. בפרט, החלבונים הממוקמים בצפיפות פוסט סינפטי להשתתף בתקשורת עצבית על ידי קולטני הנוירוטרנסמיטר אינטימי פיגומים עם מערכות העברת האותות שלהם 1. יתר על כן, שינויים מתמשכים בכוחו של היעילות הסינפטית נשלטים על ידי התוספת או גריעה של קולטנים בצפיפות פוסט סינפטי 1-6. לכן, הבידוד והכימות של חלבונים סינפטיים הוא טכניקה הכרחית ושימושית כדי לקבל תובנה הדרכים שנוירונים מגיבים לגירויים ולשנות יעילות הסינפטית 7. מאמר זה מתאר טכניקה נפוצה לבודד חלבונים סינפטיים מרקמת המוח של מכרסמים על ידי ultracentrifugation על הדרגתיים סוכרוז רציף. חלק קרום פלזמה הסינפטי יכול להיות מועשר ומבודד המבוסס עלצפיפותה בסוכרוז, שנקבע באופן אמפירי להיות דומה ל1.2 M סוכרוז. בהתאם לשאלה הביולוגית, ניתן להפריד שברים subcellular על ידי הדרגתיים רציף או רציף של שני סוכרוז או Percoll. הדרגתיים רציף יאפשר להפרדת חלבונים לשברים מרובים; זו יכולה להיות שימושית במיוחד כדי להדגים את שיתוף הלוקליזציה של חלבונים בתוך שבריר נתון 8. עם זאת, הכנת הדרגתיים רציף היא מפרכת יותר, ואין צורך ליישומים רבים. הדרגתיים רציף קלים יותר יחסית להכנה וניתן להשתמש בם כדי להפריד בין חלבונים לכמה שברים, בדרך כלל מוגדרים. הדרגתיים רציף שמורכבים משלוש שכבות סוכרוז של molarity הגדלת היה בשימוש נרחב לבודד את חלבונים הקשורים לממברנה הסינפטי הפלזמה (SPM). חלק קרום פלזמה הסינפטי זה יכול להיות מעובד בהמשך לfractio צפיפות פוסט סינפטיn (PSD) על ידי טיפול בחומר ניקוי ובידוד של חלק חומר הניקוי מסיס. כאשר תהליך זה תואר לראשונה בשנתי ה -1960 9,10, במיקרוסקופ אלקטרונים שימש כדי להדגים את האברונים וקרומים כי בערך להגדיר את קרום הפלזמה הסינפטי ושברים צפיפות פוסט סינפטי 9-14. מחקרים אלה הוכיחו את ההכללה של ממברנות של לפני ואחרי הסינפטי ושלפוחית ​​סינפטית בשבריר SPM; לאחר טיפול חומר ניקוי בעיקר האלקטרונים צפופים, צפיפות פוסט סינפטי היתה גלויות לעין. בהליך, הלם hypotonic משמש ללצבוט את התהליכים סינפטיים מהגוף התא 10. צעד זה מנצל את העובדה שהמיטוכונדריה הן עמידה יותר בפני זעזועים האוסמוטי ונותרה על כנן, ולכן הם המשקע בתחתית שיפוע סוכרוז (איור 1). שימוש באותה טכניקת העשרה זו, שברי SPM וPSD היו ראשון ביוכימיתשהוגדר על ידי ג&#39;ל אלקטרופורזה polyacrylamide ורצף של רכיבי החלבון העיקריים 15-17. ניתוח כתם בהמשך המערבי נעשה שימוש כדי לזהות ולכמת את הרמות של חלבונים סינפטיים ועוד להגדיר שברים אלה (איור 2). יש לנו להשתמש בטכניקה זו במעבדות שלנו לכמת את השינויים ברמות הסינפטי של טרנספורטר דופאמין המתרחשות כאשר מוקד Slc6a3 משוכפל בעכברים 18. יש לנו גם השתמשתי בטכניקה זו בעכברים חסרי קולטן NMDA לחשוף ירידות סינפסה הספציפית בחלבונים שהם חלק מinteractome DISC1 19. זה בא לידי ביטוי מניתוח כתם מערבי שברי SPM מכילים חלבונים סינפטיים קרום שלפוחית, סמני endosome, חלבוני המיטוכונדריה, אנזימים סינטטיים קרום הקשורים ומולקולות הולכים אותות, כמו גם רכיבים נפרד מצפיפות פוסט סינפטי וממברנות פלזמה הסינפטי 20-23. Eשברים PSD ven יכולים להיות זיהום עם חלבוני המיטוכונדריה בשפע וייתכן שיהיה צורך לבצע שקיעת שיפוע שנייה או שלבים לטיהור נוספים כדי להסיר אותם 13. לאחרונה, ספקטרומטריית מסה כמותית סיפקה רשימה של מעל 100 חלבונים בצפיפות פוסט סינפטי לבד, כמו גם אינדיקציה לשפע היחסי של רכיבים אלה 24,25.

<table><tbody><tr><td>1 מ' HEPES, pH 7.4</td><td>BioShop</td><td>HEP003.100</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>BioShop</td><td>HEP001.500&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>סוכרוז&nbsp;</td><td>BioShop</td><td>SUC507.1</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>BioBasic</td><td>EB0185</td><td></td></tr><tr><td>PMSF</td><td>BioShop</td><td>PMS123.5</td><td></td></tr><tr><td>Aprotinin</td><td>BioShop</td><td>APR600.1</td><td></td></tr><tr><td>Leupeptin</td><td>BioShop</td><td>LEU001.1</td><td></td></tr><tr><td>Pepstatin</td><td>BioShop</td><td>PEP605.5</td><td></td></tr><tr><td>Benzamidine</td><td>BioShop</td><td>BEN601.25</td><td></td></tr><tr><td>נתרן פלואוריד</td><td>BioShop</td><td>SFL001.100</td><td></td></tr><tr><td>נתרן פירופוספט</td><td>BioShop</td><td>SPP310.100</td><td></td></tr><tr><td>נתרן אורתובנאדט</td><td>BioShop</td><td>SOV664.10</td><td></td></tr><tr><td>&beta;-גליצרופוספט</td><td>BioShop</td><td>GYP001.10</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>BioShop</td><td>TRX506.500</td><td></td></tr><tr><td>18 גרם x 1 &frac12; &rdquo; מחט</td><td>BD</td><td>305196</td><td></td></tr><tr><td>1 סמ"ק מזרק</td><td>BD</td><td>309659</td><td></td></tr><tr><td>זכוכית טפלון הומוגנייזר Kontes Duall 23</td><td>VWR</td><td>KT885450-0023</td><td></td></tr><tr><td>IKA דגם RW 16 בוחש בסיסי</td><td>IKA Works</td><td>2572100</td><td></td></tr><tr><td>Sorvall SM-24 רוטור זווית קבועה</td><td>ThermoScientific</td><td>29017</td><td></td></tr><tr><td>Sorvall RC 6 Plus צנטריפוגה</td><td>ThermoScientific</td><td>46910</td><td></td></tr><tr><td>צינורות פוליאלומר דק דופן (13.2 מ"ל)</td><td>בקמן קולטר</td><td>331372</td><td></td></tr><tr><td>SW 41 דלי מתנדנד רוטור Ti</td><td>בקמן קולטר</td><td>331362</td><td></td></tr><tr><td>בקמן L-80 אולטרה-צנטריפוגה רצפתית</td><td>בקמן קולטר</td><td></td><td></td></tr> צינורות <tr><td>פוליקרבונט עבי דופן (3.5 מ"ל)</td><td>בקמן קולטר</td><td>349622</td><td></td></tr><tr><td>TLA-100.3 רוטור</td> <td>זווית קבועהבקמן קולטר</td><td>349481</td><td></td></tr><tr><td>בקמן TL-100 אולטרה-צנטריפוגה שולחנית</td><td>בקמן קולטר</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

הכנת synaptic פלזמה ממברנה וחלבוני צפיפות postsynaptic באמצעות שיפוע סוכרוז רציף

Preparation of Synaptic Plasma Membrane and Postsynaptic Density Proteins Using a Discontinuous Sucrose Gradient

טכניקות חלוקה subcellular עצביות מאפשרות כימות של חלבונים שנסחרים ומסינפסה. כפי שתואר במקור בשנתי ה -1960 מאוחר, חלבונים הקשורים עם קרום הפלזמה הסינפטי יכולים להיות מבודדים על ידי ultracentrifugation בשיפוע צפיפות סוכרוז. ברגע שקרומים הסינפטי מבודדים, המורכב macromolecular ידוע כצפיפות פוסט סינפטי יכול להיות מבודד לאחר מכן בשל insolubility חומר הניקוי שלה. הטכניקות המשמשות כדי לבודד ממברנות פלזמה הסינפטי וחלבוני צפיפות פוסט סינפטי יישארו זהה במהות לאחר 40 שנים, ונמצאות בשימוש נרחב במחקר מדעי המוח נוכחי. מאמר זה מפרט את חלוקה של חלבונים הקשורים עם קרום הפלזמה הסינפטי וצפיפות פוסט סינפטי באמצעות שיפוע סוכרוז רציף. הכנות חלבון וכתוצאה מכך מתאימות למערבי סופג או ניתוח 2D DIGE.

הכנת שיפוע צפיפות סוכרוז צריכה לגרום להפרדה ברורה של שלושה פתרונות הטוחנות של סוכרוז (0.8, 1.0, ו1.2 M סוכרוז). ראה איור 3 א לדוגמא של השיפוע לפני מדגם החלבון הוא הוסיף. אם השיפוע מוכן יותר מדי מראש, או אם הוא מוכן על משטח ספסל עם רטט מציוד אחר, השיפוע יהיה בסכנה והפרדה ראויה לא תושג. אם הפרדה ברורה של שלושה הפתרונות אינה נראה לעין, מומלץ להפוך את שיפוע חדש לפני הוספת מדגם החלבון. ראו איור 3 ב לדוגמא של שיפוע סוכרוז (חץ שחור) כאשר מדגם החלבון הוא ...

מאמר זה מפרט את ההעשרה של חלבונים הקשורים עם קרום הפלזמה הסינפטי על ידי ultracentrifugation על שיפוע סוכרוז רציף. ההכנה הבאה של חלבוני צפיפות פוסט סינפטי מתואר גם. הכנות חלבון מתאימות למערבי סופג או ניתוח 2D DIGE.

הכנת Synaptic פלזמה ממברנה וחלבוני צפיפות Postsynaptic באמצעות שיפוע סוכרוז רציף

Neuronal subcellular fractionation techniques allow the quantification of proteins that are trafficked to and from the synapse. As originally described in ...

המטרה הכוללת של הליך זה היא להדגים פיצול תת-תאי של רקמת המוח באמצעות שיפוע סוכרוז לא רציף כדי להעשיר חלבונים מהממברנות הסינפטיות וצפיפות פוסט סינפטית. זה מושג על ידי הומוגניזציה של רקמת המוח תחילה עם הומוגנייזר מופעל. לאחר מכן סדרה של שלבי צנטריפוגה להכנת תמציות חלבון ממברנה גולמית.לאחר מכן תמציות הממברנה מונחות על שיפוע סוכרוז לא רציף לאולטרה-צנטריפוגה. השלב האחרון הוא איסוף החלבונים מהשיפוע. בסופו של דבר, התוצאות יכולות להראות שינויים ברמות החלבון הסינפטי באמצעות ניתוח כתמים מערביים.זוהי טכניקה מבוססת היטב המשמשת מדעני מוח כבר למעלה מ-40 שנה. אנו משתמשים בו במעבדה שלנו כדי להבין כיצד הרכב החלבון של הסינפסה משתנה כאשר אנו מפריעים למערכות נוירוטרנסמיטורים שונות. היתרון העיקרי של טכניקה זו על פני שיטות אחרות, כמו שיפועי סוכרוז לכל קריאה או שיפועי סוכרוז רציפים, הוא שקל יותר לבנות שיפועי סוכרוז לא רציפים ביד.פרוטוקול זה עושה שימוש בזכוכית מונעת טפלון הומוגנייזר תמיד מחליף את העלי בין דגימות ושוטף ומייבש. ההומוגנייזר תחילה, טען את הרקמה המנותחת לתוך צינור של 13 מיליליטר עם ארבעה מיליליטר של תמיסת סוכרוז מולרית של 0.32 HEPA. לאחר מכן העבירו את הרקמה להומוגנייזר זכוכית נקי.הגדר את המנוע ל-900 סל"ד והומוגניזציה של הדגימה ב-12 פעימות במשך 30 שניות תוך שימוש בפחות מארבעה גרם רקמה מבטיח פיצול טוב, העברת הדגימה בחזרה לצינור ואחסון של 100 מיקרוליטר ב-80 מעלות צלזיוס שליליות לניתוח חלבון. לאחר מכן, הפרד את החומר הגרעיני על ידי סיבוב ההומוגנאט ב-900 גרם למשך 10 דקות. בארבע מעלות צלזיוס, העבירו את הסופרנטנט לצינור חדש של 15 מיליליטר.הסופרנטנט מכיל את חלק הממברנה הגולמי. כעת כדי להעשיר את הצנטריפוגה הסינפטוזומית הגולמית, הסופרנטנט ב-10,000 גרם למשך 15 דקות בארבע מעלות צלזיוס, הסר את הסופרנטנט. הגלולה מכילה את החלק הסינפטוזומי הגולמי Resus.השעו אותו במיליליטר אחד של תמיסת סוכרוז מולרית של 0.32. ואז בעוד שלושה מיליליטר של תמיסה לצנטריפוגת ההשעיה את החלק הגולמי למשך 15 דקות ב -10, 000 גרם בארבע מעלות צלזיוס, הסר את הסופרנטנט. כעת כינים במהירות את הגלולה, השעו מחדש את הכדור במיליליטר מים טהורים.ואז להוסיף עוד שלושה מיליליטר מים במהירות. העבירו את זה להומוגנייזר. יש למרוח שלוש משיכות ביד ולהעביר אותו בחזרה לצינור של 13 מיליליטר.התאם במהירות את הדגימה בחזרה לארבעה HEAs מילי-מולאריים בתוספת של 16 מיקרוליטר של HEA מולארי אחד וערבב אותו על ידי היפוך. כעת הניחו את הדגימה על מסובב בארבע מעלות צלזיוס למשך חצי שעה. כדי להבטיח את ליזיס הדגימה, סיים את הפיצול על ידי כדור ה-Lysed P שני שברים ראשוניים.סובב אותו ב-25,000 גרם למשך 20 דקות בארבע מעלות צלזיוס, הסר את הסופרנטנט, השהה מחדש את הגלולה במיליליטר תמיסת סוכרוז. זה מכיל את הממברנות האפיזומליות המועשרות של הסינאפ. ראשית, מדוד מראש את המאגרים כדי ליצור שיפוע סוכרוז לא רציף.טען שלושה צינורות כדלקמן, אחד עם 3.5 מיליליטר בדיוק של 1.2 ערימות מולאריות תמיסת סוכרוז. אחר עם שלושה מיליליטר בדיוק של תמיסה מולרית של 1.0, והשלישי עם שלושה מיליליטר של תמיסה טוחנת של 0.8. לאחר מכן, בעזרת פיפטה מזכוכית, העבירו את תמיסת הסוכרוז המולרית של 1.2 לצינור אולטרה-צנטריפוגה פולימרי בנפח 12 מיליליטר.בעזרת פיפטה חדשה, שכבו בזהירות את התמיסה המולרית 1.0 על התמיסה המולרית של 1.2. אין להפריע לתמיסה המולרית 1.2 או להכניס בועות עם הפיפטה. השתמש באותה טכניקה כדי להניח את התמיסה המולרית 0.8 מעל.היזהר. מספיקות רעידות קטנות ממערבולת ספסל או מיקרו צנטריפוגה בכדי להפריע לשלמות השיפוע. חשוב לבנות את השיפועים בזהירות וביעילות.אם זה לוקח יותר מדי זמן או אם השיפוע חשוף לרטט, לא תוכל לשחזר את הממברנות הסינפטיות בשלבים הבאים. כעת עם שכבה נוספת של פיפטה של הכומר את שבר הממברנה האפיזומלית המועשר של הסינפה על גבי השיפוע המוכן. איזון מדויק של השיפוע באולטרה-צנטריפוגה ברוטור דלי מתנדנד.לאחר מכן סובב אותו ב-150,000 גרם למשך שעתיים בארבע מעלות צלזיוס. היזהר מאוד בעת הוצאת השיפוע מהדלי לאחר הצנטריפוגה, צריכות להיות רצועות ברורות של תמיסת סוכרוז. עם שברי חלבון בכל ממשק וגלולה, השברים לא צריכים להיות מפוזרים.בעזרת מחט 18 מד ומזרק מיליליטר אחד, נקב את החלק הנמוך ביותר של הממשק המולרי עד 1.2 ומשוך את הפס הלבן של החלבון, המכיל את ממברנות הפלזמה הסינפטיות. רשום את עוצמת הקול של שכבה זו. העבירו את השכבה לצינור אולטרה-צנטריפוגה בעובי 3.5 מיליליטר.הוסף בדיוק 2.5 נפחים של ארבעה מילי-מולרי HEAs. לאחר מכן הכינו צינור איזון עם תמיסת סוכרוז חוצצת של 0.32 HEAs מולרית ברוטור זווית קבועה, אולטרה-צנטריפוגה את הדגימה ב-200, 000 גרם למשך 30 דקות בארבע מעלות צלזיוס. לאחר מכן השליכו את הסנה והשעו מחדש את גלולת קרום הפלזמה הסינפטית.ב-300 מיקרוליטר של 50 מילי-מולרי HEAs תמיסת EDTA של שני מילי-מולריות. כעת ניתן לאסוף את שבר הצפיפות הפוסט-סינפטי או שבר PSD על ידי שימוש נוסף באותן טכניקות. השלבים מתוארים בבירור בפרוטוקול הטקסט.כתם מערבי הופעל עם חלבון כולל, קרום הפלזמה הסינפטי, ושברי חלבון בצפיפות פוסט-סינפטית ראשונים. חלק ה-PSD עבר טיפול דטרגנטי אחד בלבד, והרקמה הייתה מסטריאטום עכבר. חלבונים פרה-סינפטיים כמו טרנספורטר הדופמין מועשרים בחלק ה-SPM, אך מסולקים בשלב הניקוי הבא להעשרת PSD.בזמן ניסיון הליך זה, חשוב לזכור לשמור את כל הדגימות על קרח ולכלול מעכבי פרוטאז ופוספטאז בעקבות הליך זה. ניתן לבצע שיטות אחרות כמו ניתוח דם מערבי או אלקטרופורזה דו-ממדית של ג'ל. לאחר מכן תוכלו לענות על שאלות כמו כיצד טיפול תרופתי משפיע על רמות הקולטנים בסינפסה.

preparation-synaptic-plasma-membrane-postsynaptic-density-proteins

Research

JoVE Journal

Neuroscience

מדעי המוח

שיטה להכין פעיל translationally, synaptoneurosomes שלם (SNS) של קליפת המוח עכבר מתואר. השיטה משתמשת שיפוע רציפה Percoll-סוכרוז צפיפות המאפשרת הכנה מהירה של פעיל SNS.

הכנת Synaptoneurosomes מ - עכבר Cortex באמצעות צבע רציפה Percoll-סוכרוז צפיפות

טכניקות מיקרוסקופ אור בשילוב עם מבחנים ביוכימיים מבהירים את המעורבות של אקסוציטוזיס בתיווך SNARE בהסתעפות אקסונים תלויי נטרין. שילוב טכניקות זה מאפשר זיהוי של מנגנונים מולקולריים השולטים בהסתעפות האקסון ובשינוי צורת התא.

ניצול מתודולוגיות משולב להגדיר את התפקיד של משלוח ממברנה פלזמה במהלך אקסון מסעף ו העצבית המורפוגנזה

פרוטוקול זה מתאר שיטה קלה לחילוץ ופיצול תעתיקים מרקמות צמחים על בסיס מספר הריבוזומים הקשורים. הוא מאפשר הערכה גלובלית של פעילות התרגום וקביעת סטטוס התרגום של mRNAs ספציפיים.

שיטה קלה הצמח Polysome Profiling

זיהוי מולקולות ומסלולים השולטים בגמישות הסינפטית ובזיכרון הוא עדיין אתגר מרכזי במדעי המוח. כאן, מתואר תהליך עבודה המתייחס לכימות היחסי של חלבונים סינפטיים המעורבים כביכול בארגון מחדש מולקולרי של סינפסות במהלך למידה וגיבוש זיכרון בפרדיגמת למידה שמיעתית.

גבוהה פרופיל Proteome Synaptic החלטה כמותי של אזורים במוח העכבר לאחר למידה אפליה שמיעתית

כאן, אנו מציגים פרוטוקול קרום המוח פרוקציה המייצג תהליך חסון לבודד חלבונים השייכים תאים סינפטית שונים.

קרום המוח Fractation: An<em&gt; אקס ויוו</em&gt; גישה כדי להעריך לוקליזציה חלבון subsynaptic

תקנה translational ממלא תפקיד חשוב בבקרה על שפע חלבונים. כאן, אנו מתארים שיטה תפוקה גבוהה לניתוח כמותי של תרגום שמרים ניצני האפייה.

הגנום כולו כימות של תרגום ניצני שמרים על-ידי יצירת פרופיל ריבוזום

מאמר זה נועד להציג פרוטוקול להכנת אנדוזומים למיחזור מתאי יונקים באמצעות אולטרה-צנטריפוגה הדרגתית הדרגתית של צפיפות סוכרוז.

צפיפות הדרגתית אולטרה-מרכזית לחקירת מיחזור אנדוציטי בתאי יונקים

אנו מציגים טכניקה לייצוב מהיר של מתחמים תרגומיים (ביוסינטזה של חלבונים) עם קשרים צולבים פורמלדהידים בתאי שמרים ויונקים חיים. הגישה מאפשרת לנתח מתווכים ארעיים ואינטראקציות דינמיות של RNA:חלבון. ניתן להשתמש במתחמים המקושרים ביישומים מרובים במורד הזרם, כגון בשיטות פרופיל מבוססות רצף עמוק, מיקרוסקופיה וספקטרומטריית מסה.

קיבוע מהיר ב- Vivo ובידוד מתחמים תרגומיים מתאי אוקריוטיים

פרוטוקול זה מתאר כיצד ליצור פרופיל פוליזום מבלי להשתמש ביצרני שיפועים אוטומטיים או במערכות פיצול הדרגתיות.

פרופיל פוליזום ללא יצרני שיפועים או מערכות פיצול

פרוטוקול זה מציג שיטה חזקה ומפורטת להשגת סינפטוזומים טהורים ביותר, שלפוחיות סינפטיות ושברים סינפטיים אחרים ממוח העכבר. שיטה זו מאפשרת הערכה של תהליכים סינפטיים, כולל ניתוח ביוכימי של לוקליזציה ותפקוד חלבונים ברזולוציה מדורית.

פיצול תת-תאי לבידוד רכיבים סינפטיים ממוח מורין

אתרי מגע מיטוכונדריאליים הם קומפלקסים חלבוניים המקיימים אינטראקציה עם חלבוני הממברנה הפנימית והחיצונית של המיטוכונדריה. אתרים אלה חיוניים לתקשורת בין קרומי המיטוכונדריה, ולכן בין הציטוזול לבין המטריצה המיטוכונדריאלית. במאמר זה אנו מתארים שיטה לזיהוי מועמדים המתאימים לסוג מסוים זה של חלבונים.

שיטה משופרת לבידוד אתרי מגע מיטוכונדריאליים

למד שיטת הפרדה תת-תאית של רקמת מוח באמצעות שיפוע סוכרוז רציף לאנריץ' חלבוני ממברנה סינפטית וצפיפות פוסט-סינפטית. טכניקה זו מאפשרת ניתוח שינויים ברמות חלבונים סינפטיים באמצעות Western blot ומספקת בסיס למחקר תפקוד עצבי.

הכנת Synaptic פלזמה ממברנה וחלבוני צפיפות Postsynaptic באמצעות שיפוע סוכרוז רציף

גלה סרטונים נוספים