הכנת Synaptic פלזמה ממברנה וחלבוני צפיפות Postsynaptic באמצעות שיפוע סוכרוז רציף
3 בספטמבר 2014
מאמר זה מפרט את ההעשרה של חלבונים הקשורים עם קרום הפלזמה הסינפטי על ידי ultracentrifugation על שיפוע סוכרוז רציף. ההכנה הבאה של חלבוני צפיפות פוסט סינפטי מתואר גם. הכנות חלבון מתאימות למערבי סופג או ניתוח 2D DIGE.
המטרה הכוללת של הליך זה היא להדגים פיצול תת-תאי של רקמת המוח באמצעות שיפוע סוכרוז לא רציף כדי להעשיר חלבונים מהממברנות הסינפטיות וצפיפות פוסט סינפטית. זה מושג על ידי הומוגניזציה של רקמת המוח תחילה עם הומוגנייזר מופעל. לאחר מכן סדרה של שלבי צנטריפוגה להכנת תמציות חלבון ממברנה גולמית.
לאחר מכן תמציות הממברנה מונחות על שיפוע סוכרוז לא רציף לאולטרה-צנטריפוגה. השלב האחרון הוא איסוף החלבונים מהשיפוע. בסופו של דבר, התוצאות יכולות להראות שינויים ברמות החלבון הסינפטי באמצעות ניתוח כתמים מערביים.
זוהי טכניקה מבוססת היטב המשמשת מדעני מוח כבר למעלה מ-40 שנה. אנו משתמשים בו במעבדה שלנו כדי להבין כיצד הרכב החלבון של הסינפסה משתנה כאשר אנו מפריעים למערכות נוירוטרנסמיטורים שונות. היתרון העיקרי של טכניקה זו על פני שיטות אחרות, כמו שיפועי סוכרוז לכל קריאה או שיפועי סוכרוז רציפים, הוא שקל יותר לבנות שיפועי סוכרוז לא רציפים ביד.
פרוטוקול זה עושה שימוש בזכוכית מונעת טפלון הומוגנייזר תמיד מחליף את העלי בין דגימות ושוטף ומייבש. ההומוגנייזר תחילה, טען את הרקמה המנותחת לתוך צינור של 13 מיליליטר עם ארבעה מיליליטר של תמיסת סוכרוז מולרית של 0.32 HEPA. לאחר מכן העבירו את הרקמה להומוגנייזר זכוכית נקי.
הגדר את המנוע ל-900 סל"ד והומוגניזציה של הדגימה ב-12 פעימות במשך 30 שניות תוך שימוש בפחות מארבעה גרם רקמה מבטיח פיצול טוב, העברת הדגימה בחזרה לצינור ואחסון של 100 מיקרוליטר ב-80 מעלות צלזיוס שליליות לניתוח חלבון. לאחר מכן, הפרד את החומר הגרעיני על ידי סיבוב ההומוגנאט ב-900 גרם למשך 10 דקות. בארבע מעלות צלזיוס, העבירו את הסופרנטנט לצינור חדש של 15 מיליליטר.
הסופרנטנט מכיל את חלק הממברנה הגולמי. כעת כדי להעשיר את הצנטריפוגה הסינפטוזומית הגולמית, הסופרנטנט ב-10,000 גרם למשך 15 דקות בארבע מעלות צלזיוס, הסר את הסופרנטנט. הגלולה מכילה את החלק הסינפטוזומי הגולמי Resus.
השעו אותו במיליליטר אחד של תמיסת סוכרוז מולרית של 0.32. ואז בעוד שלושה מיליליטר של תמיסה לצנטריפוגת ההשעיה את החלק הגולמי למשך 15 דקות ב -10, 000 גרם בארבע מעלות צלזיוס, הסר את הסופרנטנט. כעת כינים במהירות את הגלולה, השעו מחדש את הכדור במיליליטר מים טהורים.
ואז להוסיף עוד שלושה מיליליטר מים במהירות. העבירו את זה להומוגנייזר. יש למרוח שלוש משיכות ביד ולהעביר אותו בחזרה לצינור של 13 מיליליטר.
התאם במהירות את הדגימה בחזרה לארבעה HEAs מילי-מולאריים בתוספת של 16 מיקרוליטר של HEA מולארי אחד וערבב אותו על ידי היפוך. כעת הניחו את הדגימה על מסובב בארבע מעלות צלזיוס למשך חצי שעה. כדי להבטיח את ליזיס הדגימה, סיים את הפיצול על ידי כדור ה-Lysed P שני שברים ראשוניים.
סובב אותו ב-25,000 גרם למשך 20 דקות בארבע מעלות צלזיוס, הסר את הסופרנטנט, השהה מחדש את הגלולה במיליליטר תמיסת סוכרוז. זה מכיל את הממברנות האפיזומליות המועשרות של הסינאפ. ראשית, מדוד מראש את המאגרים כדי ליצור שיפוע סוכרוז לא רציף.
טען שלושה צינורות כדלקמן, אחד עם 3.5 מיליליטר בדיוק של 1.2 ערימות מולאריות תמיסת סוכרוז. אחר עם שלושה מיליליטר בדיוק של תמיסה מולרית של 1.0, והשלישי עם שלושה מיליליטר של תמיסה טוחנת של 0.8. לאחר מכן, בעזרת פיפטה מזכוכית, העבירו את תמיסת הסוכרוז המולרית של 1.2 לצינור אולטרה-צנטריפוגה פולימרי בנפח 12 מיליליטר.
בעזרת פיפטה חדשה, שכבו בזהירות את התמיסה המולרית 1.0 על התמיסה המולרית של 1.2. אין להפריע לתמיסה המולרית 1.2 או להכניס בועות עם הפיפטה. השתמש באותה טכניקה כדי להניח את התמיסה המולרית 0.8 מעל.
היזהר. מספיקות רעידות קטנות ממערבולת ספסל או מיקרו צנטריפוגה בכדי להפריע לשלמות השיפוע. חשוב לבנות את השיפועים בזהירות וביעילות.
אם זה לוקח יותר מדי זמן או אם השיפוע חשוף לרטט, לא תוכל לשחזר את הממברנות הסינפטיות בשלבים הבאים. כעת עם שכבה נוספת של פיפטה של הכומר את שבר הממברנה האפיזומלית המועשר של הסינפה על גבי השיפוע המוכן. איזון מדויק של השיפוע באולטרה-צנטריפוגה ברוטור דלי מתנדנד.
לאחר מכן סובב אותו ב-150,000 גרם למשך שעתיים בארבע מעלות צלזיוס. היזהר מאוד בעת הוצאת השיפוע מהדלי לאחר הצנטריפוגה, צריכות להיות רצועות ברורות של תמיסת סוכרוז. עם שברי חלבון בכל ממשק וגלולה, השברים לא צריכים להיות מפוזרים.
בעזרת מחט 18 מד ומזרק מיליליטר אחד, נקב את החלק הנמוך ביותר של הממשק המולרי עד 1.2 ומשוך את הפס הלבן של החלבון, המכיל את ממברנות הפלזמה הסינפטיות. רשום את עוצמת הקול של שכבה זו. העבירו את השכבה לצינור אולטרה-צנטריפוגה בעובי 3.5 מיליליטר.
הוסף בדיוק 2.5 נפחים של ארבעה מילי-מולרי HEAs. לאחר מכן הכינו צינור איזון עם תמיסת סוכרוז חוצצת של 0.32 HEAs מולרית ברוטור זווית קבועה, אולטרה-צנטריפוגה את הדגימה ב-200, 000 גרם למשך 30 דקות בארבע מעלות צלזיוס. לאחר מכן השליכו את הסנה והשעו מחדש את גלולת קרום הפלזמה הסינפטית.
ב-300 מיקרוליטר של 50 מילי-מולרי HEAs תמיסת EDTA של שני מילי-מולריות. כעת ניתן לאסוף את שבר הצפיפות הפוסט-סינפטי או שבר PSD על ידי שימוש נוסף באותן טכניקות. השלבים מתוארים בבירור בפרוטוקול הטקסט.
כתם מערבי הופעל עם חלבון כולל, קרום הפלזמה הסינפטי, ושברי חלבון בצפיפות פוסט-סינפטית ראשונים. חלק ה-PSD עבר טיפול דטרגנטי אחד בלבד, והרקמה הייתה מסטריאטום עכבר. חלבונים פרה-סינפטיים כמו טרנספורטר הדופמין מועשרים בחלק ה-SPM, אך מסולקים בשלב הניקוי הבא להעשרת PSD.
בזמן ניסיון הליך זה, חשוב לזכור לשמור את כל הדגימות על קרח ולכלול מעכבי פרוטאז ופוספטאז בעקבות הליך זה. ניתן לבצע שיטות אחרות כמו ניתוח דם מערבי או אלקטרופורזה דו-ממדית של ג'ל. לאחר מכן תוכלו לענות על שאלות כמו כיצד טיפול תרופתי משפיע על רמות הקולטנים בסינפסה.
צפו בתמליל המלא וקבלו גישה לאלפי סרטונים מדעיים
סקירה כללית
מאמר זה מפרט את העשרתם של חלבונים הקשורים לממברנת הפלסמה הסינפטית באמצעות אולטרה-צנטריפוגציה במדרג סוכרוז לא רציף. הפרוצדורה מדגימה פראקציונציה תת-תאית של רקמת מוח לצורך העשרת חלבונים מממברנות סינפטיות ומצפי פוסט-סינפטיים.
מרכיבי מפתח של המחקר
תחום המדע
- מדעי המוח
- ביולוגיה של התא
- אנליזה של חלבונים
רקע
- הבנת רמות החלבונים הסינפטיים היא קריטית למחקר במדעי העצב.
- הממברנות הסינפטיות והצמיפויות הפוסט-סינפטיות ממלאות תפקידים מרכזיים בתקשורת העצבית.
- אולטרה-צנטריפוגציה היא טכניקה סטנדרטית להעשרת חלבונים.
- Western blotting ו-2D DIGE הן שיטות נפוצות לניתוח חלבונים.
מטרת המחקר
- להעשיר חלבונים מממברנות סינפטיות ומצפיפות פוסט-סינפטיות.
- להכין תמריתי חלבון המתאימים לאנליזה נוספת.
- להדגים את יעילותו של מדרג סוכרוז לא רציף בהעשרת חלבונים.
שיטות שנעשה בהן שימוש
- הומוגניזציה של רקמת מוח באמצעות הומוגנייזר חשמלי.
- סדרה של שלבי צנטריפוגה להכנת תמריתי חלבון ממברנה גולמיים.
- שכיבה של תמריתי ממברנה על מדרגת ריכוז (גרדיאנט) סוכרוז לא רציפה.
- אולטרה-צנטריפוגה לאיסוף חלבונים מהגרדיאנט.
תוצאות עיקריות
- העשרה מוצלחת של חלבוני ממברנה פלזמית סינפטית.
- הכנה של חלבוני צפיפות פוסט-סינפטית לצורך ניתוח.
- התוצאות עשויות להצביע על שינויים ברמות החלבון הסינפטי.
- מתאים לניתוח Western blot ו-2D DIGE.
מסקנות
- השיטה מעשירה ביעילות חלבונים מממברנות סינפטיות.
- מספקת בסיס לחקר הדינמיקה של חלבונים סינפטיים.
- ניתן ליישמה עבור שאלות מחקר שונות בתחום מדעי המוח.
שאלות נפוצות
רלוונטיות תעשייתית למנהלים
כימות חלבונים סינפטיים מאפשר הפחתת סיכונים מכניסטיים בתיקוף מטרות במערכת העצבים המרכזית (CNS) על ידי קישור שינויים מולקולריים לפנוטיפים פונקציונליים. שיטה זו של פרקציונציה תת-תאית תומכת בביטחון חיזוי בשלבי הגילוי המוקדמים באמצעות בידוד של מדורי סינפסה הרלוונטיים למחלה. היא מספקת מערכת הרלוונטית למחלה להערכת מעורבות המטרה (target engagement) ומודולציה של מסלולים במודלים פרה-קליניים.
יישומים אסטרטגיים במחקר ופיתוח בביופארמה
גילוי מוקדם ותיקוף מטרה
- ערך מדעי: מאפשר בחינה של היפותזות טיפוליות באמצעות כימות של תעתוק חלבונים מממברנה פלסמית סינפטית ומצפיפות פוסט-סינפטית.
- ערך תפעולי: מספק גישה סטנדרטית לבידוד של מדורים סינפטיים לצורך הפחתת סיכונים של מטרות טיפוליות.
- ערך ניבוי: תומך בהלימה של סמנים ביולוגיים על ידי מדידת שינויים ברמות חלבונים פרה-סינפטיים ופוסט-סינפטיים בעקבות מודולציית מסלולים.
סריקה ופיתוח בדיקה
- ערך מדעי: מכין פראקציות מאושרות של חלבונים סינפטיים לשימוש במבחני סריקה פנוטיפיים להערכת השפעות של תרכובות על השלמות הסינפטית.
- ערך תפעולי: מייצר תוצרי חלבון כמותיים וניתנים לשחזור, המתאימים לסטנדרטיזציה של מבחנים ולניתוח בעל תוכן גבוה (high-content analysis).
- יכולת הרחבה: שיטת מדרג הסוכרוז הבלתי רציף מאפשרת עיבוד של דגימות במנות להכנה עקבית לסריקה.
מחקר תרגומי ופרה-קליני
- ערך מדעי: מאפשר מידול של מערכות הרלוונטיות למחלה על ידי בידוד חלבונים סינפטיים מאזורי מוח ספציפיים, כגון הסטריאטום (striatum), כדי לחקור מטרות נוירופסיכיאטריות.
- ערך תפעולי: תומך בפיתוח של ביומרקרים תרגומיים על ידי אספקת מדדים כמותיים של חלבונים סינפטיים המתואמים עם תוצאות תפקודיות.
- הפחתת סיכונים: מסייע ברציפות פרה-קלינית על ידי קישור של מודולציה של המטרה לשינויים מדידים בהרכב החלבונים הסינפטיים.
שילוב זרימת עבודה וצנרת עיבוד
שיטה זו משתלבת ברצף הגילוי, החל מבדיקת היפותזת המטרה, דרך זיהוי מובילים (leads) ועד לתיקוף פרה-קליני, על ידי אספקת נתונים כמותיים של חלבוני סינפסה.
- ביולוגיה של הגילוי: תומכת בבדיקת היפותזות ובבירור מסלולים על ידי בידוד מדורים סינפטיים המושפעים מהפרעות במערכת המוליכים העצביים.
- סריקה: מאפשרת מוכנות לבדיקה באמצעות הפקת פראקציות מועשרות של ממברנה פלזמית סינפטית ושל ה-PSD, המתאימות לניתוח Western blot או 2D DIGE.
- אנליזה: מספקת מדידות כמותיות של משתנים תלויים (עוצמת פס חלבון) המאפשרות השוואה של רמות חלבונים סינפטיים בין תנאים ניסיוניים שונים.
- מחקר תרגומי: מקשרת ממצאי גילוי לרצף פרה-קליני על ידי אפשור הערכת שינויים בחלבונים סינפטיים במודלים של מחלות.
- שימוש חוזר ארגוני: מקימה פלטפורמה לשימוש חוזר לבידוד חלבונים סינפטיים במגוון פרויקטים של מערכת העצבים המרכזית (CNS) ובסוגי מטרות שונים.
השפעה תפעולית וארגונית
- ערך מדעי: מגביר את הביטחון החזוי בתיקוף המטרה על ידי הפחתת העמימות המכניסטית באמצעות מדידה ישירה של תעבורת חלבונים סינפטיים.
- ערך תפעולי: מבטיח הדירות וסטנדרטיזציה באמצעות פרוטוקול מבוסס של מדרג סוכרוז לא רציף עם שלבי צנטריפוגה מוגדרים.
- ערך אסטרטגי: משפר החלטות של המשך או הפסקה (go/no-go) על ידי אספקת נתונים סינפטיים כמותיים מוקדמים של חלבונים, המפחיתים את הסיכון בהתקדמות של מטרות במערכת העצבים המרכזית (CNS).
- השפעה על פורטפוליו: מאפשר תיעדוף של מטרות CNS מותאם סיכונים, בהתבסס על השפעות מדידות על הרכב החלבונים הסינפטיים והתפקוד הסינפטי.
שיקולי יישום
- נדרשת מומחיות בפרקציונציה תת-תאית, אולטרה-צנטריפוגציה וביולוגיה סינפטית כדי להבטיח יצירה תקינה של המדרג ואיסוף נכון של הפרקציות.
- תלוי בגישה לאולטרה-צנטריפוגה בעלת רטורים של דליים מתנדנדים (swinging bucket) ורטורים בזווית קבועה, וביכולת לשמור על הדגימות בטמפרטורה של 4°C לאורך כל תהליך העיבוד.
- מחייב סטנדרטיזציה בין-צוותית של הכנת המדרג, הומוגניזציה של רקמות ושימוש במעכבי פרוטאז ופוספטאז כדי להבטיח הדירות בין אתרים שונים.
- נדרש לבחון שיקולי התאמה בעת היישום על אזורי מוח שונים או מודלים של מחלות, בשל הבדלים בביטוי חלבונים סינפטיים ובתנובת הרקמה.
- מגבלות מעשיות כוללות את הצורך ברקמה טרייה או מאוחסנת כהלכה, וטיפול זהיר למניעת הפרעה למדרג כתוצאה מרעידות או עיכובים במהלך ההקמה.
