הכנת Synaptic פלזמה ממברנה וחלבוני צפיפות Postsynaptic באמצעות שיפוע סוכרוז רציף
September 3rd, 2014
מאמר זה מפרט את ההעשרה של חלבונים הקשורים עם קרום הפלזמה הסינפטי על ידי ultracentrifugation על שיפוע סוכרוז רציף. ההכנה הבאה של חלבוני צפיפות פוסט סינפטי מתואר גם. הכנות חלבון מתאימות למערבי סופג או ניתוח 2D DIGE.
המטרה הכוללת של הליך זה היא להדגים פיצול תת-תאי של רקמת המוח באמצעות שיפוע סוכרוז לא רציף כדי להעשיר חלבונים מהממברנות הסינפטיות וצפיפות פוסט סינפטית. זה מושג על ידי הומוגניזציה של רקמת המוח תחילה עם הומוגנייזר מופעל. לאחר מכן סדרה של שלבי צנטריפוגה להכנת תמציות חלבון ממברנה גולמית.
לאחר מכן תמציות הממברנה מונחות על שיפוע סוכרוז לא רציף לאולטרה-צנטריפוגה. השלב האחרון הוא איסוף החלבונים מהשיפוע. בסופו של דבר, התוצאות יכולות להראות שינויים ברמות החלבון הסינפטי באמצעות ניתוח כתמים מערביים.
זוהי טכניקה מבוססת היטב המשמשת מדעני מוח כבר למעלה מ-40 שנה. אנו משתמשים בו במעבדה שלנו כדי להבין כיצד הרכב החלבון של הסינפסה משתנה כאשר אנו מפריעים למערכות נוירוטרנסמיטורים שונות. היתרון העיקרי של טכניקה זו על פני שיטות אחרות, כמו שיפועי סוכרוז לכל קריאה או שיפועי סוכרוז רציפים, הוא שקל יותר לבנות שיפועי סוכרוז לא רציפים ביד.
פרוטוקול זה עושה שימוש בזכוכית מונעת טפלון הומוגנייזר תמיד מחליף את העלי בין דגימות ושוטף ומייבש. ההומוגנייזר תחילה, טען את הרקמה המנותחת לתוך צינור של 13 מיליליטר עם ארבעה מיליליטר של תמיסת סוכרוז מולרית של 0.32 HEPA. לאחר מכן העבירו את הרקמה להומוגנייזר זכוכית נקי.
הגדר את המנוע ל-900 סל"ד והומוגניזציה של הדגימה ב-12 פעימות במשך 30 שניות תוך שימוש בפחות מארבעה גרם רקמה מבטיח פיצול טוב, העברת הדגימה בחזרה לצינור ואחסון של 100 מיקרוליטר ב-80 מעלות צלזיוס שליליות לניתוח חלבון. לאחר מכן, הפרד את החומר הגרעיני על ידי סיבוב ההומוגנאט ב-900 גרם למשך 10 דקות. בארבע מעלות צלזיוס, העבירו את הסופרנטנט לצינור חדש של 15 מיליליטר.
הסופרנטנט מכיל את חלק הממברנה הגולמי. כעת כדי להעשיר את הצנטריפוגה הסינפטוזומית הגולמית, הסופרנטנט ב-10,000 גרם למשך 15 דקות בארבע מעלות צלזיוס, הסר את הסופרנטנט. הגלולה מכילה את החלק הסינפטוזומי הגולמי Resus.
השעו אותו במיליליטר אחד של תמיסת סוכרוז מולרית של 0.32. ואז בעוד שלושה מיליליטר של תמיסה לצנטריפוגת ההשעיה את החלק הגולמי למשך 15 דקות ב -10, 000 גרם בארבע מעלות צלזיוס, הסר את הסופרנטנט. כעת כינים במהירות את הגלולה, השעו מחדש את הכדור במיליליטר מים טהורים.
ואז להוסיף עוד שלושה מיליליטר מים במהירות. העבירו את זה להומוגנייזר. יש למרוח שלוש משיכות ביד ולהעביר אותו בחזרה לצינור של 13 מיליליטר.
התאם במהירות את הדגימה בחזרה לארבעה HEAs מילי-מולאריים בתוספת של 16 מיקרוליטר של HEA מולארי אחד וערבב אותו על ידי היפוך. כעת הניחו את הדגימה על מסובב בארבע מעלות צלזיוס למשך חצי שעה. כדי להבטיח את ליזיס הדגימה, סיים את הפיצול על ידי כדור ה-Lysed P שני שברים ראשוניים.
סובב אותו ב-25,000 גרם למשך 20 דקות בארבע מעלות צלזיוס, הסר את הסופרנטנט, השהה מחדש את הגלולה במיליליטר תמיסת סוכרוז. זה מכיל את הממברנות האפיזומליות המועשרות של הסינאפ. ראשית, מדוד מראש את המאגרים כדי ליצור שיפוע סוכרוז לא רציף.
טען שלושה צינורות כדלקמן, אחד עם 3.5 מיליליטר בדיוק של 1.2 ערימות מולאריות תמיסת סוכרוז. אחר עם שלושה מיליליטר בדיוק של תמיסה מולרית של 1.0, והשלישי עם שלושה מיליליטר של תמיסה טוחנת של 0.8. לאחר מכן, בעזרת פיפטה מזכוכית, העבירו את תמיסת הסוכרוז המולרית של 1.2 לצינור אולטרה-צנטריפוגה פולימרי בנפח 12 מיליליטר.
בעזרת פיפטה חדשה, שכבו בזהירות את התמיסה המולרית 1.0 על התמיסה המולרית של 1.2. אין להפריע לתמיסה המולרית 1.2 או להכניס בועות עם הפיפטה. השתמש באותה טכניקה כדי להניח את התמיסה המולרית 0.8 מעל.
היזהר. מספיקות רעידות קטנות ממערבולת ספסל או מיקרו צנטריפוגה בכדי להפריע לשלמות השיפוע. חשוב לבנות את השיפועים בזהירות וביעילות.
אם זה לוקח יותר מדי זמן או אם השיפוע חשוף לרטט, לא תוכל לשחזר את הממברנות הסינפטיות בשלבים הבאים. כעת עם שכבה נוספת של פיפטה של הכומר את שבר הממברנה האפיזומלית המועשר של הסינפה על גבי השיפוע המוכן. איזון מדויק של השיפוע באולטרה-צנטריפוגה ברוטור דלי מתנדנד.
לאחר מכן סובב אותו ב-150,000 גרם למשך שעתיים בארבע מעלות צלזיוס. היזהר מאוד בעת הוצאת השיפוע מהדלי לאחר הצנטריפוגה, צריכות להיות רצועות ברורות של תמיסת סוכרוז. עם שברי חלבון בכל ממשק וגלולה, השברים לא צריכים להיות מפוזרים.
בעזרת מחט 18 מד ומזרק מיליליטר אחד, נקב את החלק הנמוך ביותר של הממשק המולרי עד 1.2 ומשוך את הפס הלבן של החלבון, המכיל את ממברנות הפלזמה הסינפטיות. רשום את עוצמת הקול של שכבה זו. העבירו את השכבה לצינור אולטרה-צנטריפוגה בעובי 3.5 מיליליטר.
הוסף בדיוק 2.5 נפחים של ארבעה מילי-מולרי HEAs. לאחר מכן הכינו צינור איזון עם תמיסת סוכרוז חוצצת של 0.32 HEAs מולרית ברוטור זווית קבועה, אולטרה-צנטריפוגה את הדגימה ב-200, 000 גרם למשך 30 דקות בארבע מעלות צלזיוס. לאחר מכן השליכו את הסנה והשעו מחדש את גלולת קרום הפלזמה הסינפטית.
ב-300 מיקרוליטר של 50 מילי-מולרי HEAs תמיסת EDTA של שני מילי-מולריות. כעת ניתן לאסוף את שבר הצפיפות הפוסט-סינפטי או שבר PSD על ידי שימוש נוסף באותן טכניקות. השלבים מתוארים בבירור בפרוטוקול הטקסט.
כתם מערבי הופעל עם חלבון כולל, קרום הפלזמה הסינפטי, ושברי חלבון בצפיפות פוסט-סינפטית ראשונים. חלק ה-PSD עבר טיפול דטרגנטי אחד בלבד, והרקמה הייתה מסטריאטום עכבר. חלבונים פרה-סינפטיים כמו טרנספורטר הדופמין מועשרים בחלק ה-SPM, אך מסולקים בשלב הניקוי הבא להעשרת PSD.
בזמן ניסיון הליך זה, חשוב לזכור לשמור את כל הדגימות על קרח ולכלול מעכבי פרוטאז ופוספטאז בעקבות הליך זה. ניתן לבצע שיטות אחרות כמו ניתוח דם מערבי או אלקטרופורזה דו-ממדית של ג'ל. לאחר מכן תוכלו לענות על שאלות כמו כיצד טיפול תרופתי משפיע על רמות הקולטנים בסינפסה.
View the full transcript and gain access to thousands of scientific videos
סקירה כללית
מאמר זה מפרט את העשרת החלבונים הקשורים לממברנת הפלזמה הסינפטית באמצעות צנטריפוגציה על ציר סוכרוז לא רציף. הנוהל מדגים חלוקה תת-תאית של רקמת מוח להעשרת חלבונים מממברנות סינפטיות וצפיפויות פוסט-סינפטיות.
מרכיבי מחקר עיקריים
תחום המדע
- מדעי המוח
- ביולוגיה תאית
- ניתוח חלבונים
רקע
- הבנת רמות החלבונים הסינפטיים חיונית למחקר מדעי המוח.
- ממברנות סינפטיות וצפיפויות פוסט-סינפטיות ממלאות תפקידים מרכזיים בתקשורת עצבית.
- צנטריפוגציה על ציר היא טכניקה סטנדרטית להעשרת חלבונים.
- בלוט ווסטרן ובלוט דו-ממדי הם שיטות נפוצות לניתוח חלבונים.
מטרת המחקר
- להעשיר חלבונים מממברנות סינפטיות וצפיפויות פוסט-סינפטיות.
- להכין תמציות חלבונים המתאימות לניתוח נוסף.
- להדגים את האפקטיביות של ציר סוכרוז לא רציף בהעשרת חלבונים.
שיטות ששימשו
- הומוגניזציה של רקמת מוח באמצעות הומוגניזר ממונע.
- סדרת שלבי צנטריפוגה להכנת תמציות חלבוני ממברנה גולמיות.
- הצבת תמציות ממברנה על ציר סוכרוז לא רציף.
- צנטריפוגציה על ציר לאסוף חלבונים מהציר.
תוצאות עיקריות
- העשרה מוצלחת של חלבוני ממברנת הפלזמה הסינפטית.
- הכנת חלבוני צפיפות פוסט-סינפטית לניתוח.
- התוצאות יכולות להצביע על שינויים ברמות החלבונים הסינפטיים.
- מתאים לניתוח בלוט ווסטרן ובלוט דו-ממדי.
מסקנות
- השיטה מעשירה באופן יעיל חלבונים מממברנות סינפטיות.
- מספקת בסיס לחקר דינמיקה של חלבונים סינפטיים.
- ניתן ליישם אותה על שאלות מחקר שונות במדעי המוח.
שאלות נפוצות
Executive Industry Relevance
Synaptic protein quantification enables mechanistic de-risking in CNS target validation by linking molecular changes to functional phenotypes. This subcellular fractionation method supports predictive confidence in early discovery by isolating disease-relevant synaptic compartments. It provides a disease-relevant system for assessing target engagement and pathway modulation in preclinical models.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses through quantification of synaptic plasma membrane and postsynaptic density protein trafficking.
- Operational Value: Provides a standardized approach to isolate synaptic compartments for target de-risking.
- Predictive Value: Supports biomarker alignment by measuring changes in presynaptic and postsynaptic protein levels following pathway modulation.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Prepares validated synaptic protein fractions for use in phenotypic screening assays to evaluate compound effects on synaptic integrity.
- Operational Value: Generates reproducible, quantitative protein outputs suitable for assay standardization and high-content analysis.
- Scalability: The discontinuous sucrose gradient method allows batch processing of samples for consistent screening readiness.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Enables disease-relevant system modeling by isolating synaptic proteins from specific brain regions, such as striatum, to study neuropsychiatric targets.
- Operational Value: Supports translational biomarker development by providing quantifiable synaptic protein readouts correlated with functional outcomes.
- Risk Mitigation: Facilitates preclinical continuity by linking target modulation to measurable changes in synaptic protein composition.
Pipeline & Workflow Integration
This method integrates into the discovery continuum from target hypothesis testing through lead identification to preclinical validation by providing quantitative synaptic protein data.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing and pathway clarification by isolating synaptic compartments affected by neurotransmitter system perturbations.
- Screening: Enables assay readiness through production of enriched synaptic plasma membrane and PSD fractions suitable for Western blot or 2D DIGE analysis.
- Analytics: Delivers quantitative dependent variable measurements (protein band intensity) that allow comparison of synaptic protein levels across experimental conditions.
- Translational Research: Connects discovery findings to preclinical continuity by enabling assessment of synaptic protein changes in disease models.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable platform for synaptic protein isolation across multiple CNS projects and target classes.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in target validation by reducing mechanistic ambiguity through direct measurement of synaptic protein trafficking.
- Operational Value: Ensures reproducibility and standardization via a well-established discontinuous sucrose gradient protocol with defined centrifugation steps.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions by providing early, quantitative synaptic protein data that de-risks CNS target progression.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of CNS targets based on measurable effects on synaptic protein composition and synaptic function.
Implementation Considerations
- Requires expertise in subcellular fractionation, ultracentrifugation, and synaptic biology to ensure proper gradient formation and fraction collection.
- Dependent on access to ultracentrifuge with swinging bucket and fixed angle rotors, and capability to maintain samples at 4°C throughout processing.
- Necessitates cross-team standardization of gradient preparation, tissue homogenization, and protease/phosphatase inhibitor use to ensure reproducibility across sites.
- Requires adaptation considerations when applying to different brain regions or disease models due to variations in synaptic protein expression and tissue yield.
- Practical limitations include the need for fresh or properly stored tissue and careful handling to prevent gradient disruption from vibration or delays during setup.
